ALIMENTOS TRANSGÉNICOS
ALIMENTOS
TRANSGÉNICOS
Tema 2. Estrategias de
manipulación genética
Estrategias de obtención de
microorganismos MG (CLONACIÓN)
Obtención del DNA Purificación
con el gen de interés del vector
Corte con E.R.
Ligación
Transformación
o transducción
Selección recombinantes
Selección portadores gen deseado
Estrategias de obtención de
microorganismos MG (SUPRESIÓN)
Disrupción génica:
Se empaqueta en un plásmido el gen a
disrumpir con las regiones flanqueantes (1 kb
upstream y downstream)
El gen se reemplaza parcial o totalmente por
un gen marcador seleccionable.
El plásmido se linealiza y se utiliza para
transformar.
Se recuperan transformantes con el gen
disrumpido.
Reemplazamiento génico mediante doble “cross-over”
Mutagénesis dirigida mediante PCR
PRODUCCIÓN DE rBGH MEDIANTE
BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
Recombinante o no: prohibido en UE
Suministro: Dependencia de reses muertas
Clonación en E. coli: sin problemas técnicos
Problemas de mercado:
Aumento niveles IGF-1 en leche
Sobrecarga a los animales
NO aumenta la calidad de la leche
Desarrollos biotecnológico en
alimentos de origen vegetal
Johnson-Green. Introduction to Food Biotechnology
Estrategias de obtención de
alimentos vegetales MG
Transformación mediada por un vector:
Se utiliza el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens: plásmido Ti
(induce tumores)
Se elimina parte de la secuencia del plásmido, manteniendo las
secuencias de los extremos (necesarias para la transferencia)
Se introducen los genes de interés.
Transferencia génica directa:
Transformación de protoplastos: eliminación pared y transformación
con PEG o electroporación
Bombardeo con partículas: microproyectiles (1-2 micras) recubiertos de
ADN a elevada velocidad en el tejido vegetal
(problema: inserción compleja puede complicar expresión)
Producción de maíz transgénico YIELDGARD
(Monsanto)
(resistente a lepidópteros)
Aprobado por la UE el 22 de abril de 1998
Producción de maíz transgénico
ROUNDUP READY GA21 (Monsanto)
(resistente a glifosato)
En estudio en la UE desde 1996
TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN DE
ANIMALES TRANSGÉNICOS
Integración de un transgen en el cromosoma de
un organismo hospedador
1. Utilización de vectores virales modificados:
El gen de interés se incorpora al genoma viral y la
quimera se une a las células embriónicas, actuando como
vehículo para integrar el transgen en genoma hospedador
Normalmente se integra una única copia del transgen
Si transgen se introduce en ovocitos antes fertilización,
estará presente en todas las células embrión
Inconvenientes: compleja preparación del vector viral
posibilidad remota de reversión
posibilidad recombinación otros virus
TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN DE
ANIMALES TRANSGÉNICOS
Integración de un transgen en el cromosoma de
un organismo hospedador
2. Microinyección:
El gen+promotor de interés se incorpora a un plásmido
para su amplificación.
Se incorpora con micropipeta (<3 pL) a huevo fertilizado
El número de copias integradas es variable.
Si transgen se integra en uno de los cromosomas del
pronúcleo, estará presente en todas las células del animal
Inconvenientes: tasa de integración variable (0-n)
locus integración variable: expresión
puede causar inactivación insercional
TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN DE
ANIMALES TRANSGÉNICOS
Integración de un transgen en el cromosoma de
un organismo hospedador
3. Inserción por recombinación homóloga:
Permite la inserción del transgen en un locus específico
del cromosoma.
Inconvenientes: sistema tedioso
requiere conocimiento de secuencia
4. Clonación:
Se pueden obtener múltiples animales de un único
donante.
Inconvenientes: tecnología en desarrollo
aspectos éticos
PROGRAMA DE TRANSFERENCIA
GÉNICA MEDIANTE MICROINYECCIÓN
Superovulación de los Inyección de 2-3 pL
animales donantes (2000-3000 copias del
mediante gonadotropina transgen) en el
Inseminación y pronúcleo del zigoto
recuperación de
ovocitos fertilizados Transferencia de los
zigotos inyectados a
oviductos de animales
Empaquetamiento del receptores
transgen en vector
Detección de
Amplificación en una
integración, número
bacteria, recuperación y
de copias y locus
purificación
Producción
de
animales
transgénicos
Hibridación
Producción de peces transgénicos
Los transgenes se limitan a
pequeñas construcciones y son
insertados aleatoriamente y en
número variable en cada individuo
Limitaciones en esto crea dificultad en la
estabilización de la modificación
la tecnología de
genética en una población en
producción de crecimiento
animales
La expresión del transgen puede
transgénicos ser incontrolada (o no, con
promotores inducibles tipo
"trigger", controlables por dieta)
Los transgenes pueden afectar la
expresión de otros genes
CRÍA DE ANIMALES TRANSGÉNICOS-problemas
El transgen ha de ser transferido a la progenie:
al menos algunas de las células germinales del
animal transgénico deben contener el transgen
El momento exacto de integración no se conoce
La estabilidad del ADN inyectado durante el
posterior desarrollo del embrión se desconoce
Aparición de mosaicos: animales con diferentes
líneas celulares: contienen células transgénicas y
no transgénicas: herencia el 50% o menos
Variabilidad en la expresión del transgen
Control de ausencia de mutaciones insercionales
RESULTADOS ACTUALES EN LA PRODUCCIÓN
DE ANIMALES TRANSGÉNICOS
Porcino: 5-10% zigotos inyectados desarrollados
GH: niveles expresión del 50%
Descendencia transgénica
Ovino: Capacidad desarrollo: mitad que porcino
Tasa de integración: 1%
Supervivencia embriones: 6-7%
Caprino: Resultados insatisfactorios hasta ahora
Vacuno: Quimeras con el gen de la TK
Hasta 30% integración (a veces bajísima)
ANIMALES TRANSGÉNICOS: CONCLUSIONES
Investigación para mejorar la efectividad de los
métodos de transferencia génica: optimizar
microinyección y desarrollar otras
Aislar y caracterizar los genes de interés para la cría
de animales: profundizar en el conocimiento del
genoma de los animales domésticos
Aislar y caracterizar elementos reguladores
adecuados:
promotores óptimos
expresión en el tejido adecuado
expresión en el momento adecuado
expresión en la cantidad adecuada
ALIMENTOS
TRANSGÉNICOS
Tema 1.
2. Diagnóstico molecular de OMGs
COMERCIALIZACIÓN DE ALIMENTOS
TRANSGÉNICOS
Maíz: Bt-maize 176 (Novartis)
Tomate: FlavrSavrTM (Calgene)
Soja: Roundup ReadyTM (Monsanto)
Patata: Potato B33 (Monsanto)
Microorganismos:
Lactobacillus curvatus
Streptococcus thermophilus
DIANAS PARA LA DETECCIÓN DE ALIMENTOS
TRANSGÉNICOS
Screening: nptII, P-35s, nos 3'
Validación: P-35S, nos 3'
Test EC: P-35S, nos 3'
Específicos: PG, nos 3' (tomate)
gbss-as (patata)
katA/cat (L. curvatus)
cat/lacZ (S. thermophilus)
cryIA(b), (maíz Bt-176)
bla (maíz Bt-176)
PAT (Liberty, Yield Gard)
Extracción y purificación
del ADN
Visualización del ADN
(Efecto de la Tª sobre la calidad)
115ºC 121ºC 133ºC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
501 bp
242 bp
110 bp
sin tratar
Detección de la secuencia
diana mediante PCR
PROCESO DE LA PCR
PCR. Detección del ADN
Prado et al., 2002
Confirmación mediante secuenciación
Detección
mediante
hibridación:
dot-blot
reversa
Detección de secuencias diana
mediante Southern blot
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2.5 kb
2.3 kb
DNA CHIPS y MICROARRAYS
Versiones miniaturizadas y
extendidas de la hibridación.
Placa: genes a cribar
Muestra: mRNA marcado del
alimento problema
Capacidad: hasta 8000 ensayos
a la vez
Microarray
1. Sonda fijada
2. Muestra marcada
positiva
3. Soporte
Sistema de resonancia
1. Sonda fijada
2. Muestra no marcada
3. Cambio I.R. de luz
reflejada desde un chip
Marker rescue
Recombinación entre el gen
diana y un promotor
inactivo unido a un gen
homólogo al diana
(se recupera la función)
Métodos inmunológicos
Mecanismo:
– selección de una diana: proteína transgénica, etc.,
frente a la que se obtiene un anticuerpo capaz de
reconocerla
Aplicaciones:
– análisis cualitativo y cuantitativo
Evolución de los inmunoensayos:
– Últimamente:
anticuerpos monoclonales
sistemas “sandwich” o competitivos, con Ac. capturador,
Ac. indicador y molécula indicadora.
Estructura de los anticuerpos
Naturaleza:
– glicoproteinas de los sistemas de defensa
de organismos superiores.
– IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
IgG:
– 2 cadenas pesadas y dos cadenas ligera regula
– unión por puentes disulfuro unión Ag-Ac
– cadenas con región conservada y región variable
– dos puntos de fijación de Ag por cada molécula de Ac.
Tipos de anticuerpos:
– policlonales o monoclonales
– recombinantes
Anticuerpos policlonales
Antisueros formados por Ac de origen
celular diverso y heterogéneo
Obtenidos por inmunización de cabra o conejo
Agente inmunizador: proteína transgénica
Si respuesta inmunológica: purificación
Inconveniente: especificidad variable
Anticuerpos monoclonales
Utilización de lineas celulares e hibridoma:
(células B del bazo de ratón + células de mieloma)
Afinidad y especificidad constantes
Anticuerpos recombinantes
Manipulación teórica total: modulación genética de la
región variable por mutación previa clonación en E. coli
Anticuerpos recombinantes
Extracción mRNA células B
inmunizadas
Obtención cDNA con RT
Amplificación cDNA
mediante PCR
Empaquetamiento en fago
e introducción en larvas
Se detecta el Ac idóneo en
presencia del antígeno
Detección mediante inmunoblot
P B L H D C T G Du P B L H D C T G Du
Detección mediante ELISA “sandwich”
Proteína Avidina-enzima
diana Conjugado
Soporte anticuerpo-biotina
