UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA
Departamento académico de biología
Título: Preparación de una muestra bacteriana y tinción simple
Informe nº: 1
Integrantes:
● 20200156_Avendaño Colonia, Isaura Estefania
● 20211637_Ballena Calvay, César A.
● 20220581_León Ulloa, Sara Mònica
● 20220591_ Rojas Rojas, Italo Angel
Mesa nº: 6
Fecha de entrega de informe: Miércoles 3 de abril del 2024.
Horario: Miércoles 15:00 pm a 17:00 pm
2024
I. INTRODUCCIÓN
La tinción simple es un método fundamental en microbiología que permite la observación de la
morfología y la estructura celular básica de las bacterias. Consiste en aplicar un único colorante a la
muestra bacteriana, lo que resalta características específicas de las células bacterianas y facilita su
observación bajo el microscopio óptico.
En esta introducción, se explorará el proceso de preparación de una muestra bacteriana y la
aplicación de la técnica de tinción simple. Desde la recolección de la muestra hasta la observación
microscópica, cada paso clave en el proceso, destacando la importancia de la precisión y la técnica
adecuada para obtener resultados fiables y significativos. A lo largo de este proceso, se pondrá
énfasis en la importancia de la esterilidad, la manipulación cuidadosa de las muestras y el uso
adecuado de los colorantes para garantizar la integridad de los datos y la interpretación precisa de las
observaciones microscópicas.
En síntesis, la preparación de una muestra bacteriana y la técnica de tinción simple son
fundamentales en el estudio de la microbiología, permitiendo a los investigadores explorar la
morfología y la estructura celular de las bacterias, lo que a su vez contribuye a nuestro entendimiento
más profundo de estos microorganismos y su papel en el mundo que nos rodea.
II. OBJETIVOS
- Aprender a preparar una muestra bacteriana en un portaobjetos, siguiendo los
protocolos de bioseguridad
- Teñir adecuadamente cada muestra para su posterior visualización en el
microscopio.
III. MARCO TEÓRICO
3.1. Colorantes
3.1.1. Azul de metileno: El azul de metileno es un compuesto químico con una coloración azul
profundo, que se presenta en forma de cristales o polvo soluble en agua. Su fórmula química es
C₁₆H₁₈N₃S Cl y es un derivado sintético del compuesto trifenilmetano, preparado por primera vez en
1876 por Heinrich Caro (Ahmad I, Aqil, F 2008). En la microbiología, se utiliza principalmente
como colorante en diversas técnicas de tinción.
A pesar de sus múltiples usos, el azul de metileno debe manejarse con precaución debido a sus
propiedades tóxicas en altas concentraciones (DC Fine chemicals, 2022). Se recomienda seguir las
normativas y protocolos de seguridad al trabajar con este compuesto. Además, debe almacenarse en
recipientes bien sellados, protegido de la luz y en un lugar fresco y seco. En resumen, el azul de
metileno es un compuesto versátil con una amplia gama de aplicaciones en medicina, microbiología,
industria textil y tratamiento de agua. Sin embargo, su uso debe realizarse con precaución y
respetando las normativas de seguridad correspondientes.
Figura 1. Estructura química del azul de metileno.
Fuente: [Link]
3.1.2. Cristal violeta: El cristal violeta es un colorante sintético que pertenece a la familia de los
colorantes de triarilmetano. Químicamente, su nombre sistemático es cloruro de hexametil
pararosanilina. Su fórmula química es C₂₅H₃₀ClN₃ y su masa molar es aproximadamente de 407.98
g/mol. A temperatura ambiente, se presenta en forma de cristales de color violeta oscuro.
Se utiliza comúnmente en microbiología, especialmente en la técnica de tinción de Gram. En esta
técnica, el cristal violeta se utiliza como el primer colorante en el proceso de tinción diferencial para
distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas (Torres & Morales, 2012). Las bacterias
Gram positivas retienen el cristal violeta, mientras que las bacterias Gram negativas lo pierden
durante el proceso de tinción. El cristal violeta puede ser tóxico en altas concentraciones y puede
causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias, además un estudio en ratones demostró un
potencial carcinogénico relacionado con la dosis en varios órganos diferentes (Littlefield et al, 1985)
por lo tanto, se recomienda manejarlo con precaución y seguir las normas de seguridad establecidas
al trabajar con este compuesto. Además, debe almacenarse en recipientes bien sellados, protegido de
la luz y en un lugar fresco y seco.
Figura 2. Estructura química del cristal violeta
Fuente: CAS: 548-62-9|Crystal Violet|Alfa químico
3.1.3. Fucsina: La fucsina es un colorante básico que pertenece a la familia de los colorantes de
triarilmetano. La fucsina fue creada por primera vez por Jakub Natanson en 1856 a partir de anilina y
1,2-dicloroetano (Cooksey & Dronsfield, 2009). Existen varias formas de fucsina, pero una de las
más comunes es la fucsina básica, también conocida como fucsina básica de Rosanilina.
Químicamente, la fucsina básica es una sal de cloruro de una base de rosanilina. Su fórmula química
varía según el tipo de fucsina, pero para la fucsina básica es C₂₀H₁₉N₃·Cl. En microbiología, la
fucsina se utiliza en técnicas de tinción diferencial, como la tinción de Ziehl-Neelsen para la
detección de bacterias ácido-alcohol resistentes, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Corrales
& Caycedo, 2020), el agente causal de la tuberculosis. La fucsina también se utiliza en la tinción de
tejidos conectivos, como el tejido conjuntivo y el colágeno, en muestras histológicas.
Figura 3. Estructura química de la fucsina básica
Fuente: Fucsina básica (C.I. 42510) | DC Fine Chemicals
IV. MATERIALES/PROCEDIMIENTOS
Parte I: Fijación de la muestra bacteriana
Los materiales usados:
- Muestras conteniendo bacterias
- Asa de kolle
- Làmina portaobjeto
- Mechero de alcohol
- Piseta de agua
Se siguieron estos pasos:
Figura 4. Esquema usado para preparar una muestra fija de bacterias.
Fuente: Elaboración propia (2024).
Parte II: Tinción simple con colorantes básicos
Los materiales usados:
- Làminas fijadas de microorganismos
- Aceite de inmersión
- Colorantes básicos (azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina)
- Papel secante
- Piseta de agua
- Soporte para tinción
Se siguieron estos pasos:
Figura 5. Esquema usado para hacer la tinción simple de una muestra fija de bacterias usando un
colorante básico.
Fuente: Elaboración propia (2024).
Los tiempos de tinción fueron los siguientes:
Azul de metileno: 60 s
Cristal violeta: 10 s
Carbolfucsina: 5 s
V. OBSERVACIONES Y/O RESULTADOS
G.A = 1000 x
Forma: cocos
Agrupación: racimo (estafilococos)
Gènero: Staphylococcus sp.
Colorante: Azul de metileno
G.A = 1000 x
Forma: alargado, abastonado (bacilo)
Agrupación: en cadena (estreptobacilo)
Gènero: Bacillus sp.
Colorante: Cristal de violeta
G.A = 1000 x
Forma: cocobacilo
Agrupación: no tiene
Gènero: [Link]
Colorante: Fucsina
VI. DISCUSIONES
Para la visualización de las bacterias mediante el microscopio, se emplean
colorantes. Es así que para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han
desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los
microorganismos (Lopez et al, 2013). Asimismo, Novais (2010) agrega que la
tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su
entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada.
Con el uso del azul de metileno, cristal de violeta y fuscina, se logró la tinción,
mediante la metodología ya explicada, de Staphylococcus sp., Bacillus sp. y [Link],
respectivamente. Previamente se tuvo en consideración los tiempos de reacción de
cada colorante para asegurar la correcta tinción de cada tipo de bacteria, de tal modo,
Novais (2010) menciona que el tiempo de decoloración es clave para un resultado
correcto.
VII. CONCLUSIONES
A. Durante el proceso de preparación de las muestras bacterianas en portaobjetos, se
siguieron estrictamente los protocolos de bioseguridad para minimizar el riesgo de
contaminación cruzada y proteger la integridad del personal manipulador. Se
observó que la correcta técnica de asepsia y el manejo adecuado de los materiales
contribuyeron significativamente a la prevención de la contaminación.
B. Se logró teñir las muestras bacterianas de Bacillus sp , Staphylococcus sp y E. coli
sp de manera efectiva mediante la técnica de tinción simple. La aplicación adecuada
de los colorantes (azul de metileno, cristal violeta y fucsina respectivamente)
permitió distinguir claramente las células bacterianas bajo el microscopio óptico, lo
que facilitó su visualización y estudio morfológico.
C. Se observaron diferencias en la morfología celular entre las tres cepas bacterianas,
lo que resalta la importancia de la tinción en la identificación microscópica de
microorganismos.
VIII. CUESTIONARIO
1) ¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en bacterias?
Las bacterias pueden establecer una variedad de asociaciones en su [Link] tipos
importantes de interacción ecológica entre especies son mutualismo, comensalismo y
parasitismo. Las bacterias pueden participar en los tres tipos de interacción.
● Mutualista: Este tipo de asociación beneficia tanto a las bacterias como al organismo
huésped. Por ejemplo, las bacterias fijadoras de nitrógeno, como Rhizobium,
establecen una relación simbiótica con las plantas leguminosas, proporcionándoles
nitrógeno fijado y recibiendo nutrientes y protección a cambio.
● Parasitismo: Algunas bacterias son patógenas y causan enfermedades en sus
hospederos. Por ejemplo, patógenos como E. coli o Salmonella, establecen
asociaciones parasitarias con humanos y otros animales, lo que puede resultar en
enfermedades graves o incluso mortales.
● Comensalismo: En este tipo de asociación, una especie se beneficia mientras que la
otra no se ve afectada significativamente. Por ejemplo, algunas bacterias, como
Staphylococcus epidermidis, pueden residir en la piel humana sin causar daño,
simplemente aprovechando el ambiente sin influir en el huésped.
2) ¿En qué rango de tamaños se definen las bacterias?
Las bacterias son microorganismos unicelulares que generalmente abarcan un rango de
tamaño de 1 a 10 μm. que oscila entre 0.5 y 5 μm de longitud y entre 0.2 y 2 μm de ancho.
Esto las hace demasiado pequeñas para ser visibles a simple vista y requieren de
microscopios para su observación. Sin embargo, algunas bacterias pueden ser más pequeñas
o más grandes que este rango, dependiendo de la especie y las condiciones ambientales.
3) ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?
Las formas bacterianas más comunes son los cocos (forma esférica), los bacilos (forma
alargada) y espirilos (forma de espirales). Los cocos pueden agruparse de dos (diplococos),
formar cadenas (estreptococos), agruparse de cuatro para formar un cuadrado (tètradas),
agruparse de ocho para formar cubos (sarcinas) o agruparse en forma de racimos
(estafilococos). Los bacilos dependiendo de su forma podrían ser bacilos si tienen la forma
alargada o cocobacilos si es que son entre alargados y redondos. Los bacilos se agrupan de
diferente manera, algunos se agrupan de dos (diplobacilos), otros forman cadenas
(estreptobacilos), también están los bacilos que crecen formando fibras (forma filamentosa)
y los que tienen la forma alargada pero con los extremos más delgados (bacilos fusiformes)
(Universidad Central de Venezuela, s.f.)
4) ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?
Según González, Elizalde, Cortés & Orduña (2020), en la tinción directa se colorea la célula
de interés y solo está permanece coloreada luego del lavado, es decir, al finalizar la tinción
sólo se observan coloreadas las bacterias màs no el fondo. Por otro lado, la tinción negativa
se refiere a un tinte que se impregna en el fondo más no en el microorganismo, por ello, al
observarse la muestra en el microscopio se ve un fondo oscuro y unas figuras brillantes.
5) ¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes
empleados?
Para el uso de colorantes como Azul de metileno, Cristal violeta y Fucsina, se debe tomar en
cuenta cómo interaccionan con las células bacterianas. Corrales y Caycedo (2020)
mencionan que los colorantes constan por un grupo químico funcional cromóforo y un
auxocromo, siendo el primero el responsable del color y el segundo, facilitador de la
interacción del radical cromóforo con la molécula que va a teñir. Asimismo, otro factor
relevante es el tiempo de reacción del colorante. Para los tres colorantes empleados en el
presente trabajo se emplearon diferentes tiempos. Estas variaciones influyen en la velocidad
y eficacia de la obtención de los resultados en el análisis microbiológico de las células
bacterianas. Unos colorantes necesitarán de más tiempo, mientras que otros proporcionaran
resultados más rápidos. De igual forma, la reactividad de los colorantes puede estar sujeta a
la sensibilidad de sus componentes con los de las células bacterianas, como el ADN, lípidos
y proteínas. Garibaldi (2009) sostiene que precisamente el azul de metileno y cristal de
violeta son los colorantes básicos que se combinan fuertemente con los ácidos nucleicos y
polisacáridos ácidos como las envueltas externas de las bacterias.
6) ¿Por qué usamos aceite de cedro o inmersión?
El aceite de inmersión se utiliza en microscopía para mejorar la resolución y la claridad de
las imágenes, especialmente con objetivos de alta potencia. Ayuda a reducir la dispersión de
la luz al tener un índice de refracción similar al del vidrio del objetivo, lo que minimiza las
aberraciones esféricas y aumenta la apertura numérica efectiva del objetivo. Esto mejora la
claridad, el contraste y la capacidad de distinguir detalles finos en la muestra
7) ¿ Cómo funciona el lente de inmersión?
El lente de inmersión es un componente óptico diseñado para ser utilizado con aceite de
inmersión en microscopía. Se coloca cerca de la muestra y tiene un índice de refracción
similar al del aceite, lo que minimiza las aberraciones y aumenta la resolución al mejorar la
transmisión de luz a través de la muestra. Esto permite una mejor visualización de detalles
finos en la muestra observada.
IX. BIBLIOGRAFÍA:
DC Fine Chemicals (2022), Ficha de datos de seguridad - azul de metileno,
[Link]
Vicente Torres-Zúñiga, Omar G. & Morales-Saavedra (2012), Structural and nonlinear optical
properties of Crystal-Violet octupolar dyes dispersed in bulk SiO2-sonogel optical-glasses,
[Link]
Lucía Constanza Corrales Ramírez & Liliana Caycedo Lozano (2020), Principios físico químicos de
los colorantes utilizados en microbiología, [Link]
Ahmad I, Aqil F (2008). New Strategies Combating Bacterial Infection, Editorial: Wiley-Blackwell
Chris Cooksey & Alan Dronsfield (2009), The battle for magenta,
[Link]
Littlefield, N.A.; Blackwell, B.N.; Hewitt, C.C.; Gaylor, D.W. (1985), "Chronic toxicity and
carcinogenicity studies of gentian violet in mice", doi:10.1016/0272-0590(85)90172-1
Corrales, L., Caycedo, L. (2020). Principios fisicoquímicos de los colorantes utilizados en
microbiología. [Link]
Garibaldi, P. (2009). Tinción y observación de microorganismos. Universidad Tecnológica Nacional.
[Link]
Universidad Central de Venezuela (s.f.) Morfología y estructura de los microorganismos. Encontrado
en: [Link]
González, Elizalde, Cortés & Orduña (2020) Las tinciones básicas en el Laboratorio de
Microbiología: un enfoque grá[Link] Nacional Autónoma de México. Encontrado en:
[Link]
[Link]
Bacillus cereus. (s.f.). Portal De Salud De La Junta De Castilla Y León. Encontrado en:
[Link]
ogicos/intoxicaciones/bacillus-cereus#:~:text=Bacillus%20cereus%20es%20una%20bacteria,ocasion
a%20diarrea%20y%20dolor%20abdominal.
National Library of Medicine. (s.f.). Infecciones por estafilococo. Encontrado en:
[Link]
on%20un%20grupo,de%20las%20infecciones%20por%20estafilococo.
Sherris, J. C., Champoux, J. J., Corey, L., Neidhard, E. C., Plorde, J. J., Ray, C. G., & Ryan, K. J.
(1993). Sherris. Microbiología médica (6ta
ed.).[Link]
Novais, J. (2010). Técnicas básicas de Microbiología. Departamento de Microbiología III. Facultad
de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense. España.
Lopez, L., Hernandez, M., Colin, C., Ortega, S., Ceron, G., Franco, R. (2014). Las tinciones básicas
en el laboratorio de microbiología. [Link]
