TEMA 8.

LA CLONACIÓN
1.LOS MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR:
La Clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de un fragmento de ADN
genómico o ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante.

PROCESOS DE LA CLONACIÓN(FASES):

1.INSERCIÓN DEL FRAGMENTO DE ADN que se quiere amplificar, en una molécula portadora o
VECTOR.
2.INTRODUCCION DEL VECTOR en una célula HOSPEDADORA.
3. SELECCIÓN Y MULTIPLICACIÓN en cultivo de las CEL.QUE PORTAN EL ADN RECOMBINANTE.
4.LA RECUPERACIÓN del fragmento amplificado.

Plásmido o vector recombinante: Es un vector de clonación que contiene un inserto de ADN.

VENTAJAS DE CLONACIÓN MOLECULAR:

 Obtención de cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
 Clonación de secuencias de ADN de mayor tamaño que en la PCR (millones de pb).
 Se puede clonar el genoma entero de un organismo, lo que permite guardarlo y crear
librerías genómicas.
 Producción de proteínas y hormonas de interés.
 Obtención de organismos transgénicos.
 Terapia génica.

COMPONENTES DE LA CLONACIÓN:
 VECTOR DE CLONACIÓN: son moléculas de ADN que pueden replicarse
autónomamente en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN extraño,
sin perder esa capacidad de replicación autónoma.
 CÉLULA HOSPEDADORA: aquellas que incorporan el vector de clonación y lo
multiplican por replicación.

CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN:

Requisitos que tiene que tener una molécula de ADN para que pueda utilizarse como vector:

 Origen de replicación: ORI que le permita replicarse en la célula huésped.

 Sitio de inserción de ADN extraño o Polylinker: secuencia diana de enzimas de
restricción, presentes una única vez en todo el vector de clonación.
 Marcador de selección: genes de resistencia a antibióticos o genes que codifican
enzimas. Nos permiten seleccionar las células que portan el vector de clonación de
aquellas que no lo portan, es decir, permite seleccionar células transformadas con
el vector de las células NO transformadas).
 Marcador de identificación: genes letales o genes que codifican proteínas
fluorescentes. Permiten identificar las células transformadas que portan un vector
recombinante, de aquellas que no tienen vector recombinante.

TIPOS DE VECTORES DE CLONACIÓN:

 Plásmidos: Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico con
capacidad autónoma de replicación. Más utilizados: pBR322 y pUC18.

 Bacteriófagos o fagos: virus que infectan bacterias. (fago lambda)

INSERTOS DE 20Kb
Ciclo lítico: se adueña del control de la maquinaria metabólica de la célula infectada,
replica su ADN vírico, la síntesis de proteínas víricas, el empaquetamiento de nuevos
virus y la lisis celular.
En el caso del fago lambda, inserta su ADN en el cromosoma bacteriano en lo que se
denomina ciclo lisogénico.
 Cósmidos: Fago ʎ + plásmido
 Fagémidos: Plásmido + ori fago M13
 Cromosomas artificiales:
 Cromosomas artificiales bacterianos (BAC). INSERTOS 300K
 Cromosomas artificiales de levaduras (YAC). INSERTOS 1Mb

BAC: Son fragmentos grandes con estructura de un cromosoma artificial

bacteriano (basado en el plásmido f de E.Col)i. Contiene:
 Genes que controlan la replicación y copias del plásmido.
 ORI (origen de replicación).
 Gen de resistencia al cloranfenicol
 Polylinker (interior del gen LacZ)

YAC: Estructura de un cromosoma artificial de levadura. contiene:

 un origen (ori)
 un centrómero(cen),
 2 secuencias teloméricas (TEL),
 2 marcadores de selección (A y B)
 Polylinker (interior de un gen de identificación)

CELULA HOSPEDADORA
Las células hospedadoras(CH) son aquellas en las que se introduce el vector de clonación.
La célula Hospedadora con el vector de clonación se cultiva en medios de cultivo adecuados en
los que se multiplica, dando lugar a células hijas (los clones).

 Células hospedadoras BACTERIANAS(bacterias): son las más utilizadas para clonar

plásmidos, fagos y cósmidos, por la escasa complicación técnica de su manipulación,su
gran versatilidad y la rapidez con que crecen. Ej. coli, Bacillus y Streptomyces.
 Células hospedadoras EUCARIOTAS:
 Levaduras. Para clonar YAC y plásmidos de levaduras.
  Células vegetales y animales. Para obtener organismos transgénicos.
 Células animales: se usan vectores víricos.
-Células de insectos: vectores víricos como baculovirus
-Células de mamíferos: vectores víricos como retrovirus.

2.FASES DE LA CLONACIÓN:
- Fase I: creación de un vector recombinante.
- Fase II: Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
- Fase III. Selección e identificación de los clones que portan el vector recombinante.

FASE I CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE: Aquel que contiene ADN extraño

1.Preparación del ADN que se va a clonar para obtener extremos cohesivos lo tratamos con
enzimas de restricción.
2. Preparación del vector de clonación. (misma enzima de restricción)
3. Inserción del ADN extraño en el vector: incubación en concentraciones adecuadas
del ADN y el vector de clonación y unión por ADN Ligasa(Ligación). Se van a formar:

 vectores recombinantes: El que tiene el inserto de ADN en su interior(el que

queremos clonar) en el sitio de inserción(o Polylinker).Pero también hay productos
que van a ser introducidos en células, que hay que eliminarlos en fases posteriores:
-Vectores recircularizados sin ADN extraño.(vector no recombinante).
-Moléculas de ADN extraño unidas entre sí.
-Vectores unidos entre sí.
-Combinaciones de vector y ADN extraño con distintos grados de complejidad, etc.

FASE II INTRODUCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA: Existen varios métodos

para introducir el vector recombinante en células hospedadoras (depende del tipo de vector y
de la cel empleada)

 Transformación bacteriana: consiste en la captación e internacionalización por parte

de una bacteria, de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo.
 Transfección: similar a la transformación bacteriana, pero en CH eucariotas(animales)
 Transducción: consiste en la introducción de material genético extraño en una célula
por la acción de un virus.
 Electroporación: consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos a una mezcla de células
hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución. Estos pulsos
aumentan la permeabilidad de la membrana celular, permitiendo el paso de los
vectores al interior de la célula.

FASE III SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES:

Una vez terminado el proceso de introducción del vector en la célula hospedadora, se obtiene
una mezcla con tres tipos de células:
 Células no transformadas (no han captado ninguna molécula de ADN extraño, ni
ningún vector de clonación)
 Células transformadas con vector recombinante. (portan el vector rec específico)
 Células transformadas con vector NO recombinante (Sin ADN) o alguna molécula
de ADN no deseada producida durante la ligación.
Es necesario un proceso de selección e identificación de los clones recombinantes, que serán
aquellos que porten el vector recombinante específico.
Este proceso de selección está condicionado por los marcadores genéticos que porta el
vector:
 Genes de resistencia a antibióticos
 Enzimas que producen reacciones coloreadas (Estrategia cromogénica).
 Proteínas fluorescentes (GFP)
 Genes letales. Utiliza vectores con un gen de resistencia a un antibiótico(marcador de
selección) y un un gen letal para las bacterias con un polylinker en su
interior(marcador de identificación)
GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS:
Sistema de detección que se emplea dos genes de resistencia a antibióticos. El Polylinker
se encuentra en uno de los dos genes (Ampicilina o Tetraciclina)
EJ: El Polylinker está en la Tetraciclina.Al introducir el ADN en el gen de resistencia al
antibiótico(tetraciclina), deja de funcionar el gen, es decir, esa célula deja de ser resistente
a la tetraciclina, ya que su secuencia está interrumpida por el inserto de ADN.

Cuando se introduce este vector en bacterias sensibles a la ampicilina y la tetraciclina se

obtienen 3 Tipos de células:
 Células no transformadas sensibles a la ampicilina y la tetraciclina.(no crecen en
Amp. y Tetrac)
 Células transformadas con el vector recombinante resistentes a la ampilicina y
sensibles a la tetraciclina. (crecen con Amp. y no crecen en medio con Tetrac.)
 Células transformadas con el vector NO recombinante resistentes a la ampicilina
y la tetraciclina. (crecen en medio con Amp. y Tetrac).

ESTRATEGIA CROMOGÉNICA
selección y la identificación se realizan simultáneamente, utilizando:
 Gen de resistencia a un antibiótico.
 Gen que produce una enzima de digestión. (Ej.Gen lacZ, enzima digiere la lactosa)
Se combinan:
 Bacterias hospedadoras lactosa negativas o lac – (No digieren la lactosa y sensibles a
la ampicilina)
 Vectores que contienen un gen de resistencia a la ampicilina y el gen LacZ con un
polylinker en su interior.
Cuando se introduce el vector en las bacterias, se obtiene 3 tipos de células:
 Células no transformadas, Sensible(no crece) en ampicilina y no digieren lactosa.
 Células transformadas con el vector recombinante, Resistente en Amp (AZULES) y no
digieren lactosa.
 Células transformadas con el vector NO recombinante, crecen en Amp (BLANCAS) y
digieren lactosa

PROTEÍNAS FLUORESCENTES (GFP):

vectores con un gen de resistencia a un antibiótico para realizar la selección y un gen que
codifica una proteína verde fluorescente(GFP) para la identificación, ya que el polylinker se
incluye en el gen de la proteína fluorescente, de manera que los insertos de ADN inactivan el
gen. La identificación se realiza iluminando las placas de cultivo con luz ultravioleta q produce
fluorescencia si tienen el gen GFP.
  Células no transformadas, No crecen(Sensibles) en Antibióticos y No fluorescentes.
 Células transformadas con vec recombinante, Resistente(crece) en Antibióticos y No
son fluorescentes.
 Celulas transformadas con vec NO recombinante, Resistente(crece) en Antibióticos y
son fluorescentes.

GENES LETALES:
vector con gen de resistencia a un antibiótico (marcador de selección) y un gen letal que
codifica una proteína letal para las bacterias(marcador de identificación) con un polylinker en
su interior.
En los vectores recombinantes la proteína letal no es funcional porque la secuencia génica
queda interrumpida por el inserto de ADN que queremos clonar.
 Células no transformadas, Sensible(no crece) a antibióticos
 Células Transf. con vector recombinante, crecen en el medio con antibiótico.
 Células Transf. con vector NO recombinante, no crecen en el medio con antibiótico.