PRÁCTICA 1: GENOTOXICIDAD.

Ensayo cometa (González-Mille et al, 2012)

Ecotoxicología
Dra. Donaji Josefina González Mille
Judith Alejandra García Grimaldo
16-octubre-2023
Introducción
Todos los organismos vivos estamos compuestos por células. La información genética está contenida
en el ADN (ácido desoxirribonucleico). Esta sustancia química es el componente principal de los
cromosomas del núcleo de las células. Llamamos genoma al conjunto de todo el ADN de una célula de
una especie y los genes que éste contiene. Los genes son segmentos de ADN capaces de ser
transcriptos –es decir, copiados– a una molécula de ARN. (Kornblihtt, 2017). Todos los componentes
básicos del ADN (bases nitrogenadas, azúcares y grupos fosfodiésteres) son posibles blancos de
alteraciones químicas por agentes genotóxicos, como algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAP) presentes en el petróleo crudo y sus productos derivados (Albert, 2004).
La teoría de la mutación somática del cáncer sugiere que las mutaciones en el ADN (por daños al
genoma) de las células somáticas son la causa principal del cáncer. Estas mutaciones pueden ser
causadas por factores externos, como la exposición a productos químicos o radiación, o por errores
durante la replicación del ADN. A medida que se acumulan mutaciones en las células, pueden perder
la capacidad de controlar su crecimiento y división, lo que puede llevar a la formación de tumores.
(Félix, 1972). Dicho en otras palabras, un sólo impacto en el ADN, ocasionado por algún agente
genotóxico (en el sitio adecuado y que no sea reparado correctamente), puede tener consecuencias
severas para la célula. De manera general, estos impactos al ADN se pueden dividir en mutaciones
puntuales, aductos, aberraciones cromosómicas y rupturas de la molécula. (González-Mille et al, 2012)
El ensayo cometa, también conocido como ensayo de electroforesis de células individuales, es una
técnica utilizada para evaluar el daño in vitro o in vivo en el ADN de las células individuales, causado
por agentes tóxicos. Esta prueba se basa en el principio de que el ADN dañado se desenrolla y migra
más lejos durante la electroforesis en gel, formando una "cola de cometa", mientras que el ADN no
dañado permanece en su lugar (Yamunaqué-Castro et al, 2019; Fairbairn et al., 1995; Rojas et al.,
1999; Tice et al., 2000). Más detalladamente la técnica (descrita por Singh et al., 1988) permite analizar
la migración del ADN debido a rupturas simples en la hebra de ADN y a sitios álcali lábiles (Lugar al
interior de la molécula de ADN sensible a la acción de agentes alcalinos y, por lo tanto, es una región
frágil y susceptible de lesionarse), (Speit y Hartmann, 1999). Consiste básicamente en analizar células
individuales que son lisadas (sin membrana celular) y sometidas a una electroforesis. Durante la
electroforesis los fragmentos de ADN migran fuera del núcleo celular hacia el ánodo y forman una cauda
o cola que, al ser observada con el microscopio de fluorescencia, tiene la apariencia de un cometa. La
magnitud del daño es evaluada de acuerdo con el número de células afectadas, a la longitud de la cola
y a la intensidad de la fluorescencia de los fragmentos. Con algunas modificaciones, esta técnica puede
usarse para evaluar la inducción de enlaces cruzados (proceso de intercambio de secciones de ADN
entre dos cromosomas) y la alteración de los mecanismos de reparación y muerte celular (apoptosis)
(Fairbairn et al., 1995; Speit y Hartmann, 1999; Tice et al., 2000). Se caracteriza por ser un método
sensible, rápido, sencillo, de bajo costo y aplicable a varios tipos de células de eucariontes (Mckelvey-
Martin et al., 1993; Collins et al., 2008).
Objetivos
• Evaluar el daño al ADN a partir de su fragmentación, por contaminantes genotóxicos a través
de un ensayo cometa.

Fundamento de la técnica
El ensayo cometa en linfocitos humanos (células sanguíneas, un tipo de glóbulos blancos) consiste
básicamente en los siguientes pasos: obtener las células, fijarlas con agarosa en un portaobjetos,
someterlas a una solución de lisis con la finalidad de romper su membrana celular, desenrollar el ADN
en una solución amortiguadora, realizar la electroforesis y la determinación del daño al material
genético.

Material Reactivos Equipo

➢ Agitadores magnéticos ➢ Ácido clorhídrico (HCl) ➢ Estufa

➢ Caja portalaminillas grado analítico ➢ Baño
➢ Charola de aluminio de ➢ Ácido ➢ Cámara de
30x20 cm etilendiaminotetraacético electroforesis
➢ Chupones (EDTA) para biología ➢ Fuente de poder
➢ Cubrebocas molecular ➢ Agitador mecánico
➢ Cubreobjetos de 24x50 ➢ Agarosa de bajo punto basculante para tubos
cm de fusión para biología ➢ Balanza analítica
➢ Frascos ámbar de 250 molecular ➢ Baño maría
y 500 ml y 1L con tapón ➢ Agarosa regular para ➢ Cámara de
➢ Frascos de vidrio para biología molecular electroforesis
baño de 50 ml ➢ Agua desionizada ➢ Campana de extracción
➢ Gasa ➢ Bromuro de etidio grado ➢ Cronómetro
➢ Guantes de nitrilo analítico ➢ Cuarto frío a 4°C
➢ Matraces aforados de ➢ Cloruro de sodio (NaCl) ➢ Horno de microondas
50, 250 y 500 ml y 1 L grado analítico ➢ Lámpara de luz amarilla
➢ Micropipetas de 0.5-10, ➢ Dimetilsulfóxido (DMSO) ➢ Microscopio de quipado
5-50, 20-200 y 200- para biología molecular con luz fluorescente y el
1000 µL ➢ Etanol anhidro grado software “Komet” 4.0 (o
➢ Papel absorbente analítico con ocular graduado)
➢ Papel aluminio ➢ Hidróxido de sodio ➢ Refrigerador
➢ Vasos Coplín de (NaOH) en perlas grado ➢ Placa de agitación
polipropileno analítico ➢ Potenciómetro
➢ Vasos de precipitado de ➢ Triton X-100 grado ➢ Vórtex
1y2L analítico
➢ Trizma Base grado
analítico

Preparación de soluciones.
➢ Solución de agarosa regular al 1 %.

100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑛 𝑎 1 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑒𝑠𝑡é 𝑎𝑙 1%

1𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑥 (1𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎)(25𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼)
∴ = →𝑥=
100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 25 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 100𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼
𝑥 = 0.25𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎
 o Pesar 0.25 g de agarosa y disolver en 25 ml de agua desionizada
▪ Para disolver, utilizar el horno de microondas a una temperatura de 30°C entre 7
y 10 s, y agitar.
▪ Repetir hasta que se disuelva completamente.
o Verter la agarosa en un frasco y colocar en un baño maría a 50°C
*Preparar esta solución nuevamente cada vez que se realice un nuevo ensayo.
➢ Solución de agarosa regular al 0.6 %.

100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑛 𝑎 0.6 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑒𝑠𝑡é 𝑎𝑙 1%

0.6𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑥
∴ = →
100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 12.5 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼
(0.6𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎)(12.5 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼)
𝑥=
100𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼
𝑥 = 0.075𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎

o Pesar 0.075 g de agarosa y disolver en 12.5 ml de agua desionizada

▪ Para disolver, utilizar el horno de microondas a una temperatura de 30°C entre 7
y 10 s, y agitar.
▪ Repetir hasta que se disuelva completamente.
o Verter la agarosa en un frasco y colocar en un baño maría a 50°C
*Preparar esta solución nuevamente cada vez que se realice un nuevo ensayo.
➢ Solución de hidróxido de sodio 10 N.
°
𝑛𝑒𝑞 °
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑃𝑀
𝑁= ; 𝑛𝑒𝑞 = ; 𝑒𝑞 =
𝑉 𝑃𝑀 #𝑂𝐻 −
23𝑔 𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = (𝑁𝑎) + 16 (𝑂) + 1 (𝐻) = 40
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔
𝑃𝑀 40
𝑒𝑞 = = 𝑚𝑜𝑙 = 40 𝑔
#𝑂𝐻 − 1 𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑁= → 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁. 𝑉. 𝑃𝑀 = (10𝑁)(0.5𝐿)(40𝑔)
𝑉. 𝑃𝑀
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑁𝑎𝑂𝐻 = 200𝑔

o Pesar 200g de NaOH y disolver en 500 ml de agua desionizada.

▪ Preparar en una campana de extracción con la ayuda de un baño maría y una
placa de agitación.
▪ Agregar las perlas de NaOH de forma paulatina en un vaso de precipitado con
agua desionizada hasta disolverse.
▪ Aforar la solución en un matraz de 500 ml y filtrar posteriormente con papel No.
1.
o Almacenar en un frasco ámbar debidamente etiquetado en el cuarto frío (4°C)
*Esta solución se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 días.
➢ Solución de lisis.
o Pesar 146.1 g de NaCl (2.5M)
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = ;
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = 22.99 (𝑁𝑎) + 35.45 𝐶𝑙 = 58.44
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (2.5 𝑀) (58.44 ) (1𝐿) = 146.1 𝑔
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙
o Pesar 1.2 g de Trisma Base (10mM) - C4H11NO3.
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = ;
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
12𝑔 𝑔 𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = 4 ( ) (𝐶) + 11 (1 ) (𝐻) + 14 (𝑁) + 3 (16 ) (𝑂) = 121
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 −3
𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (10𝑥10 𝑀) (121.136 ) (1𝐿) = 1.21 𝑔
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙

o Pesar 8 g de NaOH (0.2 M)

𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = ;
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
23𝑔 𝑔 𝑔 𝑔
𝑀= (𝑁𝑎) + 16 (𝑂) + 1 (𝐻) = 40
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (0.2 𝑀) (40 ) (1𝐿) = 8 𝑔
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙

o Pesar 37.2 g de EDTA (100 mM) – sal disódica C10H14N2 Na2O8.2H2O

𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 =
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
𝑔 𝑔 𝑔
𝑀 = 10 (12.011 ) (𝐶) + 14 (1.00784 ) (𝐻) + 2 (14.0067 ) (𝑁)
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔 𝑔
+ 2 (22.989769 ) (𝑁𝑎) + 8 (15.999 ) (𝑂) + 4 (1.00784 ) (𝐻)
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
+ 2 (15.999 ) (𝑂) = 372.24
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (100𝑥10−3 𝑀) (372.24 ) (1𝐿) = 37.24 𝑔
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙
o Disolver en 890 ml de agua desionizada.
▪ En la placa de agitación se coloca un vaso de precipitado de 1L y se agregan
aproximadamente 500 ml de agua desionizada.
▪ Se agregan los reactivos en el siguiente orden: NaCl, Trisma Base, y de forma
alternada NaOH y EDTA, es decir, se pone un poco de NaOH y después un poco
de EDTA y así sucesivamente.
o Cuando los reactivos se han disuelto, medir el pH, que deberá tener un valor de 10.
▪ Con una pipeta pasteur, agregar gota a gota la solución de NaOH 10N para elevar
los valores de pH; en caso de que el pH exceda el valor de 10, agregar gota a
gota HCl concentrado hasta obtener el valor deseado.
o Agregar 100 ml de DMSO y 10 ml de Tritón 100x
o Aforar la solución en un matraz de 1 L y filtrar con papel no. 1.
o Almacenar en un frasco ámbar debidamente etiquetado a 4°C durante al menos 1h antes
de utilizar
 ➢ Solución de ácido etilendiaminotetraacético 200 mM.
o Pesar 3.72 g de EDTA para disolverse en 50ml de agua desionizada
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 =
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = 10 (12.011 ) (𝐶) + 14 (1.00784 ) (𝐻) + 2 (14.0067 ) (𝑁)
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔 𝑔
+ 2 (22.989769 ) (𝑁𝑎) + 8 (15.999 ) (𝑂) + 4 (1.00784 ) (𝐻)
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
+ 2 (15.999 ) (𝑂) = 372.24
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (200𝑥10−3 𝑀) (372.24 ) (50𝑥10−3 𝐿)
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙
= 3.7224 𝑔

▪ Agregar el EDTA de forma paulatina en un vaso de precipitado con agua

desionizada hasta disolverse.
▪ Preparar la solución con ayuda de una placa de agitación.
o Cuando el reactivo esté disuelto, medir el pH, el cual debe tener un valor de 10. Para
ajustarlo, utilizar la solución de NaOH 10 N o HCl concentrado, indicado en la
preparación de la solución de lisis.
o Aforar la solución en un matraz de 50 ml y filtrar con papel no. 1.
o Almacenar en un frasco ámbar debidamente etiquetado en el cuarto frío a 4°C y en
ausencia de luz directa
*Esta solución se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 días.
➢ Solución amortiguadora para electroforesis.
𝐶1 𝑉1 (10 𝑁)(48 𝑥10−3 𝐿)
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 → 𝐶2 = = = 0.24 𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻
𝑉2 2𝐿
𝐶1 𝑉1 (0.2 𝑁)(8 𝑥10−3 𝐿)
𝐶2 = = = 0.0008 𝑁 𝐸𝐷𝑇𝐴
𝑉2 2𝐿

o Agregar en un vaso de precipitado 48 ml de la solución de NaOH 10N, 8 ml de la solución

de EDTA 200 mM y 1544 ml de agua desionizada. Y mezclar
o Medir el pH, que debe estar en un valor de 13 o mayor. Para ajustarlo, utilizar la solución
de NaOH 10 N o HCl concentrado, indicado en la preparación de la solución de lisis.
o Aforar la solución en un vaso de precipitado de 2L y filtrar con papel no. 1.
o Almacenar en un frasco ámbar debidamente etiquetado en el cuarto frío (4°C)
➢ Solución de Trisma Base 0.4 M - C4H11NO3.
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔
𝑀= ; 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = ;
𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀
12𝑔 𝑔 𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = 4 ( ) (𝐶) + 11 (1 ) (𝐻) + 14 (𝑁) + 3 (16 ) (𝑂) = 121
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (0.4 𝑀) (121.136 ) (0.25 𝐿) = 12.1136𝑔
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙

o Pesar 12.12 g de Trisma Base y disolver en 250 ml de agua desionizada.

 ▪ Agregar el Trisma Base paulatinamente en un vaso de precipitado con agua
desionizada hasta disolverse.
o Mezclar y medir el pH que debe tener un valor de 7.5. Para ajustarlo, utilizar la solución
de NaOH 10 N o HCl concentrado, indicado en la preparación de la solución de lisis.
o La solución puede preparase con ayuda de una placa con agitador.
o Aforar la solución en un matraz de 250 ml y filtrar con papel Whatman no.1
o Almacenar en un frasco ámbar debidamente etiquetado en el cuarto frío (4°C)

➢ Solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5%

100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑛 𝑎 0.5 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑒𝑠𝑡é 𝑎𝑙 1%
0.5 𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝑥 (0.5𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎)(25𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼)
∴ = →𝑥=
100 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 25 𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼 100𝑚𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝐷𝐼
𝑥 = 0.125𝑔 𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎

o Pesar 0.125 g de agarosa de bajo punto de fusión y disolver en 25 mL de agua

desionizada.
▪ Para ayudar a disolverla se utiliza un horno microondas a una temperatura de 30
°C entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se procede de forma repetitiva hasta
que se disuelva completamente.
o Verter la agarosa en un frasco y colocarla en un baño a una temperatura de 37 °C.
*De preferencia, esta solución debe prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo
➢ Solución stock de bromuro de etidio (0.5 mM)- C21H20BrN3
12.011 𝑔 𝑔 𝑔 𝑔
𝑃𝑀 = 21 ( ) (𝐶) + 20 (1.00784 ) (𝐻) + 79.904 (𝐵𝑟) + 3 (14.0067 ) (𝑁)
𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙
𝑔
= 394.294
𝑚𝑜𝑙
𝑔 𝑔
𝑀= → 𝑔 = 𝑀. 𝑃𝑀. 𝐿 = (0.5𝑥10−3 𝑀) (394.294 ) (10𝑥10−3 𝐿)
𝑃𝑀. 𝐿 𝑚𝑜𝑙
= 0.00197 𝑔 ~ 0.002 𝑔

o Pesar 0.002 g de bromuro de etidio y disolver en 10 ml de agua desionizada.

▪ Esta solución debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse
en un frasco ámbar o, en su defecto, en un tubo cónico de polipropileno cubierto
con papel aluminio.
▪ El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de
nitrilo, y debe evitarse el contacto directo con la piel.
➢ Solución de trabajo de bromuro de etidio - C21H20BrN3
𝐶1 𝑉1 (0.05 𝑚𝑀)(0.01 𝐿) (0.05 𝑥10−3 𝑀)(0.01 𝐿)
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 → 𝑉2 = = =
𝐶2 5 𝑚𝑀 0.5 𝑥10−3 𝑀
𝑉 = 1 𝑚𝑙
o A partir de la solución de stock de bromuro de etidio, tomar 1 ml y disolver en 9 ml de
agua desionizada.
▪ La concentración final del bromuro de etidio deberá ser de 0.05mM.
o Esta solución debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse en un
frasco ámbar o, en su defecto, en un tubo cónico de polipropileno cubierto con papel
aluminio.
 o El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de nitrilo,
y debe evitarse el contacto directo con la piel.
Procedimiento
Tabla 1. Resumen de las condiciones recomendadas para el ensayo cometa en linfocitos humanos

Volumen de muestra 15 µL
Volumen de agarosa 225 µL
Tiempo de desenrollamiento 20 min
Tiempo de electroforesis 20 min
Luz Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Temperatura Desenrollamiento y electroforesis a 4°C
Número de réplicas 2

➢ Preparación de camas de electroforesis.

o Para esta parte es importante el uso de guantes en todo momento.
o Colocar las laminillas con el esmerilado hacia arriba en un vaso de precipitado con etanol
anhidro.
o Tapar con papel Parafilm y dejar 15 min como mínimo.
o Mientras, cortar trozos de gasa en forma de cuadros.
o Preparar con aluminio las charolas donde se colocarán las laminillas.
o Tomar las laminillas con una pinza por el lado esmerilado y limpiar con gasa. Colocarlas
en las charolas y rotularlas por la parte esmerilada.
o Agregar 150 µL de agarosa regular a cada laminilla. Distribuir la agarosa por toda la
laminilla con la ayuda de la punta de un dedo limpio.
o Colocar las laminillas con la cama de agarosa en las charolas y secar en el horno a una
temperatura de 65°C a 70°C.
o Una vez que estén bien secas y frías pueden ser almacenadas en cajas portalaminillas.
Utilizar antes de 2 semanas, de lo contrario se desechan.
➢ Preparación de las laminillas en el vaso de Coplin.
o Agregar en el vaso de Coplin 50 ml de la solución de lisis con una probeta. Almacenar
el vaso en el cuarto frío por lo menos 1h antes de su uso.
o Sumergir los portaobjetos o laminillas en el vaso de Coplin por lo menos 1h antes de
pasar a la electroforesis. La permanencia de las laminillas bajo estas condiciones no
debe exceder las 2 semanas.
➢ Preparación de las células.
o Obtener una muestra de sangre de 3 ml en un tubo Vacutainer con heparina y se coloca
en el agitador hasta que la muestra se encuentre completamente homogenizada para
evitar su coagulación.
o Tomar alícuotas de 15 µL de la muestra de sangre con ayuda de una micropipeta y
colocarla en el fondo de los tubos Eppendorf.
o Agregar 225µL de agarosa de bajo punto de fusión y homogenizar con el vórtex.
o Tomar 75 µL de la mezcla y colocar sobre una cama de electroforesis. Colocar un
cubreobjetos.
o Colocar las laminillas en la charola de aluminio y llevar a refrigeración por 5 min.
o Retirar delicadamente el cubreobjetos de la laminilla y agregar de 75 a 80 µL de agarosa
de bajo punto de fusión.
 o Colocar un nuevo cubreobjetos y colocar en la charola. Llevar a refrigeración por 5 min.
o Retirar el cubreobjetos cuidadosamente y desecharlo.
o Colocar las laminillas en pares (espalda con espalda) en el vaso de Coplin con la
solución de lisis.
➢ Electroforesis.
o Dentro del cuarto frío, colocar la cámara de electroforesis en la mesa. Asegurarse que
esta cámara quede completamente en posición horizontal verificando que la burbuja
indicadora se encuentre centrada, de lo contrario, ajustar las patas hasta la posición
adecuada.
o Conectar la cámara a la fuente de poder, de acuerdo con el color y la polaridad de los
cables (rojo-positivo, negro-negativo).
o A partir de aquí se trabaja en completa oscuridad y sólo con ayuda de la lámpara de luz
amarilla para no dañar el ADN con la luz.
o Colocar la solución de electroforesis en la cámara hasta la plataforma, por ambos lados,
sin que la solución se junte.
o Colocar las laminillas en la cámara, tomándolas con las pinzas por la parte esmerilada
y asegurándose que estén en la dirección correcta.
o Verter la solución de electroforesis hasta cubrir las laminillas asegurándose que no
queden burbujas debajo de las laminillas.
o Dejar las laminillas en la solución de electroforesis por 20 min (tiempo de
desenrollamiento)
o Mientras, configurar los parámetros de la fuente de poder a 25V, 300ª y 20 min.
o Transcurrido el tiempo, colocar la tapa y encender la fuente de poder con los parámetros
ya configurados.
o Se observará unos segundos la formación de espuma y un valor constante de 300 A, lo
que será indicativo que la electroforesis se esta llevando a cabo correctamente. Si el
valor de la corriente disminuye, colocar más solución de electroforesis por un costado
de la cámara hasta obtener el valor deseado.
o Colocar la placa metálica que cubre la cámara
o Pasado el tiempo de la electroforesis, apagar la fuente de poder y quitar la tapa.
o Sacar las laminillas con las pinzas y secar por debajo con papel absorbente.
o Colocar las laminillas en la charola de lavados y agregar solución de Trisma Base 0.4 M,
aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra.
o Dejar reposar por 5 min y repetir el lavado.
o Escurrir y agregar etanol anhidro, aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra.
o Dejar reposar por 5 min más y repetir el lavado con etanol anhidro otros 5 min.
o Sacar, limpiar por debajo con papel absorbente, dejar secar y guardar en una caja de
portalaminillas.
➢ Tinción de las células.
o Justo antes de la observación al microscopio, agregar 25 µL de la solución de trabajo de
bromuro de etidio a la laminilla que se desea leer y colocar un cubreobjetos.
➢ Lectura de resultados.
o Tomar una laminilla previamente teñida y colocar en el microscopio.
o Enfocar con el objetivo 20x hasta ver de forma adecuada el campo.
 o Leer con la técnica circular (la lectura se inicia en el centro de la laminilla y se continua
con la lectura en círculos o zig-zag -se empieza a leer la laminilla desde el extremo
superior izquierdo hacia el extremo superior derecho y se continua a partir de este punto
con movimientos en zig-zag-)
o En el software Komet 4.0 se pulsa “Experiment” y se le asignan 2 ID (muestras). Pulsar
“Live”. El programa contabiliza 100 células (50 muestra y 50 duplicado). En caso de no
contar con el software de análisis de imágenes, la cuantificación del daño en las células
se puede realizar con un ocular graduado con el cual se debe medir la longitud de la
cola (en micras) de 100 células.
Cálculo de resultados
Para comunicar los resultados del estudio del cometa, el grupo de especialistas del IWGTP
recomienda utilizar dos medidas: el momento de la cola de oliva (OTM), que se calcula multiplicando
la longitud de la cola por la fracción de ADN total de la cola. Solo se obtiene en caso de contar con el
software Komet 4) y las categorías de daño de acuerdo con la longitud de la cola del cometa (las cuales
se usan cuando no se cuenta con el software mencionado) (Kumaravel et al., 2009) (Figura 1).

Figura 1. Medición del Olive Tail Moment (OTM) y categorización del daño de acuerdo con la longitud
(en micras) de la cola: 0 = sin daño; 1 = daño leve; 2 = daño moderado;
3 = daño alto; 4 = daño grave.

Si el análisis se lleva a cabo con el software Komet 4, se obtendrá una serie de parámetros (entre ellos
el OTM), los cuales son generados de las diversas medidas de daño que se toman de las células. En
la figura 2 se muestra un ejemplo de pantalla del software durante la medición del daño en las células.
Una vez finalizada la cuantificación del daño en las células se obtiene una hoja de cálculo (figura 3)
donde se tienen los datos de todos los parámetros obtenidos de cada una de las células medidas por
individuo, además de algunas medidas estadísticas de tendencia central, dispersión y variabilidad de
estos mismos parámetros por individuo.

Figura 2. Ejemplo de pantalla de software Komet durante la medición de las células.

 Figura 3. Ejemplo de hoja de cálculo obtenida de la cuantificación del daño en las células

En caso de no contar con el software de medición se pueden establecer categorías de daño en las
células a partir de la longitud de la cola del cometa. Las categorías de daño que se pueden asignar en
las células de acuerdo con el tamaño de la cola del cometa son las siguientes:

1) Clase 0 -sin daño-, daño no visible;

2) Clase 1 -daño leve-, la longitud de la cola es menor que el diámetro del núcleo;
3) Clase 2 -daño moderado-, la longitud de la cola es de 1 a 2 veces el diámetro del núcleo;
4) Clase 3 -daño alto-, la longitud de la cola es de 2 a 3 veces el diámetro del núcleo; y
5) clase 4 –daño grave-, la longitud de la cola es más de 3 veces el diámetro del núcleo (Kobayashi et
al., 1995).

El puntaje total de las 100 células se obtiene por la multiplicación de la suma del número de células en
cada clase por la clase de daño (0-4), y el rango va de 0 (todas sin daño) a 400 (todas con el máximo
daño) (ver ejemplo en la tabla 2).

Tabla 2. Ejemplo de cálculos por clase de daño.

clase Células
n Scores
0 1 2 3 4 analizadas
2 0 25.5 63.5 11 0 200 185.5
7 0 12.4 75.6 12 0 700 199.6
5 0 2.6 54.6 42.8 0 500 240.2
8 0 3.8 46.6 49.6 0 800 245.9

Control de calidad - PRECAUCIONES

• Solución de agarosa
Las soluciones de agarosa deben manejarse con cuidado para asegurar una adecuada migración de
las células durante la electroforesis.
La solución de agarosa no debe hervir durante su preparación; si esto sucede, se debe desechar.
Se debe cuidar que en las soluciones se disuelva por completo y que no deje residuos en suspensión;
esto se reconoce por su tonalidad completamente transparente. Si esto no sucede, es necesario
prepararla de nuevo.
Si la agarosa se solidifica antes de preparar las laminillas o las células, la solución debe prepararse de
nuevo.
Para obtener una capa uniforme de agarosa, hay que tener cuidado de no pasar muchas veces el dedo
sobre la laminilla, pues esto podría causar migración irregular de las células.
• Bromuro de etidio
Durante el manejo del bromuro de etidio debe evitarse el contacto debido a sus propiedades
genotóxicas.
Es necesario manejarse en todo momento con guantes de nitrilo y evitarse el contacto directo con la
piel.
• Preparación de soluciones
Durante la preparación de las soluciones se recomienda utilizar agitación y agregar los reactivos en un
orden especifico; esto no debe alterarse, para garantizar la adecuada disolución de todos los
componentes.
• Almacén
Se recomienda colocar papel encerado en los tapones de los frascos ámbar donde se almacenen las
soluciones, para evitar que se peguen.
• Muestras de sangre
Las muestras de sangre humana tienen una viabilidad para su uso en el ensayo, y por ello deben
evaluarse antes de 3 h.
• Electroforesis
Durante la preparación de las células es necesario tener cuidado de no formar burbujas al mezclar la
sangre con la agarosa en la laminilla, de no tocar la cama de agarosa en la laminilla con la punta de la
pipeta, y de colocar espalda con espalda las laminillas en el vaso Coplin. Con ello se puede evitar que
las muestras se dañen y que se presente migración irregular de las células durante la electroforesis.
Durante la colocación de las laminillas en la cámara de electroforesis, deben enjugarse las pinzas cada
vez que se desee tomar una nueva laminilla.
Dentro de la cámara, se debe fijar la parte posterior de las laminillas y colocar en la dirección
correcta con respecto al flujo eléctrico para evitar que se pierdan las muestras.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Para el determinar el daño al ADN se ha utilizado una aproximación de la evaluación del daño que ha
marcado el desarrollo de los parámetros en el ensayo del cometa, descrita por Olive et al (1990) quienes
utilizaron el concepto de momento de la cola para describir la heterogeneidad de la respuesta dentro
de una población celular, ya que su cálculo considera las variaciones de la distribución del DNA dentro
de la cola (Zuñiga, 2009).

Se realizaron estadísticas básicas de tendencia central, dispersión y variabilidad para el OTM y un

análisis de varianza (ANOVA), mediante el software “Minitab, versión: 0.3.1” y los gráficos mediante el
software: “Microsoft Excel, 2019”

Tabla 3. Datos de cometas de especies de fauna silvestre de Coatzacoalcos, Veracruz.

 Feeding Taxonomic
Specie System OTM TL Tail DNA IDD
habits group

Iguana iguana terrestrial herbivorous 5.1 15.2 69.44 285.0 Reptiles

Iguana iguana terrestrial herbivorous 4.5 15.2 59.80 262.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 2.6 11.1 41.62 197.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 3.4 12.3 55.15 226.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 4.0 13.2 60.21 239.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 2.8 11.9 44.90 209.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 5.1 14.6 70.14 313.0 Reptiles
Iguana iguana terrestrial herbivorous 2.0 8.7 39.06 179.0 Reptiles
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.5 11.0 42.14 217.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.5 10.8 41.50 211.6 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 1.8 8.8 35.00 191.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.5 9.8 43.73 216.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 1.9 8.2 32.89 208.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 1.9 8.3 41.12 202.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.6 10.5 43.44 232.0 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.0 10.0 38.22 233.3 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 1.8 8.7 33.97 194.6 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 1.8 9.3 39.22 193.3 Invertebrates
Eisenia sp terrestrial Detritivore 2.4 10.2 39.27 214.0 Invertebrates
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.9 16.7 63.38 182.0 Amphibians
, Wetland omnivorous 2.7 11.4 43.43 173.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.4 14.7 61.20 176.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 2.4 10.5 39.58 104.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.4 14.4 62.39 135.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 2.4 10.4 40.78 145.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.1 14.5 58.27 172.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 0.8 7.6 15.44 284.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.0 14.1 59.83 266.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 1.5 9.4 31.07 282.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 2.1 10.4 37.61 264.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 1.7 9.8 31.08 261.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 4.4 15.5 60.03 192.0 Amphibians
Rhinella marina Wetland omnivorous 1.7 9.3 30.99 273.0 Amphibians
Trachemys scripta Wetland omnivorous 11.7 43.5 51.79 213.0 Reptiles
Trachemys scripta Wetland omnivorous 9.3 39.6 41.78 186.0 Reptiles
Trachemys scripta Wetland omnivorous 11.6 39.3 57.72 249.0 Reptiles
Trachemys scripta Wetland omnivorous 3.4 23.7 21.35 132.7 Reptiles
 Trachemys scripta Wetland omnivorous 2.1 18.7 17.07 117.0 Reptiles
Trachemys scripta Wetland omnivorous 6.6 30.3 36.54 180.0 Reptiles
Crocodylus moreletii Wetland carnivore 14.8 42.5 64.82 296.0 Reptiles
Crocodylus moreletii Wetland carnivore 20.6 56.9 66.09 321.0 Reptiles
Crocodylus moreletii Wetland carnivore 17.7 49.7 65.46 308.5 Reptiles
Ariopsis felis Acuatic Detritivore 1.8 8.0 45.21 219.0 Fishes
Ariopsis felis Acuatic Detritivore 2.2 10.6 39.03 153.0 Fishes
Centropomus
Acuatic carnivore 0.7 6.5 22.27 140.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 3.3 11.4 57.16 236.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 2.6 10.3 47.80 213.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 2.1 9.8 40.42 204.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 2.0 9.3 40.56 199.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 2.5 10.0 46.47 210.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 2.6 10.1 46.80 212.0 Fishes
parallelus
Centropomus
Acuatic carnivore 1.8 8.1 40.98 194.0 Fishes
parallelus
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 4.5 15.4 59.62 284.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 3.7 13.0 61.41 262.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 3.3 12.1 57.25 271.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 2.2 8.7 45.49 215.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 2.2 9.3 42.63 207.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 3.5 11.4 58.74 248.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 3.1 11.4 51.28 223.0 Fishes
Mugil cephalus Acuatic Detritivore 3.8 11.4 69.14 319.6 Fishes
Oreochromis sp Acuatic omnivorous 2.8 10.4 52.62 232.7 Fishes
Oreochromis sp Acuatic omnivorous 3.8 13.1 57.67 270.3 Fishes
Oreochromis sp Acuatic omnivorous 3.7 13.2 52.89 231.0 Fishes
Oreochromis sp Acuatic omnivorous 3.8 11.8 59.59 252.0 Fishes
Oreochromis sp Acuatic omnivorous 3.4 11.5 56.33 236.0 Fishes

Tabla 4. Estadísticas básicas por especie

Especie N Media Desv. Varianza Coef. Mínimo Mediana Máximo

Est. Var.
Iguana 8 3.662 1.175 1.380 32.07 1.950 3.700 5.066
iguana
Eisenia sp 11 2.153 0.339 0.115 15.73 1.770 2.040 2.580
 Rhinella 14 2.955 1.352 1.829 45.77 0.800 2.515 4.870
marina
Crocodylus 3 17.70 2.87 8.27 16.24 14.83 17.70 20.58
moreletii
Trachemys 6 7.44 4.12 16.98 55.39 2.11 7.94 11.74
scripta
Ariopsis felis 2 2.000 0.226 0.051 11.31 1.840 2.000 2.160
Centropomus 8 2.206 0.759 0.577 34.42 0.740 2.315 3.340
parallelus
Mugil 8 3.280 0.806 0.650 24.58 2.150 3.405 4.490
cephalus
Oreochromis 5 3.474 0.430 0.185 12.39 2.760 3.660 3.810
sp

Figura 4. Gráfico de medias por especie

De los datos anteriormente presentados se puede resumir que, de manera general, todas las especies
presentan daño al ADN, siendo el Crocodylus moreletii el que mayor daño presenta de acuerdo con su
media de 17.7, seguida del Trachemys scripta y la Iguana iguana, la que menos daño presenta es la
Ariopsis feliz.

El ANOVA arroja los siguientes resultados.

Método (para todos los ANOVA)
Hipótesis nula Todas las medias son iguales (Todas las especies presentan el mismo daño al ADN)
Hipótesis alterna No todas las medias son iguales
Nivel de significancia α = 0.05
Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis.

Análisis de Varianza
 Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 8 727.3 90.914 35.02 0.000
Error 56 145.4 2.596
Total 64 872.7

Dado que el valor p es menor al nivel de significancia, se rechaza la hipótesis nula y se asume que el
nivel de daño al ADN es diferente dependiendo de la especie.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95%

Factor N Media Agrupación
Crocodylus moreletii 3 17.70 A
Trachemys scripta 6 7.44 B
Iguana iguana 8 3.662 C
Oreochromis sp 5 3.474 C
Mugil cephalus 8 3.280 C
Rhinella marina 14 2.955 C
Centropomus parallelus 8 2.206 C
Eisenia sp 11 2.153 C
Ariopsis felis 2 2.000 C
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Según una prueba de Tukey, observamos que Crocodylus moreletii y Trachemys scripta son los que
presentan una diferencia significativa con respecto al resto de las especies, además de ser los que
mayor daño tienen.

A continuación, se presentan las estadísticas correspondientes clasificando los datos por el grupo
taxonómico.

Tabla 5. Estadísticas básicas por grupo taxonómico

Variable
Conteo Media Desv.Est. Mínimo Mediana Máximo Rango
total
REPTILES 17 7.47 5.82 1.95 5.05 20.58 18.63
ANFIBIOS 14 2.955 1.352 0.800 2.515 4.870 4.070
INVERTEBRADOS 11 2.153 0.339 1.770 2.040 2.580 0.810
PECES 29 2.837 0.893 0.740 2.760 4.490 3.750
 Figura 5. Gráfico de medias por grupo taxonómico

Se puede observar que los reptiles son los que presentan mayor daño, seguidos por los anfibios, los
peces y finalmente los invertebrados.

El ANOVA arroja los siguientes resultados.

Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 3 288.9 96.285 10.06 0.000
Error 61 583.8 9.571
Total 64 872.7

Dado que el valor p es menor al nivel de significancia, se rechaza la hipótesis nula y se asume que el
nivel de daño al ADN es diferente dependiendo del grupo taxonómico.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95%
Factor N Media Agrupación
REPTILES 17 7.47 A
ANFIBIOS 14 2.955 B
PECES 23 2.837 B
INVERTEBREADOS 11 2.153 B
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Según la prueba de Tukey, observamos que los reptiles son los que presentan un daño
significativamente diferente al resto de los grupos taxonómicos, además de ser el grupo con mayor
daño.

A continuación, se presentan las estadísticas correspondientes clasificando los datos por sistema.
Tabla 6. Estadísticas básicas por sistema

Conteo
Variable Media Desv.Est. Mínimo Mediana Máximo Rango
total
TERRESTRE 25 2.788 1.089 1.770 2.530 5.066 3.296
ACUÁTICO 29 2.837 0.893 0.740 2.760 4.490 3.750
HUMEDAL 29 6.05 5.55 0.80 4.13 20.58 19.78

Figura 6. Gráfico de medias por sistema

A partir de la información anterior, se observa que las especies que habitan el humedal son las que
mayor daño al ADN presentan, que corresponden a una parte de ellos reptiles (Trachemys scripta,
Crocodylus moreletii) y a los anfibios (Rhinella marina).

Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Factor 2 155.4 77.70 6.72 0.002
Error 62 717.3 11.57
Total 64 872.7

Dado que el valor p es menor al nivel de significancia, se rechaza la hipótesis nula y se asume que el
nivel de daño al ADN es diferente dependiendo del sistema.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95%

Factor N Media Agrupación
HUMEDALES 23 6.05 A
ACUATICOS 23 2.837 B
TERRESTRES 19 2.788 B
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Según la prueba de Tukey, observamos que los humedales son significativamente diferentes del resto
de sistemas, además de ser los que presentan mayor daño.

Podemos concluir de todo este estudio que posiblemente el sistema con más contaminación es el
humedal, seguido por el acuático, y el terrestre. Por eso, los reptiles que habitan el humedal son los
más perjudicado, así como los anfibios que también habitan este sistema; seguidos por los peces y al
final los invertebrados. Es decir, que el hábitat se relaciona con el daño al ADN. Y lo que es
definitivamente cierto es que todo el lugar de Coatzacoalcos, Veracruz está contaminado ocasionando
un daño a todas las especies que le habitan.

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