TECNICATURA SUPERIOR EN PALEONTOLOGÍA BIOLOGÍA GENERAL
TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO N° 1: BIOMOLÉCULAS Y MICROSCOPÍA
Objetivos:
Reconocimiento de propiedades físico-químicas compuestos orgánicos
Extracción y observación de ADN
Conocer técnicas de microscopía
Adquirir habilidad en el manejo del microscopio
Las células pueden ser estudiadas bajo diferentes aspectos: bioquímicos, fisiológicos o
morfológicos. Dentro del campo de la microscopía, las técnicas utilizadas son muy diversas y
comprenden procesos sencillos como la toma de muestra, y otros complejos como la preservación
y coloración.
La mayoría de las células y sus estructuras internas son transparentes o incoloras, por lo cual su
observación directa al microscopio suele ser poco frecuente. Para preservar las estructuras
celulares y tisulares se utilizan sustancias denominadas fijadores (técnicas de fijación), y para
resaltar y/o diferenciarlas reactivos denominados colorantes (técnicas de tinción).
En las células se encuentran sustancias constituidas por átomos de carbono unidos entre sí
(compuestos orgánicos), que pueden formar largas cadenas. Los carbonos se asocian con
hidrogeno, oxigeno, y en ocasiones con nitrógeno, fosforo y azufre, y otros elemento minoritarios.
Las células tienen la capacidad de producir compuestos orgánicos a partir de compuestos
inorgánicos. Entre los compuestos orgánicos sintetizados encontramos a las biomoléculas:
carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, de gran importancia en los seres vivos.
Funcionamiento y uso del microscopio
Las imágenes amplificadas de objetos diminutos se logran con el empleo de dos lentes de cristal
(ocular y objetivo), partes esenciales de un microscopio. Cada lente hace converger los rayos
luminosos que la atraviesan. El objetivo se sitúa cerca del objeto que se quiere observar, forma
una imagen real aumentada e invertida. La imagen es tomada por el ocular y magnificada
nuevamente, resultando en una imagen definitiva, invertida y de mayor tamaño. El aumento de la
imagen definitiva resulta del producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular (por
ejemplo; aumento de ocular 10x y aumento de objetivo 40x, entonces la imagen está aumentada
400x).
Como la posición de la imagen depende de la ubicación del objeto, para que sea visible, debe
procederse a enfocar. Esto consiste en desplazar el tubo del microscopio acercándolo o alejándolo
del objeto a observar, usando el tornillo macrométrico (primero) y el tornillo micrométrico
(segundo), hasta que la imagen aparezca bien nítida.
Preparación del material para su observación
Las observaciones biológicas corrientes se efectúan por transmitancia de la luz a través de la
preparación. La muestra es colocada sobre un vidrio que es el portaobjeto, que se puede cubrir
con otro vidrio muy delgado llamado cubreobjeto. Los preparados que pueden ser realizados en
el momento se denominan temporarios, porque no perduran en el tiempo, en cambio aquellos que
deben realizarse utilizando procesos y reactivos más complejos (denominados técnicas o procesos
histológicos), que permiten su permanencia sin sufrir cambios en el tiempo, se denominan
permanentes. Consideraciones:
1. Los porta y cubreobjetos deben estar limpios, preferentemente enjuagados con alcohol y
secos.
2. La preparación del material se debe hacer sobre una superficie limpia y plana.
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3. Si se realizan cortes, estos deben ser muy delgados como para dejar pasar la luz a través
del material.
4. Se puede realizar un preparado húmedo o temporario colocando una gota de agua en el
centro del portaobjeto y sobre ella el material a observar; luego el cubreobjeto. Además
existen dos técnicas para el montaje del material:
Aplastamiento: consiste en la disgregación de la muestra mediante el aplastamiento del material
entre porta y cubreobjeto. Procedimiento:
1. Se disgrega el material con la ayuda de una pinza o agujas de disección. Se puede colorear
el tiempo necesario.
2. Se cubre con un cubreobjeto.
3. Sobre una superficie plana se coloca el preparado y sobre el cubreobjeto un papel secante
y se aplasta con el pulgar o lápiz, sin deslizar ni rotar para evitar la rotura del material.
Frotis: consiste en esparcir el material (generalmente líquido o semilíquido), de modo que quede
distribuido uniformemente en una capa delgada. Procedimiento:
1. Se coloca una gota del material sobre un extremo del portaobjeto limpio y seco.
2. Se apoya sobre la gota el borde del otro portaobjeto formando un ángulo agudo.
3. Cuando la gota se extiende por capilaridad a todo el ancho del portaobjeto, se desliza hacia
el otro extremo con movimiento suave y uniforme.
Indicaciones prácticas para el uso del microscopio
Limpieza y conservación del microscopio
1. Antes de usarlo ver si las lentes están limpias.
2. Proceder a repasar con un trapo de hilo, muy limpio y suave, todas las lentes.
3. Las lentes no deben tocarse con las manos. Si se ensucian, limpiarlas suavemente.
4. Limpiar la platina. Esta debe mantenerse seca y limpia.
5. Ver si el condensador o la fuente luminosa poseen polvo. Si es así, limpiar con pincel.
6. No dejar portaobjeto sobre la platina sin no se está utilizando el microscopio.
7. Al terminar de utilizar el microscopio, a veces la parte superior del tubo queda mojada por
la humedad de la respiración, en ese caso secar con otro trapo limpio.
1. No forzar el sistema mecánico del microscopio (tornillo macro y micrométricos, platina,
revólver, condensador).
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8. Si utiliza aceite de inmersión*, limpiar el objetivo con un paño humedecido con alcohol.
*Aceite de inmersión: se utilizan para objetivo de inmersión (100x), entre la superficie de la
muestra y la lente objetivo, para disminuir la distorsión de la luz e incrementar la resolución de la
imagen. Ejemplo: aceite de cedro, glicerina. También se puede utilizar agua.
Iluminación
1. Encender la fuente de iluminación mediante la perilla reguladora que posee el microscopio,
cuando éste tiene luz propia.
2. Quitando el ocular, controlar la iluminación hasta que la imagen de la fuente de iluminación
se observe clara y centrada.
3. Colocar el ocular y comprobar si el campo está uniformemente iluminado, caso contrario
corregir.
4. El diafragma debe estar abierto unos dos tercios aproximadamente.
5. El condensador debe estar en el punto superior.
6. Observar si no hay intercalado un filtro de color.
Enfoque
2. Una vez iluminado el campo, colocar la preparación previa selección del objetivo de menor
aumento.
3. Colocar el preparado sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
4. Bajar la platina por medio del tornillo macrométrico, mirando lateralmente.
5. Levantar suavemente la platina con el mismo tornillo, esta vez observando con el ocular,
hasta observar el preparado.
6. Una vez visualizado el objeto, corregir la nitidez con el macrométrico primero y luego el
tornillo micrométrico.
7. Use los tornillos macro y micrométricos moviéndolos lentamente.
8. Pasar sucesivamente a mayores aumentos siguiendo las instrucciones precedentes.
9. Para cambiar el objetivo, bajar la platina con el tornillo macrométrico.
10. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. La rotura del cubreobjeto puede
ser extremadamente perjudicial para la lente frontal del objetivo, pudiendo dañarla en forma
irrecuperable.
11. Para moverse en el campo visual utilizar el sistema de Charriot.
Una vez finalizada la observación de la muestra, se baja la platina y se coloca el objetivo de menor
aumento girando el revolver. En este momento se puede retirar la muestra de la platina.
Si desplaza un microscopio hágalo manteniendo siempre el instrumento en posición vertical,
tomándolo del brazo y levantándolo, NUNCA lo arrastre sobre una superficie para moverlo (la
vibración provocada afloja y desajusta las lentes).
Al finalizar el trabajo, el microscopio debe quedar limpio, con el objetivo de menor aumento en
posición de observación y la parte mecánica de la platina sin sobresalir del borde de la misma, y
dejarlo cubierto con la funda.
ACTIVIDADES:
Materiales
Provisto por la cátedra Provistos por los alumnos (por grupo)
Microscopio óptico compuesto 1 banana
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Microscopio estereoscópico 1 huevo
Porta y cubreobjeto Sacarosa (una cucharada)
Preparados permanentes Granos de arroz (una cucharada)
Instrumental de laboratorio (tubo de Hielo (un vaso)
ensayo, pipetas, mortero, vaso de Detergente (medio vaso)
precipitados) Aceite de cocina (medio vaso)
Colorante (azul de metileno) Almidón (una cucharada)
Lugol (solución acuosa de yodo) Papel de cocina
Agua destilada o potable Cloruro de sodio (tres cucharadas)
Agua caliente (37°C) Pinza de depilar, aguja de disección,
Algodón gotero, hoja de afeitar, pincel
Alcohol 96° frío (dejar en congelador la Letra “A” tamaño 3 mm recortada de
noche anterior) publicación
Carbohidratos (glucosa, almidón) Paño de tela suave para limpiar las
Éter etílico lentes, papel secante
Ácido acético (vinagre) Materiales de dibujo (lápices de
colores, compás, hojas lisas)
Guardapolvo (no excluyente)
Lámpara pequeña (tipo mesa de luz)
1) Reconocimiento de lípidos. Rotular con número tres tubos de ensayos a los que se agregará:
a. Tubo 1: 4 ml de agua destilada + 1 ml de aceite
b. Tubo 2: 4 ml de alcohol etílico + 1 ml de aceite
c. Tubo 3: 4 ml de éter etílico + 1 ml de aceite
Agitar los tubos durante unos segundos. Observar, dibujar e interpretar los resultados.
2) Reconocimiento de carbohidratos. Rotular con número seis tubos de ensayos a los que se
agregará:
a. Tubo 1: 4 ml de agua destilada + 3 gotas de lugol
b. Tubo 2: 4 ml de suspensión de almidón al 10% + 3 gotas de lugol
c. Tubo 3: 4 ml de solución de glucosa al 10% + 3 gotas de lugol
d. Tubo 4: 4 ml de solución de sacarosa al 10 % + 3 gotas de lugol
e. Tubo 5: 4 ml de agua destilada + granos de arroz triturados + 3 gotas de lugol
f. Tubo 6: 4 ml de agua destilada + raspado de banana + 3 gotas de lugol
Agitar los tubos durante unos segundos. Observar, dibujar e interpretar los resultados.
Fundamentos: las moléculas de yodo se intercalan en los bucles de la hélice de amilosa
formando un complejo de color azul-violáceo.
3) Reconocimiento de proteínas. Rotular con número tres tubos de ensayos a los que se agregará:
a. Tubo 1: 4 ml de agua destilada + 2 ml de clara de huevo
b. Tubo 2: 4 ml de agua destilada + 2 ml de clara de huevo + 1 ml de alcohol etílico
c. Tubo 3: 4 ml de suspensión de almidón al 10% + 1 ml de saliva + pizca de sal. Sumergir
el tubo en agua caliente a 37°C.
Agitar los tubos durante unos segundos. Para el tubo 3 esperar 5 minutos, y luego agregar
3 gotas de lugol. Observar, dibujar e interpretar los resultados.
4) Extracción y reconocimiento de ADN.
a. Solución de lisis. En un vaso preparamos una solución salino-jabonosa compuesta con 100
ml de agua, 1 cucharada de detergente y una cucharada de sal. No agitar bruscamente para
no hacer espuma.
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b. Preparación de material orgánico. Pelamos la banana y cortamos en trozos pequeños,
trituramos en un mortero.
c. Mezcla y lisis. Añadir la banana triturada en el vaso con solución de lisis. Mezclar y dejar
reposar 5 minutos para que las células se rompan. Mantener en frio.
d. Separación del material sólido. Pasamos la mezcla por un colador o algodón y luego por
un filtro. Recogemos el líquido filtrado en un tubo de ensayo.
e. Precipitación del ADN por acción del alcohol. Sobre el filtrado y las paredes del tubo
agregamos lentamente alcohol frio (100-150 ml), evitar que se mezclen. Dejamos reposar
unos minutos, aparecen 3 capas. Sobre la capa blanquecina (interfase alcohol-agua)
introducimos una varilla de vidrio, y con movimientos circulares podremos recuperar el
ADN (filamento blanco) enrollado en la varilla.
5) Observación y formación de imagen a través del microscopio.
a. Coloque una letra “A” recortada de un periódico sobre un portaobjeto, humedézcala con
agua y tape con un cubreobjeto. La letra debe estar colocada en su posición normal al ser
enfocada con un microscopio estereoscópico. Observe y dibuje. Fíjese si la imagen de la
letra se presenta en la misma posición.
b. Enfoque la preparación anterior con un microscopio compuesto respetando la posición
normal de la letra al colocarla sobre la platina. Para el uso del microscopio compuesto,
segur el procedimiento descrito arriba. Observe y dibuje. Escriba que diferencias nota en
la imagen si la compara con la observación anterior.
6) Realización y observación de preparados temporarios.
a. Observación de muestra banana. Con la hoja de afeitar tomar un raspado de la cara
interna de la cáscara de banana, colocar en un portaobjeto, agregar una gota de agua, cubrir
con cubreobjetos y observar al microscopio compuesto. Dibujar y rotular indicando el
aumento utilizado.
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APÉNDICE
I. Elementos de uso común en el laboratorio:
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