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Iso 16140-3

La norma establece el protocolo para la verificación de métodos de referencia y alternativos validados en un único laboratorio. Describe los principios generales de verificación de métodos cualitativos y cuantitativos, incluyendo la verificación de la implementación y de artículos alimentarios. Además, detalla el protocolo técnico para la verificación de métodos cualitativos.

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Norma Española

UNE-EN ISO 16140-3

Diciembre 2021
Versión corregida, Enero 2022

Microbiología de la cadena alimentaria

Validación de métodos
Parte 3: Protocolo para la verificación en un único
laboratorio de métodos de referencia y de métodos
alternativos validados
(ISO 16140-3:2021)

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

CTN 34 Productos alimentarios, cuya secretaría
desempeña FIAB.

Asociación Española
de Normalización
Génova, 6 - 28004 Madrid
915 294 900
[email protected]
www.une.org

Microbiología de la cadena alimentaria

Validación de métodos
Parte 3: Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de
referencia y de métodos alternativos validados
(ISO 16140-3:2021)

Microbiology of the food chain. Method validation. Part 3: Protocol for the verification of reference
methods and validated alternative methods in a single laboratory (ISO 16140-3:2021).

Microbiologie de la chaîne alimentaire. Validation des méthodes. Partie 3: Protocole pour la

vérification dans un seul laboratoire de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées
(ISO 16140-3:2021).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 16140-3:2021, que
a su vez adopta la Norma Internacional ISO 16140-3:2021.

Esta versión corregida de la Norma UNE-EN ISO 16140-3:2021 incorpora las siguientes correcciones:

– Se sustituye “tipo/s de (alimento)” por “tipo/s (de alimento)”

– Se sustituye “categoría de (alimento)” por “categoría (de alimento)”

– Se sustituye “categoría/s (alimento/s)” por “categoría/s (de alimento/s)”

– Se sustituye “artículo/s (alimento/s)” por “artículo/s (alimentario/s)”

– Figuras C.1, C.2, D.4 y D.5 se sustituye “overnight” por “durante toda la noche”

– Figura D.3 se sustituye “Cultivo de 16 h a 24 h” por “Cultivo durante toda la noche”

– Figura F.2 se sustituye “un rango limitado de alimentos” por “por una gama limitada de alimentos”

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
[email protected]
www.une.org

© UNE 2022
Prohibida la reproducción sin el consentimiento de UNE.
Todos los derechos de propiedad intelectual de la presente norma son titularidad de UNE.

Este documento ha sido adquirido por UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER a través de la suscripción a AENORmás.
Para uso en red interna se requiere de autorización previa de AENOR.
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN ISO 16140-3
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Febrero 2021

ICS 07.100.30

Versión en español

Microbiología de la cadena alimentaria

Validación de métodos
Parte 3: Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos
de referencia y de métodos alternativos validados
(ISO 16140-3:2021)
Microbiology of the food chain. Method Microbiologie de la chaîne alimentaire. Mikrobiologie der Lebensmittelkette.
validation. Part 3: Protocol for the Validation des méthodes. Partie 3: Verfahrensvalidierung. Teil 3:
verification of reference methods and Protocole pour la vérification dans un Arbeitsvorschrift für die Verifizierung
validated alternative methods in a seul laboratoire de méthodes de von Referenz- und alternativen
single laboratory (ISO 16140-3:2021). référence et de méthodes alternatives Verfahren in einem einzelnen Labor
validées (ISO 16140-3:2021). (ISO 16140-3:2021).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2020-12-28.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión de CEN/CENELEC, tiene el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia,
Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta,
Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, República de Macedonia del
Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium

© 2021 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

Índice

Prólogo europeo .............................................................................................................................6

Declaración.......................................................................................................................................6

Prólogo...............................................................................................................................................7

0 Introducción ....................................................................................................................8
0.1 La serie de Normas ISO 16140 ...................................................................................8
0.2 Verificación frente a validación .............................................................................. 12

1 Objeto y campo de aplicación .................................................................................. 15

2 Normas para consulta ................................................................................................ 15

3 Términos y definiciones ............................................................................................ 16

4 Principios generales de verificación de métodos cualitativos

(detección) y métodos cuantitativos ..................................................................... 19
4.1 Generalidades .............................................................................................................. 19
4.2 Verificación de la implementación ........................................................................ 20
4.3 Verificación de artículos (alimentarios) .............................................................. 20
4.4 Requisitos para la verificación de la implementación y verificación
de artículos (alimentarios) ...................................................................................... 21
4.5 Características de rendimiento .............................................................................. 24

5 Métodos cualitativos. Protocolo técnico para la verificación ........................ 25

5.1 Determinación del LOD50 estimado (eLOD50) ..................................................... 25
5.2 Diseño experimental .................................................................................................. 25
5.3 Selección de artículos (alimentarios) ................................................................... 26
5.4 Contaminación artificial............................................................................................ 26
5.4.1 Selección de cepas ....................................................................................................... 26
5.4.2 Inoculación de porciones para análisis ................................................................ 27
5.5 Evaluación de resultados .......................................................................................... 29
5.5.1 Determinación de eLOD50 utilizando el protocolo 1......................................... 29
5.5.2 Determinación de eLOD50 utilizando el protocolo 2......................................... 31
5.5.3 Uso del protocolo 3 ..................................................................................................... 33
5.6 Límites de aceptabilidad ........................................................................................... 34
5.7 Análisis de las causas ................................................................................................. 34

6 Métodos cuantitativos. Protocolo técnico de verificación .............................. 35

6.1 Determinación de la desviación estándar de la reproducibilidad
intralaboratorio........................................................................................................... 35
6.1.1 Generalidades .............................................................................................................. 35
6.1.2 Diseño experimental .................................................................................................. 35
6.1.3 Selección del artículo (alimentario) ...................................................................... 37
6.1.4 Contaminación natural .............................................................................................. 37
6.1.5 Contaminación artificial............................................................................................ 37
6.1.6 Evaluación de resultados .......................................................................................... 39
6.1.7 Límite de aceptabilidad ............................................................................................. 40
6.1.8 Análisis de las causas ................................................................................................. 42

6.2 Determinación de la desviación estimada (eBias) ............................................ 42

6.2.1 Generalidades .............................................................................................................. 42
6.2.2 Diseño experimental .................................................................................................. 42
6.2.3 Selección de artículos (alimentarios) ................................................................... 43
6.2.4 Contaminación artificial............................................................................................ 43
6.2.5 Evaluación de resultados .......................................................................................... 45
6.2.6 Límite de aceptabilidad ............................................................................................. 45
6.2.7 Análisis de las causas ................................................................................................. 46

7 Métodos alternativos validados de confirmación y tipaje. Protocolo

de verificación técnica ............................................................................................... 47
7.1 Generalidades .............................................................................................................. 47
7.2 Verificación de la implementación ........................................................................ 47
7.3 Diseño experimental .................................................................................................. 47
7.3.1 Generalidades .............................................................................................................. 47
7.3.2 Selección de cepas ....................................................................................................... 48
7.4 Evaluación de resultados .......................................................................................... 48
7.5 Límite de aceptabilidad ............................................................................................. 49
7.6 Análisis de causa principal ....................................................................................... 49

8 Resumen de los límites de aceptabilidad aplicables a la verificación de

métodos validados ...................................................................................................... 49

Anexo A (Informativo) Clasificación de categorías (de alimentos) y

combinaciones objeto de estudio sugeridas para
estudios de verificación ............................................................ 51

Anexo B (Informativo) Recomendaciones sobre cómo elegir un artículo(s)

(alimentario(s)) difícil(es) para la verificación de
artículos (alimentarios) ........................................................... 69

Anexo C (Informativo) Verificación del método cualitativo. Ejemplo .................... 72

Anexo D (Informativo) Verificación del método cuantitativo. Ejemplo ................. 81

Anexo E (Informativo) Verificación del método alternativo validado de

confirmación o tipaje. Ejemplos............................................. 86

Anexo F (Normativo) Protocolo para la verificación en un solo

laboratorio de métodos de referencia no validados........ 90

Bibliografía .................................................................................................................................... 98

Prólogo europeo

El texto de la Norma EN ISO 16140-3:2021 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34 Productos
alimenticios en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 463 Microbiología de la cadena alimentaria,
cuya Secretaría desempeña AFNOR.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de agosto de 2021, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de agosto de 2021.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN no es responsable de la identificación de dichos derechos de patente.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, República de Macedonia del Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración

El texto de la Norma ISO 16140-3:2021 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 16140-3:2021
sin ninguna modificación.

Prólogo

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos

nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de elaboración de las Normas
Internacionales se lleva a cabo normalmente a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo
miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho
de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no
gubernamentales, vinculadas con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con
la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los temas de normalización electrotécnica.

En la Parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar este
documento y aquellos previstos para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota
de los diferentes criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Este
documento ha sido redactado de acuerdo con las reglas editoriales de la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC
(véase www.iso.org/directives).

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan
estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de alguno o
todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente identificado durante el
desarrollo de este documento se indicarán en la Introducción y/o en la lista ISO de declaraciones de
patente recibidas (véase www.iso.org/patents).

Cualquier nombre comercial utilizado en este documento es información que se proporciona para
comodidad del usuario y no constituye una recomendación.

Para una explicación de la naturaleza voluntaria de las normas, el significado de los términos específicos
de ISO y las expresiones relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como la información
acerca de la adhesión de ISO a los principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a
los Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC), véase www.iso.org/iso/foreword.html.

Este documento ha sido preparado por el Comité Técnico ISO/TC 34, Productos alimenticios, Subcomité
SC 9, Microbiología, en colaboración con el Comité Europeo de Normalización (CEN) Comité Técnico
CEN/TC 463, Microbiología de la cadena alimentaria, conforme al acuerdo de cooperación técnica entre
ISO y CEN (Acuerdo de Viena).

En el sitio web de ISO se puede encontrar un listado de todas las partes de la serie de Normas ISO 16140.

Cualquier comentario o pregunta sobre este documento deberían dirigirse al organismo nacional de
normalización del usuario. En www.iso.org/members.html se puede encontrar un listado completo de
estos organismos.

0 Introducción

0.1 La serie de Normas ISO 16140

La serie de Normas ISO 16140 se ha ampliado en respuesta a la necesidad de disponer de diferentes
protocolos para la validación o verificación de los métodos de análisis. Esta serie de normas sustituyen
a la Norma ISO 16140:2003. La serie de Normas ISO 16140 consta de seis partes, bajo el título general,
Microbiología de la cadena alimentaria. Validación de métodos:

– Parte 1: Vocabulario.

– Parte 2: Protocolo para la validación de métodos alternativos (registrados) frente a los métodos de
referencia.

– Parte 3: Protocolo para la verificación en un único laboratorio de métodos de referencia y de métodos

alternativos validados.

– Parte 4: Protocolo para la validación de métodos internos de un laboratorio.

– Parte 5: Protocolo para la validación factorial interlaboratorios de métodos no registrados.

– Parte 6: Protocolo para la validación de métodos alternativos (registrados) para procedimientos de

confirmación y de tipaje microbiológicos.

La Norma ISO 17468 es una norma internacional estrechamente ligada, que establece las reglas técnicas
para el desarrollo y validación de métodos normalizados.

En general, son necesarias dos etapas antes de poder usar un método en un laboratorio.

– La primera etapa es la validación del método. La validación se lleva a cabo utilizando un estudio en
un solo laboratorio, seguido de un estudio interlaboratorio (véanse las Normas ISO 16140-2,
ISO 16140-5 e ISO 16140-6). En el caso de que un método sea validado para un solo laboratorio
(véase la Norma ISO 16140-4), no se realiza ningún estudio interlaboratorio.

– La segunda etapa es la verificación del método, en el que un laboratorio demuestra que puede realizar
un método validado de manera satisfactoria. Esto está descrito en este documento (es decir, la Norma
ISO 16140-3). La verificación solamente aplica a métodos que se han validado utilizando un estudio
interlaboratorio.

En general, se distinguen dos tipos de métodos: métodos de referencia y métodos alternativos.

Un método de referencia se define como “un método reconocido de forma internacional y ampliamente
aceptado” en el apartado 2.59 de la Norma ISO 16140-1:2016. La nota aclara que “corresponden a las
normas ISO y a las normas publicadas conjuntamente por ISO y CEN, así como otras normas regionales/
nacionales de una categoría equivalente.

En la serie de Normas ISO 16140, los métodos de referencia incluyen métodos de normas de referencia
(ISO y CEN) como se definen en el apartado 3.5 de la Norma ISO 17468:2016 como “métodos de referencia
descritos en una norma”.

En el apartado 2.4 de la Norma ISO 16140-1:2016, se define un método alternativo (método sujeto a
validación), como un “método de análisis que detecta o cuantifica, para una categoría determinada de
productos, el mismo analito detectado o cuantificado por el correspondiente método de referencia”. La
nota aclara que: “El método puede ser objeto de propiedad. El término ‘alternativo’ se utiliza para
referirse a todo el ‘procedimiento analítico y sistema de reacción’. Este término incluye todos los
elementos, tanto materiales como de otro tipo, necesarios para la implementación del método”.

La Norma ISO 16140-4 aborda la validación interna de un solo laboratorio. Por tanto, los resultados
solamente son válidos para el laboratorio que ha llevado a cabo el estudio. En este caso, la verificación
no aplica (tal y como describe en este documento). La Norma ISO 16140-5 describe protocolos para
métodos no registrados, cuando se requiere una validación más rápida o cuando el método a validar es
altamente especializado y no puede alcanzarse el número de laboratorios participantes requeridos por
la Norma ISO 16140-2. Las Normas ISO 16140-4 e ISO 16140-5 pueden utilizarse para la validación
frente a un método de referencia. La Norma ISO 16140-4 (cualitativa y cuantitativamente) y la Norma
ISO 16140-5 (únicamente cuantitativamente) se pueden utilizar para la validación sin un método de
referencia.

El diagrama de flujo de la figura 1 ofrece una visión general de las relaciones entre las diferentes partes
mencionadas anteriormente. También ayuda al usuario a elegir la parte adecuada de la serie de Normas
ISO 16140, en función del propósito del estudio y las observaciones expuestas anteriormente.

Figura 1 – Diagrama de flujo para la aplicación de la serie de Normas ISO 16140

NOTA 1 En este documento, los términos "categoría", "tipo" y/o "artículo" se asocia a veces con el término "(de alimento)"
o “(alimentario)” para una mejor comprensión. Sin embargo, el término "(de alimento)” o “(alimentario)” puede
intercambiarse por “(piensos)" y por otras áreas de la cadena alimentaria como se menciona en el capítulo 1.

NOTA 2 El principio general de la verificación del método es que el método que se tiene que verificar (método alternativo o
de referencia) se ha validado. Sin embargo, algunos métodos de referencia (incluidas las normas de ISO o CEN) aún
no están (completamente) validados. Para la verificación de estos métodos, los protocolos se describen en el anexo F.

La Norma ISO 16140-6, es algo diferente de las otras partes de la serie de Normas ISO 16140, ya que se
refiere a una situación muy específica donde únicamente se valida el procedimiento de confirmación de un
método [por ejemplo, la confirmación bioquímica de Enterobacteriaceae (véase la Norma ISO 21528-2)].
El procedimiento de confirmación cambia un resultado sospechoso (presuntivo) a un resultado positivo
confirmado. La validación de técnicas de tipaje (por ejemplo, serotipificación de la Salmonella) también
está incluida en este documento. El estudio de validación en este documento define claramente el agar
o agares selectivos a partir de los cuales se pueden confirmar las colonias mediante el método alternativo
de confirmación. Si el método de confirmación alternativo está satisfactoriamente validado, el método
solo se puede utilizar si las colonias se cultivan en un agar utilizado y considerado aceptable durante el
estudio de validación. La figura 2 muestra las situaciones en las que se puede aplicar un método alternativo
de confirmación validado de acuerdo con la Norma ISO 16140-6 (véase el texto de los recuadros).

Figura 2 – Uso de métodos de confirmación alternativos validados (véase la Norma ISO 16140-6)

EJEMPLO A continuación se muestra un ejemplo de la aplicación de un método de confirmación validado

alternativo.

Se ha validado un método de confirmación alternativo basado en un ELISA para reemplazar la confirmación

bioquímica de la Salmonella como se describe en la Norma ISO 6579-1. Durante el estudio de validación, XLD (agar
obligatorio de acuerdo con la Norma ISO 6579-1) así como BGA y un agar cromogénico específico (dos agares
opcionales para la segunda siembra en placa de acuerdo con la Norma ISO 6579-1) se utilizaron para comenzar la
confirmación. El método de confirmación validado se puede utilizar para reemplazar la confirmación bioquímica
en las siguientes condiciones:

– por laboratorios que utilizan la Norma ISO 6579-1; o

– por laboratorios que utilizan un método alternativo validado por la Norma ISO 16140-2 que hace referencia a
la Norma ISO 6579-1 para la confirmación; o

– por laboratorios que utilizan un método alternativo validado según la Norma ISO 16140-2 que comienza la
confirmación a partir del agar XLD y/o BGA y/o un agar cromogénico específico.

El método de confirmación validado no se puede utilizar en las siguientes condiciones:

– por laboratorios que utilizan un método alternativo validado por la Norma ISO 16140-2 que se refiere solo a
agares distintos de los incluidos en la validación para iniciar la confirmación (por ejemplo, únicamente agar
Hektoen y agar SS); o

– por laboratorios que utilizan un método alternativo validado por la Norma ISO 16140-2 que solo se refiere a
un procedimiento de confirmación que no requiere aislamiento en agar.

0.2 Verificación frente a validación

La Norma ISO 16140-1:2016 define los términos de validación y verificación, de la siguiente manera:

– validación: declaración de las características de rendimiento de un método y demostración objetiva

de que este cumple con los requisitos de rendimiento para un uso previsto especificado;

– verificación: demostración de que un método validado implementado por un usuario tiene un

rendimiento conforme a las especificaciones del método determinadas en el estudio de validación y
que resulta adecuado para su uso previsto.

NOTA 1 El término usuario designa el laboratorio usuario.

La verificación del método se aplica a los métodos que son:

– métodos de referencia, incluidas las normas de ISO o CEN, que se validan mediante al menos un
estudio interlaboratorio;

NOTA 2 Sin embargo, algunos métodos de referencia (incluidas las normas de ISO o CEN) aún no están (completamente)
validados. Para la verificación de estos métodos, los protocolos se describen en el anexo F.

– métodos alternativos, registrados o de otro tipo, cuando la validación incluye un estudio interlabo-
ratorio. El método ha sido validado de acuerdo con:

– la Norma ISO 16140-2 para métodos alternativos (registrados),

– la Norma ISO 16140-5 para métodos no registrados, o

– la Norma ISO 16140-6 para métodos alternativos (registrados) de confirmación y tipaje.

En un estudio de validación, es imposible analizar todos los alimentos existentes; la diversidad y el

número de muestras utilizadas en un estudio de validación es limitado. En la mayoría de los casos, la
validación se basa en cinco categorías de alimentos diferentes (categorías definidas en 2.11 de la Norma
ISO 16140-1:2016 y especificadas en el anexo A de la Norma ISO 16140-2:2016). La validación a veces
se complementa con categorías adicionales (otras) como alimentos para animales y mascotas, muestras
ambientales (de la producción de alimentos o piensos) y/o muestras de producción primaria.

Cuando se validan al menos cinco categorías de alimentos diferentes, el método se considera validado
para una “gama amplia de alimentos". Además, incluso si solo se ensayan cinco categoría de alimento
durante el estudio de validación, se espera que el método funcione para cualquier tipo de muestras de
alimentos de las 15 categorías de alimentos mencionadas en el anexo A de la Norma ISO 16140-2:2016.
En otras palabras, el “alcance” de la validación del método es una gama amplia de alimentos,
correspondiente a las 15 categorías de alimentos incluidas en el anexo A de la Norma ISO 16140-2:2016.
El alcance de la validación es importante al elegir categorías, tipos y artículos para la verificación.

Hay dos tipos de verificación:

– El primer tipo es la verificación de la implementación. Sirve para demostrar que el laboratorio

usuario es capaz de llevar a cabo el método correctamente. El laboratorio usuario analiza un artículo
(alimentario) que se utilizó en el estudio de validación (para métodos cualitativos) y un artículo
(alimentario) del alcance de la validación (para métodos cuantitativos) y luego compara el resultado
de la verificación con el resultado de la validación.

– El segundo tipo es la verificación de artículos (alimentarios). Sirve para demostrar que el

laboratorio usuario es capaz de analizar los artículos (alimentarios) que declara como incluidos
dentro del alcance del laboratorio. El laboratorio usuario analiza artículos (alimentarios), incluidos
en el alcance de la validación, que el usuario examina habitualmente. Dado que no todos los artículos
(alimentarios) pueden incluirse en la verificación, se solicita que el laboratorio usuario analice
artículos (alimentarios) difíciles.

El alcance especifica el (grupo de) productos -categorías, tipos o artículos- a los que se puede aplicar el
método. Existen diferentes alcances:

– alcance del método: (grupo de) productos -categorías, tipos o artículos- para los que se afirma que
el método es aplicable;

– alcance de la validación: (grupo de) productos -categorías, tipos o artículos- para los que se afirma
que la aplicabilidad del método está validada.

NOTA En la mayoría de los casos, la declaración del alcance de la validación es más amplia que los productos incluidos en
el propio estudio de validación. Por ejemplo, en el caso de métodos alternativos (registrados) validados de acuerdo
con la Norma ISO 16140-2:2016: si en el estudio de validación se ha ensayado al menos cinco ( 5) categorías de
alimentos, utilizando al menos tres tipos diferentes de alimentos por categoría, entonces el alcance de la validación
es una “gama amplia de alimentos" (por lo tanto, se afirma que las 15 categorías de alimentos están dentro del
alcance de la aplicación de la validación). Cuando se han ensayado menos de cinco (< 5) categorías de alimentos, el
alcance de la validación se limita a las categorías de alimentos incluidas en la validación.

– alcance del laboratorio: (grupo de) productos -categorías, tipos o artículos- para los que el
laboratorio afirma que se tiene que utilizar el método y que este forma parte del alcance de la
validación.

La superposición entre los diferentes alcances (ejemplo incluido) se muestra en la figura 3.

Figura 3 – Referencia cruzada entre los diferentes alcances (ejemplo incluido)

En el momento de la publicación de este documento (es decir, la Norma ISO 16140-3:2021), algunos
métodos de referencia aún no están (completamente) validados y, por lo tanto, no estarían dentro del
alcance de este documento. Se sabe que los organismos de normalización (incluidos los comités de ISO y
CEN) necesitarán tiempo para validar sus métodos de referencia. Por lo tanto, estos métodos de referencia
no validados (incluidas las normas de ISO o CEN) se verifican en un laboratorio usuario de acuerdo con
un protocolo específico (véase el anexo F). Esta situación se considera temporal hasta que estos métodos
sean validados por los comités de ISO y/o CEN. Para obtener más información, véase la referencia [13].

En este documento:

– "debe" indica un requisito;

– "debería" indica una recomendación;

– "puede" indica permiso, o bien una posibilidad o capacidad.

La información marcada como "NOTA" ayuda a comprender o aclarar la frase asociada.

1 Objeto y campo de aplicación

Este documento especifica el protocolo para la verificación de métodos de referencia y métodos
alternativos validados para su implementación en el laboratorio usuario.

Este documento es aplicable a la verificación de métodos utilizados para el análisis (detección y/o
cuantificación), confirmación y tipificación de microorganismos presentes en:

– productos destinados al consumo humano;

– productos destinados a la alimentación animal;

– muestras ambientales recogidas de las áreas de producción y manipulación de productos alimentarios

para consumo humano o animal;

– muestras procedentes de la etapa de producción primaria.

Este documento es aplicable, en particular, a bacterias y hongos. Algunos capítulos pueden ser aplicables
a otros (micro)organismos y sus metabolitos, que se determinan según cada caso.

En los capítulos 5 y 6 se describen los protocolos técnicos para la verificación de métodos cualitativos y
cuantitativos validados. En el capítulo 7 se establece un protocolo de verificación de métodos alternativos
validados de confirmación y de tipaje. Los protocolos para la verificación de métodos de referencia no
validados se describen en el anexo F.

2 Normas para consulta

En el texto se hace referencia a los siguientes documentos de manera que parte o la totalidad de su
contenido constituyen requisitos de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la
edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier modificación
de esta).

ISO 6887 (todas las partes), Microbiología de la cadena alimentaria. Preparación de las muestras de
ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico.

ISO 7218, Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal. Requisitos
generales y guía para el examen microbiológico.

ISO 16140-1:2016, Microbiología de la cadena alimentaria. Validación de métodos. Parte 1: Vocabulario.

3 Términos y definiciones
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones incluidos en la Norma
ISO 16140-1 además de los siguientes:

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las siguientes
direcciones:

– Plataforma de búsqueda en línea de ISO: disponible en http://www.iso.org/obp

– Electropedia de IEC: disponible en http://www.electropedia.org/

3.1 método alternativo de confirmación o de tipaje; método de confirmación o de tipaje

sometido a validación:
Método de análisis que confirma o tipifica el mismo analito que el confirmado o tipificado por medio del
método de referencia correspondiente.

NOTA 1 El método puede ser registrado. El término "alternativo" se refiere a todo el "procedimiento analítico y sistema de
reacción". Este término incluye todos los ingredientes, tanto materiales como de otro tipo, necesarios para la
implementación del método.

[FUENTE: ISO 16140-6:2019, 3.2, modificado - Se ha eliminado la nota 2.]

3.2 desviación; desviación de la medida:

Estimación del error sistemático de la medida, o bien de la diferencia sistemática entre el valor asignado
cuantitativo y el promedio de los resultados de replicados de las medidas.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.9]

3.3 categoría (de alimento):

Grupo de tipos (de alimento) (3.18) que tienen el mismo origen.

EJEMPLO Categoría de alimento: leche y productos lácteos sometidos a tratamiento térmico. Tipo de alimento:
productos lácteos pasteurizados. Artículo alimentario: crème brûlée.

NOTA 1 Las categorías (de alimentos) se enumeran en el anexo A.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.11, modificado - En el término, se ha añadido "(de alimento)" después
de "categoría". En la definición, se ha sustuido “muestras” por " (de alimento)". Se ha modificado el ejemplo
de acuerdo con los términos utilizados en el anexo A. Se ha añadido la nota 1.]

3.4 desviación estimada; eBias:

Determinación de la desviación (3.2) según el protocolo de estudio descrito en este documento (es decir,
la Norma ISO 16140-3).

NOTA 1 No se puede determinar la desviación exacta si el número de muestras analizadas es pequeño. Por lo tanto, en este
documento se utiliza el término " desviación estimada" ("eBias").

3.5 LOD50 estimado; eLOD50:

Determinación del LOD50 (nivel de detección con una probabilidad de detección del 50%) según el
protocolo de estudio descrito en este documento.

NOTA 1 No se puede determinar el LOD50 con exactitud si el número de muestras analizadas es pequeño en comparación con
el número de muestras requerido en la Norma ISO 16140-2:2016. Por lo tanto, en este documento se utiliza el término
"LOD50 estimado" ("eLOD50").

NOTA 2 El LOD50 se define en el apartado 2.35 de la Norma ISO 16140-1:2016.

3.6 estudio de exclusividad:

Estudio que implica a cepas no objeto de estudio (3.11) puras que pueden presentar potencialmente una
reacción cruzada pero que no se espera detectar o cuantificar mediante el método alternativo.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.22]

3.7 estudio de inclusividad:

Estudio que supone la detección o recuento de cepas objeto de estudio (3.15) puras mediante el método
alternativo.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.31]

3.8 artículo (alimentario):

Matriz (3.10) de producción primaria, muestra ambiental, alimento para animales o alimento individual
definido.

EJEMPLO Categoría de alimento: leche y productos lácteos sometidos a tratamiento térmico. Tipo de alimento:
productos lácteos pasteurizados. Artículo alimentario: crème brûlée.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.34, modificado - En el término, se ha añadido "(alimentario)" después

de "artículo". Se ha modificado el ejemplo de acuerdo con los términos utilizados en el anexo A.]

3.9 muestra de laboratorio:

Muestra preparada para su envío a laboratorio y destinada a su inspección o análisis.

[FUENTE: ISO 6887-1:2017, 3.1]

3.10 matriz:
Todos los componentes de la muestra.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.38, modificado - En el término, se ha eliminado "(producto)".]

3.11 cepa no objeto de estudio:

Cepa, definida conforme al alcance del método de referencia, cuya presencia no cabría esperar
razonablemente confirmar, detectar o cuantificar mediante el método alternativo.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.44, modificado - En la definición, se ha añadido "confirmar" a "detectar

o cuantificar".]

3.12 material de referencia:

Material, suficientemente homogéneo y estable en una o más propiedades especificadas, que se ha
declarado como adecuado para su uso previsto en un proceso de medición.

NOTA 1 Las propiedades pueden ser cuantitativas o cualitativas, por ejemplo, la identidad de sustancias o especies.

NOTA 2 Los usos pueden incluir la calibración de un sistema de medición, la evaluación de un procedimiento de medición, la
asignación de valores a otros materiales y el control de calidad.

[FUENTE: Guía ISO 30:2015, 2.1.1, modificada - Se han eliminado las notas 1 y 4 originales y se han
reenumerado las notas.]

3.13 alcance del laboratorio:

Categorías, matrices, analitos y concentraciones aplicables a un método de análisis que un laboratorio
usuario (3.19) afirma ser capaz de ensayar de manera satisfactoria en su laboratorio.

NOTA 1 Un método puede haberse validado para una gama más amplia (alcance) de analitos, matrices y concentraciones que
el alcance que declarará un laboratorio usuario. El alcance del laboratorio es  el alcance de la validación (3.14).

3.14 alcance de la validación:

Categorías, matrices, analitos y concentraciones para los que se puede utilizar de manera satisfactoria
un método de análisis validado.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.70, modificado - Se ha añadido "categorías" y se ha movido "matrices"

delante de "analitos".]

3.15 cepa objeto de estudio:

Cepa, definida de acuerdo con el alcance del método de referencia, que se espera confirmar, detectar o
cuantificar mediante el método alternativo.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.74, modificado - En la definición, se ha añadido "confirmar" a "detectar

o cuantificar".]

3.16 porción para análisis:

Muestra representativa medida (volumen o masa) que se recoge de la muestra de laboratorio (3.9) que
se utiliza para preparar la suspensión inicial.

NOTA 1 En algunos casos, se requiere preparar una muestra de ensayo (3.17) a partir de la muestra de laboratorio antes de
recoger la porción para análisis, aunque es poco frecuente en los exámenes microbiológicos.

[FUENTE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modificado - En la nota, se ha añadido "una muestra de ensayo a partir
de" antes de "la muestra de laboratorio".]

3.17 muestra de ensayo:

Muestra preparada a partir de la muestra de laboratorio (3.9) conforme al procedimiento descrito en el
método de análisis y de la cual se recogen las porciones para análisis (3.16).

NOTA 1 Preparar la muestra de laboratorio antes de tomar la muestra de ensayo es poco frecuente para exámenes
microbiológicos.

NOTA 2 Para los métodos de confirmación y de tipaje, la muestra es una colonia aislada en placas definidas de agar selectivo
o no selectivo.

[FUENTE: ISO 6887-1:2017, 3.4, modificado - En la definición, se ha sustituido "método para análisis"
por "método de análisis" y se ha añadido la nota 2.]

3.18 tipo (de alimento):

Para una categoría (de alimento) (3.3) determinada, grupo de artículos (alimentarios) (3.8) transformados
de la misma manera que tienen características intrínsecas similares y una ecología microbiológica
similar.

EJEMPLO Categoría de alimento: leche y productos lácteos sometidos a tratamiento térmico. Tipo de alimento:
producto lácteo pasteurizado.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.78, modificado - En el término y en la definición, se ha añadido "(de

alimento)" o “(alimentario)” después de "tipo", "categoría" y "artículos".]

3.19 laboratorio usuario:

Laboratorio que implementa un método alternativo validado y/o un método de referencia validado.

NOTA 1 Algunos métodos de referencia (incluidas las normas de ISO o CEN) aún no están (completamente) validados. Para la
verificación de estos métodos, los protocolos se describen en el anexo F.

3.20 validación:
Proceso para establecer las características de rendimiento de un método y demostración objetiva de
que este cumple los requisitos de rendimiento para un uso previsto especificado.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.81]

3.21 verificación:
Demostración de que un método validado implementado por un usuario tiene un rendimiento conforme
a las especificaciones del método determinadas en el estudio de validación (3.20) y que resulta adecuado
para su uso previsto.

NOTA 1 Algunos métodos de referencia (incluidas las normas de ISO o CEN) aún no están (completamente) validados. Para la
verificación de estos métodos, los protocolos se describen en el anexo F.

[FUENTE: ISO 16140-1:2016, 2.83, modificado - En la definición, se ha sustituido “tiene un rendimiento”

por “funciona” y se ha añadido “previsto” después de “uso”. Se ha sustituido la nota 1.]

4 Principios generales de verificación de métodos cualitativos (detección) y

métodos cuantitativos

4.1 Generalidades
La verificación de métodos cualitativos (detección) y de métodos cuantitativos se realiza en dos etapas:

– verificación de la implementación;

– verificación de artículos (alimentarios).

La verificación se centra en artículos (alimentarios) que están dentro del alcance de la validación y
dentro del alcance del laboratorio.

Antes de realizar la verificación del método, el laboratorio usuario debe consultar los informes de
validación publicados por los organismos de normalización reconocidos y/u organismos de certificación
los métodos como fuente(s) para el alcance de la validación y para seleccionar los artículos (alimentarios)
apropiados para la verificación.

La verificación de la implementación tiene lugar antes de la verificación de artículos (alimentarios). Las

reglas técnicas para llevar a cabo la verificación de la implementación y la verificación de los artículos
(alimentarios) se indican en el capítulo 5 para los métodos cualitativos y en el capítulo 6 para los
métodos cuantitativos.

Para la verificación de métodos de referencia no validados, el laboratorio usuario debe utilizar los
protocolos técnicos descritos en el anexo F.

4.2 Verificación de la implementación

La verificación de la implementación sirve para demostrar que el laboratorio usuario es capaz de
implementar el método validado. Esto se demuestra por su capacidad para obtener los resultados
previstos en un artículo (alimentario).

El laboratorio usuario debe:

– revisar los datos de validación para el método;

– para métodos cualitativos:

– seleccionar un artículo (alimentario) ensayado en el estudio de validación que pertenezca al

alcance del laboratorio usuario;

– cuando los artículos (alimentarios) incluidos en el estudio de validación no entran en el alcance

del laboratorio usuario, el laboratorio usuario debe obtener uno de los artículos (alimentarios);
esto es necesario porque el límite de detección del método está influido por el artículo (alimentario);

– utilizar este artículo (alimentario) y el tamaño de muestra utilizado en el estudio de validación

para verificar la implementación;

– para métodos cuantitativos: se selecciona un artículo (alimentario) que pertenezca al alcance de la

validación del método (pero no necesariamente ensayado durante la validación).

4.3 Verificación de artículos (alimentarios)

La verificación de artículos (alimentarios) sirve para demostrar que el laboratorio usuario es capaz de
realizar el método validado con los artículos (alimentarios) que se analizan en el laboratorio usuario.

El laboratorio usuario debe:

– seleccionar un artículo (alimentario) difícil por cada categoría (de alimento) incluida en el alcance de
la validación (para más detalles, véase 4.4) que también sea una categoría (de alimento) analizada
dentro del alcance del laboratorio usuario;

– utilizar ese artículo (alimentario) y el tamaño de muestra (o un tamaño de muestra más pequeño si
se usa comúnmente en el laboratorio usuario) utilizado en el estudio de validación para verificar el
artículo (alimentario).

4.4 Requisitos para la verificación de la implementación y verificación de artículos

(alimentarios)
Las figuras 4, 5 y 6 muestran el número de artículos (alimentarios) necesarios para la verificación de la
implementación y para la verificación de los artículos (alimentarios) en diferentes circunstancias. Las
figuras 4 y 5 solo se refieren a las categorías de alimentos. La figura 6 incluye otras categorías.

Figura 4 – Artículos alimentarios necesarios para verificar un método

para su aplicación en una “gama amplia de alimentos"

En la figura 4, la selección de categorías para verificar artículos (alimentarios) se indica solo a modo de
ejemplo (flechas con contornos punteados). A diferencia de la verificación de la implementación, no es
obligatorio elegir un artículo alimentario de una categoría ensayada durante la validación (en el caso de
métodos cualitativos) y cuatro artículos alimentarios de cuatro categorías no ensayadas durante la
validación. El laboratorio usuario puede hacer su propia elección entre las 15 categorías de alimentos.

El alcance del laboratorio que se muestra en la figura 4 es de una “gama amplia de alimentos”, lo que
significa que el laboratorio usuario ha incluido al menos cinco categorías de alimentos en su estudio de
verificación y, por lo tanto, puede declarar un alcance de una “gama amplia de alimentos". Si el alcance
del laboratorio es menor que el alcance de la validación, el laboratorio usuario solo debe analizar artículos
alimentarios de sus categorías de alimentos restringidas. Por ejemplo, si el alcance del laboratorio está
limitado a tres categorías de alimentos, el laboratorio usuario debe verificar al menos un artículo
alimentario de cada una de las tres categorías de alimentos.

Figura 5 – Artículos alimentarios necesarios para verificar un método

para un alcance de una "gama limitada de alimentos"

En la figura 5, la selección de categorías para verificar artículos (alimentarios) se indica solo a modo de
ejemplo. Para el alcance de una “gama limitada de alimentos", se ensaya un número limitado de
categorías de alimentos durante la validación. Esto significa que el alcance de la validación se limita a
las categorías ensayadas. Por lo tanto, el laboratorio usuario no debe verificar el método con categorías
que están fuera del alcance limitado. Si el alcance del laboratorio es menor que el alcance de la
validación, el laboratorio usuario solo debe analizar artículos (alimentarios) de sus categorías de
alimentos restringidas (flechas con contornos punteados). Aunque el alcance de la validación se limita a
una categoría, siempre se deben verificar tanto la implementación como los artículos (alimentarios),
utilizando al menos dos artículos de la categoría: un artículo para la verificación de la implementación
y otro artículo alimentario para verificación de artículos (alimentarios).

La figura 6 muestra el número de artículos requeridos cuando los alimentos y otras categorías se validan
e incluyen dentro del alcance del laboratorio. Estas categorías incluyen alimentos para animales y
mascotas, muestras ambientales (producción de alimentos o piensos) y muestras de producción primaria
(MPP). Si alguna de estas otras categorías se ha incluido en el estudio de validación y si se declara que
está dentro del alcance del laboratorio usuario, entonces también se debe incluir un artículo de cada
categoría declarada en la verificación de artículos (alimentarios).

Figura 6 –Artículos necesarios para verificar un método para su aplicación en una

“gama amplia de categorías de alimentos y otras categorías"

La tabla 1 resume el número mínimo de artículos (alimentarios) requeridos para los diferentes escenarios.

Tabla 1 – Resumen del número mínimo de artículos

(alimentarios) requeridos para la verificación

Número de muestras
Alcance de la validación Verificación de la Verificación de artículos
Total
implementación (alimentarios)
Alcance de una “gama amplia de
alimentos” ≥ 5 categorías de 1 ≥5 ≥6
alimentos
Alcance de una “gama limitada de
1 Nalimento ≤ 4 (Nalimento + 1) ≤ 5
alimentos” categorías Nalimento
≥ 5 artículos alimentarios
Alcance de una “gama amplia de
+
alimentos” + otras categorías 1 ≥ 6 + Notras
1 artículo por cada una de
(Notras)
las Notras otras categorías
Alcance de una “gama Nalimento ≤ 4
limitada de alimentos” +
1 (Nalimento + Notras + 1) ≤ 8
Categorías Nalimento+ otras artículo por cada una de las
categorías (Notras) Notras otras categorías
Alcance solo para otras categorías
1 Notras ≤ 3 (Notras + 1) ≤ 4
(Notras)

La tabla A.1 proporciona la lista de categorías (de alimentos) y los artículos (alimentarios)
correspondientes. El anexo B proporciona más recomendaciones para la selección de un artículo
(alimentario) difícil de cada categoría (de alimento) para la verificación de artículos (alimentarios). Los
artículos (alimentarios) elegidos en cada categoría (de alimento) deben ser artículos que reflejen la
gama de muestras de laboratorio recibidas por el laboratorio usuario y, cuando sea posible, dichos
artículos deberían contener componentes con propiedades antimicrobianas naturales, vitaminas,
sabores y probióticos que puedan interferir con la detección del microorganismo objeto de estudio.

4.5 Características de rendimiento

La tabla 2 enumera las características de rendimiento requeridas para la verificación del método.

Tabla 2 – Características de rendimiento requeridas que se determinarán para la verificación

Verificación de la Verificación de artículos

Método Características de rendimiento
implementación (alimentarios)
Cualitativo LOD50 estimado(eLOD50) ✓ ✓
Desviación estándar de la reproducibilidad
✓ No aplica
Cuantitativo intralaboratorio (SIR)
Desviación estimada (eBias) No aplica ✓
NOTA 1 La relación entre la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio (SIR) y la Norma ISO 19036 se explica
en el apartado 6.1.
NOTA 2 Para la verificación del método cualitativo, se proponen tres protocolos al laboratorio usuario. El protocolo 3 no
requiere la determinación de un eLOD50, sino que tiene como objetivo una concentración de 3 ufc a 5 ufc/porción
para análisis.

5 Métodos cualitativos. Protocolo técnico para la verificación

5.1 Determinación del LOD50 estimado (eLOD50)

La determinación del eLOD50 es necesaria para la verificación tanto de la implementación como de los
artículos (alimentarios).

– En primer lugar, el laboratorio usuario sigue en su totalidad uno de los protocolos técnicos elegidos
que se describen a continuación para completar la verificación de la implementación, demostrando
así su capacidad para implementar correctamente el método validado.

– A continuación, el laboratorio usuario aplica este mismo protocolo técnico para verificar los artículos
(alimentarios).

Durante la verificación del método, se realiza todo el protocolo del método como se describe, incluido el
procedimiento de confirmación (si existe uno). Es necesario confirmar al menos una porción para
análisis en cada nivel de inoculación, y el número de colonias para la confirmación se puede reducir a
uno.

5.2 Diseño experimental

El laboratorio usuario debe elegir uno de los tres protocolos descritos en la tabla 3.

Tabla 3 – Protocolos para determinar el eLOD50 y el

número de réplicas necesarias por nivel de inoculación

Nivel de inoculación de la porción para análisis

Nivel
Nivel alto Nivel bajo
Protocolo intermedio 3 ufc a 5 ufc/
9 × LOD50/ 1 × LOD50/ Número total
3 × LOD50/ porción para Blanco
porción para porción para de réplicas
porción para análisis
análisis análisis
análisis
1 1 4 4 − 1 10
2 − 3 5 − 1 9
3 − − − 7 1 8
NOTA La abreviatura de unidades formadoras de colonias es ufc.

La elección del protocolo depende de la capacidad del laboratorio para obtener el nivel deseado de
contaminación de la porción para análisis. Para la inoculación, se pueden utilizar cultivos desarrollados
en el laboratorio o materiales de referencia (véase 5.4.1).

– El protocolo 1 se puede utilizar en caso de incertidumbre en cuanto al logro del nivel deseado de
contaminación de las porciones para análisis. Esto es relevante cuando se usa un cultivo, sin
conocimiento previo del nivel real del inóculo, para inocular las porciones para análisis.

– El protocolo 3 se puede utilizar cuando se conoce el nivel de contaminación del inóculo, por ejemplo,
cuando se utiliza un material de referencia de concentración conocida.

– El protocolo 2 se puede utilizar si el primer protocolo elegido no funcionó como se esperaba, y es

necesario repetir el ensayo.

Se pueden usar diluciones adicionales a las especificadas para cualquiera de los protocolos para minimizar
la necesidad de repetir el ensayo cuando los niveles de inoculación no cumplen con los requisitos o
cuando los resultados del ensayo de verificación no pueden interpretarse (véanse las tablas 6 y 8). Sin
embargo, esto no es obligatorio, sino que es decisión del laboratorio que realiza el experimento.

Los protocolos deben realizarse de la siguiente manera.

– Se preparan los cultivos de los microorganismos objeto de estudio para inocular los artículos
(alimentarios).

– Como mínimo, se prepara el número de porciones para análisis del mismo artículo (alimentario)
requerido para el protocolo elegido (véase la tabla 3). Se elige un artículo (alimentario) que no debería
estar contaminado de forma natural con el microorganismo objeto de estudio.

– Se inoculan las suspensiones iniciales de las porciones para análisis de acuerdo con el protocolo
elegido de la tabla 3.

– Se determina el nivel del microorganismo objeto de estudio en el inóculo, a la vez que se inoculan las
porciones para análisis, realizando una siembra en un medio no selectivo (por ejemplo, una placa de
agar de recuento) o realizando una técnica NMP (por ejemplo: 3 diluciones × 3 tubos). Se enumeran
según la Norma ISO 7218.

NOTA Si no se conoce el nivel del cultivo utilizado para la inoculación, se pueden inocular porciones para análisis adicionales
con otras diluciones para garantizar que los niveles objetivo se incluyen en la verificación.

– Se analizan las porciones para análisis inoculadas mediante el procedimiento completo del método
que se está verificando.

– Para los protocolos 1 y 2, se determina el eLOD 50 utilizando los resultados positivos y negativos
obtenidos (para más detalles, véase 5.5). Para el protocolo 3, no se determina el eLOD50. En su lugar,
los resultados se evalúan en función del número de positivos encontrados en las siete réplicas
analizadas.

Para más recomendaciones y ejemplos, véase también el anexo C.

5.3 Selección de artículos (alimentarios)

Se requiere un artículo (alimentario) para la verificación de la implementación. Se puede seleccionar
cualquier artículo (alimentario) incluido en la validación y que esté dentro del alcance del laboratorio.

Para la verificación de artículos (alimentarios), el laboratorio usuario debe analizar al menos un artículo
(alimentario), preferiblemente uno difícil, de cada categoría (de alimento) requerida. En el capítulo 4.4
se proporciona información detallada sobre el número requerido de categorías (de alimentos) que hay
que analizar de acuerdo con el alcance de la validación o el alcance del laboratorio. El anexo B proporciona
recomendaciones sobre cómo elegir artículos (alimentarios) difíciles.

5.4 Contaminación artificial

5.4.1 Selección de cepas

Las cepas pueden provenir de:

– colecciones de cultivos;

– colecciones del laboratorio usuario;

– materiales de referencia (incluidos materiales de referencia comerciales, por ejemplo, una cepa
liofilizada de concentración conocida).

Al seleccionar las cepas de ensayo, la mayoría debería provenir de las categorías (de alimentos) elegidas
para el estudio de verificación y cubrir el rango reconocido del analito objeto de estudio con respecto a
la diversidad de características identificativas (por ejemplo, bioquímicas, serotipo o fagotipo), distribución
geográfica e incidencia (véase el anexo E de la Norma ISO 16140-2:2016).

NOTA Preferiblemente, las cepas utilizadas durante la verificación proceden de fuentes relevantes para el artículo (alimentario)
que se está verificando y se utiliza una cepa diferente para cada uno de los artículos (alimentarios) analizados.

5.4.2 Inoculación de porciones para análisis

Se utilizan los datos de LOD50 de las categorías (de alimentos) correspondientes del estudio de validación
del método para determinar el nivel de contaminación (este debería ser entre una y nueve veces el
LOD50, véase la tabla 3) que se utilizará para inocular la porción para análisis. Para el protocolo 3, se
usan 3 ufc a 5 ufc/porción para análisis.

Si no se dispone de una categoría (de alimento) correspondiente en el estudio de validación [por ejemplo,
para un artículo (alimentario) difícil analizado durante la verificación de artículos (alimentarios)], se
supone que el valor LOD50 es igual o inferior a 1 ufc/porción para análisis.

Las siguientes recomendaciones se dan como ejemplos de procedimientos adecuados para producir
inóculos.

– La cepa seleccionada se cultiva en un medio de cultivo cuyas condiciones permiten el crecimiento

óptimo de la cepa (por ejemplo, cultivo “durante toda la noche”). Se siguen los procedimientos
especificados en el apartado 5.4 de la Norma ISO 11133:2014.

NOTA En este documento, el cultivo "durante toda la noche" corresponde a entre 16 h y 24 h de incubación.

– Se enumera el cultivo en un medio no selectivo para determinar la concentración de la cepa, en

ufc/ml. Se considera que este nivel se alcanzará sistemáticamente si se utilizan las mismas
condiciones de cultivo.

– Se repite el cultivo en las mismas condiciones y se tiene en cuenta la concentración determinada

previamente para preparar diluciones que cubran el rango de inoculación. Este paso no es necesario
si el laboratorio usuario conoce la estabilidad de la cepa (por ejemplo, viabilidad después del
almacenamiento a 4 °C durante toda la noche)

Si el laboratorio usuario trabaja con cepas objeto de estudio listas para usar con niveles conocidos (por
ejemplo, material de referencia), los pasos descritos anteriormente no son necesarios.

El inóculo preparado se introduce directamente en la suspensión inicial de cada porción para análisis.
Se mezcla totalmente la suspensión después de la inoculación. Se recomienda el uso de cultivos estresados,
pero no es obligatorio (véase el anexo C de la Norma ISO 16140-2:2016).

La tabla 4 proporciona una recomendación sobre cómo alcanzar los niveles de inoculación para cada
protocolo.

Tabla 4 – Niveles de inoculación para cada protocolo

Nivel alto Nivel intermedio Nivel bajo

3 ufc a 5 ufc/ porción
Protocolo 9 × LOD50/porción 3 × LOD50/porción 1 × LOD50/porción
para análisis
para análisis para análisis para análisis
Para alcanzar el nivel Para alcanzar el nivel
Este debería ser, como
intermedio, se realiza bajo, se realiza una
1 máximo, nueve veces el
una dilución 1:3 a partir dilución 1:3 a partir
LOD50 esperado
del nivel alto del nivel intermedio
Para alcanzar el nivel
Este debería ser como
bajo, se realiza una
2 máximo tres veces el
dilución 1:3 a partir
LOD50 esperado
del nivel intermedio
El nivel de
contaminación del
inóculo se conoce (por
3 ejemplo, material de
referencia de
concentración
conocida)

Se pueden ensayar otras diluciones para garantizar que se incluyen los niveles objetivo. Se usan tantas
diluciones como sea necesario, pero siempre se considera un factor de dilución de 1:3 entre niveles.

Para determinar el nivel de inóculo, se enumera, durante la inoculación de las porciones para análisis,
el inóculo de nivel superior cuando se usa el protocolo 1, el inóculo de nivel intermedio cuando se usa
el protocolo 2 o el inóculo de 3 ufc a 5 ufc/porción para análisis cuando se usa el protocolo 3, de acuerdo
con la Norma ISO 7218 (utilizando un medio no selectivo, por ejemplo, una placa de agar de recuento).
Hay que tener en cuenta que el nivel de contaminación del inóculo es muy bajo y que, por tanto, se debe
analizar un mayor número de réplicas y/o un mayor volumen de inóculo para obtener un resultado
válido según la Norma ISO 7218. La concentración de los niveles inferior e intermedio mediante los
protocolos 1 o 2 se calcularán a partir de los recuentos obtenidos y los factores de dilución utilizados.

Alternativamente, se puede realizar una determinación del NMP de inóculos usando la técnica NMP para
3 diluciones × 3 tubos; el uso de un medio no selectivo para el enriquecimiento (por ejemplo, un caldo
infusión cerebro-corazón o caldo de triptona soja) es apropiado (véase también el anexo C para más
información). En este caso, los resultados se determinan de acuerdo con la tabla C.1.

EJEMPLO Un laboratorio usuario desea verificar el método de detección de la Salmonella (véase la Norma
ISO 6579-1) utilizando el protocolo 1.
– A partir del LOD50 (2,5 ufc/porción para análisis) determinado durante el estudio de validación,
el rango de contaminación para el artículo (alimentario) A será, en teoría, 22,5 ufc/porción para
análisis, 7,5 ufc/porción para análisis y 2,5 ufc/porción para análisis.
– Se prepara un cultivo “durante toda la noche”. Según la enumeración preliminar, se supone que
contiene 6 × 108 ufc/ml.
– Dado que no se conoce el recuento real del nuevo cultivo “durante toda la noche”, el laboratorio
usuario puede usar varias diluciones que cubran los tres niveles objetivo, usando cada dilución y
las porciones para análisis requeridas en la tabla 5. En este caso:
– Dilución A (60 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 10 -7 del cultivo de “durante toda la noche”.
– Dilución B (20 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 1:3 de A.

– Dilución C (6,7 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 1:3 de B.

– Dilución D (2,2 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 1:3 de C.
– Dilución E (0,7 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 1:3 de D.
– Dilución F (0,2 ufc/ml): se utiliza 1 ml de la dilución 1:3 de E.
En este ejemplo particular, se utilizan seis diluciones para garantizar que se incluyen las diluciones
correctas. Se analizarán un total de 21 porciones para análisis inoculadas al mismo tiempo que una
porción para análisis en blanco. Solo se utilizarán los tres niveles apropiados y el nivel en blanco (no
inoculado) para la determinación del eLOD50.

Tabla 5 – Ejemplos de diluciones y número correspondiente de réplicas para los

protocolos 1, 2 y 3 utilizando más que el número mínimo de diluciones requerido

Protocolo Dilución A Dilución B Dilución C Dilución D Dilución E Dilución F)

(10−7) (1:3 de A) (1:3 de B) (1:3 de C) (1:3 de D) (1:3 de E)
1 1 4 4 4 4 4
2 − 3 5 5 5 5
3 − − 7 7 7 7

– En este ejemplo, el recuento que permite obtener el nivel de contaminación medio final para esta
dilución es de 54 ufc/ml.

– El uso de esta dilución seleccionada (A) para la preparación de diluciones de acuerdo con la tabla 5
dará como resultado una dilución B de 18 ufc/ml, una dilución C (dilución 1:3 de B) de 6 ufc/ml y una
dilución D (dilución 1:3 de C) de 2 ufc/ml. Las diluciones B, C y D se consideran los tres niveles
apropiados, ya que un inóculo de 1 ml de dilución D es el más cercano al LOD50 (2,5 ufc/porción para
análisis) del método. Para más recomendaciones y ejemplos, véase también el anexo C.

5.5 Evaluación de resultados

5.5.1 Determinación de eLOD50 utilizando el protocolo 1

Se registra el número de resultados positivos obtenidos en cada nivel de inóculo y se utiliza la tabla 6
para determinar el eLOD50. El nivel en blanco no debe dar resultados positivos. Si se obtienen resultados
positivos para el nivel en blanco, el ensayo debe repetirse para todos los niveles.

Para la evaluación de los resultados utilizando el protocolo 1, el inóculo de nivel superior (9 × LOD50)
debe dar solo resultados positivos. Si se obtienen resultados negativos, el ensayo debe repetirse para
todos los niveles. Es muy poco probable que se produzcan algunas de las combinaciones de NMP que se
indican como "resultado NMP no fiable" (véanse las tablas 6 y 7) y, por tanto, el ensayo debe repetirse.

Cuando se usa un número mayor de diluciones, para evaluar los datos de acuerdo con la tabla 6 deben
usarse las tres diluciones con el nivel de inoculación más bajo más cercano al nivel LOD50.

Tabla 6 – Determinación de eLOD50 a partir del número de resultados

positivos por nivel de contaminación utilizando el protocolo 1

Nivel alto de Nivel intermedio Nivel bajo de Nivel en

eLOD50
inoculación de inoculación inoculación blanco
objetivo 9  objetivo 3  objetivo 1 
ufc/porción
LOD50/porción LOD50/porción LOD50/porción
para análisis
para análisis para análisis para análisis
1/1 4/4 4/4 0/1 < 1,0 × LILa
1/1 4/4 3/4 0/1 = 0,5 × LIL
1/1 4/4 2/4 0/1 = 0,7 × LIL
1/1 4/4 1/4 0/1 = 1,0 × LIL
1/1 4/4 0/4 0/1 = 1,5 × LIL
1/1 3/4 4/4 0/1 = 0,7 × LIL
1/1 3/4 3/4 0/1 = 1,0 × LIL
1/1 3/4 2/4 0/1 = 1,3 × LIL
1/1 3/4 1/4 0/1 = 1,7 × LIL
1/1 3/4 0/4 0/1 = 2,3 × LIL
1/1 2/4 4/4 0/1 = 1,1 × LIL
1/1 2/4 3/4 0/1 = 1,5 × LIL
1/1 2/4 2/4 0/1 = 1,9 × LIL
1/1 2/4 1/4 0/1 = 2,6 × LIL
1/1 2/4 0/4 0/1 = 3,7 × LIL
1/1 1/4 4/4 0/1 Resultado NMP no fiableb
1/1 1/4 3/4 0/1 = 2,1 × LIL
1/1 1/4 2/4 0/1 = 2,8 × LIL
1/1 1/4 1/4 0/1 = 4,0 × LIL
1/1 1/4 0/4 0/1 = 6,3 × LIL
1/1 0/4 4/4 0/1 Resultado NMP no fiableb
1/1 0/4 3/4 0/1 = 3,0 × LIL
1/1 0/4 2/4 0/1 = 4,3 × LIL
1/1 0/4 1/4 0/1 = 6,7 × LIL
1/1 0/4 0/4 0/1 = 14,0 × LIL
a LIL = Nivel de inoculación bajo.
b Resultado NMP no fiable: Es muy poco probable que se produzca la combinación de NMP. El ensayo debe repetirse.

Se puede utilizar la tabla 6 para determinar el eLOD50 utilizando el nivel de inóculo real indicado en el
ejemplo descrito en el apartado 5.4.2. Esto se muestra en la tabla 7. En este ejemplo, se usa un nivel de
contaminación superior de 18 ufc/porción para análisis con el nivel de contaminación intermedio
correspondiente de 6 ufc/porción para análisis y el nivel de contaminación inferior de 2 ufc/porción
para análisis.

Tabla 7 – Ejemplo de determinación de eLOD50 a partir del número de resultados

positivos por nivel de contaminación utilizando el protocolo 1

Nivel alto de Nivel intermedio Nivel bajo de Nivel en

eLOD50
inoculación de inoculación inoculación blanco
= 18 ufc/porción = 6 ufc/porción = 2 ufc/porción ufc/porción
para análisis para análisis para análisis para análisis
1/1 4/4 4/4 0/1 < 2,0
1/1 4/4 3/4 0/1 = 1,0
1/1 4/4 2/4 0/1 = 1,4
1/1 4/4 1/4 0/1 = 2,0
1/1 4/4 0/4 0/1 = 3,0
1/1 3/4 4/4 0/1 = 1,4
1/1 3/4 3/4 0/1 = 2,0
1/1 3/4 2/4 0/1 = 2,6
1/1 3/4 1/4 0/1 = 3,4
1/1 3/4 0/4 0/1 = 4,6
1/1 2/4 4/4 0/1 = 2,2
1/1 2/4 3/4 0/1 = 3,0
1/1 2/4 2/4 0/1 = 3,8
1/1 2/4 1/4 0/1 = 5,2
1/1 2/4 0/4 0/1 = 7,4
1/1 1/4 4/4 0/1 Resultado NMP no fiablea
1/1 1/4 3/4 0/1 = 4,2
1/1 1/4 2/4 0/1 = 5,6
1/1 1/4 1/4 0/1 = 8,0
1/1 1/4 0/4 0/1 = 12,6
1/1 0/4 4/4 0/1 Resultado NMP no fiablea
1/1 0/4 3/4 0/1 = 6,0
1/1 0/4 2/4 0/1 = 8,6
1/1 0/4 1/4 0/1 = 13,4
1/1 0/4 0/4 0/1 = 28,0
a Resultado NMP no fiable: Es muy poco probable que se produzca la combinación de NMP. El ensayo debe repetirse.

5.5.2 Determinación de eLOD50 utilizando el protocolo 2

Si se utiliza el protocolo 2 para verificar el ejemplo del apartado 5.4.2, se habrían examinado 23 porciones
para análisis (véase la tabla 5) junto con una porción para análisis en blanco. Se registran el número de
resultados positivos obtenidos en cada nivel de inóculo y utiliza la tabla 8 para determinar el eLOD 50.

El nivel en blanco no debe producir resultados positivos. Si se obtienen resultados positivos para el nivel
en blanco, el ensayo debe repetirse para todos los niveles.

Para la evaluación de resultados utilizando el protocolo 2, los niveles de inoculación intermedio y bajo
pueden tener resultados positivos y negativos. Si solo se obtienen resultados negativos, el ensayo debe
repetirse. Es muy poco probable que se produzcan algunas de las combinaciones de NMP que se indican
como "resultado NMP no fiable" (véanse las tablas 8 y 9) y, por tanto, el ensayo debe repetirse.

Cuando se usa un número mayor de diluciones, para evaluar los datos de acuerdo con la tabla 8, se deben
usar las dos diluciones con el nivel de inoculación más bajo más cercano al LOD50

Tabla 8 – Determinación de eLOD50 a partir del número de resultados

positivos por nivel de contaminación utilizando el protocolo 2

Nivel en
Nivel intermedio de inoculación Nivel bajo de inoculación eLOD50
blanco
objetivo 3  LOD50/porción objetivo 1  LOD50/porción
ufc/porción para análisis
para análisis para análisis
3/3 5/5 0/1 < 1,0 × LILa
3/3 4/5 0/1 = 0,4 × LIL
3/3 3/5 0/1 = 0,7 × LIL
3/3 2/5 0/1 = 1,0 × LIL
3/3 1/5 0/1 = 1,4 × LIL
3/3 0/5 0/1 = 2,0 × LIL
2/3 5/5 0/1 = 0,7 × LIL
2/3 4/5 0/1 = 0,9 × LIL
2/3 3/5 0/1 = 1,2 × LIL
2/3 2/5 0/1 = 1,6 × LIL
2/3 1/5 0/1 = 2,3 × LIL
2/3 0/5 0/1 = 3,7 × LIL
1/3 5/5 0/1 Resultado NMP no fiableb
1/3 4/5 0/1 = 1,4 × LIL
1/3 3/5 0/1 = 1,8 × LIL
1/3 2/5 0/1 = 2,6 × LIL
1/3 1/5 0/1 = 4,1 × LIL
1/3 0/5 0/1 = 8,6 × LIL
0/3 5/5 0/1 Resultado NMP no fiableb
0/3 4/5 0/1 Resultado NMP no fiableb
0/3 3/5 0/1 = 2,9 × LIL
0/3 2/5 0/1 = 4,5 × LIL
0/3 1/5 0/1 = 9,4 × LIL
a LIL = Nivel de inoculación bajo.
b Resultado NMP no fiable: Es muy poco probable que se produzca la combinación de NMP. El ensayo debe repetirse.

Se puede utilizar la tabla 8 para determinar el eLOD50 utilizando el nivel de inóculo real indicado en el
ejemplo descrito en el apartado 5.4.2. Esto se muestra en la tabla 9. En este ejemplo, se usa un nivel de
contaminación intermedio de 6 ufc/porción para análisis y un nivel de contaminación más bajo de
2 ufc/porción para análisis.

Tabla 9 – Ejemplo de determinación de eLOD50 a partir del número de resultados

positivos por nivel de contaminación utilizando el protocolo 2

Nivel intermedio de Nivel en

Nivel bajo de inoculación eLOD50
inoculación blanco
= 6 ufc/porción para análisis = 2 ufc/porción para análisis ufc/porción para análisis
3/3 5/5 0/1 < 2,0
3/3 4/5 0/1 = 0,8
3/3 3/5 0/1 = 1,4
3/3 2/5 0/1 = 2,0
3/3 1/5 0/1 = 2,8
3/3 0/5 0/1 = 4,0
2/3 5/5 0/1 = 1,4
2/3 4/5 0/1 = 1,8
2/3 3/5 0/1 = 2,4
2/3 2/5 0/1 = 3,2
2/3 1/5 0/1 = 4,6
2/3 0/5 0/1 = 7,4
1/3 5/5 0/1 Resultado NMP no fiablea
1/3 4/5 0/1 = 2,8
1/3 3/5 0/1 = 3,6
1/3 2/5 0/1 = 5,2
1/3 1/5 0/1 = 8,2
1/3 0/5 0/1 = 17,2
0/3 5/5 0/1 Resultado NMP no fiablea
0/3 4/5 0/1 Resultado NMP no fiablea
0/3 3/5 0/1 = 5,8
0/3 2/5 0/1 = 9,0
0/3 1/5 0/1 = 18,6
a Resultado NMP no fiable: Es muy poco probable que se produzca la combinación de NMP. El ensayo debe repetirse.

5.5.3 Uso del protocolo 3

El nivel en blanco no debe producir resultados positivos. Si se obtienen resultados positivos para el nivel
en blanco, el ensayo debe repetirse para todos los niveles.

Los resultados del protocolo 3 solo deberían usarse para la evaluación cuando el nivel de contaminación
de las porciones para análisis se encuentre dentro de los límites indicados de 3 ufc/porción para análisis
a 5 ufc/porción para análisis. Este nivel de contaminación debe determinarse por enumeración o por
NMP como se indica en el apartado 5.4.2. Si el nivel de contaminación es > 5 ufc/porción para análisis,
los resultados no se pueden utilizar y el ensayo debe repetirse. Si el nivel de contaminación es < 3 ufc/
porción para análisis y se cumple el límite de aceptabilidad, se pueden utilizar los resultados. De lo
contrario, el ensayo debe repetirse.

No se determina ningún eLOD utilizando el protocolo 3. Los resultados deben evaluarse en función
del número de positivos encontrados en las siete réplicas ensayadas. El límite de aceptabilidad
correspondiente se presenta en el apartado 5.6.

5.6 Límites de aceptabilidad

El eLOD50, determinado de acuerdo con el protocolo 1 (véase 5.5.1) o el protocolo 2 (véase 5.5.2) debe
compararse con el LOD50 del estudio de validación. Para verificar la implementación, se usa el valor
LOD50 correspondiente al artículo (alimentario) analizado.

Para la verificación de artículos (alimentarios), el eLOD50 no debe ser > 4 × LOD50 observado durante el
estudio de validación. Si ningún valor de LOD50 coincide con el del artículo (alimentario) que se está
analizando, el eLOD50 no debe ser > 4 ufc/muestra de ensayo. Este límite de aceptabilidad se basa en el
valor teórico de un LOD50 de 1 ufc/porción para análisis.

Para el protocolo 3, debe haber al menos seis resultados positivos de las siete réplicas analizadas.

El capítulo 8 proporciona un resumen de los límites de aceptabilidad.

NOTA

– El eLOD50 del estudio de verificación es válido y aceptable solo si se obtiene en la misma porción para análisis o en una
porción para análisis más pequeña (por ejemplo, 25 g, 100 ml, 375 g) que la utilizada para el estudio de validación.

– El LOD50 observado durante el estudio de validación puede expresarse en ufc/g, en ufc/ml o en ufc/porción para análisis.
El LOD50 de la validación se expresará en ufc/porción para análisis para poder comparar el resultado con el resultado del
estudio de verificación.

– Si el LOD50 observado durante el estudio de validación se expresa en ufc/g o en ufc/ml, entonces es necesario multiplicar
el LOD50 por el tamaño de la porción para análisis utilizada. Por lo tanto, un LOD 50 de 0,1 ufc/g o 0,1 ufc/ml dará un LOD50
de 2,5 cuando se utilice una porción para análisis de 25 g o 25 ml.

– Si, por ejemplo, el LOD50 del estudio de validación es de 2,5 ufc/porción para análisis, el valor máximo aceptable para el
eLOD50 será de 10 ufc/porción para análisis (máximo de 4  LOD50).

5.7 Análisis de las causas

Cuando el resultado de la verificación excede los límites de aceptabilidad (por ejemplo, el eLOD 50 es
> 4 × LOD50 observado durante el estudio de validación), se realiza un análisis de las causas para
proporcionar una explicación de los resultados observados.

Puede resultar útil repetir la verificación de un método alternativo validado en paralelo con el método
de referencia validado en ese artículo (alimentario). Esto permite identificar si ese artículo (alimentario)
se comporta de la misma manera con los dos métodos implementados por el laboratorio usuario.

Se debe realizar un análisis de las causas para determinar los siguientes problemas (entre otros):

– error analítico debido a un incumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio;

– error analítico durante la aplicación del protocolo (por ejemplo, nivel de inoculación incorrecto);

– especificidad del artículo (alimentario) [por ejemplo, artículos (alimentarios) muy difíciles que
requieren un factor de dilución más alto en la suspensión inicial].

Una vez identificados los problemas, se toman acciones correctivas y se repite el experimento.

Se puede registrar la información (basada en investigaciones, por ejemplo, el análisis de las causas) en
el informe del estudio de verificación para explicar los resultados.

Cuando la verificación de un artículo (alimentario) en particular no cumple con los límites de aceptabilidad,
se recomienda que el laboratorio usuario informe a un organismo competente (por ejemplo, un organismo
de normalización, un proveedor, un organismo de certificación), según el método.

6 Métodos cuantitativos. Protocolo técnico de verificación

6.1 Determinación de la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio

6.1.1 Generalidades
La determinación de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio se aplica solo a la
verificación de la implementación.

La verificación de la implementación se realiza en un solo laboratorio, y la reproducibilidad se expresa

como la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio (SIR).

La determinación de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (SIR) durante la

verificación de la implementación corresponde a la determinación de la incertidumbre técnica, que es uno
de los tres componentes principales de la incertidumbre (técnica, matriz y distribución) descritos en la
Norma ISO 19036. La determinación de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (SIR)
se basa en el apartado 5.2.2 de la Norma ISO 19036:2019.

Durante la verificación de la implementación, se lleva a cabo todo el protocolo del método como se
describe, incluido el procedimiento de confirmación para cada porción para análisis.

6.1.2 Diseño experimental

El protocolo debe realizarse de la siguiente manera.

– Se requieren al menos diez muestras de laboratorio, pertenecientes al mismo artículo (alimentario).

Pueden provenir de un número máximo de lotes diferentes si el laboratorio usuario está asociado a
un sitio de producción o de diferentes fabricantes para laboratorios privados que ofrecen sus
servicios a diferentes fabricantes. Se pueden ensayar más muestras para cubrir la posible pérdida de
datos de algunas muestras debido a errores prácticos/contratiempos durante el ensayo.

– Los niveles de contaminación utilizados deben ser representativos del rango de contaminación
natural observado en las muestras ensayadas en el laboratorio usuario.

– Cada muestra de laboratorio (o muestra de ensayo) debe mezclarse u homogeneizarse antes de

tomar dos porciones para análisis(véase la figura 7). Esto es esencial para asegurar una distribución
uniforme de microorganismos. Para los productos líquidos, la mezcla debe realizarse agitando la
muestra de laboratorio (o muestra de ensayo) a mano (por ejemplo, 25 veces en un arco de 25 cm).
Para productos sólidos, la homogeneización se puede realizar con un dispositivo mecánico, que
podría incluir un Stomacher y un mezclador. Para obtener más detalles, se sigue el procedimiento
especificado en la serie de Normas ISO 6887.

– Si se utiliza contaminación artificial, se inocula la suspensión inicial de cada porciones para análisis
con un nivel conocido de la cepa.

– Las porciones para análisis contaminadas naturalmente se pueden analizar inmediatamente después
de la homogeneización de la muestra de laboratorio (o muestra de ensayo).

Para obtener más recomendaciones y ejemplos, véase también el capítulo D.1.

Figura 7 – Protocolo de estudio para estimar la desviación estándar

de la reproducibilidad intralaboratorio

La muestra de ensayo, como se define en el término 3.17, rara vez se usa en exámenes microbiológicos.
La mayoría de las veces, la muestra de laboratorio se utiliza directamente para la homogeneización.

Las condiciones de ensayo utilizadas durante el análisis de las porciones para análisis A y B deben ser
lo más diferentes posible, dentro del alcance de la validación. Estas deben incluir, a menos que el
laboratorio usuario pueda justificar otra elección, entre otras:

a) los técnicos;

b) los lotes de los medios de cultivo y de los reactivos (opcional: cuando proceda, también se pueden
utilizar diferentes cepas para inocular diferentes muestras de laboratorio);

c) los dispositivos (por ejemplo, incubadoras, mezcladores vórtex, pipetas).

Se considera que las condiciones de ensayo a) y b) causan la mayor variabilidad en los resultados de un
método y deben cambiarse, a menos que el laboratorio usuario pueda justificar otra elección. La condición
de ensayo c) debe modificarse en función de la disponibilidad de aparatos en el laboratorio usuario. Si
es posible demostrar que la contaminación del artículo (alimentario) es suficientemente estable, el análisis
se puede realizar en días diferentes. Los resultados deben analizarse de acuerdo con el apartado 6.1.6.

NOTA Los lotes de los medios de cultivo pueden provenir de diferentes preparaciones/producciones del mismo lote de polvo.

6.1.3 Selección del artículo (alimentario)

Se requiere un artículo (alimentario) para verificar la implementación. La desviación estándar de
reproducibilidad intralaboratorio (SIR), según se determina de acuerdo con la figura 7, es independiente
de la matriz, porque los ensayos están diseñados para excluir las contribuciones de la heterogeneidad
de la matriz, de modo que cualquier artículo (alimentario) dentro del alcance de la validación puede
seleccionarse. Se recomienda seleccionar un artículo (alimentario) que pueda homogeneizarse eficazmente
para minimizar la incertidumbre de la matriz.

6.1.4 Contaminación natural

Siempre que sea posible, se utilizan artículos contaminados naturalmente. Para el artículo (alimentario)
elegido, las porciones analizadas deben tener niveles de contaminación representativos del rango de
contaminación natural observado en las muestras analizadas en el laboratorio usuario.

Si el nivel esperado de contaminación natural es inferior a 10 ufc/g en la porción para análisis, se utiliza
la contaminación artificial (para más detalles, véase 6.1.5) para cubrir el rango de uso del método.

6.1.5 Contaminación artificial

6.1.5.1 Selección de cepa

La cepa puede provenir de:

– una colección de cultivos;

– una colección del laboratorio usuario;

– un material de referencia (incluido un material de referencia comercial, por ejemplo, una cepa
liofilizada de concentración conocida).

NOTA Preferiblemente, la cepa utilizada en la verificación es de una fuente apropiada para el artículo (alimentario) que se está
verificando.

6.1.5.2 Inoculación de la muestra de ensayo

Al inocular la porción para análisis, los niveles de contaminación utilizados deben ser representativos
del rango de contaminación natural observado en las muestras de laboratorio analizadas en el
laboratorio usuario.

Las siguientes recomendaciones se dan como ejemplos de procedimientos adecuados para producir
inóculos.

– La cepa seleccionada se cultiva en un medio de cultivo cuyas condiciones permitan un crecimiento

óptimo de la cepa (por ejemplo, cultivo “durante toda la noche”). Se siguen los procedimientos
especificados en el apartado 5.4 de la Norma ISO 11133:2014.

NOTA En este documento, el cultivo “durante toda la noche ” corresponde a entre 16 h y 24 h de incubación .

– Se enumera el cultivo en medio no selectivo para determinar la concentración de la cepa, en ufc/ml.

Se considera que este nivel se alcanzará sistemáticamente si se utilizan las mismas condiciones de
cultivo.

– Se repite el cultivo en las mismas condiciones y se tiene en cuenta la concentración determinada

previamente para preparar diluciones que cubran el rango representativo de contaminación natural.
Este paso no es necesario si el laboratorio usuario conoce la estabilidad de la cepa (por ejemplo,
viabilidad después del almacenamiento durante toda la noche a 4 °C).

Si el laboratorio usuario trabaja con cepas objeto de estudio listas para usar con niveles conocidos (por
ejemplo, material de referencia), los pasos descritos anteriormente no son necesarios.

El inóculo preparado se introduce directamente en la suspensión inicial de cada muestra de ensayo. Se

mezcla totalmente la suspensión después de la inoculación. Se recomienda el uso de cultivos estresados,
pero no es obligatorio (véase el anexo C de la Norma ISO 16140-2:2016).

EJEMPLO Un laboratorio usuario desea verificar el método para la enumeración de Enterobacteriaceae (véase
la Norma ISO 21528-2). La validación de este método se llevó a cabo utilizando un artículo (alimentario)
de cada una de las cuatro categorías de alimentos y otra categoría:
a) categoría de alimento: leche y productos lácteos sometidos a tratamiento térmico; tipo de
alimento: productos lácteos pasteurizados; artículo alimentario: leche pasteurizada;
b) categoría de alimento: carne cruda y productos cárnicos listos para cocinar (excepto de ave);
tipo de alimento: carnes frescas (sin procesar); artículo alimentario: carne cruda (carne de cerdo
picada);
c) categoría de alimento: huevos y ovoproductos; tipo de alimento: ovoproducto (sometido a
tratamiento térmico) sin aditivos; artículo alimentario: ovoproducto (huevo líquido entero);
d) categoría de alimento: chocolate, productos de panadería y pastelería, productos de confitería;
tipo de alimento: pastas; artículo alimentario: tiramisú;
e) otra categoría: alimentos para animales y mascotas; tipo (de alimento): ingredientes de origen
animal; artículo (alimentario): pienso para animales (harina de carne y huesos).

Para la verificación de la implementación se eligió el artículo alimentario "tiramisú" y se eligió E. coli

como cepa para la inoculación artificial. Conviene tener en cuenta que el tiramisú se da como ejemplo,
ya que se puede elegir cualquier artículo (alimentario) para la verificación de la implementación.

– Según el rango representativo de niveles de contaminación de la contaminación natural observada

en las muestras analizadas en el laboratorio usuario, el tiramisú se inoculará entre 30 (1,5 log10) ufc/g
y 30 000 (4,5 log10) ufc/g.

– Se prepararán al menos diez muestras de laboratorio diferentes (marcas, lotes) de tiramisú, y cada
una se dividirá en dos porciones para análisis: A y B (véase la figura 7).

– Las dos porciones para análisis, A y B, de la misma muestra de laboratorio (véase la figura 7), se
inocularán con el mismo inóculo. Cada grupo de diez o más muestras de laboratorio se inoculará a
diferentes niveles (y posiblemente con diferentes cepas) entre 30 ufc /g y 30 000 ufc/g. El cultivo se
inoculará en suspensiones iniciales preparadas utilizando porciones para análisis de 10 g.

– Para ello, se prepara un cultivo “durante toda la noche” y se asume que contiene 109 ufc/ml (según
los resultados de las enumeraciones previas).

– Para contaminar al nivel de 30 ufc/g, se preparan seis diluciones decimales sucesivas del cultivo
“durante toda la noche”, a fin de reducir el nivel inicial de 109 ufc/ml a 103 ufc/ml.

Se pueden obtener diferentes niveles de contaminación que cubren el rango de 30 ufc/g a 30 000 ufc/g
con diferentes diluciones y/o diferentes volúmenes de inoculación. El laboratorio usuario debe asegurarse
de que el inóculo no afecte la integridad del artículo. Los resultados de este ejemplo se resumen en la
tabla 10. El capítulo D.1 proporciona información detallada sobre el protocolo de estudio para este
ejemplo.

6.1.6 Evaluación de resultados

La desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio (SIR) se calcula, a partir de al menos diez
muestras de laboratorio, de acuerdo con la fórmula (1):

n
1
 ( yiA − yiB )
2
sIR = (1)
2n
i =1

donde

SIR es la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio;

i es el índice de la muestra de laboratorio, i = 1 a n (n ≥ 10);

n es el número de muestras;

yiA, yiB son los datos transformados logarítmicamente, en log 10 (ufc/g) o log10 (ufc/ml), de las
condiciones a, b y c, respectivamente.

En la tabla 11 se indica un ejemplo de cálculo manual.

6.1.7 Límite de aceptabilidad

La desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (SIR) del método verificado debe ser  2 ×
el valor medio más bajo de la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio (SR) de los
artículos (alimentarios) utilizados en el estudio de validación. Cuando se determina un valor único (SR)
durante el estudio de validación, el (SIR) del método verificado debe ser ≤ 2 × la desviación estándar de
la reproducibilidad entre laboratorios (SR).

El capítulo 8 proporciona un resumen de los límites de aceptabilidad.

EJEMPLO
– El laboratorio usuario ha examinado 12 muestras de laboratorio de tiramisú para determinar la concentración
de Enterobacteriaceae (según la Norma ISO 21528-2) siguiendo el protocolo de estudio que se indica en la
figura 7. Se obtuvieron los resultados (calculados en ufc/g en las porciones para análisis A y B de la muestra de
laboratorio) que se muestran en la tabla 10.

Tabla 10 – Resultados del ensayo

Nivel de
Número de Resultado A Resultado B Log10 resultado A Log10 resultado B
contaminación
muestra de (xiA) (xiB) yiA = log10(xiA) yiB = log10(xiB)
previsto
laboratorio
cfu/g cfu/g cfu/g
1 30 < 40 (10) < 40 (30) ≤ 1,60 ≤ 1,60
2 300 110 182 2,04 2,26
3 300 410 620 2,61 2,79
4 600 640 330 2,81 2,52
5 600 690 570 2,84 2,76
6 600 780 640 2,89 2,81
7 600 620 1 300 2,79 3,11
8 600 870 1 500 2,94 3,18
9 6 000 8 600 6 400 3,93 3,81
10 6 000 16 000 5 000 4,20 3,70
11 6 000 > 15 000 13 400 > 4,18 4,13
12 30 000 20 000 32 000 4,30 4,51

– Los resultados de las muestras de laboratorio 1 y 11 no se pueden utilizar porque uno de los recuentos
fue demasiado alto (resultado ">") o demasiado bajo (por debajo del rango de recuento permitido
según la Norma ISO 7218). Se dispone de los resultados de diez muestras de laboratorio para el
cálculo.

– A partir de las diez muestras de laboratorio restantes, el SIR se puede calcular como se muestra en la
tabla 11.

Tabla 11 – Cálculo de la SIR

Número de
Diferencia Diferencia al
muestra de Log10 resultado A Log10 resultado B
absoluta cuadrado
laboratorio
yiA = log10(xiA) yiB = log10(xiB) |yiA – yiB| |yiA – yiB|2
1 ≤ 1,602 1 ≤ 1,602 1 No utilizado No utilizado
2 2,041 4 2,260 1 0,218 7 0,047 8
3 2,612 8 2,792 4 0,179 6 0,032 3
4 2,806 2 2,518 5 0,287 7 0,082 8
5 2,838 8 2,755 9 0,083 0 0,006 9
6 2,892 1 2,806 2 0,085 9 0,007 4
7 2,792 4 3,113 9 0,321 6 0,103 4
8 2,939 5 3,176 1 0,236 6 0,056 0
9 3,934 5 3,806 2 0,128 3 0,016 5
10 4,204 1 3,699 0 0,505 1 0,255 2
11 > 4,176 1 4,127 1 No utilizado No utilizado
12 4,301 0 4,505 1 0,204 1 0,041 7
Suma 0,650 0
Suma/(2 × 10) 0,032 5
SIR = √(0,032 5) 0,18

– El valor SIR calculado de 0,18 se compara con los resultados del estudio de validación (datos tomados
de la Norma ISO 21528-2). La tabla 12 enumera los valores de SR obtenidos de este estudio de
validación.

Tabla 12 – Resumen de los valores de SR obtenidos

del estudio de validación de la Norma ISO 21528-2

Valores de SR obtenidos del estudio de validación

Artículo (alimentario) Valores medios de

Nivel bajo de Nivel intermedio Nivel alto de
tres niveles de
inoculación de inoculación inoculación
inoculación
Ovoproducto 0,32 0,50 0,48 0,43
Carne cruda 0,28 0,36 0,57 0,40
Pienso 0,18 0,17 0,20 0,18
Leche pasteurizada 0,24 0,18 0,19 0,20
Tiramisú 0,22 0,28 0,13 0,21

– El experimento está diseñado para no considerar el efecto del artículo (alimentario). El SIR resultante
se compara con el SR de uno de los artículos (alimentarios) ensayados en el estudio de validación. En
este ejemplo, el valor medio más bajo de SR fue 0,18 (para pienso).

– El SIR obtenido en el estudio de verificación (0,18) se evalúa frente al 2 × SR (2 × 0,18) obtenido

después del estudio de validación.

– Dado que la SIR del estudio de verificación (0,18) es menor o igual que 0,36 (2 × 0,18), la conclusión
es que se cumple el límite de aceptabilidad para la verificación de la implementación.

NOTA Cuando solo se determina un valor de SR durante el estudio de validación, el valor de SIR se compara con este valor de SR.

6.1.8 Análisis de las causas

Cuando el resultado de la verificación no cumple con los límites de aceptabilidad, se realiza un análisis
de las causas para proporcionar una explicación de los resultados observados.

Puede ser útil repetir una verificación de un método alternativo validado en paralelo con el método de
referencia validado en ese artículo (alimentario). Esto permite identificar si ese artículo (alimentario)
se comporta de la misma manera con los dos métodos implementados por el laboratorio usuario.

Se debe realizar un análisis de las causas para determinar los siguientes problemas (entre otros):

– error analítico debido a un incumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio;

– error analítico durante la aplicación del protocolo (por ejemplo, nivel de inoculación incorrecto);

Una vez identificados los problemas, se toman acciones correctivas y se repite el experimento.

Se puede registrar la información (basada en investigaciones, por ejemplo, el análisis de las causas) en
el informe del estudio de verificación para explicar los resultados.

6.2 Determinación de la desviación estimada (eBias)

6.2.1 Generalidades
La determinación de la eBias se aplica solo a la verificación del artículo (alimentario) (véase la tabla 2).

Durante la verificación de los artículos (alimentarios), se lleva a cabo todo el protocolo del método como
se describe, incluido el procedimiento de confirmación (si existe uno) para cada muestra de ensayo.

6.2.2 Diseño experimental

El protocolo debe realizarse de la siguiente manera.

– Se seleccionan el/los artículo(s) (alimentario(s)) que se van a analizar (véase 6.2.3).

– Se contaminan artificialmente el/los artículo(s) (alimentario(s)) a tres niveles de inoculación que

cubran el rango de uso del método por parte del laboratorio usuario. La contaminación artificial se
realiza en la suspensión inicial. Cada nivel se realiza por duplicado. Se utiliza preferiblemente
una muestra de laboratorio diferente o un lote diferente que consista en el mismo artículo(s)
(alimentario(s)) para cada uno de los tres niveles de inoculación.

– Se enumeran, utilizando el método que se va a verificar, el artículo (alimentario) contaminado

artificialmente y la suspensión (cultivo puro) utilizada para inocular el artículo (alimentario).

– Se analiza la porción para análisis sin inocular para cada muestra de laboratorio o lote, para determinar
el nivel de contaminación de base. Los resultados de estos controles negativos se registran y pueden
proporcionar información útil cuando se requiere un análisis de las causas (véase 6.2.7).

Para más recomendaciones y ejemplos, véase también el capítulo D.2.

6.2.3 Selección de artículos (alimentarios)

Para la verificación de artículos (alimentarios), el laboratorio usuario debe analizar al menos un artículo
(alimentario), preferiblemente un artículo difícil, de cada categoría (de alimento) requerida. En el
apartado 4.4 se proporciona información detallada sobre el número requerido de categorías (de alimentos)
que hay que analizar de acuerdo con el alcance de la validación o el alcance del laboratorio. El anexo B
proporciona recomendaciones sobre cómo elegir artículos (alimentarios) difíciles.

6.2.4 Contaminación artificial

6.2.4.1 Selección de cepas

Las cepas pueden provenir de:

– colecciones de cultivos;

– colecciones del laboratorio usuario;

– materiales de referencia (incluidos materiales de referencia comerciales, por ejemplo, una cepa
liofilizada de concentración conocida).

Al seleccionar las cepas de ensayo, la mayoría debería provenir de las categorías (de alimentos) elegidas
para el estudio de verificación y cubrir el rango reconocida del analito objeto de estudio con respecto a
la diversidad de características identificativas (por ejemplo, bioquímicas, serotipo o fagotipo), distribución
geográfica e incidencia (véase el anexo E de la Norma ISO 16140-2:2016).

NOTA Preferiblemente, las cepas utilizadas en la verificación proceden de fuentes apropiadas para el artículo (alimentario)
que se está verificando y se utiliza una cepa diferente para cada uno de los artículos (alimentarios) analizados.

6.2.4.2 Inoculación de porciones para análisis

Al inocular las porciones para análisis, los tres niveles de contaminación utilizados deben ser
representativos del rango de contaminación natural observado en las muestras de laboratorio
analizadas en el laboratorio usuario.

NOTA 1 Si el laboratorio usuario define más de tres niveles de inóculo (por ejemplo, cinco o seis), es más probable que logre
los tres niveles requeridos para los estudios de comparación.

Las siguientes recomendaciones se dan como ejemplos de procedimientos adecuados para producir
inóculos.

– La cepa seleccionada se cultiva en un medio de cultivo cuyas condiciones permitan un crecimiento

óptimo de la cepa (por ejemplo, cultivo “durante toda la noche”). Se siguen los procedimientos
especificados en el apartado 5.4 de la Norma ISO 11133:2014.

NOTA 2 En este documento, el cultivo “durante toda la noche ” corresponde a entre 16 h y 24 h de incubación .

– Se repite el cultivo en las mismas condiciones y se tiene en cuenta la concentración previamente

determinada para preparar diluciones que cubran el rango de contaminación objetivo. Este paso no
es necesario si el laboratorio usuario conoce la estabilidad de la cepa (por ejemplo, viabilidad
después del almacenamiento durante toda la noche a 4 °C).

Si el laboratorio usuario trabaja con cepas listas para usar con niveles conocidos (por ejemplo, material
de referencia), los pasos descritos anteriormente no son necesarios.

El inóculo preparado se introduce directamente en la suspensión inicial de cada muestra de ensayo. Se

mezcla totalmente la suspensión después de la inoculación. Se recomienda el uso de cultivos estresados,
pero no es obligatorio (véase el anexo C de la Norma ISO 16140-2:2016).

EJEMPLO Un laboratorio usuario espera encontrar entre 10 2 ufc/g y 106 ufc/g en las muestras enviadas. El
estudio de verificación requirió la inoculación de la suspensión inicial a los niveles de 101 ufc/ml,
103 ufc/ml y 105 ufc/ml (siendo la suspensión inicial una dilución decimal de la muestra de ensayo,
esto equivale a 102 ufc/g, 104 ufc/g y 106 ufc/g de la porción para análisis). Se asume que la porción
para análisis pesa 10 g y el volumen final de la suspensión inicial es de 100 ml.

– Se preparó un cultivo fresco “durante toda la noche” del microorganismo requerido (véase 6.2.4.1) y
se supuso que contenía, según mediciones/experimentos previos, 107 ufc/ml. Para la inoculación, se
prepararon diluciones decimales apropiadas, que cubrían el intervalo objetivo de 10 3 ufc/ml a 107
ufc/ml (= cultivo “durante toda la noche” sin diluir).

– Se transfirió 1 ml de inóculo a suspensiones iniciales duplicadas, dando concentraciones supuestas

en las suspensiones iniciales de 101 ufc/ml, 103 ufc/ml y 105 ufc/ml (es decir, 102 ufc /g, 104 ufc/g y
106 ufc/g en las porciones para análisis). Se incluyó una porción para análisis sin inocular. Se
utilizaron diluciones adicionales (que cubren un intervalo más amplio de 100 ufc/ml a 106 ufc/ml de
suspensiones madre) porque en este momento no se conoce la concentración real de microorganismos
en el inóculo.

– A continuación, la porción para análisis sin inocular y cada una de las suspensiones iniciales inoculadas
se enumeraron usando el método a verificar.

– También se enumeraron el cultivo “durante toda la noche” y sus diluciones, utilizadas para inocular
las suspensiones iniciales, utilizando el método a verificar, para determinar la concentración real de
microorganismos.

– Sin embargo, después de la incubación y el recuento del inóculo, se determinó que el cultivo “durante
toda la noche” en realidad contenía 5 × 108 ufc/ml (es decir, 1 log10 > el nivel esperado). Por lo tanto,
los niveles reales en las suspensiones iniciales variaron de 10 2 ufc/ml a 106 ufc/ml, y los niveles
calculados en las porciones para análisis variaron de 103 ufc/g a 107 ufc/g.

– Debido a las diluciones adicionales utilizadas, el laboratorio usuario pudo seleccionar los resultados
correspondientes a 102 ufc g, 104 ufc /g y 106 ufc/g de la porción para análisis (101 ufc/ml, 103 ufc/ml
y 105 ufc/ml de las suspensiones iniciales) y comparar los resultados reales aplicables para el método
que se estaba verificando, con los recuentos de inóculo.

6.2.5 Evaluación de resultados

Se comparan los resultados del artículo (alimentario) contaminado artificialmente con los resultados de
la suspensión de inóculo [que es la suspensión específica (diluida) utilizada para contaminar la suspensión
inicial del artículo (alimentario)]. El artículo (alimentario) y la suspensión de inóculo específica (diluida)
se analizan utilizando el método a verificar.

Para la comparación, los resultados aplicables al artículo (alimentario) deben expresarse en log10
ufc/porción para análisis y los resultados aplicables a la suspensión de inóculo deben expresarse en
log10 ufc/ml.

Los resultados de la porción para análisis sin inocular (control negativo) proporcionan información
sobre el nivel de contaminación natural, si la hay, del artículo (alimentario) por los microorganismos
objeto de estudio.

6.2.6 Límite de aceptabilidad

Se espera que, en cada nivel, la diferencia absoluta entre los resultados del artículo (alimentario)
contaminado artificialmente en log10 ufc/porción para análisis y los de la suspensión de inóculo sea igual
o inferior a 0,5 log10. Sin embargo, este no es necesariamente el caso si el artículo (alimentario) utilizado
estaba contaminado naturalmente antes de la inoculación. Los resultados de las muestras sin inocular
(controles negativos) pueden ser útiles cuando se requiere un análisis de las causas (véase 6.2.7).

El capítulo 8 proporciona un resumen de los límites de aceptabilidad.

EJEMPLO El laboratorio usuario desea verificar el eBias de un método alternativo validado para el recuento de
Enterobacteriaceae, utilizando el artículo (alimentario) "pasta hervida". El rango de contaminación
esperado está entre 102 ufc/g y 104 ufc/g. Los resultados de los ensayos se muestran en la tabla 13.

Tabla 13 – Resultados del ensayo obtenidos con el método a verificar

Para comparación eBias:

diferencia
Resultado absoluta entre
medio Resultado resultados de
Resultado
Artículo Artículo artículo
Suspensión de
(alimentario) (alimentario) (alimentario)
inóculo [sin
contaminado contaminado contaminado
artículo
artificialmente artificialmente artificialmente en
(alimentario)]
(log10 ufc/g (log10 cfu/ cada porción para
artículo
o ml)a porción para análisis y la
(log10 cfu/ml)
análisis)a suspensión de
inóculo
Muestra de laboratorio 1
(de lote 1), porción para
análisis 1 2,06
(promedio de 3,06 3,17 0,11
Muestra de laboratorio 1 1,87 y 2,25)
(de lote 1), porción para
análisis 2
Muestra de laboratorio 2
(de lote 2), porción para
análisis 1 3,11
(promedio de 4,11 4,05 0,06
Muestra de laboratorio 2 3,16 y 3,06)
(de lote 2), porción para
análisis 2
Muestra de laboratorio 3
(de lote 3), porción para
análisis 1 3,99
(promedio de 4,99 5,29 0,30
Muestra de laboratorio 3 3,93 y 4,04)
(de lote 3), porción para
análisis 2
a Este ejemplo se basa en el uso de una porción para análisis de 10 g inoculada con 1 ml de inóculo.

Los resultados indican que, en cada nivel de contaminación, la diferencia absoluta entre los dos resultados
es inferior a 0,5 log10, lo que significa que el método a verificar está funcionando correctamente en el
laboratorio usuario.

6.2.7 Análisis de las causas

Cuando el resultado de la verificación no cumple con los límites de aceptabilidad, se realiza un análisis
de las causas para proporcionar una explicación de los resultados observados.

Se debe realizar un análisis de las causas para determinar los siguientes problemas (entre otros):

– error analítico debido a un incumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio;

– error analítico durante la aplicación del protocolo (por ejemplo, nivel de inoculación incorrecto);

Una vez que se identifican los problemas, se toman las acciones correctivas y se repite el ensayo.

La información (basada en la investigación, por ejemplo, el análisis de la causa principal) se puede

proporcionar en el informe del estudio de verificación para explicar los resultados cuando el eBias es
> 0,5 log10 ufc/g.

7 Métodos alternativos validados de confirmación y tipaje. Protocolo de

verificación técnica

7.1 Generalidades
La verificación de métodos alternativos validados de confirmación y tipaje microbiológico solo requieren
la verificación de la implementación. La muestra es una colonia aislada en placas definidas de agar
selectivo o no selectivo.

7.2 Verificación de la implementación

La verificación de la implementación sirve para demostrar que el laboratorio usuario es capaz de
implementar el método alternativo validado de confirmación o tipaje. Esto se demuestra por su
capacidad para obtener los resultados esperados en una colonia aislada de uno o más agares selectivos
o no selectivos especificados.

El laboratorio usuario debe:

– revisar los datos de validación relacionados con el método (los datos de validación se pueden
consultar en el informe de validación de los métodos alternativos);

– seleccionar una placa de agar selectivo utilizado durante el estudio de validación que, si es posible,
pertenezca al alcance del laboratorio;

– utilizar esta placa de agar selectivo para verificar la implementación. Si no se ha ensayado una placa
de agar selectivo, se selecciona y utiliza una placa de agar no selectivo utilizada durante el estudio de
validación para llevar a cabo la implementación.

NOTA En el anexo E se dan ejemplos detallados de cómo verificar un método de confirmación alternativo y un método de
tipaje alternativo.

7.3 Diseño experimental

7.3.1 Generalidades
Para la verificación de la implementación, el número de cepas que se tienen que ensayar se proporciona
en la tabla 14.

Tabla 14 –Número de cepas para la verificación de la implementación

de los métodos alternativos validados de confirmación o tipaje

Estudio de Estudio de
Nivel de la confirmación
inclusividad exclusividad
Familia
Género
5 5
Especie
(Sub)tipo microbiano (por ejemplo, serotipo de la Salmonella)

7.3.2 Selección de cepas

Las cepas pueden provenir de:

– colecciones de cultivos;

– colecciones del laboratorio usuario;

– materiales de referencia (incluidos materiales de referencia comerciales, por ejemplo, cepas

liofilizadas).

Al seleccionar las cepas de ensayo, la mayoría debería provenir de las categorías (de alimentos) dentro
del alcance del laboratorio y cubrir el rango reconocido del analito objeto de estudio con respecto a la
diversidad de características identificativas (por ejemplo, bioquímicas, serotipo, fagotipo), distribución
geográfica e incidencia (véase el anexo E de la Norma ISO 16140-2:2016).

Para la verificación de la implementación, se seleccionan cinco cepas objeto de estudio y cinco cepas no
objeto de estudio para los estudios de inclusividad y de exclusividad, respectivamente. La selección de
cepas puede basarse en las cepas ensayadas durante el estudio de validación. Las cepas de exclusividad
deben ser relevantes (por ejemplo, L. innocua debe seleccionarse para un método alternativo validado
para confirmar L. monocytogenes).

7.4 Evaluación de resultados

Se ensayan las cepas de inclusividad y exclusividad seleccionadas de acuerdo con el método alternativo
validado de confirmación o tipaje que se está verificando.

Los resultados de los estudios de inclusividad y exclusividad se presentan como se muestra en la

tabla 15. Se registran las concordancia y discrepancias entre la confirmación esperada o el resultado de
tipaje y el resultado del método de confirmación o tipaje que se está verificando.

Tabla 15 – Resumen de los resultados de la verificación para un método

alternativo validado de confirmación o tipaje

Resultado del
Confirmación
Cepas Inclusividad/ Características método de
esperada/ Interpretacióna
ensayadas exclusividad de las cepas confirmación/
resultado de tipaje
tipaje a verificar
1
2
…
9
10
a Concordancia o discrepancia entre el resultado esperado y el resultado del método de confirmación o tipaje ensayado.
NOTA Las características de las cepas individuales son, como mínimo: el nombre de la cepa, el número de la colección (de
cultivo) y el origen de la cepa. También se pueden añadir otras características disponibles.

7.5 Límite de aceptabilidad

El resultado del método alternativo verificado de confirmación o tipaje debe ser idéntico al resultado de
confirmación o tipaje esperado para todas las cepas ensayadas. Por tanto, debería obtenerse una
concordancia del 100%.

7.6 Análisis de causa principal

Cuando el resultado no cumpla el límite de aceptabilidad, se realiza un análisis de las causas para
explicar los resultados observados.

Se debe realizar un análisis de las causas para determinar los siguientes problemas (entre otros):

– error analítico debido a un incumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio;

– error analítico al aplicar el protocolo (por ejemplo, tiempo o temperatura de incubación incorrectos);

– formulación del (de los) medio(s) de cultivo;

– identidad correcta de las cepas de ensayo.

8 Resumen de los límites de aceptabilidad aplicables a la verificación de métodos

validados
La tabla 16 resume los límites de aceptabilidad que se utilizan para la verificación de métodos validados.

Como se indica en los apartados 4.3 y 5.6, el LOD50 del estudio de validación y el eLOD50 de la verificación
solo son válidos y aceptables si ambos provienen de porciones para análisis del mismo tamaño (o de un
tamaño de muestra más pequeño en caso de que el laboratorio usuario lo use habitualmente).

Tabla 16 – Límites de aceptabilidad aplicables a la verificación de métodos validados

Método Características de rendimiento Límites de aceptabilidad

Para los protocolos 1 y 2: eLOD50 ≤ 4  LOD50
Cualitativo eLOD50 Para el protocolo 3: ≥ 6 de 7
resultados positivos

SIR ≤ 2  valor medio más bajo de SRa

SIR
determinado durante el estudio de validación

Cuantitativo | log10 ufc/ml (inóculo) - promedio log10

ufc/porción para análisis (artículo
eBias [alimentario] contaminado artificialmente) |
≤ 0,5 log10 para cada uno de los niveles de
inoculación

Confirmación
Inclusividad y exclusividad Concordancia del 100% entre métodos
o tipaje

a SIR  2  SR para estudios de validación con un solo valor de SR.

Anexo A (Informativo)

Clasificación de categorías (de alimentos) y combinaciones

objeto de estudio sugeridas para estudios de verificación

La tabla A.1 proporciona la clasificación de alimentos, piensos, muestras de producción primaria y

muestras ambientales para guiar a los laboratorios usuarios en la selección de artículos (alimentarios)
en sus categorías (de alimentos) correspondientes para la verificación del método.

Las propiedades intrínsecas de los alimentos, como los niveles de microbiota basal, el contenido de
grasa, el pH, el contenido de sal, la actividad del agua y la presencia de compuestos antimicrobianos,
pueden tener una influencia sustancial en el resultado de un método. En la clasificación de los alimentos,
se tuvieron en cuenta las principales propiedades fisicoquímicas de los alimentos, en la medida de lo
posible.

Las autoridades reguladoras en diferentes jurisdicciones pueden tener requisitos ligeramente diferentes
para la clasificación de alimentos.

Puntos que hay que considerar al usar la tabla A.1:

– El anexo A de la Norma ISO 16140-2:2016 es la fuente de la tabla A.1 y las notas aparecen en la parte
inferior de la tabla;

– el símbolo "Y" en la tabla A.1 indica que, para esta muestra, es relevante analizar el microorganismo
indicado;

– AHI es la abreviatura de "alimento de humedad intermedia".

Tabla A.1 – Clasificación de muestras y su relevancia para las pruebas de varios microorganismos
E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Leche cruda Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Leche cruda o Leche cruda
leche fermen- fermentada/
tada/acidi- acidificada,
ficada (no yogures a base
sometida a Y Y Y Y Y Y Y
de leche cruda,
tratamiento bebidas lácteas a
térmico) base de leche
cruda
Mantequilla
Productos Y Y Y Y Y Y Y
cruda
lácteos y leche
cruda Productos a Nata cruda Y Y Y Y Y Y Y
base de leche
Quesos curados y
cruda, con un
semicurados (por
alto contenido Y Y Y Y Y Y Y
ejemplo, Comté,
de materia
Beaufort)
grasa o
microbiota Quesos azules
Y Y Y Y Y Y Y
basal (Roquefort)
abundante
Quesos suaves
(por ejemplo, Y Y Y Y Y Y Y
Brie, Munster)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Productos Postres lácteos,
lácteos helados, bebidas, Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
pasteurizados nata
Productos
Leche UHT,
lácteos esterili-
conservas de Y
zados o some-
nata o leche
tidos a UHT
Leche pasteuri-
zada acidificada/
fermentada, Y Y Y Y Y Y Y Y
yogures,
productos lácteos
Leche y Leche
Y Y Y Y Y Y Y Y
productos pasteurizada
lácteos
Mantequilla Y Y Y Y Y Y Y
sometidos a
tratamiento Nata Y Y Y Y Y Y Y
térmico
Productos a Quesos curados y
base de leche semicurados
pasteurizados (sometidos a
tratamiento
Y Y Y Y Y Y
térmico) (por
ejemplo, Comté,
Emmental,
Gouda)
Quesos azules
Y Y Y Y Y
(Blue de Bresse)
Quesos suaves
(por ejemplo, Y Y Y Y Y Y
Brie, Munster)

Secos Productos en
polvo para hacer Y Y Y Y Y Y Y Y
postres lácteos
Canales, carne al
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
corte, carpacho
Carne picada,
Carne cruda y Carne fresca preparados de Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
productos (no carne, carpacho
cárnicos listos transformada) Canales,
para cocinar (a torundas,
excepción de Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
líquidos de
las aves de lavado
corral)
Hamburguesas
Lista para
congeladas,
cocinar Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
brochetas de
(transformada)
ternera marinada
Productos
Jamón cocido,
cárnicos Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
paté
cocinados
Productos Productos
cárnicos listos cárnicos
Salami Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
para comer, fermentados o
listos para desecados
recalentar
Curados
crudos Filetes de
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
(ahumados) Sajonia, manteca
(aw > 0,92)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Curados
Jamón de
crudos
Cobourg, jamón Y Y Y Y Y Y Y Y
(ahumados)
curado seco
(aw < 0,92)
Conservas
cárnicas
Ternera en
(estable a Y Y Y
salmuera
temperatura
ambiente)
Canales, carne, al
Y Y Y Y Y Y Y Y
corte
Canales,
Carne fresca torundas,
Y Y Y Y Y Y Y Y
(no transfor- líquidos de
Productos de mada) lavado
aves de corral Carne picada,
crudos y listos preparados de Y Y Y Y Y Y Y Y
para cocinar carne
Productos
listos para
Pechugas de
cocinar Y Y Y Y Y Y Y Y
pollo sazonadas
(transfor-
mados)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Productos
Filete de pavo
cárnicos Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
cocinado
cocinados
Productos
cárnicos Salchichas de
Productos Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
fermentados o pollo
cárnicos de desecados
aves de corral
listos para Curados
comer, listos crudos Filetes de pavo
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
para recalentar (ahumados) ahumados
(aw > 0,92)
Conservas Conservas de
(estables a carne de ave de
Y Y Y
temperatura corral , conservas
ambiente) de paté de pato
Huevos (sin Huevos con
Y Y Y Y Y Y Y Y
procesar) cáscara
Productos
derivados del
huevo Yema de huevo,
(sometidos a clara de huevo,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
tratamiento huevo líquido
Huevos y térmico) con completo
productos aditivos (sal o
(derivados) del azúcar > 2%)
huevo
Productos
derivados del Yema de huevo,
huevo (someti- clara de huevo,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
dos a trata- huevo líquido
miento térmi- completo
co) sin aditivos
Secos Huevo en polvo Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Productos
derivados de
crustáceos
Productos de
cocinados con y
pescadería Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
sin cáscara,
cocinados
pescado y
terrinas de
marisco
Productos de
pescadería Rollo de arenque,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
acidificados y anchoas
marinados
Productos
Productos de ahumados o
pescadería curados y
Pescado
listos para otros Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
ahumado
comer, listos productos
para recalentar transformados
(aw > 0,92)
Productos
ahumados o Pescado
curados y ahumado,
otros pescado Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
productos desecado
transformados (salado)
(aw < 0,92)
Conservas
Conservas de
(pescado
pescado,
estable a Y Y Y
conservas de
temperatura
cangrejo
ambiente)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Fruta cortada
lista para Mezclas de frutas Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
comer
Bolsas de zana-
Verduras y horia triturada,
hortalizas ensaladas y hojas
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
cortadas listas de verduras y
para comer hortalizas
cortadas
Patatas, ñames,
Productos
batatas,
cultivados en
mandiocas,
Fruta y el interior o en Y Y Y Y Y Y Y Y
dalias,
productos contacto con el
zanahorias,
frescos suelo
crucíferas
Soja, alholva,
Brotes Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
alfalfa, soja verde
Zumos de Batidos, zumo de
frutas/verdu- fresas recién
ras y hortalizas exprimido, Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
crudas (no licuados, zumo
pasteurizadas) de zanahoria
Albahaca,
Vegetales de cilantro,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
hoja verde cebolleta, lechuga
y perejil

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Frutas, verdu-
ras y hortalizas
(no transfor-
Cultivos Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
madas) no
incluidas en las
anteriores
Zumos de
frutas/
verduras y Zumo de
hortalizas manzana Y Y Y Y Y Y Y
sometidos a pasteurizado
tratamiento
térmico
Frutas,
verduras y
hortalizas en
Conservas de
Frutas, conserva Y Y Y
piña
verduras y (estables a
hortalizas temperatura
transformadas ambiente)
Frutas, Espinacas
verduras y escaldadas,
hortalizas verduras y
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
sometidas a hortalizas
tratamiento cocidas
térmico escaldadas
Verduras y
hortalizas Col fermentada,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
fermentadas/ encurtidos
acidificadas

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Frutas de
Siropes,
contenido de
concentrados,
agua bajo e
mermeladas, Y Y Y Y Y
intermedio
ciruelas pasas
(IMF)
semi-secas
(aw < 0,85)
Especias, hierbas,
Condimentos Y Y Y Y Y
pimientas
Frutos secos,
Verduras y frutos secos
Frutos secos y
hortalizas, pelados, manteca Y Y Y Y Y Y Y
semillas
semillas, frutos de frutos secos,
secos, fruta y semillas
cereales secos Frutas,
verduras y Verduras y
hortalizas hortalizas Y Y Y Y Y Y
desecadas liofilizadas
(aw < 0,60)
Maíz, avena,
Cereales secos cereales de Y Y Y Y Y Y
desayuno
Trigo, trigo
Harinas Y Y Y Y Y Y
sarraceno, avena

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Cultivos en polvo
secados por
Ingredientes
pulverización, Y Y Y Y Y Y Y Y
probióticos
previamente
mezclados
Leche
deshidratada,
Ingredientes yogur
Y Y Y Y Y Y Y Y
sin probióticos deshidratado,
frutas de baya
deshidratadas
Fórmula de
Fórmulas Fórmulas refuerzo a base
infantiles y infantiles sin de suero (lácteo), Y Y Y Y Y Y Y Y
cereales probióticos a base de soja
infantiles (vegetal)
Fórmula de
Fórmulas refuerzo a base
infantiles de suero (lácteo), Y Y Y Y Y Y Y Y
probióticas a base de soja
(vegetal)
Cereales
Cereales
infantiles sin Y Y Y Y Y Y Y Y
infantiles
probióticos
Cereales Cereales
infantiles probióticos Y Y Y Y Y Y
probióticos infantiles

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Productos de
panadería y
Repostería Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
pastelería con
crema, dulces
Productos Mezclas para
Y Y Y Y Y Y Y
secos en polvo tartas
Productos con
un bajo Galletas saladas,
Y Y Y Y Y
contenido de panes, galletas
agua
Chocolate,
productos de Productos
panadería y secos
pastelería, azucarados y Bizcochos,
confitería con un bajo bombones, Y Y Y Y Y
contenido de mazapán
agua
(aw < 0,85)
Productos
secos Galletas,
azucarados y chocolate, dulces,
con un bajo miel, azúcar, Y Y Y Y Y
contenido de siropes de
agua caramelo
(aw < 0,65)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Alimentos
mixtos con una Ensaladas de
proporción pasta
sustancial de refrigeradas,
ingredientes sándwiches, Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
crudos mousse de
(excluyendo chocolate,
los productos bavaroise
de repostería)
Alimentos
mixtos Comidas
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
transformados calientes
(cocinados)
Alimentos de
Alimentos
múltiples
Alimentos cocinados
componentes o
listos para enfriados, arroz o
componentes Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
(re)calentar: pasta hervida,
de comidas
refrigerados volovanes al
vacío
Alimentos Croissants
listos para rellenos, patatas
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
(re)calentar: fritas congeladas,
congelados pizza
Alimentos
listos para
(re)calentar: Volovanes en
estables a recipientes de Y Y Y
temperatura vidrio
ambiente
(conservas)

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Alimentos
Sopas
listos para
(instantáneas) Y Y Y Y Y Y Y
(re)calentar:
deshidratadas
secos
Ensaladas de
mayonesa con
Ensaladas de
productos de
verduras y
charcutería Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
hortalizas crudas
(ácidas) con
con aliño
ingredientes
Alimentos de crudos
múltiples
componentes o Ensaladas de
componentes mayonesa con
de comidas productos de
Pastas untables
charcutería Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
en sándwiches
(ácidas) con
ingredientes
transformados
Alimentos
ácidos Ketchup, salsas,
(pH < 4,8) aliños,
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
estables a mayonesas,
temperatura mostaza
ambiente

E. coli
produc-
toras de Bacillus Clostridium Clostridium
Estafilo- Yersinia
Recuen- Bacte- Sal- toxina cereus perfringens botulinum
Artículos Leva- Entero- cocos Liste- L. mono- Crono- enteroli-
to total rias del Escheri mo- Shiga Campy- Vibrio (esporas (esporas (esporas
Categorías Tipos (algunos duras y bacte- positivos ria cyto- bacter tica
de ácido chiacoli nella (STEC; lobacter spp. o células o células o células
ejemplos) mohos riacae para spp. genes spp. (pato-
viables láctico spp. shiga- vegeta- vegeta- vegeta-
coagulasa génica)
toxin tivas) tivas) tivas)
producing
E. coli)
Harina de huesos
y carne, harina de
Ingredientes plumas y carne
de origen de pollo, harina Y Y Y Y Y Y Y Y
animal de pescado,
digestatos de
origen animal
Harina de maíz,
Ingredientes
harina de soja,
de origen Y Y Y Y Y Y Y
verduras y
vegetal
hortalizas
Productos
microbiológicos
Alimentos para Otros tales como
Y Y Y Y Y Y Y
mascotas y ingredientes extractos de
alimentos para levadura,
animales probióticos
Alimentos
secos Pellets, snacks Y Y Y Y Y Y Y
(aw ≤ 0,7)
Alimentos Carne fresca,
húmedos salchichas, Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
(aw > 0,7) croquetas
Conservas Carne, pescado Y
Productos
alimenticios
para animales
Cereales, harinas Y Y Y Y Y Y Y
(bovinos,
ovinos,
porcinos)

Muestras de
torundas
Heces de
(calzas), Y Y Y Y
Muestras de animales
muestras fecales
producción de recto
primaria (PPS;
primary Muestras de
Muestras
production polvo, torundas
ambientales y
samples) higiénicas, agua
muestras Y Y Y Y
de bebederos,
distintas de
yacija, muestras
heces
de incubadoras

NOTA 1 Si procede, algunas categorías o artículos pueden agruparse o dividirse.

NOTA 2 Algunos organismos reguladores han definido requisitos específicos para que el estudio de validación esté reconocido
por las autoridades, por ejemplo, véanse las referencias [17], [18] y [19]).

NOTA 3 Los productos sin transformar de acuerdo con el Reglamento (CE) nº 852/2004[15] se definen como “los productos
alimenticios que no hayan sido sometidos a una transformación, incluyendo los productos que se hayan dividido,
partido, seccionado, rebanado, deshuesado, picado, pelado o desollado, triturado, cortado, limpiado, desgrasado,
descascarillado, molido, refrigerado, congelado, ultracongelado o descongelado”. No se incluyen los procesos sanitarios
autorizados por algunas jurisdicciones. Por tanto, es necesaria una distinción entre productos crudos no sujetos y
productos sujetos a procesos sanitarios. Diferentes jurisdicciones tienen diferentes definiciones de productos
transformados y sin transformar. Es importante consultar con la autoridad competente de la jurisdicción.

EJEMPLO El término "carne fresca" [véase el Reglamento (CE) nº 853/2004[16]] designa la carne que no ha sido
sometida a procesos de conservación distintos de la refrigeración, la congelación o la ultracongelación,
incluida la carne envasada al vacío o envasada en atmósfera controlada.

NOTA 4 La transformación de acuerdo con el Reglamento (CE) nº 852/2004[15] se define como "que altere sustancialmente el
producto inicial, incluido el tratamiento térmico, el ahumado, el curado, la maduración, el secado, el marinado, la
extracción, la extrusión o una combinación de esos procedimientos”. Los productos transformados pueden contener
ingredientes necesarios para su fabricación o darles características especiales. Diferentes jurisdicciones tienen diferentes
definiciones de productos transformados y sin transformar. Es importante consultar con la autoridad competente de
la jurisdicción.

NOTA 5 Las preparaciones de carne picada incluyen carne en trozos, cortada o picada (con < 1% de NaCl o de especias),
diseñadas para ser sometidas a tratamiento térmico antes de su consumo, y presentadas en forma de: condimentada,
marinada, recubierta, con hierbas y especias, o con otros ingredientes añadidos para mejorar su textura o las
propiedades sensoriales.

NOTA 6 Las preparaciones de carne de aves de corral incluyen los cortes de carne especiados y marinados, los filetes de pollo
y las alitas de pollo, es decir, la estructura intacta con o sin la piel.

NOTA 7 Los mariscos incluyen a los moluscos bivalvos vivos y, por analogía, a los tunicados, equinodermos y gasterópodos
marinos.

NOTA 8 Alimentos listos para comer (RTE; ready to eat): Alimentos que el productor o el fabricante destina al consumo
humano directo sin necesidad de que se cocinen o que se sometan a otro tipo de procesamiento efectivo con el que
reducir el nivel de microorganismos objeto de estudio a un nivel aceptable.

NOTA 9 Alimentos listos para cocinar (RTC; ready to cook): Alimentos que el productor o el fabricante diseña para que se
cocinen o se sometan a otro procesamiento efectivo para eliminar o reducir el nivel de microorganismos objeto de
estudio hasta un nivel aceptable.

NOTA 10 Alimentos listos para recalentar (RTRH; ready to re-heat): Alimentos que el productor o el fabricante diseñan como
aptos para el consumo humano directo sin necesidad de que se cocinen, pero que pueden mejorar sus propiedades
organolépticas si se calientan antes de su consumo.

NOTA 11 Consúltese el Reglamento (CE) nº 79/373/CEE[14] sobre las definiciones de los productos alimenticios para
animales.

NOTA 12 El agua mencionada en la tabla A.1 se refiere al agua utilizada en el proceso de fabricación o de los PPS. En estos
casos, no es necesario filtrar las muestras.

NOTA 13 Si se van a analizar tamaños de muestra específicos de un artículo determinado dentro de una categoría alimentaria,
por ejemplo 375 g de ternera triturada, se necesita desarrollar un protocolo técnico completo del estudio de
comparación de métodos para este caso específico.

NOTA 14 Cuando se va a validar un método para fórmulas infantiles o cereales infantiles que contienen probióticos, los
artículos que contienen probióticos tienen que seleccionarse y validarse como una categoría propia.

NOTA 15 Si el estudio se centra en formadores de esporas, se incluyen tanto células vegetativas como esporas.

Anexo B (Informativo)

Recomendaciones sobre cómo elegir un artículo(s) (alimentario(s))

difícil(es) para la verificación de artículos (alimentarios)

B.1 Generalidades
Es importante elegir artículos (alimentarios) representativos de los que se encuentren en el laboratorio
usuario. Este anexo se aplica específicamente a la verificación de artículos (alimentarios).

El artículo (alimentario) puede influir en el resultado de un análisis. La composición del alimento, su

microbiota basal y otros contaminantes pueden interferir con el método de análisis e invalidar el
resultado. Por tanto, se espera que el laboratorio usuario se asegurará de que el método sea adecuado
para los artículos (alimentarios) en cuestión. Incluso si un método está validado para una gama amplia
de alimentos, no todos los artículos (alimentarios) se han ensayado en la validación. Por tanto, es
importante que el laboratorio usuario demuestre que el método es aplicable a los artículos (alimentarios)
analizados en su laboratorio. Dado que solo se requiere un artículo (alimentario) para cada categoría
(de alimento), es importante realizar la validación de los artículos (alimentarios) con el más difícil.

B.2 Efectos de la matriz a tener en cuenta

B.2.1 Características microbianas

A menos que el alimento se haya esterilizado (por ejemplo, conservas), los artículos (alimentarios)
pueden contener microorganismos (introducidos de forma natural o intencionadamente durante el
proceso de fabricación), que se pueden clasificar en las siguientes categorías:

– microbiota tecnológica, como cultivos microbianos y probióticos, por ejemplo, alimentos fermentados
y curados, productos alimentarios inoculados con probióticos con un nivel de microorganismos de
106 ufc g a 109 ufc/g;

– muestras con mucha microbiota basal, por ejemplo, carne de ave picada, muestras fecales, leche
cruda;

– microorganismos alterantes: la presencia de esta microbiota nativa puede influir en la recuperación

y crecimiento del microorganismo objeto de estudio.

B.2.2 Características físicas y químicas

Se sabe que las siguientes características físicas y químicas influyen en la recuperación de microor-
ganismos y/o en el rendimiento del método:

– composición, por ejemplo, alto contenido de grasa, lecitina, espesantes, nutrientes;

– pH, por ejemplo pH < 4 a 5 (por ejemplo, bebidas, salsas, etc.);

– potencial redox;

– actividad del agua, por ejemplo, aw < 0,85 (harina, alimentos bajos en humedad);

– compuestos antimicrobianos e inhibidores del crecimiento, por ejemplo, polifenoles, enzimas e

inhibidores moleculares;

– estructura física del alimento, por ejemplo, viscosidad, solubilidad;

– color, por ejemplo, colorantes alimentarios.

B.2.3 Características inducidas por el procesamiento de alimentos

El proceso de fabricación de una matriz a menudo puede incluir un paso de procesamiento (por ejemplo,
calentamiento o un proceso de alta presión) que podría dañar las células microbianas. Esto afecta a la
viabilidad y capacidad de cultivo de las células y, por tanto, a la recuperación del microorganismo en
cuestión.

B.3 Selección de artículos (alimentarios) para verificación

Las características microbianas, físicas, químicas e inducidas por procesos mencionadas anteriormente
se pueden encontrar en los artículos (alimentarios) de todas las categorías (de alimentos) descritas en
el anexo A.

Al seleccionar un artículo (alimentario) difícil de cada categoría, el laboratorio usuario debe elegir, entre
los artículos (alimentarios) analizados en su laboratorio, un artículo con una o más de las características
difíciles. Por ejemplo, es mejor seleccionar un artículo (alimentario) con una combinación de dos
características difíciles (por ejemplo, pH + aw) ya que este es el peor de los casos.

Para una “gama amplia de alimentos", se requieren al menos cinco artículos (alimentarios) seleccionados
de cinco categorías (de alimentos) (para más detalles, véase 4.4). Siempre que sea posible, cada uno de
los cinco artículos (alimentarios) debe tener una característica de dificultad diferente o una combinación
de estas características, para cubrir diferentes casos. La tabla B.1 proporciona un ejemplo.

Tabla B.1 – Ejemplos de artículos (alimentarios) y sus características

Categoría Artículo Características desafiantes

1 1 pH
2 2 Viscosidad
3 3 Contenido en grasa
4 4 Microbiota basal alta y pH alto
5 5 Polifenol

La selección de artículos (alimentarios) también depende del principio del método que puede orientar
al laboratorio usuario en la selección de artículos (alimentarios). La tabla B.2 proporciona ejemplos de
las características de los alimentos que, según el principio del método, pueden afectar al rendimiento
del método.

Tabla B.2 – Ejemplos de características de artículos (alimentarios) que

pueden afectar al rendimiento, clasificadas por el principio de método

Número alto de
(micro)organismos Características físicas Compuestos químicos
competidores
Principio del
método Solubi- Inhibi-
Microbiota Vaini-
Microbiota lidad/ Enzi- dores
basal alta, pH aw Color lla, Polifenol
tecnológica visco- ma molecu-
alterante sal…
sidad lares
Método de
x x x x x x x x x
cultivo
Inmuno-
x x x x x x x x x
enzimático
Ensayo
x x x x x x x x x x
molecular
Citometría de
x x x x x x x
flujo
ATP x x x x x x x

Anexo C (Informativo)

Verificación del método cualitativo. Ejemplo

C.1 Método a verificar

El laboratorio usuario desea verificar la Norma ISO 6579-1. El LOD50 aplicable al método, obtenido de
una revisión de los datos de validación del método, fue de 2,5 ufc/porción para análisis.

C.2 Preparación para la verificación

Se realiza una enumeración preliminar de la suspensión microbiana que se utilizará para la verificación
del método, a fin de proporcionar una estimación del nivel de inóculo que se utilizará. El procedimiento
es el siguiente.

– Se prepara un cultivo del microorganismo en condiciones adecuadas (medio, temperatura y tiempo

de incubación) y se comprueba la pureza. Si esto falla, se repite el aislamiento, se selecciona e
identifican las colonias puras y se repite el subcultivo. Se siguen los procedimientos especificados en
el apartado 5.4 de la Norma ISO 11133:2014.

– Se realiza la enumeración del cultivo en un medio no selectivo para determinar la concentración, en

ufc/ml. Para obtener más detalles sobre la dilución decimal y la enumeración, consúltense las
Normas ISO 7218 e ISO 6887-1.

El resultado de la enumeración se utilizará como punto de partida para las diluciones para inocular
las muestras del ensayo. En este ejemplo, la concentración inicial del cultivo “durante toda la noche”
determinada fue de 6  108 ufc/ml (véase la figura C.1).

NOTA El cultivo “durante toda la noche” permite obtener microorganismos en una fase de crecimiento estacionaria. Las
condiciones de cultivo se modifican si el microorganismo objeto de estudio requiere tiempos de incubación más
largos.

Figura C.1 – Ejemplo de una determinación preliminar del nivel de inóculo

C.3 Verificación
Utilizando la concentración determinada previamente (6  108 ufc/ml para este ejemplo), se preparan
diluciones que cubran los niveles de contaminación objetivo (véase la figura C.2). Las diluciones elegidas
para la inoculación se basan en el LOD50 del estudio de validación (2,5 ufc/porción para análisis) indicado
en el informe de validación para la Norma ISO 6579-1.

Figura C.2 – Ejemplo de preparación de inóculo

– En teoría, se requieren tres niveles de contaminación (alto, intermedio y bajo) y un nivel en blanco
para el protocolo 1. Sin embargo, cuando no se conoce el recuento real en el momento de la
inoculación, se recomienda realizar una serie de diluciones sucesivas, que incluiría los tres niveles
de contaminación objetivo (véase la figura C.3). Se inocula 1 ml de la dilución seleccionada en la
suspensión inicial de cada porción para análisis.

– En el ejemplo que se muestra en la figura C.3, el inóculo de nivel alto esperado se prepara utilizando
la dilución 10-7, en caso de que el cultivo “durante toda la noche” fresco tenga una concentración
diferente de la concentración esperada.

– La figura C.4 muestra el proceso de inoculación de las porciones para análisis si se utilizó el protocolo 2
para la verificación.

– La figura C.5 muestra el proceso de inoculación de las porciones para análisis si se utilizó el protocolo 3.
El material de referencia se prepara para garantizar un inóculo de 3 ufc a 5 ufc/porción para análisis.

– Se aplica el método que se va a verificar.

– Se registran los resultados positivos y negativos.

– Se calcula la contaminación real a partir del resultado enumerado (véase 5.4.2).

–– En el ejemplo que se muestra en la figura C.6, la concentración del cultivo “durante toda la noche”
fresco es de 5,4  108 ufc/ml y no de 6  108 ufc/ml.

Figura C.3 – Ejemplo de inoculación de las porciones para análisis cuando se usa el protocolo 1

Figura C.4 – Ejemplo de inoculación de las porciones para análisis cuando se usa el protocolo 2

Figura C.5 – Ejemplo de inoculación de las porciones para análisis cuando se usa el protocolo 3

Figura C.6 – Ejemplo de enumeración del nivel real del inóculo

– Como alternativa, se puede utilizar la técnica NMP para determinar el nivel de contaminación del
inóculo.

– Para los protocolos 1 y 2, el NMP se obtiene utilizando 3  1 ml de diluciones C y D y 3  0,3 ml de

dilución D. Véase también la figura C.7.

– Para el protocolo 3, el NMP se obtiene utilizando 3  3 ml, 3  1 ml y 3  0,3 ml del inóculo. Véase
también la figura C.8.

Los resultados del NMP (expresados como NMP/ml del nivel más bajo de inóculo) se determinan
utilizando la tabla C.1.

Se pueden utilizar los resultados NMP obtenidos y consultar la tabla 7 (para el protocolo 1) o la tabla 9
(para el protocolo 2) para determinar el eLOD50.

Figura C.7 – Determinación por NMP del nivel de inóculo para los protocolos 1 y 2

Figura C.8 – Determinación por NMP del nivel de inóculo para el protocolo 3

Tabla C.1 – Tabla NMP para el cálculo del nivel de inóculo utilizando el protocolo 1, 2 o 3

Número de resultados positivo por volumen de inóculo (ml) NMP por ml de

Protocolo 1 1 ml dilución C 1 ml dilución D 0,3 ml dilución D dilución D
Categoría
(protocolos 1 y 2)
Protocolo 2 1 ml dilución C 1 ml dilución D 0,3 ml dilución D de rarezaa
o de inóculo
Protocolo 3 3 ml inóculo 1 ml inóculo 0,3 ml inóculo (protocolo 3)
3 1 1 0,8 1
3 1 0 0,6 1
3 0 3 1,0 3
3 0 2 0,8 1
3 0 1 0,6 1
3 0 0 0,4 1
2 3 3 1,3 3
2 3 2 1,1 2
2 3 1 0,9 1
2 3 0 0,7 1
2 2 3 1,0 3
2 2 2 0,8 1
2 2 1 0,7 1
2 2 0 0,5 1
2 1 3 0,8 3
2 1 2 0,6 1
2 1 1 0,5 1
2 1 0 0,3 1
2 0 3 0,6 3
2 0 2 0,5 2
2 0 1 0,3 1
2 0 0 0,2 1
1 3 3 0,8 3
1 3 2 0,7 3
1 3 1 0,5 2
1 3 0 0,4 2
1 2 3 0,6 3
1 2 2 0,5 2
1 2 1 0,4 1
1 2 0 0,3 1
1 1 3 0,5 3
1 1 2 0,4 2
1 1 1 0,3 1
1 1 0 0,2 1
1 0 3 0,4 3
1 0 2 0,3 2
1 0 1 0,2 1

Número de resultados positivo por volumen de inóculo (ml) NMP por ml de

Protocolo 1 1 ml dilución C 1 ml dilución D 0,3 ml dilución D dilución D
Categoría
(protocolos 1 y 2)
Protocolo 2 1 ml dilución C 1 ml dilución D 0,3 ml dilución D de rarezaa
o de inóculo
Protocolo 3 3 ml inóculo 1 ml inóculo 0,3 ml inóculo (protocolo 3)
1 0 0 0,1 1
0 3 3 0,6 3
0 3 2 0,5 3
0 3 1 0,4 3
0 3 0 0,3 3
0 2 3 0,4 3
0 2 2 0,4 3
0 2 1 0,3 2
0 2 0 0,2 1
0 1 3 0,3 3
0 1 2 0,3 3
0 1 1 0,2 2
0 1 0 0,1 1
0 0 3 0,2 3
0 0 2 0,2 3
0 0 1 0,1 1
0 0 0 0,0 1
a Si el resultado de la categoría de rareza es 3, es muy poco probable que se produzca la combinación de NMP. En este caso,
el experimento debe repetirse.

Anexo D (Informativo)

Verificación del método cuantitativo. Ejemplo

D.1 Determinación de la desviación estándar de la reproducibilidad

intralaboratorio. Ejemplo
Los niveles de contaminación utilizados deben ser representativos del rango de contaminación natural
observado en las muestras ensayadas en el laboratorio usuario.

Este anexo describe la preparación de muestras de laboratorio y porciones para análisis (véase también
la figura D.1).

Figura D.1 – Preparación de muestras para la determinación

de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio

– Para un artículo (alimentario), por ejemplo, tiramisú, se toman al menos diez muestras de laboratorio.
Cada muestra de laboratorio se homogeneiza cuidadosamente (para excluir contribuciones de
heterogeneidad dentro de la muestra de laboratorio/muestra de ensayo) y se divide en dos porciones
para análisis.

– Si no se dispone de artículo (alimentario) con contaminación natural (o si la contaminación es

< 10 ufc/g), se inocula la suspensión inicial con una cepa seleccionada. Si se utiliza contaminación
artificial, se enumera, en paralelo, la suspensión de inóculo (utilizada para preparar la suspensión
inicial) utilizando un medio no selectivo.

– A continuación, se analiza cada suspensión inicial de acuerdo con el protocolo del método. Las
condiciones de ensayo utilizadas en el análisis de las porciones para análisis A y B deben ser tan
diferentes como sea posible dentro del alcance de la validación (por ejemplo, técnicos, lotes de
medios de cultivo y reactivos y, cuando corresponda, aparatos y días, si se puede demostrar que la
muestra de laboratorio inoculada es suficientemente estable). También se pueden usar diferentes
cepas para diferentes muestras de laboratorio, pero no para las porciones para análisis A y B. Véase
la figura D.2.

– A partir de los resultados obtenidos, se calcula la desviación estándar de la reproducibilidad

intralaboratorio SIR (véanse 6.1.6 y 6.1.7).

Figura D.2 – Variaciones sugeridas para la determinación de la

desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio

D.2 Determinación de eBias. Ejemplo

D.2.1 Preparación para la verificación

Se prepara un cultivo del microorganismo en las condiciones adecuadas (medio, temperatura y tiempo
de incubación) y se comprueba la pureza. Si esto falla, se repite el aislamiento, se seleccionan e identifican
las colonias puras y se repite el subcultivo. Se siguen los procedimientos especificados en el apartado
5.4 de la Norma ISO 11133:2014.

Figura D.3 – Ejemplo de una determinación preliminar del nivel de inóculo

D.2.2 Verificación

– Se repite el cultivo teniendo en cuenta la concentración determinada previamente.

– Un laboratorio usuario normalmente espera encontrar entre 102 ufc/g y 106 ufc/g en las muestras
enviadas. Para esta determinación de este eBias, es necesario inocular la suspensión inicial a los
niveles de 101 ufc/ml, 103 ufc/ml y 105 ufc/ml. A partir de los resultados del ensayo de enumeración
anterior, se preparan las diluciones apropiadas para que cubran el rango amplio supuesto del inóculo
de 101 ufc/ml a 107 ufc/ml (véase la figura D.4).

Figura D.4 – Ejemplo de preparación del inóculo

– Se inocula 1 ml de cada dilución en suspensiones iniciales por duplicado para obtener las siguientes
concentraciones finales: 101 ufc/ml, 103 ufc/ml y 105 ufc/ml (véase la figura D.5). Se pueden preparar
diluciones adicionales (que cubren el amplio rango de 100 ufc/ml a 106 ufc/ml de suspensiones
iniciales) de modo que sea probable que se alcancen los tres niveles requeridos para los estudios de
comparación.

Figura D.5 – Ejemplo de inoculación de las porciones para análisis

– Se enumeran utilizando el método que se va a verificar (véase la figura D.6):

– la porción para análisis sin inocular;

– las porciones para análisis inoculadas (A y B);

– la suspensión de inóculo (utilizada para preparar la suspensión inicial).

Figura D.6 – Ejemplo de verificación del método cuantitativo (eBias)

utilizando contaminación artificial

– Se comparan los resultados del artículo (alimentario) contaminado artificialmente con los resultados
de la suspensión de inóculo analizada con el mismo método (véase la tabla 13). Los resultados del
control negativo (porción para análisis sin inocular) pueden proporcionar información útil cuando
se requiere un análisis de las causas (véase 6.2.7).

Anexo E (Informativo)

Verificación del método alternativo validado

de confirmación o tipaje. Ejemplos

E.1 Verificación del método alternativo de confirmación. Ejemplo

Este capítulo muestra un ejemplo de verificación de un método alternativo validado de confirmación a
nivel de especie para la Listeria monocytogenes, que se ha validado de acuerdo con la Norma ISO 16140-6
(véase también el ejemplo aplicable a la validación en el anexo B de la Norma ISO 16140-6:2019). El
método de referencia de confirmación es la serie de Normas ISO 11290 para la detección y recuento de
Listeria monocytogenes. El aislamiento se realiza en agar Listeria según Ottaviani y Agosti, seguido de
pruebas de confirmación de hemólisis y fermentación de L-ramnosa y D-xilosa, como mínimo. El método
alternativo validado de confirmación es una PCR disponible comercialmente, que se aplica directamente
a las colonias aisladas en agar Listeria según Ottaviani y Agosti.

Se selecciona un grupo de cinco cepas objeto del estudio de Listeria monocytogenes.

Se selecciona un grupo de cinco cepas no objeto del estudio, incluyendo al menos una cepa de Listeria
innocua.

Se prueban las cepas de inclusividad y exclusividad seleccionadas de acuerdo con el método alternativo
verificado de confirmación.

Los resultados de la verificación se muestran en la tabla E.1.

Tabla E.1 – Resumen de los resultados de la verificación

para el método alternativo validado de confirmación

Resultado del
Resultado de método de
Cepas Inclusividad características de
confirmación confirmación Interpretaciónb
ensayadas /exclusividad las cepas
esperadoa que se está
verificandoa
1 Inclusividad L. monocytogenes + + Concordancia
(serotipo 4b)
WDCM 00021
Aislado humado
2 Inclusividad L. monocytogenes + + Concordancia
(serotipo 1/2a)
WDCM 00109
Aislado de cobaya
3 Inclusividad L. monocytogenes + + Concordancia
(genotipo IV)
12MOB112LM
Aislado de carne
4 Inclusividad L. monocytogenes + + Concordancia
(genotipo II)
12MOB118LM
Aislado lácteo
5 Inclusividad L. monocytogenes + + Concordancia
Cepa silvestre
LM01
Aislado de salmón
ahumado
6 Exclusividad L. innocua − − Concordancia
WDCM 00017
7 Exclusividad L. ivanovii − − Concordancia
WDCM 00018
8 Exclusividad Bacillus cereus − − Concordancia
WDCM 00001c
9 Exclusividad Enterococcus − − Concordancia
faecalis
WDCM 00009c
10 Exclusividad Staphylococcus − − Concordancia
aureus
WDCM 00034c
a +: resultado positivo, indica que es la cepa objeto del estudio;
–: resultado negativo, indica que no es la cepa objeto del estudio.
b Concordancia o discrepancia entre el resultado esperado y el resultado del método de confirmación que se está
verificando.
c No se puede cultivar en agar Listeria según Ottaviani y Agosti, por lo que se ensayó en una placa de agar no selectivo.

E.2 Verificación de un método alternativo de tipaje. Ejemplo

Este capítulo muestra un ejemplo de verificación de un método alternativo de tipaje a nivel de serotipo
de la Salmonella, que se ha validado de acuerdo con la Norma ISO 16140-6 (véase también el ejemplo
aplicable a la validación en el anexo C de la Norma ISO 16140-6:2019). El método de referencia para la
serotipificación de la Salmonella es la Informe Técnico ISO/TR 6579-3. El método alternativo de
serotipificación es una PCR disponible comercialmente. El método alternativo de serotipificación afirma
ser capaz de serotipificar los quince serotipos de Salmonella enterica subsp. enterica: S. Agona, S.
Anatum, S. Brandenburg, S. Enteritidis, S. Hadar, S. Heidelberg, S. Indiana, S. Infantis, S. Mbandaka, S.
Montevideo, S. Lexington, S. Livingstone, S. Senftenberg, S. Typhimurium y S. Virchow.

Se selecciona un grupo de cinco cepas objeto de estudio.

Se selecciona un grupo de cinco cepas no objeto de estudio.

Se prueban las cepas de inclusividad y exclusividad seleccionadas de acuerdo con el método alternativo
de confirmación que se está verificando.

Los resultados de la verificación se muestran en la tabla E.2.

Tabla E.2 – Resumen de los resultados de la verificación para el método alternativo de tipaje

Resultado del
Resultado de método de
Cepas Inclusividad Características
confirmación confirmación Interpretaciónb
ensayadas /exclusividad de las cepas
esperadoa que se está
verificandoa
1 Inclusividad S. Anatum S. Anatum S. Anatum Concordancia
(3,(10)(15)(15,34):
e,h:1,6)
Cepa salvaje Salm01
Aislado lácteo
2 Inclusividad S. Enteritidis S. Enteritidis S. Enteritidis Concordancia
(1,9,12:g,m:-)
WDCM 00030
3 Inclusividad S. Hadar S. Hadar S. Hadar Concordancia
(6,8:z10:e,n,x)
Cepa salvaje Salm02
Aislado de carne de ave
4 Inclusividad S. Infantis S. Infantis S. Infantis Concordancia
(6,7,14:r:1,5)
Cepa salvaje Salm03
Aislado de ovoproducto
5 Inclusividad S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium Concordancia
(1,4,[5],12:i:1,2)
WDCM 00031
Aislado de tejido de ave
6 Exclusividad S. Panama – – Concordancia
(1,9,12:l:v:1,5)
Cepa salvaje Salm04
Aislado humano

Resultado del
Resultado de método de
Cepas Inclusividad Características
confirmación confirmación Interpretaciónb
ensayadas /exclusividad de las cepas
esperadoa que se está
verificandoa
7 Exclusividad S. Saintpaul – – Concordancia
(1,4,[5],12:e,h:1,2)
Cepa salvaje Salm05
Aislado de pavo
8 Exclusividad Citrobacter freundii Concordancia
WDCM 00006
9 Exclusividad Escherichia coli Concordancia
WDCM 00012
10 Exclusividad Hafnia alvei Concordancia
WDCM 00095
a –: resultado negativo, indica que no es uno de los quince serotipos de Salmonella objeto del estudio.
b Concordancia o discrepancia entre el resultado esperado y el resultado del método de tipaje que se está verificando.

Anexo F (Normativo)

Protocolo para la verificación en un solo laboratorio

de métodos de referencia no validados

F.1 Generalidades
Para los métodos de referencia no validados, solo se lleva a cabo la verificación de artículos (alimentarios)
para la verificación de métodos cualitativos (detección) y métodos cuantitativos. La verificación de la
implementación no se aplica a los métodos de referencia no validados porque no hay datos de validación
disponibles para la comparación.

La verificación se centra en los artículos (alimentarios) que están dentro del alcance del método de
referencia y del alcance del laboratorio.

Las reglas técnicas aplicables para llevar a cabo la verificación de artículos (alimentarios) se proporcionan
en el capítulo F.5 para métodos cualitativos y en el capítulo F.6 para métodos cuantitativos.

F.2 Verificación de artículos (alimentarios)

La verificación de artículos (alimentarios) sirve para demostrar que el laboratorio usuario es capaz de
realizar el método de referencia no validado con artículos (alimentarios) que se analizan en el laboratorio
usuario.

El laboratorio usuario debe:

– seleccionar un artículo (alimentario) sin dificultad de una categoría (de alimento) declarada dentro
del alcance del método de referencia, que también es una categoría (de alimento) analizada en el
alcance del laboratorio usuario;

– seleccionar al menos un artículo (alimentario) difícil de cada categoría (de alimento) declarada en el
alcance del método de referencia, que también es una categoría (de alimento) analizada en el alcance
del laboratorio usuario;

– utilizar estos artículos (alimentarios) y el tamaño de muestra utilizado en el método de referencia (o

un tamaño de muestra más pequeño si se utiliza habitualmente en el laboratorio usuario) para
realizar la verificación del artículo (alimentario).

F.3 Requisitos para la verificación de artículos (alimentarios)

La figura F.1 muestra el caso de un alcance de una “gama amplia de alimentos" sin datos de validación.

Figura F.1 – Artículos alimentarios requeridos para verificar un método de

referencia no validado para un alcance de una “gama amplia de alimentos"

El laboratorio usuario demuestra primero su capacidad para aplicar el método correctamente. Para ello,
selecciona y ensaya un artículo (alimentario) sin dificultad dentro del alcance del laboratorio. Después
de demostrar su capacidad para aplicar correctamente el método, el laboratorio usuario selecciona y
analiza al menos cinco artículos (alimentarios) difíciles, cada uno de una categoría de alimento diferente
y perteneciente al alcance del laboratorio.

El alcance del laboratorio que se muestra en la figura F.1 es para una “gama amplia de alimentos”, lo que
significa que el laboratorio usuario ha incluido al menos cinco categorías de alimentos en su estudio de
verificación y, por lo tanto, puede declarar un alcance de una “gama amplia de alimentos ". Si el alcance
del laboratorio es menor que el del método, el laboratorio usuario solo debe analizar artículos alimentarios
de sus categorías de alimentos restringidas. Por ejemplo, si el alcance del laboratorio está limitado a tres
categorías de alimentos, entonces el laboratorio usuario debe verificar al menos un artículo alimentario
difícil de cada una de las tres categorías de alimentos.

La figura F.2 muestra el caso de un alcance de una “gama limitada de alimentos" sin datos de validación.

Figura F.2 - Artículos alimentarios requeridos al verificar un método de referencia

no validado para un alcance de una "gama limitada de alimentos"

En este caso, el laboratorio usuario aún tiene que demostrar su capacidad para aplicar correctamente el
método. Para ello, selecciona y analiza un artículo alimentario sin dificultad dentro del alcance del
laboratorio. Después de demostrar su capacidad para aplicar correctamente el método, el laboratorio
usuario selecciona al menos un artículo alimentario difícil de cada una de las categorías de alimentos y
perteneciente al alcance del laboratorio. Si el alcance del laboratorio es menor que el alcance del método,
el laboratorio usuario solo debe analizar artículo alimentario de sus categorías de alimentos
restringidas.

La figura F.3 muestra el número de artículos requeridos cuando los alimentos y otras categorías se
incluyen dentro del alcance del laboratorio. Estas categorías incluyen alimentos para animales y mascotas,
muestras ambientales (producción de alimentos o piensos) y muestras de producción primaria (MPP).
Si se declara que alguna de estas otras categorías está dentro del alcance del laboratorio usuario,
entonces también se debe incluir un artículo difícil de cada categoría declarada en la verificación de los
artículos (alimentarios).

Figura F.3 – Artículos requeridos al verificar un método para un alcance

de una "gama amplia de alimentos y otras categorías"

La tabla F.1 resume el número mínimo de artículos (alimentarios) requeridos para los diferentes escenarios
de un método de referencia no validado.

Tabla F.1 – Resumen del número mínimo de artículos (alimentarios)

requeridos para la verificación de un método de referencia no validado

Número de muestras
Alcance del método
de referencia Verificación de la Verificación de artículos
Total
implementación (alimentarios)
Alcance de una “gama
amplia de alimentos” 1 sin dificultad + Nalimento
No aplica ≥6
≥ 5 categorías de ≥ 5 alimentos difíciles
alimentos
Alcance de una “gama
1 sin dificultad + Nalimento
limitada de alimentos” No aplica (Nalimento + 1) ≤ 5
≤ 4 alimentos difíciles
categorías Nalimento
1 sin dificultad + Nalimento
Alcance de una “gama ≥ 5 alimentos (artículos)
amplia de alimentos” + difíciles
No aplica ≥ 6 + Notras
otras categorías +
(Notras) 1 artículo difícil por cada uno
de las Notras otras categorías
1 sin dificultad
Alcance de una “gama
(alimento o otras) + Nalimento
limitada de alimentos”
≤ 4 alimentos difíciles
categorías Nalimento+ No aplica (Nalimento + Notras + 1) ≤ 8
+
otras categorías
1 artículo difícil por cada uno
(Notras)
de las Notras otras categorías
Alcance solo para
1 sin dificultad + Notras
otras categorías No aplica (Notras + 1) ≤ 4
≤ 3 alimentos difíciles
(Notras)

La tabla A.1 proporciona la lista de categorías (de alimentos) y artículos (alimentarios) correspondientes.
El anexo B proporciona más recomendaciones sobre la selección de un artículo (alimentario) difícil de
cada categoría (de alimento) para la verificación de los artículos (alimentarios).

F.4 Características de rendimiento

La tabla F.2 enumera las características de rendimiento requeridas para la verificación del método.

Tabla F.2 – Características de rendimiento requeridas que se determinarán

para la verificación de un método de referencia no validado

Verificación de la Verificación de artículos

Método Características del rendimiento
implementación (alimentarios)
Cualitativo LOD50 estimado(eLOD50) No aplica ✓
Desviación estándar de la reproducibilidad
No aplica No aplica
Cuantitativo intralaboratorio (SIR)
Desviación estimada (eBias) No aplica ✓
NOTA Para la verificación del método cualitativo, se proponen tres protocolos al laboratorio usuario. El protocolo 3 no
requiere la determinación de un eLOD50, sino que tiene una concentración objetivo de 3 ufc a 5 ufc/muestra de ensayo.

F.5 Métodos cualitativos. Protocolo técnico para la verificación de un método de

referencia no validado

F.5.1 Determinación del LOD50 estimado (eLOD50)

Para métodos de referencia no validados, la determinación del LOD 50 es necesaria para la verificación
de los artículos (alimentarios).

Durante la verificación, se lleva a cabo todo el procedimiento del método de referencia no validado como
se describe, incluido el procedimiento de confirmación (si existe uno). Es necesario confirmar al menos
una porción para análisis en cada nivel de inoculación, y el número de colonias para la confirmación se
puede reducir a uno.

F.5.2 Diseño experimental

El laboratorio usuario debe seleccionar uno de los tres protocolos descritos en la tabla F.3. Para métodos
de referencia no validados, se supone que el valor LOD50 es igual a 1 ufc/porción para análisis.

Tabla F.3 – Protocolos para determinar el eLOD50 y el número de réplicas

requeridas por nivel de inoculación para un método de referencia no validado

Nivel de inoculación de la porción para análisis

Nivel
Protocolo Nivel alto Nivel bajo 3 ufc a
intermedio Número total
9 ufc/porción 1 ufc /porción 5 ufc/porción Blanco
3 ufc /porción de réplicas
para análisis para análisis para análisis
para análisis
1 1 4 4 – 1 10
2 – 3 5 – 1 9
3 – – – 7 1 8
NOTA La abreviatura de unidades formadoras de colonias es ufc.

Para obtener más información, véase el apartado 5.2.

F.5.3 Selección de artículos (alimentarios)

Para la verificación de artículos (alimentarios), el laboratorio usuario debe:

– ensayar primero un artículo (alimentario) sin dificultad de una categoría (de alimento) declarada en
el alcance del método de referencia ensayada en el alcance del laboratorio;

– ensayar a continuación al menos un artículo (alimentario) difícil de cada categoría (de alimento)
incluida en el alcance del método de referencia ensayada en el alcance del laboratorio.

F.5.4 Contaminación artificial

F.5.4.1 Selección de cepas

Véase el apartado 5.4.1.

F.5.4.2 Inoculación de porciones para análisis

Véase el apartado 5.4.2.

Para los métodos de referencia no validados, se supone que el valor LOD50 es igual a 1 ufc/porción para
análisis.

La tabla F.4 proporciona una recomendación sobre cómo alcanzar los niveles de inoculación para cada
protocolo.

Tabla F.4 – Niveles de inoculación para cada protocolo

para un método de referencia no validado

Nivel alto Nivel intermedio Nivel bajo 1 ufc / 3 ufc a 5 ufc/

Protocolo 9 ufc/porción para 3 ufc/porción para porción para porción para
análisis análisis análisis análisis
Para alcanzar el Para alcanzar el
Este debería ser
nivel intermedio, se nivel bajo, se realiza
como máximo nueve
1 realiza una dilución una dilución 1:3 a –
veces el LOD50
1:3 a partir del partir del nivel
esperado
nivel alto intermedio
Para alcanzar el
Este debería ser
nivel bajo, se realiza
como máximo tres
2 – una dilución 1:3 a –
veces el LOD50
partir del nivel
esperado
intermedio
El nivel de
contaminación del
inóculo se conoce
3 – – – (ejemplo material
de referencia con
concentración
conocida

Se pueden ensayar otras diluciones para asegurar que se alcancen los niveles objetivo. Se usan tantas
diluciones como sea necesario, pero siempre se considera un factor de dilución de 1:3 entre niveles.

F.5.5 Evaluación de resultados

Véase el apartado 5.5.

Para los métodos de referencia no validados, se supone que el valor LOD50 mencionado en las tablas 6 y 8
es igual a 1 ufc/porción para análisis.

F.5.6 Límites de aceptabilidad

El eLOD50, determinado según el protocolo 1 (véase 5.5.1) o el protocolo 2 (véase 5.5.2) no debe ser
> 4 × LOD50. Para métodos de referencia no validados, se supone que el valor LOD 50 es igual a 1 ufc/
porción para análisis. Por lo tanto, el eLOD50 no debe ser > 4 ufc/porción para análisis.

Para el protocolo 3, debe haber al menos seis resultados positivos de las siete réplicas ensayadas.

El capítulo F.7 proporciona un resumen de los límites de aceptabilidad.

F.5.7 Análisis de las causas

Cuando el resultado excede el límite de aceptabilidad (si el eLOD 50 es > 4 ufc/porción para análisis), se
realiza un análisis de las causas para proporcionar una explicación de los resultados observados.

Para obtener más información, véase el apartado 5.7.

F.6 Métodos cuantitativos. Protocolo técnico para la verificación de un método

de referencia no validado

F.6.1 Determinación de la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio

Para métodos de referencia no validados, solo se requiere determinar la desviación estimada (eBias).
No se requiere determinar la desviación estándar de reproducibilidad dentro del laboratorio.

F.6.2 Determinación de la desviación estimada (eBias)

Para la verificación de artículos (alimentarios), el laboratorio usuario debe:

– ensayar primero un artículo (alimentario) sin dificultad de una categoría (de alimento) declarada en
el alcance del método de referencia, que también sea una categoría (de alimento) sujeta a ensayo en
el alcance del laboratorio usuario;

– a continuación, se analiza al menos un artículo (alimentario) difícil de cada categoría (de alimento)
declarada en alcance del método de referencia y ensayada en el alcance del laboratorio.

Para obtener más información, véase el apartado 6.2.

F.7 Resumen de los límites de aceptabilidad

La tabla F.5 resume los límites de aceptabilidad que se utilizan para la verificación de métodos de
referencia no validados.

Tabla F.5 – Límites de aceptabilidad aplicables a la

verificación de métodos de referencia no validados

Método Características de rendimiento Límites de aceptabilidad

Para los protocolos 1 y 2: eLOD50 ≤ 4 ufc/porción para
Cualitativo eLOD50 análisis
Para el protocolo 3: ≥ 6 resultados positivos de 7
| log10 ufc/ml (inóculo) - promedio log10 ufc/porción para
Cuantitativo eBias análisis (artículo [alimentario] contaminado artificial-
mente) | ≤ 0,5 log10 para cada uno de los niveles de inóculo

Bibliografía

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serotyping of Salmonella. Part 1: Detection of Salmonella spp.

[2] ISO/TR 6579-3, Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection, enumeration
and serotyping of Salmonella. Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp.

[3] ISO 11133:2014, Microbiology of food, animal feed and water. Preparation, production, storage and
performance testing of culture media.

[4] ISO 11290 (todas las partes), Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection
and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp.

[5] ISO 16140-2:2016, Microbiology of the food chain. Method validation. Part 2: Protocol for the
validation of alternative (proprietary) methods against a reference method.

[6] ISO 16140-4, Microbiology of the food chain. Method validation. Part 4: Protocol for method validation
in a single laboratory.

[7] ISO 16140-5, Microbiology of the food chain. Method validation. Part 5: Protocol for factorial
interlaboratory validation for non-proprietary methods.

[8] ISO 16140-6:2019, Microbiology of the food chain. Method validation. Part 6: Protocol for the
validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and typing
procedures.

[9] ISO 17468:2016, Microbiology of the food chain. Technical requirements and guidance on
establishment or revision of a standardized reference method.

[10] ISO 19036:2019, Microbiology of the food chain. Estimation of measurement uncertainty for
quantitative determinations.

[11] ISO 21528-2, Microbiology of the food chain. Horizontal method for the detection and enumeration
of Enterobacteriaceae. Part 2: Colony-count technique.

[12] ISO Guide 30:2015, Reference materials. Selected terms and definitions.

[13] Transition period for the implementation of ISO 16140-3. Available (viewed: 2020-09-15) from:
https://committee.iso.org/home/tc34sc9.

[14] Council Directive 79/373/EEC of 2 April 1979 on the marketing of compound feedingstuffs.
Official Journal of the European Communities. L 86, 6.4.1979, pp. 30-37.

[15] Regulation (EC) No 852/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on
the hygiene of foodstuffs. Official Journal of the European Communities. L 139, 30.4.2004, pp. 1–54.

[16] Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004
laying down specific hygiene rules for food of animal origin. Official Journal of the European
Communities. L 139, 30.4.2004, pp. 55–205.

[17] Health Canada (website). Available at: https://www.hc-sc.gc.ca/.

[18] United States Department of Agriculture (website). Available at: http://www.fsis.usda.gov/.

[19] US Food & Drug Administration (website). Available at: http://www.fda.gov/.

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