UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA
PROTOCOLO DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
201504 – MICROBIOLOGÍA
San Juan de Pasto
Junio de 2022
1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO
La primera versión de las guías que se proponen para el componente
práctico del curso de Microbiología, fueron diseñadas en el año 2004 por
la Doctora Carmen Eugenia Piña López, docente de la UNAD.
El contenido didáctico de este componente práctico ha sido apoyado por
las profesoras Angélica Yara y Rocío Gómez. Ha tenido actualizaciones a
partir de su creación desarrolladas por Marta Cecilia Vinasco Guzmán y
Yurby Salazar, quienes han apoyado el proceso de revisión de estilo e
hizo aportes disciplinares, didácticos y pedagógicos.
La última versión de este componente práctico (2023) ha sido creada y
actualizada por Mery Liliana López Martínez, Docente Asistente de la
UNAD, quien actualmente se desempeña como directora nacional del
curso de Microbiología.
2. CARACTERÍSTICAS GENERALES
La microbiología estudia los microorganismos u
organismos generalmente microscópicos, aunque
Introducción algunos pueden ser observados a simple vista.
Su estudio comprende la identificación y clasificación
de los microorganismos, su origen y evolución, la
dinámica del crecimiento, el rol interactivo de los
microorganismos con el sistema inmunológico, las
enfermedades que pueden producir y su importancia
en la producción industrial.
El curso de Microbiología hace parte del Campo de
Formación Disciplinar Común, constituyéndose en
Justificación herramienta fundamental de los procesos de
desarrollo científico y que posibilitan la inserción de
nuestro país en las dinámicas globales del
desarrollo. Por lo tanto, su objetivo primordial es
comprender y reconocer la importancia de los
microorganismos en la vida del planeta, conocer su
morfología, fisiología, bioquímica, distribución y sus
efectos beneficiosos y/o perjudiciales para el
hombre.
Metas:
Desarrollar la totalidad de las prácticas que se
Intencionalid presentan en esta guía.
ades
formativas
Resultado de Aprendizaje: Implementar métodos
y protocolos de cultivo, aislamiento e identificación
de microorganismos con fines académicos e
investigativos.
Práctica 1: Normas generales de bioseguridad.
Práctica 2: Preparación de medios de cultivo.
Práctica 3: Siembra de microorganismos.
Práctica 4: Evaluación de sensibilidad a
Denominación
desinfectantes y antisépticos.
de practicas
Práctica 5: Descripción macroscópica de colonias de
microorganismos
Práctica 6: Técnicas de Tinción.
Práctica 7: Hongos
Horas 12 horas
laboratorios
Puntaje 120 puntos
3. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS
PRACTICA 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD.
Propósito:
Conocer los principales equipos con los cuales se trabaja en un laboratorio
de microbiología y conocer y aplicar las normas de bioseguridad que se
deben tener en un laboratorio.
Objetivo:
Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el
laboratorio.
Fundamentación Teórica
La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas encaminadas a
reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, las plagas
de cuarentena, las especies exóticas invasoras, organismos vivos
modificados.
Cuando se trabaja en laboratorio con microorganismos se deben poner
en práctica varias normas de bioseguridad para evitar accidentes y
adquirir enfermedades.
Descripción de la práctica
A continuación, encuentra las normas de bioseguridad básicas de
cualquier laboratorio y los cuidados que se deben tener al lavar material
del vidrio.
Por favor realice una buena lectura, pero principalmente ponga en
práctica todas las recomendaciones.
✓ Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas, jugar,
correr o gritar.
✓ No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que no
porten sus implementos de bioseguridad adecuados.
✓ No se permitirá el ingreso de personas bajo efectos de bebidas
alcohólicas o sustancias psicoactivas.
✓ Para el ingreso a los laboratorios, préstamo de material o equipo se
debe presentar el carné vigente.
✓ Todas las superficies de trabajos se limpiarán y desinfectarán
diariamente y siempre que se produzca un derrame.
✓ Usar bata de manga larga con puños, la cual debe estar completamente
cerrada.
✓ Usar guantes de nitrilo, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y todos
los elementos de seguridad solicitados dependiendo del riesgo.
✓ Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas.
✓ Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas,
manillas, reloj o elementos que puedan entorpecer la manipulación de los
materiales o equipos.
✓ En ninguna circunstancia se permitirá comer, beber o fumar en el
laboratorio.
✓ En ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las sustancias
químicas o biológicas utilizadas en el desarrollo de las prácticas.
✓ No trabajar nunca solo en el laboratorio.
✓ No pipetear sustancias con la boca.
✓ Cuando en el desarrollo de las prácticas se utilice ácido y agua en
diluciones, agregue el ácido sobre el agua.
✓ No devolver reactivos a los frascos, así no hayan sido utilizados.
✓ Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por el docente
responsable del laboratorio.
✓ Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde nadie
corra peligro de quemarse.
✓ Los residuos y muestras de procedimientos de microbiología que van a
ser incinerados fuera del laboratorio deber ser sometidos a desactivación
en autoclave.
✓ Como norma general no se podrá verter ninguna sustancia peligrosa
para el medio ambiente por el desagüe.
✓ Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesón, devolver los
elementos y materiales perfectamente limpios, asegúrese de dejar
cerrado el gas, agua y lavarse las manos.
✓ Para la eliminación de los residuos se deben utilizar los recipientes
destinados para este fin siguiendo las indicaciones del docente
responsable del laboratorio.
✓ Cualquier accidente por pequeño que sea debe comunicarse al docente
responsable del laboratorio.
✓ Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar que
queden sobre ellos.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Revisar el reglamento de normas de bioseguridad de la Universidad
Nacional Abierta y a Distancia disponible en:
https://academia.unad.edu.co/laboratorios-normas-de-bioseguridad
Observar el siguiente vídeo:
https://www.youtube.com/watch?v=g9cmQXjpRAI&t=59s
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRACTICA No. 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.
Propósito:
Conocer los principales medios de cultivo, la forma de preparación y
presentación.
Objetivo:
Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.
Fundamentación Teórica
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá
de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales
varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes
que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos
muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas,
suero o sangre para crecer.
Descripción de la práctica
Revise las etiquetas de los recipientes de diferentes medios de cultivo,
anote el nombre, la composición y forma de preparación.
En las instrucciones de forma de preparación le dicen la cantidad en
gramos de medio deshidratado que se necesitan para disolver en un litro
de agua. En muchas ocasiones no es necesario preparar un litro de medio,
por lo tanto, mediante un cálculo matemático sencillo ustedes pueden
preparar una cantidad menor.
Supongamos que desean preparar 325 mililitros de medio de cultivo, al
leer las instrucciones de preparación en la etiqueta dice que para preparar
1 litro (1000 ml) de medio se necesitan 20 gramos medio deshidratado.
Para hacer el cálculo se realiza una regla de tres simple:
20 gr. 1000 ml X= (20 gr. x 325ml) /1000= 6.5 gr.
X gr. 325ml
Esto quiere decir que se necesitan 6,5 gramos de medio deshidratado
para preparar 325 ml de medio de cultivo. Para preparar el medio se hace
el siguiente procedimiento:
Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua
destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada
coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua
destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe
ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar.
Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el
erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada.
Mezcle con el agitador.
A continuación, lleve la preparación a disolver en la plancha de
calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio
hasta que ebulla para lograr la disolución total del Agar.
Tape la boca del erlenmeyer papel aluminio. Si las normas de preparación
no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121
grados centígrados, durante 15 minutos.
Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C.
Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri,
previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la
placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no
luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique.
Los medios de cultivo líquidos se preparan de la misma forma y se sirven
en tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a
esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios
directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada.
Finalmente tenga en cuenta que, para preparar Agar inclinado en tubo,
solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos
deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de
agar inclinado.
Tome un medio de cultivo al azar y realice los cálculos para preparar
volúmenes de 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml.
Experimentalmente prepare 20 ml de medio de cultivo sólido y sírvalo en
2 cajas de Petri.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Recipientes con diferentes medios de cultivo, Erlenmeyer, Probeta, Agua
destilada, Cajas de petri, balanza, papel aluminio, estufa, autoclave,
cámara de flujo.
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRACTICA No. 3. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS.
Propósito:
Conocer y aplicar las diferentes técnicas de siembra que existen.
Objetivo:
Determinar las condiciones necesarias para realizar la siembra de
microorganismos
Reconocer los distintos sistemas de siembra y su utilidad.
Fundamentación Teórica
Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para
obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la
muestra sobre caja de Petri, que contiene un medio compuesto por las
sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A veces se
añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el
crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. La
siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos
de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los
microorganismos.
Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el
medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma,
tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas.
También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas
bioquímicas o de otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias
son muy difíciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y
algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.
Descripción de la práctica
1. Siembra de medio líquido a medio líquido
Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de
siembra utilizado y la fecha.
Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje
siempre al lado de él.
Esterilice un asa de argolla en la llama de un mechero y déjela enfriar.
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo,
flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes
y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del
tubo, tápelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo
estéril en el cual va a colocar la muestra, destápelo, flameando la boca
el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.
Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo
las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape.
Esterilice el asa en el mechero después de usarla.
Incube los tubos a 37ºC por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda
transparente
2. Siembra de medio líquido a sólido
Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje
siempre al lado de él.
Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar.
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo,
flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en el tubo sin tocar las paredes
y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del
tubo, tápelo y déjelo en una gradilla.
Tome el tubo de agar nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra,
destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa
con la muestra obtenida.
Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un
solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de
entrada que de salida.
Esterilice el asa en el mechero después de usarla.
Incube los tubos a 37ºC por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido.
3. Siembra de medio sólido a sólido
Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje
siempre al lado de él.
Esterilice un asa de argolla en la llama de un mechero y déjela enfriar.
Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se
emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden
inocular mediante varios métodos: como estrías, agotamiento y rejilla
con el fin de lograr un cultivo puro.
a. Siembra por agotamiento
Tome el asa o el escobillón y realice estrías en toda la caja de petri en
forma consecutiva y sin recargar el asa. Se desliza suavemente el asa
por la superficie en forma de zigzag.
b. Siembra por estrías
Tome una placa de agar, divida la base de la caja de Petri en cuartos y
márquelos con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el
número 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire
la caja hasta el número 2, tome las dos últimas estrías y siga estriando
hasta el número 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no
tocar las estrías ya hechas.
Incube las cajas a 37ºC por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido.
4. Siembra en agar inclinado
Esta se realiza por agotamiento. Extienda el inoculo sobre el agar
inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de
zigzag.
No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra.
Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una
película o por el crecimiento de colonias en la superficie.
5. Siembra en profundidad
Marque la caja de Petri estéril con el número de grupo, la fecha y siembra
en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.
Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de
Pasteur plástica, transfiera 1 ml de este cultivo a la base de la caja de
Petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con hipoclorito
de sodio.
Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego
realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas
del reloj luego, al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en
forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias
en todo el agar para facilitar su posterior recuento.
Incube las cajas a 37ºC por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
1 tubo de ensayo con caldo nutritivo y S. aureus en crecimiento
1 tubo de ensayo con caldo nutritivo
1 tubo de ensayo con agar nutritivo recto
1 tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado
1 caja de Petri con agar nutritivo y S. aureus en crecimiento
2 cajas de Petri con agar nutritivo
1 caja de Petri estéril sin agar
10 ml de Agar nutritivo caliente
Mecheros
Incubadora
Asas de punta recta y argolla
Pipetas Pasteur
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRÁCTICA 4. EVALUACIÓN DE SENSIBILIDAD A
DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS.
Propósito:
Se va a demostrar en la siguiente serie de experimentos que los métodos
que se utilizan para eliminar los microorganismos no son igualmente
efectivos. De igual forma se va a comparar la efectividad de varios
desinfectantes que se utilizan comúnmente.
Objetivo:
Explicar la diferencia entre los resultados obtenidos al utilizar diferentes
métodos de esterilización de bacterias.
Explicar cómo se hace un ensayo comparativo de la eficiencia de varios
desinfectantes.
Fundamentación Teórica
Se define esterilidad a la condición de ausencia de cualquier
microorganismo. Significa destrucción de toda forma de vida microbiana
incluyendo esporas. Los métodos de esterilización más usados en el
laboratorio son calor seco, calor húmedo, flameado, utilización de
soluciones químicas.
La desinfección se refiere a la reducción de los organismos patógenos
(organismos que ocasionan enfermedades). Los desinfectantes de
acuerdo con su composición química se clasifican en: Fenoles,
Hipocloritos (cloro), Yodoformos (yodo Povidona), Amonio Cuaternario,
Formaldehídos, Peróxidos. Los desinfectantes pueden ser de bajo nivel,
de nivel intermedio o de alto nivel.
Los desinfectantes de bajo nivel (Fenoles, amonio cuaternario) pueden
destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto
grampositivas como gramnegativas, algunos virus (virus con envoltura
lipídica) y hongos (levaduras), pero no Mycobacterium sp, ni las esporas
bacterianas.
Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las
formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis,
la mayoría de los virus (virus con y sin envoltura) y hongos filamentosos,
pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas.
En cambio, los desinfectantes de alto nivel (formaldehídos, peróxidos,
hipocloritos) consiguen destruir todos los microorganismos, excepto
algunas esporas bacterianas.
Descripción de la práctica
Tome un desinfectante y coloque 1 ml. en un tubo de ensayo
Marque 4 cajas de petri con agar nutritivo así: 15, 30, 45 y 60 segundos
Añada 3 ml. de cultivo de Staphylococcus aureus o E. coli al tubo que
contiene el desinfectante. Apenas añada el cultivo inicie a contar el
tiempo.
De acuerdo con los tiempos marcados en la caja de agar nutritivo vaya
tomando una muestra del tubo (desinfectante + cultivo) y siémbrela en
la caja de agar nutritivo correspondiente. Utilice escobillones y siembre
por agotamiento.
Incube la caja a 37 o C por 24 horas
Repita el proceso anterior por cada uno de los desinfectantes que va a
evaluar.
Anote los resultados obtenidos en la tabla 1
TABLA 1
Desinfectante TIEMPO EN SEGUNDOS
15 30 45 60
Alcohol
Yodopovidona
Hipoclorito de
sodio
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Cultivos de Staphylococcus aureus o Escherichia coli en caldo nutritivo
Pipetas
Escobillones
3 tubos de ensayo estériles
12 cajas de petri con Agar nutritivo
Solución de hipoclorito de sodio 2ppm
Alcohol antiséptico
Isodine (Yodopovidona)
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRACTICA 5. DESCRIPCIÓN MACROSCOPICA DE COLONIAS DE
MICROORGANISMOS.
Propósito:
Cultivar microorganismos de diferentes ambientes y realizar una
descripción macroscópica de las colinas que crezcan.
Objetivos:
Explicar cómo se puede demostrar la presencia de microorganismos en
diferentes sitios.
Describir las características macroscópicas de las colonias bacterianas.
Fundamentación Teórica
En esta práctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en
el ambiente que nos rodea. Con este fin se toman muestras de diferentes
sitios y se las siembra en un medio de cultivo que contiene las sustancias
nutritivas que los microorganismos necesitan para desarrollarse, se las
lleva a incubar a la temperatura apropiada y se las deja el tiempo
necesario para que crezcan y se puedan observar las colonias a simple
vista y así determinar las características macroscópicas de esas colonias.
Descripción de la práctica
Marcar cada caja de Petri que se va a utilizar con los siguientes datos:
Nombre, Sitio del cual se tomó la muestra, Fecha de la práctica.
Tome cajas de Petri que contengan agar nutritivo y tome muestras de los
diferentes sitios que se relacionan a continuación:
✓ Pase un copito sobre la superficie del mesón en el cual está trabajando
y siembre en una caja de Petri.
✓ Pase sus dedos por el cabello y rasque suavemente para que el
producto que salga caiga sobre la caja de Petri.
✓ Toque con sus dedos la superficie de una caja de Petri.
✓ Tosa o estornude sobre una caja de Petri.
✓ Introduzca un copito en su oído y siembre en una caja de Petri.
✓ Siembre una muestra tomándola del sitio que desee.
Todas las cajas se llevan a incubar durante 24-48 horas a 37 grados.
✓ Tome 2 cajas de Petri que contengan Agar PDA o Agar Sabouraud,
destápelas y déjelas al aire libre durante 30 minutos en el sitio que desee
y luego tápelas.
Déjelas a temperatura ambiente y en las oscuridad durante 48- 72 horas.
Resultados
Observe las colonias y basándose en la figura 1, llene los datos de la tabla
1describiendo las características de las colonias y la cantidad de
crecimiento (mucho, abundante, regular, poco). Describa 2 colonias de
cada caja teniendo en cuenta las siguientes características:
Tamaño
Forma: circular, irregular, extendida.
Elevación: Plana, convexa, Umblicada.
Borde: irregular, aserrado, discreto, regular, entero ondulado.
Color: pigmentada, incolora.
Textura: Granular, friable, húmeda, seca, membranosa.
Superficie: suave, áspera, rugosa, opaca, resbalosa.
Olor: inodora, aromática desagradable.
TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS
SITIO DE TOMA DE CARACTERÍSTICAS DE LAS
LAS MUESTRAS COLONIAS
Superficie del mesón
Cabello
Dedos
Estornudo
Oído
Libre
Agar PDA 1
Agar PDA 2
FIGURA 1. FORMA, ELEVACIÓN Y BORDE DE LAS COLONIAS
MICROBIANAS
Fuente: Valencia (2004) Manual de prácticas de microbiología básica. Colección Notas
de Clase. Editorial UNIBIBLIOS. Universidad Nacional de Colombia.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
6 cajas de Petri con agar nutritivo
2 cajas de Petri con agar PDA o agar Sabouraud
Incubadora
Hisopos
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRACTICA 6. TÉCNICAS DE TINCIÓN.
Propósito:
Realizar diferentes tipos de tinciones para identificar microorganismos.
Objetivo:
Preparar frotis de bacterias para observaciones microscópicas
Observar las bacterias teñidas al microscopio y clasificarlas por su forma
y su reacción a la coloración de Gram.
Fundamentación Teórica
La observación microscópica de las bacterias se facilita cuando han sido
coloreadas. Se acostumbra a fijar las bacterias en la lámina portaobjetos
para poder teñirlas con facilidad.
La fijación puede hacerse con solventes o con calor. En cualquier caso,
se trata de deshidratar la célula y coagularla con proteínas.
Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante
o compuestas cuando se utilizan 2 ó más colorantes. También se puede
hacer una coloración negativa en la cual se tiñe el fondo, además de la
bacteria, para poder observar la cápsula.
Descripción de la práctica
1. Coloración Simple
Para la coloración simple se utiliza azul de metileno y se trabaja con
Staphylococcus aureus. Se toma una pequeña muestra del
microorganismo y se fija con calor, posteriormente se añade una gota
pequeña de azul de metileno, se coloca la laminilla o cubre objetos y se
observa al microscopio en un aumento de 100x.
2. Tinción de Gram
La tinción de Gram se realiza en cultivos de Staphylococcus aureus, y
Escherichia coli.
La tinción de Gram. Es una coloración compuesta porque en ella se
utilizan 2 colorantes, uno primario: cristal violeta o violeta de genciana y
uno de contraste, safranina o fucsina de Gram. Es una tinción diferencial
porque según la composición química de la pared celular las bacterias
quedan teñidas con el cristal violeta o la safranina, como mordiente o
sustancia fijadora del color se utiliza lugol.
El agente diferenciador, es decir, el que actúa de modo diferente sobre la
pared celular de las Gram. Positivas y las Gram negativas es la solución
alcohol cetona o alcohol- ácido.
Los pasos de la tinción de gran son los siguientes:
✓ Fijar la muestra al calor
✓ Añadir el violeta de genciana o cristal violeta y dejarlo actuar durante
1minuto
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Añadir lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Añadir alcohol- ácido y dejarlo actuar durante 15 segundos y lavar
rápidamente con agua
✓ Añadir fucsina y dejar actuar durante 1 minutos
✓ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
✓ Secar al aire libre o con una toalla absorbente según las indicaciones
del profesor
✓ Observar en el microscopio a un aumento de 100x.
Observe todas las bacterias con las diferentes coloraciones, determine su
morfología y trate de identificar sus partes, determine si son bacterias
Gram. Positivas o bacterias gran negativas. Dibuje lo observado.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
Cajas de Petri con Agar nutritivo y cultivos de E. coli y S. aureus.
Porta Objetos
Cubre Objetos
1 microscopio
2 ml de violeta de genciana o cristal violeta
2 ml de lugol
2 ml de alcohol- ácido
2 ml de fucsina
2 ml de azul de metileno
2 ml de azul de Lactofenol
Mechero
Pinzas
Aceite de Inmersión
Asas
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
profesor de laboratorio.
PRACTICA 7. HONGOS.
Propósito:
Realizar observaciones de estructuras fúngicas.
Objetivos:
Identificar las estructuras reproductoras y vegetativas de algunos
hongos.
Distinguir entre hongos filamentosos y levaduras
Fundamentación Teórica
Los hongos no poseen clorofila, adquieren su energía de los compuestos
orgánicos que están en el suelo y en el agua. El alimento lo pueden
obtener de los materiales muertos o se nutren como parásitos de
huéspedes vivos, por eso se consideran heterótrofos.
Son descomponedores de la madera, las hojas y otros restos vegetales,
formando el humus que enriquece el suelo y sintetizando el dióxido de
carbono que vuelve a la atmósfera, para ser aprovechado por las plantas.
Los hongos, se utilizan industrialmente en la fermentación para producir
ácidos, alcoholes, antibióticos y otros compuestos importantes en
industrias alimenticias y farmacéuticas.
Los hongos pueden deteriorar productos textiles, cuerdas, aislamientos
eléctricos e infinidad de artículos comerciales e industriales.
Por lo tanto, los hongos pueden se beneficiosos o patógenos.
Descripción de la práctica
Previo a la práctica observe el siguiente recurso:
Universidad de Antioquia. Escuela de Microbiología. Micología Veterinaria.
https://www.youtube.com/watch?v=vt1iA-EPAJI
En el laboratorio:
1. Observación de hongos pluricelulares:
Previamente en casa, cada estudiante prepara las muestras con
crecimiento de hongos.
Rhizopus sp: Tome una tajada de pan fresco, rocíe con agua y colóquela
dentro de una bolsa de plástico que se pueda cerrar. Guarde la bolsa en
un lugar caliente, húmedo y alejado de la luz. Este procedimiento se debe
hacer una semana antes del laboratorio. No abra la bolsa, hágalo
únicamente si observa que el pan pierde la humedad. No manipule, ni
inhale, ni consuma el contenido de la bolsa
Penicillium sp: En casa conserve en una bolsa cerrada una naranja o
limón en el cual se evidencia el crecimiento del hongo. La naranja con
hongos toma un color verde y/o blanquecino.
En el laboratorio, observe la morfología de Rhizopus sp. y Penicillium sp.
Examine el hongo a simple vista, describa el color, consistencia, textura
y apariencia general.
Para la observación microscópica, tome con un asa una muestra de hifas
y colóquela en portaobjetos, teñir con azul de lactofenol y observe al
microscopio. Dibuje lo observado y describa.
2. Observación de levaduras
Compre un sobre de levadura seca, la que se utiliza en panificación y
pastelería.
Para realizar una solución acuosa de levadura, ponga agua con azúcar en
beaker, caliente a una temperatura máxima de 50 grados, agrégale un
poco de levadura seca y agítelo hasta que quede totalmente disuelta y
con un aspecto lechoso homogéneo, deje en reposo 30 minutos.
Con una pipeta pasteur tome una gota de la solución preparada y móntela
en un portaobjetos y observe en fresco al microscopio.
Tome otra gota, fije la muestra, añada azul de lactofenol y observe al
microscopio.
Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)
Para un grupo:
Porta Objetos
Cubre Objetos
Beaker
1 microscopio
Mechero
Pinzas
Aceite de Inmersión
Asas
Opcional: Rhizopus sp. Cultivo en agar sabouraud
Opcional: Penicillium sp. Cultivo en agar sabouraud
Realice el informe según las orientaciones que le suministre su
tutor de laboratorio.
4. BIBLIOGRAFÍA
✓ APHA, AWWA. WPCF. 1989. Standar Methods for the examination of
water and wasterwater.
✓ GARCES, Emira. 2003. Morfología y Clasificación de los hongos. Notas
de clase Universidad Nacional de Colombia. Editorial UNIBIBLIOS.
✓ GRANT Y LONG. 1999. Microbiología Ambiental. Editorial Acriba.
España.
✓ MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M. Y PARKER, J. 2003. Brock: Biología
de los Microorganismos, Prentice Hall.
✓ MONTOYA, Olga Inés. 2004. Manual de Microbiología. Universidad
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