GUÍAS PRÁCTICA DE

LABORATORION°2

Posgrado: Microbiología de los alimentos

Módulo II: Microbiología alimentaria

Expertos:
 [Link]. Johann René Pérez Poveda
 [Link]. Denis Antonio Escorcia Morales

Integrantes:

 Daniela María Castillo González

 Alex Fernando López

 Reyna Corina Ortiz Guevara

 Elvin Alonzo Torrez Cabrera

 GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 2:
PRIMERA PARTE
OBSERVACIÓN Y CLASIFICACIÓN DE MICRORGANISMOS
Introducción
Los microorganismos son seres vivos que poseen existencia individual y no se agregan para
formar tejidos y órganos como en los animales y vegetales superiores. Miden milésimas de
milímetro y para verlos hay que utilizar dispositivos ópticos (microscopios) que permitan ver con
unos 1.000 veces de aumento. El método de tinción de células conocido como Tinción de Gram
fue desarrollada por el Bacteriólogo Danés Christian Gram en 1884. Permite la rápida evaluación
de la morfología y complejidad de la célula bacteriana.

Objetivos
General
Identificar las estructuras de los microorganismos que estén presentes en la muestra problema,
aprendiendo así la técnica de tinción utilizada en el estudio microscópico de cultivos bacterianos.

Específicos
1. Explicar los pasos necesarios para la correcta realización de la Tinción de Gram.
2. Manipular correctamente los materiales de uso en la práctica de laboratorio, con base a las
normas de bioseguridad.
3. Identificar qué tipo de bacteria según los criterios de reacción al Gram. si las bacterias
sonGram(+) oGram(-)
Procedimientos
1. Colocar una pequeña gota de agua destilada estéril en el portaobjetos (con pipeta Pasteur).
2. Tomar con el asa de platino estéril una pequeña porción de la muestra biológica suministrada.
3. Re-suspender con agua destilada estéril la muestra en el portaobjetos.
4. Secar
5. Colocar Cristal Violeta cubriendo toda la muestra por 1min.
6. Lavar
7. Luego debe agregarse el lugol, cubrir la muestra por 1 min.
8. Lavar con agua corriente.
9. El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla, es el paso más crítico del
procedimiento. Este debe cubrir la muestra por el tiempo que puede ir de 15s a 30s y la reacción
debe ser detenida con el lavado con agua corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las
muestras. Al ser por lo general tiempos muy cortos, se recomienda agregar el alcohol mientras ya
se tiene la llave del agua corriendo, listo para el lavado.
10. El último paso consiste en agregar una tinción de contraste, para teñir las bacterias que
pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la muestra por 15 segundos a
1minuto.
11. Lavar con agua corriente y se deja secar.
 1. ¿En qué consiste la Tinción de Gram?

La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian Gram en el
año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar
diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. Es una técnica muy
sencilla que se basa en el uso de un colorante (tinción) y que tiene una gran utilidad en medicina.

Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una
forma u otra. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias
grampositivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a las que se
visualizan de color rosado y rojo.

2. ¿Cuáles son los mecanismos y uso de la Tinción de Gram?

La tinción de Gram se suele usar para saber si usted tiene una infección bacteriana. Si es así, la
prueba muestra si la infección es grampositiva o gramnegativa.

3. Establezca la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram Negativas.

La tinción de Gram es de color púrpura. Cuando la tinción se combina con la bacteria en una
muestra, las bacterias pueden seguir de color púrpura o volverse rosadas o rojas. Si se mantienen
púrpura, son grampositivas. Si se vuelven rosadas o rojas, son gramnegativas. Las bacterias
grampositivas y las gramnegativas se tiñen de forma distinta porque sus paredes celulares son
diferentes. También causan diferentes tipos de infecciones, y hay distintos tipos de antibióticos
eficaces contra ellas.

4. ¿Investigue sobre los pasos a seguir para realizar la Tinción de Gram?

En primer lugar, para realizar una tinción, lo que debemos tener son microorganismos
sembrados. Dichos microorganismos los hemos el día anterior mediante la técnica de siembra de
estría múltiple, los hemos dejado incubar durante 24 horas a 37ºC en la incubadora para así
obtener las colonias de los diferentes microorganismos. En este caso son microorganismos de la
orofaringe.
Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá hacerse en condiciones de esterilidad.
Para conseguir estas condiciones podemos utilizar un mechero Bunsen o un mechero de alcohol.
Con el mechero, conseguiremos que se forme un ambiente de esterilidad alrededor de la llama,
por lo tanto, si trabajamos cerca del mechero, tendremos un ambiente estéril.

A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que realizar es un frotis del
microorganismo, para ello hay que añadir una gota pequeña de agua destilada (cuanto mayor sea
la gota, tardará más tiempo en secarse).

Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada. Para ello
encendemos el mechero de alcohol y ponemos el asa en posición vertical encima del mechero
hasta que el hilo del extremo del asa se quede totalmente incandescente.

Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con el hilo incandescente las
colonias podemos matar al microorganismo.
Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para comprobar que éste está
frío.

A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos sobre la gota de agua
destilada.
Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo material debe ser esterilizado antes
de volver a ser guardado. A continuación, lo que tenemos que hacer es fijar la muestra, la cual se
puede fijar con metanol o se puede fijar con calor. En este caso utilizaremos la fijación por calor.
Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por encima de la llama del mechero,
levantando constantemente la muestra para que no se nos queme el tiempo suficiente para que la
muestra quede totalmente seca y por lo tanto fijada.

Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.

Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto con diferentes tipos
de tinciones para poder visualizar cada microorganismo (bacteria) al microscopio.
Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de tinciones y el porta
con la muestra.

Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer lugar el cristal violeta, en
segundo lugar el lugol,

usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede estar formado por una mezcla de alcohol,
alcohol-acetona y por diferentes mezclas),
y por último la safranina.

¿Qué va a ocurrir? Las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas tienen diferente
grosor en el peptidoglicano de su pared celular, de tal forma que cuando echemos el cristal
violeta se nos van a teñir tanto las gram positivas como las gram negativas. El lugol lo que hará,
será fijar el colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla decolorante), lo
que haremos será eliminar el cristal violeta de las gram negativas y por último, la safranina, va a
teñir solamente a las gram negativas que son las que están decoloradas. Por lo tanto, las gram
positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina (color fucsia).
El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto, luego lavar con
el frasco lavador. A continuación, añadir Lugol durante un minuto, volver a lavar con el frasco
lavador. Después, añadir durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o alcohol-acetona…,
lavar la muestra con el frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina durante un minuto y lavar
con agua destilada.
Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta.

Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con agua destilada.

Ahora vamos a añadir el Lugol justo por encima de la zona de la muestra y esperamos otro
minuto.
Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A continuación decoloraremos la
muestra con el alcohol. Para conseguirlo hay que incorporar el porta de un lado para ir añadiendo
el alcohol y que vaya resbalando para abajo. Cada protocolo estipula un tiempo pero con 15
segundos aproximadamente la muestra quedará decolorada.

Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua destilada para que el alcohol no siga
actuación, porque si no paramos el proceso de decoloración a tiempo, todas las bacterias
quedarían decoloradas, no solamente las gram negativas y por lo tanto no podríamos diferenciar
unas de otras.

Por último, aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos actuar durante otro minuto.

Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua destilada y dejaríamos que la
muestra se secara.

Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.

Qué importancia tienen los mohos y las levaduras en la práctica de
laboratorio?

Son muy importante en la industria alimentaria ya que muchos de los alimentos que se consumen
no se considerarían como tales sin la presencia de determinados microorganismos. El vino, el
pan, la cerveza, el yogur o el queso dependen de bacterias, levaduras u hongos, es decir,
microorganismos, para que se puedan elaborar.

También es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que,
al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de
prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos,
así como el uso de materia prima inadecuada.
Bibliografía

1. [Link]
2. [Link]
gram/
3. [Link]
alimentos/#:~:text=Los%20hongos%20y%20levaduras%20son,yogurt%2C%20cerveza%
2C%20entre%20otros.
4. [Link]
grampositivas/introducci%C3%B3n-a-las-bacterias-
grampositivas#:~:text=Las%20bacterias%20grampositivas%20se%20clasifican,de%20ro
jo%2C%20son%20las%20gramnegativas.

2019
5. |
6. Karen Steward PhD
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