SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INFORME TÉCNICO
DE RESIDENCIA PROFESIONAL

“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO

ESPECTROSCOPICO (RAMAN) APLICADA A LA FORMULACIÓN
DE UN DESPARASITANTE INYECTABLE DE LÍNEA
VETERINARIA.”

DESARROLLADO POR

JAZMÍN JANETH ARMENTA SALAZAR

06270207

ASESOR

Q.B.P. AURA FLORES PEREZ

ASESOR EXTERNO

ING. EVERARDO TORRES HERNÁNDEZ

REVISOR

Q.F.B. DULCE MARÍA HERNANDEZ BERISTAIN

DRA. ROCÍO MEZA GORDILLO

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS, JUNIO DEL 2012

AGRADECIMIENTOS

A mi Dios, porque todo lo que tengo es gracias a él, por él y para él.
A mis padres por ser mi apoyo y fortaleza.
A mis asesores que cada día nos guían y enseñan a ser mejores.

2
ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

1. CARACTERIZACIÓN DEL PROYECTO

1.1 Planteamiento del problema
1.1 .1 Antecedentes del problema
1.1.2. Definición del problema
1.2 Objetivo general
1.3. Objetivos particulares
1.4. Justificación del proyecto
1.5. Delimitación

2. GENERALIDADES DE LA EMPRESA
2.1 Antecedentes
2.2 Misión
2.3 Visión
2.4 Valores
2.5 Logotipo
2.6 Localización de la empresa
2.7 Razón social
2.8 Organigrama planta Casal´s internacional
2.9 Descripción de los productos

3. FUNDAMENTO TEORÍCO
3.2 Validación de métodos analíticos
3.2.1 Definición
3.3 Tipos de validación
3.3.1 Validación prospectiva
3.3.2. Validación retrospectiva

3
3.3.3. Revalidación
3.4. Características de desempeño analítico para validación
3.4.1. Verificación del sistema
3.4.2. Precisión del sistema
3.4.3. Linealidad del sistema
3.4.4. Especificidad/selectividad del método
3.4.5. Exactitud del método
3.4.6. Linealidad e intervalo del método
3.4.7. Precisión del método
3.4.8. Límite de detección del método
3.4.9. Límite de cuantificación del método
3.4.10. Robustez del método
3.4.11. Tolerancia del método

3.5. Métodos de validación

3.5.1. Requisitos previos a la validación

3.6. Métodos Analíticos

3.6.1. Métodos clásicos
3.6.2 Pasos en un análisis
3.6.3.1. Muestro de sólidos
3.6.3.2. Muestreo de líquidos
3.6.3.3. Muestreo de gases
3.6.4. Estrategias de muestreo

3.7. Pruebas estadísticas y análisis de errores

3.7.1. Introducción e importancia de la estadística
3.7.2. Medición de errores
3.7.3 Precisiòn y exactitud
3.7.3.1. Ejemplo de cálculo de precisión

4
 3.8 Principios activos del desparasitante (APIS: Active pharmaceutical ingredient)
3.8.1. Ivermectina
3.8.2 Características generales de ivermectina
3.8.3. Mecanismo de acción
3.8.4 Triclabendazole
3.8.5. Prazicuantel

4. METODOLOGÍA
4.1. Diagrama general de la metodología a implementar.

4.2. Preparación de las muestras

4.2.1. Preparación de muestras de principio activo para análisis cualitativo.
4.2.2. Preparación de las muestras de desparasitante para análisis cuantitativo.
4.2.3. Preparación de muestras de desparasitante para curva de calibración.

4.3. Análisis cualitativo de los 3 APIS (Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel)

4.3.1. Proceso de determinación de análisis cualitativo.

4.4. Preparación de curva de calibración con diferentes concentraciones de

desparasitante inyectable.

4.5. Análisis cuantitativo del producto final para determinar el contenido de

Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel.

4.6. Cálculos estadísticos para validación.

5. RESULTADOS
5.1. Análisis cualitativo de los 3 APIS (Ivermectina, triclabendazole y prazicuantel)
5.1.1. Análisis cualitativo Ivermectina

5.1.2. Análisis cualitativo de Prazicuantel

5
5.1.3. Análisis cualitativo de Triclabendazole
5.2. Curva de calibración
5.2.1. Muestras de desparasitante a diferentes concentraciones de Ivermectina
5.2.3. Muestras de desparasitante a diferentes concentraciones de Prazicuantel
5.2.4. Muestras de desparasitante a diferentes concentraciones de Triclabendazole.
5.3 Arèa bajo la curva de Ivermectina

6. RESULTADOS
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÌA
9. ANEXOS

6
 INTRODUCCIÓN
La mayoría de los análisis químicos se desarrollan mediante el método de prueba y
error. La validación es importante ya que de esta forma demostramos que cada
procedimiento analítico mide en efecto lo que el analista dice que mide en lo que respecta a
un tipo específico de muestra. A este proceso se le llama validación del método analítico.

La validación nos determina si la metodología desarrollada para detectar un analìto

específico (principios activos ivermectina, triclabendazole y prazicuantel) en una muestra
específica de producto terminado (desparasitante inyectable) da lugar a resultados
comparables.

El presente trabajo se realizo en la empresa farmacéutica CASAL`S internacional

ubicada en la ciudad de Atotonilquillo, Jalisco. Esta empresa tiene un sistema de control de
calidad que consta principalmente de un equipo espectroscópico Raman, ya que con este
equipo realizan la aprobación de materias primas y producto terminado.

Este proyecto consistió básicamente en realizar un análisis cualitativo y cuantitativo a

un desparasitante inyectable usado en línea veterinaria, que contiene 3 APIS: (active
pharmaceutical ingredients) Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel. Para esto se realizo
el análisis de los espectros identificando los picos que sobresalían en los espectros y son los
que se consideraron representativos para realizar con ello al análisis cualitativo identificando
los grupos funcionales de cada principio activo directamente en muestras directas del
proveedor. Para el análisis cuantitativo al producto final (desparasitante) se realizo una curva
de calibración haciendo variar las concentraciones de cada API.

El proceso de validación se realizó para determinar los datos estadísticos necesarios

para comprobar si efectivamente el método analítico espectroscópico Raman es preciso,
reproducible y tiene una linealidad del sistema en un producto desparasitante inyectable de la
empresa CASAL`S internacional y se realizo a 2 lotes de desparasitante inyectable de lotes
PL-0552 y PL-0553 con 2 replicas de cada muestra. Se determino respectivamente el área

7
bajo la curva con una aplicación llamada GRAMS del equipo Raman y se realizo una curva
de calibración para cada API del desparasitante y a este se le realizo los datos estadísticos.

8
CAPÍTULO 1

Caracterización del proyecto

9
 1.1. Planteamiento del problema

1.1.1. Antecedentes del problema

La industria farmacéutica cada día propone nuevas normas y metodologías que

garanticen que el producto que se lanza al mercado es seguro y confiable para su
utilización. Esto aplica tanto en el ramo de la línea humana como en línea veterinaria.

En la línea veterinaria se ha propuesto que basándose en las Buenas

prácticas de manufactura (GMP) debe aplicarse la validación a los productos
farmacéuticos para garantizar que estos no causen algún daño al consumidor y
proporcionen un alto grado de confianza, antes de lanzarse al mercado. Es por esto
que en Casal´s internacional con la visión de mejorar en la calidad de sus productos
implementara la validación a todos sus productos.

Casal´s internacional propone se utilize el equipo espectroscópico Raman en

la determinación cuantitativa y cualitativa de un desparasitante inyectable que se
lanzara al mercado para corroborar que tan preciso y reproducible es el uso de este
equipo para realizar este mismo proceso a todos los productos farmacéuticos de la
empresa Casal`s.

1.1.2. Definición del problema

El proceso de producción de todos los productos de Casal´s internacional no

posee una metodología que garantice una reproducibilidad y grado de confianza que
denoten una calidad a sus productos.

10
 1.2. Objetivo general

Implementar una técnica de análisis cualitativo y cuantitativo a un desparasitante

inyectable con los principios activos: Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel
usando la espectroscopia Raman para dichos fines, realizando los cálculos de
reproducibilidad y precisión para la validación.

1.3. Objetivos particulares

_Realizar el análisis cualitativo y cuantitativo de los 3 principios activos

(Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel) a un desparasitante de línea veterinaria
usando la técnica de espectroscopia Raman. Para el análisis cuantitativo se
realizara una curva de calibración usando la aplicación del equipo Raman del área
bajo la curva.

_Desarrollar el análisis cuantitativo de los 3 principios activos del desparasitante

determinando el área bajo la curva de los espectros de cada principio activo, usando
la aplicación de Grams incluida en el espectroscopio Raman.

_Determinar los parámetros estadísticos necesarios para la validación como

son: desviación estándar y linealidad del sistema por la técnica de mínimos
cuadrados.

1.4. Justificación del proyecto

La industria farmacéutica veterinaria es un ramo industrial con grandes alcances que

cada día cobra auge debido a la importancia y aceptación que está tiene en el mercado
nacional e internacional.

11
 Debido a esta relevancia se pretende cumplir con los estándares de calidad y
normatividad que establecen las distintas farmacopeas como son: La farmacopea de los
estados unidos mexicanos (FEUM), Real farmacopea Española y British Pharmacopoeia.

La industria farmacéutica veterinaria es tan estricta como la humana en términos de

calidad e infraestructura, esto se debe a la importancia e impacto que estos tienen ya que un
error durante el proceso de elaboración podría acarrear grandes pérdidas económicas,
sociales y morales.

Casal´s internacional es una empresa comprometida con el bienestar y tranquilidad de

sus clientes, con el compromiso de que cada producto cumple con los estándares y niveles
de calidad que preservaran la salud y el cuidado de los animales. Para esto es necesario que
se implementen metodologías y técnicas que aseguren que cada producto tiene la cantidad
que específica, basándose en un método analítico que se encuentre validado para su
reproducibilidad y aplicación.

La validación de un método analítico es un proceso que nos establece paso a paso el

estudio experimental através de diversos parámetros. Para el desarrollo de un nuevo
producto se necesita utilizar un método analítico que permita cuantificar el producto en forma
de materia prima o como principio activo de la formulación con un alto grado de
confiabilidad.

La validación es necesaria también porque nos proporciona un conocimiento profundo

del método, así como de sus características de funcionamiento, en resumen la validación
disminuye el número de fallas y repeticiones, con el consiguiente ahorro de los costos
asociados y en consecuencia un cumplimiento con los plazos previstos de análisis.

El equipo espectroscópico Raman es una buena opción para realizar esta validación
ya que esté ha sido aceptado ante la FDA en la detección y adulteración de productos
farmacéuticos y también es un método aprobado por la USP que es aceptado y comparado
como el HPLC.

12
 1.5. Delimitación

El proyecto se llevara a cabo en las instalaciones de la planta de Casal´s

internacional S.A. de C.V. Ubicada en Atotonilquillo, Jalisco, México. Con un periodo de
elaboración de 5 meses, a partir del día 23 de junio del 2012.

El corto tiempo es una de las limitantes ya que para tener un sistema bien establecido
de validación se necesitan controlar diversos parámetros y se pretende que este sistema se
implemente para todos los productos de Casal´s internacional.

Otra de las limitantes es que en esta empresa no se realizan validaciones a ningún

producto y establecer una metodología correcta requiere de conocimientos previos y practica
en este proceso.

13
CAPÍTULO 2

Generalidades de la empresa

14
2.1. Antecedentes

CASAL´S INTERNACIONAL es una empresa integradora de negocios veterinarios,

surge a partir de Laboratorios SOPHIA división veterinaria, esta última es vendida en el año
de 1999 al Lic. Javier de la Mora que decide cambiar el nombre a LABORATORIOS LAVET
trasladando la planta a Atotonilquillo, Jalisco.

Seis años más tarde en el 2005 la planta la adquiere el Ing. Jorge Castro
Aldrete y en el 2008 decide hacer de la planta una unidad de negocios llamada: CASAL´S
INTERNACIONAL, transformando la empresa en una integradora de negocios veterinarios,
al mismo tiempo se forma el equipo de CASAL´S integrado por: LAVET que es una
comercializadora de productos con marca propia y PAOSA y DIPROA: distribuidora de
productos veterinarios de diferentes marcas y también con la marca CASAL´S ubicada en
Atotonilquillo Jalisco.
Los productos qe se elaboran dentro de CASAL´S INTERNACIONAL constan
de una amplia gama formas farmacéuticas que van desde un complejo vitamínico hasta un
desparasitante, o un antibiótico sin olvidar su marca de croquetas SYNERGY CACHORROS
y su más reciente innovación: gel calostro producto que será lanzado al mercado en este
año. En CASAL´S INTERNACIONAL día a día se preocupa por la investigación y desarrollo
de nuevos y mejores productos es por ello que se hace alianza con centros de investigación
tal es el caso de la UNAM y el CINVESTAV.

Todo esto conlleva a que CASAL´S INTERNACIONAL tenga una misión clara:
asegurar que nuestros clientes de la industria veterinaria cumplan sus promesas, logrando
soluciones integrales, a través de servicios innovadores y excelencia operativa, nuestra
visión es ser una empresa de clase mundial, en la cual la industria farmacéutica veterinaria
deposite su confianza, dado que -somos una organización sólida y experimentada que
genera desarrollo profesional, 1rentabilidad y soluciones al mercado nacional e internacional.
Con una vocación de servicio al cliente y respetuosa del medio ambiente.

15
2.2 Misión

Asegurar que nuestros clientes de la industria veterinaria cumplan sus promesas,

logrando soluciones integrales, a través de servicios innovadores y excelencia operativa.

2.3 Visión

Somos una empresa de clase mundial, en la cual la industria farmacéutica veterinaria

deposite su confianza, dado que somos una organización sólida y experimentada que genera
desarrollo profesional, rentabilidad y soluciones al mercado nacional e internacional. Con una
vocación de servicio al cliente y respetuosa del medio ambiente.

2.4 Valores

 Profesionalismo: Representado en el compromiso hacia los clientes, creando

vínculos de comunicación eficaz, respetando los tiempos de entrega con productos de
calidad.

 Pro actividad: Desarrollo de ideas, acciones y actitudes en la búsqueda de la

mejora continua.

 Humildad: Ser consciente de las limitaciones, así como de las debilidades para
trabajar en ellas y transformarlas en herramientas que ayuden a la superación de las
expectativas.

 Servicio: Es el desarrollo de actividades enfocadas en la satisfacción de los

clientes.

 Respeto: Conocer y reconocer los intereses de los trabajadores, como el de los

clientes para ofrecerles productos y/o servicios acordes a sus necesidades.
16
  Creatividad e innovación: Generar e implementar ideas enfocadas en la
satisfacción de las necesidades de los clientes que reúnan los estándares de calidad
en productos veterinarios.

2.5. Logotipo

Figura 2.1 Logotipo Casal`s internacional S.A. de C.V.

2.6. Localización de la empresa

La empresa se encuentra ubicada en carretera Guadalajara-Ocotlán Km 12 N° 2910

Atotonilquillo, Jalisco México.

La Figura 2.2 muestra la ubicación macroscópica, en el estado de Jalisco de la

empresa Casal´s Internacional ubicada en el municipio de Atotonilquillo.

Figura 2.2 Ubicación macroscópica (Fuente Google Maps)

17
2.7. Razón social

La razón social oficial de la empresa es Casal´s Internacional S.A de C.V.

2.8. Organigrama planta Casal´s Internacional

La Figura 2.3 representa de manera gráfica el Organigrama con el cual se rige

Casal´s Internacional S.A de C.V.

DIRECTOR
GENERAL

DIRECTOR DE DIRECTOR DE
OPERACIONES INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO

LOGISTICA PLANEACIÓN ALMACEN JEFE DE CONTROL

DE CALIDADRE ASEGURAMIENTO
RCEPCIONES DE LA CALIDAD

AUXILIAR DE
SUPERVISOR DE SUPERVISOR DE
ALMACEN QUÍMICO ANALISTA
PRODUCCIÓN CONTROL DE CALIDAD
Cocina e
intendencia
AUXILIAR DE
PRODUCCIÓN

Figura 2.3 Organigrama Casal`s internacional

(Fuente Casal`s internacional S.A. de C.V.

18
 2.9. Descripción de los productos

Casal´s Internacional maneja una vasta línea de productos propios y maquilas

realizadas a distintos laboratorios veterinarios de México dentro de los productos realizados
se encuentran los observados en la tabla 2.1.

Tabla 2.1 Listado de productos inyectables

(Fuente Casal`s internacional S.A. de C.V.)

Registro
Descripción Presentaciones Principios activos
SAGARPA
Vitamina A propionato 2.5 Mui
12 x 20 ml
oleosa Q-6565-
ADEPLUS 100 ml Vitamina D3 40 mui cristales 020
500 ml Vitamina E acetato Oleosa
Aminoácidos
Dextrosa anhidra Q-6565-
AVYMINE 500 ml
Minerales 023
Vitaminas
250 ml Ácido bórico
500 ml Dextrosa anhidra
D-pantenol
Gluconato de calcio
Hipofosfito de magnesio
Q-6565-
CALCITON L-Metionina 015
Niacinamida
Piridoxina clorhidrato
Tiamina clorhidrato
Vitamina B2 ribof.5 fosfato
sódico
12 x 20 ml D-pantenol
50 ml Extracto de hígado inyectable
100 ml Niacinamida
COMPLEJO B 250 ml Piridoxina clorhidrato Q-6565-
FORTE Tiamina clorhidrato 024
Vitamina B2 ribof.5 fosfato
sódico
Vitamina B12 cianocobalamina

19
 Tabla 2.1 Listado de productos inyectables ( continuaciòn)
(Fuente Casal`s internacional S.A. de C.V.

Registro
Descripción Presentaciones Principios activos
SAGARPA
100 ml
VERMIFUGO 12% 250 ml Levamisol clorhidrato Q-6565--012
500 ml
100 ml Levamisol clorhidrato
250 ml Niacinamida
VERMIFUGO 12% 500 ml Piridoxina clorhidrato
Q-6565-041
VIT. Tiamina clorhidrato
Vitamina B2 riboflavina 5 fosfato sódico
Vitamina B12 cianocobalamina
20 ml Levamisol clorhidrato
VERMIFUGO ADE 100 ml Vitamina A propionato 2.5 M.U.I. oleosa
Q-6565-009
12% 250 ml Vitamina D3 40 M.U.I.
500 ml Vitamina E acetato oleosa
100 ml Selenito de sodio
SELAVET 250 ml Vitamina E acetato oleosa Q-6565-044
500 ml
20 ml
50 ml
CATOLAV 100 ml Ácido 1-(butafosfan)1-metiletil fosforoso Q-6565-050
250 ml
500 ml
50 ml
100 ml
OXIMAS 200 L.A Oxitetraciclina Q-6565-036
250 ml
500 ml
20 ml Antipirina
GANAVET Q-6565-045
50 ml Diaminacendiaceturato
12 x 20 ml
CEFTIOLAV 100 ml Ceftiofur clorhidrato (como base) Q-6565-058
250 ml
10 ml
50 ml
IVOMAS 3.5% L.A. Ivermectina Q-6565-056
100 ml
200 ml

20
 Tabla 2.1 Listado de productos inyectables ( continuaciòn)
(Fuente Casal`s internacional S.A. de C.V.

Registro
Descripción Presentaciones Principios activos
SAGARPA
20 ml Complejo Hierro dextrán al 20%
50 ml Cloruro de cobalto R.A. 6H2O
PORFER PLUS Q-6565-042
100 ml Sulfato de zinc R.A. 7H2O
Vitamina B12 cianocobalamina
20 ml Enrofloxacina
50 ml Bromhexina
NEUMOFLOX Q-6565-054
100 ml
250 ml
Vitamina B12
IVOMAS
10 ml Ivermectina Q-6565-061
EQUINOS
Prazicuantel

Dentro de la tabla 2.1 se muestra el nombre comercial del producto en la primer

columna, siendo estos 27 productos distintos; en la segunda columna se encuentran las
presentaciones en las que se producen los distintos productos danto un total de 82
presentaciones, la tercer columna muestra los principios activos del producto y por último se
muestra en la última columna el registro otorgado por SAGARPA de cada uno de los
productos.

21
CAPÍTULO 3

Fundamento teórico

22
 3.1. Introducción

3.2 Validación de métodos analíticos

3.2.1 Definición

La validación de un método analítico es importante ya que nos demuestran la

calidad de los medicamentos, la industria farmacéutica está interesada en la validación de
nuevos métodos analíticos. Las buenas prácticas de Manufactura también hacen referencia
a este proceso y destacan que las empresas farmacéuticas también deben realizarlo para
dar confiabilidad a los productos.

La farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM 2008) nos menciona: La

validación de un método es el proceso que establece, mediante estudios de laboratorio; que
las características de desempeño del método, satisfacen los requisitos para su aplicación
analítica.

El proceso de validación de los métodos analíticos pude comprender pero no está

limitado al estudio de las características de desempeño que se describe en la tabla 2.2:

Verificación del sistema

Precisión del sistema
Linealidad del sistema
Especificidad/ Selectividad del método
Exactitud del método
Linealidad e intervalo del método
Precisión del método
Limite de detección del método
Límite de cuantificación del método
Robustez del método
Tolerancia del método

Tabla 2.2. Caracterìsticas de desempeño de validaciòn

(Fuente FEUM 2008)
23
 (Hernández et al 1998) Refiere que la validación de un método analítico es el
proceso por el cual queda establecido por estudios experimentales que la capacidad del
método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada. Esta se fundamenta en
la determinación de diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría a la que
pertenezcan.

En una definición simple y clara validad es comprobar y certificar, con evidencia

documentada, que un método, sistema o proceso, cumple y se desarrolla tal y como estaba
previsto, dentro de intervalos definidos.

Para el desarrollo de un nuevo producto es necesaria la utilización de métodos

analíticos que permitan cuantificar el producto en forma de materia prima o como principio
activo de la formulación con un alto grado de confiabilidad.

En la actualidad los laboratorios de control de calidad de la industria médico-

farmacéutica no solo se ocupan de analizar si un producto cumple o no con sus requisitos de
calidad mediante la utilización de métodos analíticos establecidos para cada uno de ellos,
sino también se esfuerzan para validad cada método analítico utilizado en el control de la
calidad de sus productos.

3.3 Tipos de validación

3.3.1 Validación prospectiva

Se realiza cuando la verificación del cumplimiento de las condiciones establecidas

para un proceso o método analítico, se llevan a cabo antes de la comercialización del
producto. Este tipo de validación se aplica cuando se elabora un nuevo método analítico.
Es típico en los laboratorios de investigación y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un
protocolo perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios
necesarios para demostrar el buen funcionamiento del método (Morales Cesar 2004).

24
 3.3.2. Validación retrospectiva

Se realiza cuando la idoneidad del proceso o método analítico, se basa en la

garantía constatada a través de los datos analíticos del producto ya comercializado. Se
aplica a métodos no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de
resultados.

Este tipo de validación se aplica para métodos por cromatografía líquida, métodos
espectrofotométricos y métodos volumétricos.

3.3.3. Revalidación

La introducción de un cambio que pueda afectar la idoneidad del método analítico

establecido por la validación, podrá exigir una nueva validación, es decir una revalidación
total o parcial de dicho método analítico. Los criterios a estudiar se deciden en función del
tipo de cambio efectuado.

Entre los motivos que exigen una nueva validación tenemos:

_ Cambios importantes en la matriz del producto
_Cambios importantes en el método analítico.
_Cambios en las especificaciones.

3.4. Características de desempeño analítico para validación

3.4.1. Verificación del sistema

Son pruebas utilizadas para verificar que el sistema funciona correctamente, con
base en criterios establecidos previamente. Esta verificación permite establecer la
confiabilidad del sistema, antes del procesamiento de las muestras durante el uso rutinario
del método; también se le conoce como buen o correcto funcionamiento del sistema.

25
 En función del sistema de medición, se deben establecer las características
relacionadas con su funcionamiento correcto, basadas en el tipo de equipo e instrumentación
utilizado en el método. Éstas pueden ser definidas en función de una respuesta analítica,
como pueden ser sus propiedades, su variabilidad, su forma, su tiempo de respuesta,
indicadores de separación, indicadores de eficiencia, respuesta de blancos, entre otros.
En la fase de desarrollo del método, las características mencionadas
anteriormente y sus criterios de aceptación deben ser establecidas; durante la validación, la
verificación debe ser únicamente verificada. Los criterios de aceptación deben ser
cumplidos.

3.4.2. Precisión del sistema

La precisión de un método analítico, es el grado de concordancia de los resultados

de la prueba, cuando el método se aplica repetidamente a múltiples tomas de una muestra
homogénea.

La precisión puede ser medida, ya que sea por el grado de reproducibilidad o de

repetibilidad del método analítico, bajo condiciones normales operativas. Definimos:

Reproducibilidad: se refiere al uso del procedimiento analítico en diferentes

laboratorios.
Precisión intermedia: Expresa la variación dentro de un mismo laboratorio, en
diferentes días, o con diferentes analistas o equipos.

La farmacopea (FEUM 2008) Refiere: La precisión del sistema es el grado de

concordancia relativa de la respuesta analítica de soluciones de referencia de concentración
o magnitud conocida. A partir de una sustancia de referencia, el analista debe preparar por lo
menos seis soluciones que representen al 100% de la cantidad o concentración del analito
en la muestra, ya sea, por dilución o por pesadas independientes y medir la respuesta dentro
de una misma corrida analítica.

26
 Calcular el coeficiente de variación de la respuesta analítica. Este valor debe cumplir
con un criterio previamente establecido en función de la naturaleza de la respuesta analítica
(física, química o biológica) o de la categoría del método.

3.4.3. Linealidad del sistema

Cuando la relación entre la concentración y la respuesta del analito (o sus

transformaciones matemáticas) no es lineal dentro del intervalo de trabajo, dará lugar a
inexactitud del método analítico, por lo que, es conveniente verificarlo bajo las condiciones
del laboratorio. La linealidad del sistema es la verificación de que la respuesta analítica y la
concentración del analito (puede ser una sustancia de referencia) se ajustan al modelo
matemático, en un intervalo de concentraciones pertinentes a la aplicación analítica.
Se debe investigar la relación concentración-respuesta en un intervalo que incluya al
menos 5 niveles, por triplicado, de la concentración del analìto. El intervalo debe incluir las
concentraciones esperadas del analìto según la aplicación analítica del método. Este
concepto generalmente se denomina “curva de calibración” y es parte esencial de varios
métodos analíticos en las determinaciones cuantitativas del analìto.
Estimar los parámetros del modelo basado en métodos estadísticos (mínimos
cuadrados, máxima verosimilitud, etc.) Deben establecerse criterios de aceptación para
definir la calidad de ajuste al modelo, que como mínimo consideren un efecto significativo del
modelo, una magnitud mínima del coeficiente de determinación o una prueba estadística de
falta de ajuste.

3.4.4. Especificidad/selectividad del método

La especificidad/selectividad permite investigar la influencia de otros componentes de

la muestra en las determinaciones cualitativas o cuantitativas de un método analítico. La
especificidad/ selectividad, es la capacidad de un método analítico para obtener una
respuesta debida únicamente al analìto para obtener una respuesta debida únicamente al
analìto de interés y no a otros componentes de la muestra, que pueden estar presentes
(especificidad) o que se pudieran presentar por efectos ambientales y/o de interacción con

27
los mismos componentes (selectividad) tales como: impurezas, productos de degradación o
componentes de la misma muestra.
Para determinar la especificidad, se debe demostrar que la respuesta analítica se
debe únicamente al analito.
Para el caso de especificidad se debe determinar, la respuesta a componentes como:
aditivos, sustancias auxiliares, sustancias relacionadas estructuralmente al fármaco, etc.
Para el caso de selectividad se debe determinar la respuesta a componentes como:
sustancias de degradación del fármaco originadas por la influencia de las condiciones de
almacenamiento (temperatura, humedad, luz, etc.) o por condiciones extremas (hidrólisis,
oxidación, etc.).
Se presenta evidencia de que la respuesta analítica del método sea debida
únicamente al analìto.

3.4.5. Exactitud del método

La exactitud del método debe ser determinada a todos los métodos de carácter
cuantitativo. La exactitud de un método analítico, es la concordancia absoluta entre el
resultado obtenido con el método y la cantidad verdadera del analito presente en la
muestra, a una cantidad fija.

En el estudio de laboratorio la exactitud, puede determinarse por la aplicación del

método analítico, a placebos o muestras adicionadas preparados de mancera
independiente, al menos por sextuplicado, obtenidas de acuerdo a un procedimientos
específico, dichas muestras deben contener todos los componentes del producto y además
se le debe adicionar la concentración del analìto que represente el 100%. La exactitud puede
determinarse por comparación de los resultados obtenidos, aplicando el método en estudio
con los resultados obtenidos al aplicar un segundo método que haya sido bien caracterizado
y cuya exactitud ha sido establecida o definida.

La exactitud se evalúa mediante el porcentaje de recobro (cociente porcentual de la

concentración recuperada entre la concentración adicionada) considerando los resultados del
análisis de las muestras. La diferencia entre el valor de la media aritmética del porcentaje de

28
recobro y el valor verdadero aceptado (100%), mide el sesgo del método. Un método
estadístico que demuestre que la magnitud del sesgo es cero, indica que el método es
exacto.
El análisis de datos debe incluir la metodología estadística aplicada y los criterios de
aceptación para la exactitud del método analítico.

3.4.6. Linealidad e intervalo del método

Todo método analítico no debe presentar sesgo (error sistemático) dentro del intervalo
de cuantificación, por lo que es necesario seleccionar al menos tres niveles de concentración
(intervalo), que permitan demostrar exactitud y linealidad. Es necesario que el intervalo
incluya los límites de especificación de la aplicación analítica del método.
Linealidad es la capacidad de un método analítico para dar resultados que son
directamente proporcionales a la concentración del analito (sin sesgo) dentro de un intervalo
dado.
Definición de intervalo: Es el intervalo comprendido entre las concentraciones superior
e inferior del analito (incluyendo dichas concentraciones) y para el que se ha demostrado
que el analito es cuantificado con un nivel satisfactorio de precisión, exactitud y linealidad,
cuando se aplica el método analítico.
En el laboratorio la linealidad puede determinarse por la aplicación del método
analítico, a una muestra (placebo adicionado o muestra adicionada de analito), obtenida de
acuerdo a un procedimiento específico para su preparación. Dicha muestra debe ser
preparada al menos a tres niveles de concentración del analito por triplicado, para ser
analizadas aplicando el método analítico. La linealidad puede determinarse por comparación
de los resultados obtenidos, aplicando el método en estudio, con los resultados obtenidos al
aplicar un segundo método, bien caracterizado, en los tres niveles de concentración
seleccionados.
Las concentraciones seleccionadas para la linealidad, deben ser como mínimo tres
concentraciones y considerar los siguientes intervalos, en función de la aplicación del
método:

29
 Cuantificación de un fármaco: (materia prima o de un producto terminado): de 80% a
120% del contenido de marbete. Cuantificación de una impureza: de 50% a 120% de la
especificación.
Uniformidad de contenido: de 90% a 115% de la concentración declarada en el
marbete, a menos que se justifique un intervalo más amplio, basado en la naturaleza de la
forma farmacéutica.
Análisis de datos: Es recomendable hacer una gráfica con los resultados obtenidos de
la concentración adicionada contra la concentración recuperada del analito y por medio de
su examen visual, determinar una posible relación lineal. Cuando exista visualmente una
relación lineal, llevar a cabo el ajuste por mínimos cuadrados de la relación lineal, entre
concentración adicionada (x) y concentración recuperada (y). El análisis debe contemplar la
calidad de ajuste al modelo, por medio del coeficiente de determinación (r 2), la desviación
estándar de la regresión (Sy/x) y el coeficiente de variación de regresión (CVy/x). Puede ser
necesario establecer la linealidad basada en una prueba estadística de falta de ajuste.
La exactitud se evalúa mediante el porcentaje de recobro (cociente porcentual de la
concentración recuperada entre la concentración adicionada) considerando los resultados del
análisis de las muestras. La diferencia entre el valor de la media aritmética del porcentaje de
recobro y el valor verdadero aceptado (100%), mide el sesgo del método.

3.4.7. Precisión del método

Cuando un método analítico es exacto y lineal, la variabilidad de un resultado analítico

se debe a factores aleatorios, como la incertidumbre de las mediciones debidas a: la balanza
analítica, material graduado, material graduado, material volumétrico, instrumento de
medición de la respuesta analítica, corridas analíticas, analistas de laboratorio, lotes de
reactivos. Los factores se pueden clasificar en factores aleatorios intramétodo,
intralaboratorio e interlaboratorio. La precisión intramétodo se mide en términos de
repetibilidad, la reproducibilidad intralaboratorio se mide en términos de la precisión
intermedia, la reproducibilidad interlaboratorios se mide en términos de estudios
colaborativos.

30
 Para estudios de precisión, una corrida analítica es el análisis, al menos por triplicado,
de una misma muestra de un producto, utilizando el método analítico, ejecutado por un
mismo analista, bajo las mismas condiciones de análisis.

La precisión de un método analítico, bajo las mismas condiciones analíticas

(repetibilidad) o bajo diferentes condiciones analíticas (reproducibilidad), utilizando una
muestra homogénea. Generalmente la precisión se expresa como la desviación estándar o
como el coeficiente de variación (desviación estándar relativa).

La repetibilidad se refiere a la variación de los resultados de las muestras, al aplicar el

método en una corrida analítica. La repetibilidad es una propiedad crítica del método
analítico. La repetibilidad se determina a partir de los resultados obtenidos de la exactitud y
de la linealidad del método y de la relación de la concentración adicionada contra la
concentración recuperada.

3.4.8. Límite de detección del método

El límite de detección es una característica de desempeño analítico que debe

determinarse cuando un método analítico se aplica como prueba límite. El límite de detección
(LD) es la cantidad mínima de analito en una muestra que puede ser detectada, pero no
necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de aplicación del método. Así las pruebas
límite solo indican que la cantidad del analito es superior o inferior a la concentración
establecida. El límite de detección se expresa como la concentración indicada en el método
analítico (ppm, partes por billón, mg/g, etc).

El límite de detección se puede determinar empleando el procedimiento basado en “la

señal ruido” o el de linealidad. En el procedimiento de linealidad, es necesario generar una
relación concentración vs. Respuesta analítica, con al menos tres niveles de concentración
por triplicado, lo que permitirá determinar la linealidad, estimar la pendiente (b) y una medida
del error de la respuesta (se), como lo es la desviación estándar de la regresión (s y/x) o la
desviación estándar de la ordenada al origen (sa).

31
 Límite de cuantificación del método: El límite de cuantificación es una característica de
desempeño analítico, que determina la capacidad cuantitativa del método a concentraciones
bajas del analito en la muestra y se debe determinar en los métodos cuantitativos.
El límite de cuantificación (LC) es la cantidad mínima de analito en una muestra que
puede ser determinada con exactitud y precisión aceptable, bajo las condiciones de
aplicación del método. Las unidades del límite se expresan como se indica en el método
analítico.
Determinación para métodos instrumentales: El límite de cuantificación se puede
determinar empleando el procedimiento de la señal-ruido o el de la linealidad. En el primero,
se evalúa obteniendo las respuestas analíticas de muestras de concentraciones conocidas
del analito y por el establecimiento de la respuesta analítica a una concentración cero del
analito a la que comúnmente se llama señal-ruido.

3.4.9. Límite de cuantificación del método

El límite de cuantificación es una característica de desempeño analítico, que

determina la capacidad cuantitativa del método a concentraciones bajas del analito en la
muestra y se debe determinar en los métodos cuantitativos.

El límite de cuantificación (LC) es la cantidad mínima de analito en una muestra que

puede ser determinada con exactitud y precisión aceptable, bajo las condiciones de
aplicación del método. Las unidades del límite se expresan como se indica en el método
analítico.
Determinación para métodos instrumentales: El límite de cuantificación se puede
determinar empleando el procedimiento de la señal-ruido o el de la linealidad. En el primero,
se evalúa obteniendo las respuestas analíticas de muestras de concentraciones conocidas
del analito y por el establecimiento de la respuesta analítica a una concentración cero del
analito a la que comúnmente se llama señal-ruido.

32
 3.4.10. Robustez del método

La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la

influencia de factores internos del método que pudiesen afectar la exactitud del método,
mientras que la tolerancia, se refiere a factores externos al método, que puedan impactar en
la reproducibilidad de éste. Robustez es la capacidad del método analítico de mantener su
desempeño al presentarse variaciones pequeñas pero deliberadas, en las características
normales de operación del método.

Se deben establecer aquellos factores instrumentales (temperatura de la columna,

presión en la columna, velocidad de flujo, etc.) y/o factores no instrumentales (PH de fases,
volúmenes de solventes orgánicos para una extracción, etc.), que se consideren críticos.

3.4.11. Tolerancia del método

Los resultados de los métodos analíticos pueden variar por una serie de factores
relacionados con diferentes condiciones externas o no inherentes al método, por lo que es
necesario investigar su reproducibilidad. La tolerancia es el grado de reproducibilidad de los
resultados de prueba obtenidos por el análisis de la misma muestra, bajo una variedad de
condiciones tales como: diferentes laboratorios, analistas, instrumentos, lotes de reactivos,
días. Etc. Se deben establecer aquellos factores ajenos al método como: diferentes
equipos, lotes de reactivos, columnas, etc. Que se puedan presentar al reproducir el método
en otras condiciones.

Análisis de datos: Calcular la media aritmética (ŷ), desviación estándar (s) y

coeficiente de variación (CV) de todos los resultados de todas las condiciones investigadas.
Se debe de cumplir con el criterio establecido en función con el coeficiente de variación.

33
 Tabla 2.3 Parámetros de desempeño de los procedimientos analíticos validables
Fuente ( Morales 2010)

3.5. Método de validación

3.5.1. Requisitos previos a la validación

_ Calificación del personal en el uso de los métodos a validar.

_Calibración de los instrumentos de medición y las medidas de capacidad de vidrio
utilizado.
_Utilización de reactivos apropiados y soluciones de trabajo valoradas.
_Observación de las medidas de seguridad.
_Selección de los parámetros apropiados de acuerdo con la clasificación del
método analítico y el tipo de validación a realizar. Tomado de (Morera Yelina
1998).

34
 3.6. Métodos analíticos

3.6.1. Métodos clásicos

En los primeros años de la química, la mayor parte de los análisis se realizaban

separando los componentes de interés de una muestra, los analitos, mediante un
procedimiento de precipitación, extracción o destilación y posteriormente se trataban con un
reactivo para dar lugar a unos productos que pudiéramos distinguir, en el caso de los análisis
cualitativos (Rubinson et al 2001).

En los análisis cuantitativos, la cantidad de analìto se determinaba mediante medidas

gravimétricas, es decir midiendo su masa; o volumétricas, determinando el volumen o el peso
de un reactivo patrón que reacciona completamente con el analìto.

A pesar de que estos métodos se están quedando obsoletos, es cierto que todavía se
usan en algunos laboratorios, pues algunos métodos clásicos son más sensibles.

Además aunque el fenómeno de algunos métodos instrumentales se conoce desde

hace más un siglo, su aplicación no se ha podido llevar a cabo por falta de instrumentos
sencillos y fiables.

3.6.2. Pasos en un análisis

Un análisis químico consta, de cuatro pasos principales:

1._Muestreo, esto es, seleccionar una muestra representativa del material que va a ser
analizado.
2._Conversiòn de la analita a una forma adecuada para la medición
3._Mediciòn.
4._Càlculo e interpretación de las mediciones

35
 Si la muestra es un sólido, puede ser necesario secarla antes de realizar el análisis. Los
sólidos también necesitan ser disueltos en un solvente adecuado antes de la medición. Debe
hacerse una medición precisa del peso de la muestra (del volumen si se trata de un gas), ya
que los resultados analíticos se reportan por lo general, en términos relativos; por ejemplo, el
número de gramos de analita (Underwood et al 1989).

3.6.3. Muestreo

El método de muestreo de una sustancia y su preparación para su análisis está,

inevitablemente, unido al método o a los métodos de análisis. El método de muestreo es una
parte integral y significativa del análisis químico (Rubinson 2001).

Muestra: porción pequeña seleccionada para su examen, de una cantidad de material

que es mucho mayor.
A la hora de recoger la muestra es de especial atención que esta sea representativa
de una mucha mayor. Su composición debe reflejar lo mejor posible una porción
representativa de todo el material.
Dentro de la muestra se hayan distribuidos constituyentes, es decir, las sustancias que
trataremos de determinar. Según el porcentaje de estos en la muestra, hablamos de:
La cantidad disponible de un constituyente para un procedimiento analítico elegido,
depende tanto del nivel del constituyente como del tamaño de la muestra. Así, según el
tamaño de la muestra sea macroscópica, semimacroscópica, microscópica, submicroscópica
o ultramacroscopica, las cantidades del constituyente se hacen cada vez menores � se
utilizan técnicas analíticas cada vez más sofisticadas.

Muestreo: proceso por el cual se obtiene una fracción representativa siendo a menudo
esta etapa la más difícil de todo el procedimiento analítico, y la que limita la exactitud de todo
el procedimiento.

- Lote: material completo del que se toman las muestras. Ej.: todo el agua de un lago.
A menudo, los lotes están formados por unidades muéstrales. Ej.: Cajas individuales
de un camión.

36
 - Muestra Bruta: se obtiene del lote para análisis o almacenamiento. Suele
seleccionarse de modo que sea representativa del lote y su elección es crítica para realizar
un análisis válido. De la muestra bruta se toma una muestra de laboratorio.

- Muestra de laboratorio: más reducida. Debe tener exactamente la misma

composición de la muestra bruta. Para realizar los análisis individuales se emplea alícuotas o
porciones de prueba de la muestra de laboratorio.

La identificación de la población de la que debe obtenerse la muestra es inmediata,

mientras que la obtención de la muestra bruta, muestra de laboratorio, no son sencillas, y
pueden requerir más esfuerzo e ingenio que cualquier otra etapa del esquema general de
todo el análisis.
Cuando las muestras son homogéneas (igual composición en todas sus partes), la
variación en los resultados debe reflejar solamente, la habilidad del analista y la variabilidad
inherente del método.
En la realidad las muestras suelen ser heterogéneas (distinta composición en sus
partes), con lo que el problema se complica en gran medida. Cuando se analiza un material
heterogéneo, el resultado final depende de la forma en que se elijan las muestras del
material, y de cómo se trate la muestra una vez colectada.

3.6.3.1. Muestreo de Sólidos

El carbón es un material particularmente difícil de muestrear, y lo utilizaremos para

ilustrar los métodos empleados en materiales sólidos. El primer paso en el procedimiento de
muestreo es seleccionar una gran porción de carbón, llamada muestra gruesa, la cual,
aunque no es homogénea, representa la composición promedio de toda la masa. El tamaño
de la muestra necesaria depende de factores como son el tamaño y la homogeneidad de las
partículas. En el caso del carbón, la muestra debe ser como de 1000 libras, cuando las
partículas no son mayores de 1 pulgada en cualquier dimensión (Underwood et al 1989)

Después que se ha seleccionado la muestra, ésta se muele o tritura, se mezcla

sistemáticamente y se reduce de tamaño. Un método utilizado para reducir la muestra de

37
carbón consiste en apilarla dentro de un cono por medio de una pala, aplanar el cono y
dividirlo en cuatro partes iguales, dos de las cuales son desechadas. Existe un aparato
mecánico para subdividir la muestra y se conoce como separador.

3.6.3.2. Muestreo de líquidos

Si el líquido que va a ser analizado es homogéneo, el procedimiento de muestreo es

fácil. El proceso es mucho más difícil si el líquido es heterogéneo. En el caso de un líquido
que circula, digamos, en un sistema de tubería, muchas veces las muestras se toman en
diferentes puntos del sistema.

Los aparatos conocidos como muestreadores de gancho pueden utilizarse para

recolectar muestras de grandes cantidades de agua a diversas profundidades.

3.6.3.3 Muestreo de gases

Hoy en día se tiene mucho interés en el muestreo de la atmósfera, debido a los

intentos de mejorar la calidad del aire que respiramos. Por supuesto, el aire es una mezcla
compleja que contiene partículas de material, así como numerosos compuestos gaseosos.
Su composición depende de un número de factores, como el lugar, la temperatura, el viento y
la lluvia.

En la recolección de una muestra atmosférica para análisis, son factores importantes

el volumen tomado y la velocidad y duración del muestreo. El aire se pasa a través de una
serie de filtros finos para aislar las partículas de material y a través de una columna llena de
solución en donde ocurre una reacción química que atrapa al componente deseado.

3.6.4. Estrategias de muestreo

Muestreo de caso homogéneo: situación más fácil. Una vez obtenido, este se divide
en unidades, y aleatoriamente se analizan distintas unidades. Se obtienen resultados más

38
precisos si se mezclan la “n” unidades, y se realizan n análisis de los grupos mezclados, que
analizando las n unidades separadamente.

Muestreo de caso no homogéneo: tomamos varias muestras de cada uno de los

estratos, y de cada una de ellas tomamos otro par, se mezclan y así se obtiene la muestra
representativa para el análisis(Scribd 2012)

3.7. Pruebas estadísticas y análisis de errores

3.7.1. Introducción e importancia de la estadística

En nuestro uso cotidiano, usamos frases para concluir, indicando el grado de

certidumbre, y para ello se emplean frases como “bastante seguro”, “muy seguro” e “lo más
probable”. En el análisis químico se requieren declaraciones de certidumbre de tipo más
cuantitativo y para reemplazar estas frases ambiguas se emplean pruebas estadísticas. Para
ello debemos estar seguros que el valor obtenido experimentalmente es cercano al valor
verdadero y cuanta certidumbre se tiene que el valor obtenido es el mismo del valor obtenido
con la misma muestra en un momento distinto o por otra persona (Rubinson 1998).

Para desarrollar análisis químicos confiables es necesario identificar en dónde se

producen errores, con el objeto de evaluar su magnitud.

Al realizar cualquier procedimiento o cualquier análisis, existe la posibilidad de

cometer errores en cualquier paso. Estos posibles errores se llaman fuentes de error. En
cualquier procedimiento es recomendable emplear varias replicas de la muestra, todas ellas
obtenidas de la misma muestra original. La certidumbre aumenta cuando se efectúa el
análisis de tres muestras similares, y se incrementa aún más si se emplean cuatro. A
medida que se llevan a cabo más experimentos, aumenta la certeza de que el siguiente
resultado va a estar dentro del mismo intervalo que los anteriores. La descripción estadística
de la certidumbre, se comporta de la misma manera que el incremento de confianza en el
resultado promedio.

39
 3.7.2. Medición de errores

La medida estadística de la calidad de un ensayo sólo puede obtenerse si se llevan a

cabo una serie de pruebas. Si solo se analiza una muestra, el valor obtenido debe
considerarse como resultado. Si se llevan a cabo varias corridas es improbable que se
obtengan dos resultados exactamente iguales. El resultado numérico representativo de una
serie de pruebas es la media aritmética de los resultados individuales, la cual se encuentra
dividiendo la suma de los resultados entre el número de determinaciones en serie y se
expresa matemáticamente como sigue:

X = ∑Xi
i
N
Donde

X representa la media aritmética

Xi representa el resultado numérico de la i-èsima corrida, y
N es el número total de corridas

La media aritmética se conoce como simplemente media o promedio.

La desviación con respecto a la media di se define para cada medida individual. Es la

diferencia entre cada valor medido Xi y el valor medio de todas las mediciones X.
algebraicamente,

di= Xi- X

(Es frecuente emplear letras mayúsculas para referirse a los errores o diferencias).

El intervalo de las mediciones es la diferencia de magnitud entre el resultado de

prueba más alto y el más bajo de una serie.

40
 Intervalo= w= Xmàs alto- Xmàs bajo

La medida más empleada de la reproducibilidad de un conjunto de mediciones (y la

de mayor significado estadístico) se llama desviación estándar. La desviación estándar es la
raíz cuadrada de la varianza. La varianza se define mediante la siguiente ecuación.

Varianza= d12+ d22+…+d2N

N-1

desviación estándar = S= d12+ d22+…+d2N

N-1
Otra medida estadística del error es la desviación estándar relativa, que es la
desviación estándar expresada como fracción o porcentaje del valor medio. Algebraicamente
se expresa así

desviación relativa estándar= S

X

Desviación estándar relativa porcentual = S

X

Ocasionalmente la desviación estándar relativa porcentual se llama también

coeficiente de variación.

3.7.3. Precisión y exactitud

Cuando la dispersión de los valores determinados experimentalmente es pequeña, se

dice que la precisión es alta. Una medida cuantitativa de la dispersión es la desviación
estándar de un conjunto de mediciones. La desviación estándar es baja cuando la precisión
del experimento es alta.

41
 La diferencia entre el valor verdadero del analìto y el valor medio de una serie de
resultados analíticos se llama error medio y se abrevia Em. El error medio tiene las mismas
unidades que la medición. Cuando se expresa el error medio como porcentaje del resultado
verdadero, se llama error relativo. La palabra relativo sugiere que es una cantidad
adimensional.

Desde el punto de vista estadìstico no existe una cantidad tal como la denominada
error medio, ya que no se conoce el “resultado verdadero”. Es posible aproximarse al “valor
verdadero” mediante experimentos de validación diseñados de manera inteligente.

El error medio se encuentra dentro de la categoría de los denominados errores

determinados. El error determinado significa que se origina a partir de una causa fija. Cada
vez que se realice una réplica, el error determinado siempre será alto o bajo. El error
determinado también se llama error sistemático. Los errores para los cuales se usa la
desviación estándar se consideran errores aleatorios (Rubinson et al 1998).

Un método será más preciso, en tanto menor coeficiente de variación se obtenga, es

decir, cuanto más se acerquen entre sí los resultados obtenidos de varios análisis realizados
a una misma muestra.

3.7.3.1 Ejemplo de cálculo de precisión

En un estudio del contenido de grasa en chocolate en polvo se ensayaron 2 métodos

analíticos realizando 8 repeticiones para cada técnica y se obtuvieron los siguientes
resultados (Zumbado 2002).

Resultados obtenidos para las 8

repeticiones(Expresado en g grasa/100g
de muestra)
Mètodo A 3.2 3.5 3.2 3.4 3.3. 3.4 3.3 3.3
Mètodo B 3.1 3.2 3.4 3.5 3.6 3.4 3.3 3.4

42
 Si se desea calcular la precisión de ambos métodos el procedimiento a seguir
sería.

Método A

X = 3.2+ 3.5+3.2+…+ 3.3

8
X= 3.32

S= (3.32-3.32)2+ (3.32-3.5)2+…+ (3.32-3.3)2

8-1
S= 0.1035

CV= 0.1035 x 100

3.32
CV= 3.1%

Método B

X= 3.4

S= 0.2

CV= 5.9%

El método A es màs preciso que el método B, dado que posee un menos coeficiente
de variación (3.1% < 5.9%).

43
 Los valores de coeficiente de variación reportados para que un método analítico sea
considerado preciso, se mueven en rangos más o menos amplios en la literatura científica
que aborda esta temática.

Los criterios de la validación seguidos por el colegio Nacional de químicos

Farmacéuticos, Biológicos de México.

Tabla 2.4 Criterios de validación por el colegio nacional de químicos

(Fuente Zumbado 2002)
Tipo de método CV permisible
Cromatogràficos ≤2%
Químicos y espectrofotométricos ≤ 3%
Microbiológicos ≤5 %

3.8. Principios activos del desparasitante (APIS: Active

pharmaceutical ingredients)

3.8.1.1 Ivermectina

En la farmacopea británica (2009) encontramos la siguiente estructura molecular

Figura 2.3 Estructura química de Ivermectina

44
 Contenido:
_Ivermectina (H2B1a+H2B1b): 95.0 por ciento a 102.0 por ciento (sustancia anhidra);
_Proporción H2B1a/ (H2B1a+H2B1b) (áreas por cromatografía liquida): mínimo 90.0 por
ciento.
Características:
Apariencia: blanco a blanco amarillento, polvo cristalino, ligeramente higroscópico
Solubilidad: prácticamente insoluble en agua, muy soluble en cloruro de metileno, soluble
en alcohol.

Ivermectina es una lactona macro cíclica derivado semi-sintético de una avermectina y

producida por el Streptomyces avermitilis Es altamente lipofílica por lo cual tiene una elevada
distribución tisular y una prolongada residencia en plasma (Camero, 2004).

3.8.1.2 Características generales de ivermectina

La ivermectina es un producto de Streptomyces avermitilis o sus derivados químicos,

tienen un espectro antiparasitario potente y amplio a dosis bajas. Son activos contra muchos
nematodos inmaduros y maduros y contra artrópodos. En las últimas décadas el uso de
ivermectina (IVM) se ha convertido en una de las alternativas de tratamiento de mayor
eficacia y uso frecuente por parte de los ganaderos, debido a que se trata de un
antihelmíntico de amplio espectro activo frente a formas adultas e inmaduras de nematodos
que afectan a los animales de producción (Merck 1993).

3.8.1.3 Mecanismo de acción

La Ivermectina (IVM), es una lactona macrocíclica que deriva de productos de

fermentación de la dihidroavermectina B1a, antihelmíntico que presenta una alta eficacia
sobre endo y ectoparásitos de las diferentes especies animales (Lagiola, 2005). Su
mecanismo de acción involucra tanto la potenciación de los efectos del ácido γ-amino butírico
(GABA), un neurotransmisor inhibitorio de las respuestas motoras de los parásitos, como la
interacción con canales glutamato-cloruro independientes del ácido γ-amino butírico (GABA),

45
incrementando la permeabilidad de la membrana celular de las neuronas del parásito a los
iones cloruro. De esta manera la Ivermectina causa bloqueo neuromuscular, resultando en
parálisis flácida y la eventual muerte del parásito. También menciona además que las
propiedades físico-químicas de la Ivermectina (IVM) incluyen un alto peso molecular y una
elevada lipofilicidad, las que le confieren características farmacocinéticas de un alto volumen
de distribución, con una gran afinidad por la grasa corporal y prolongada persistencia de sus
concentraciones en el organismo. La Ivermectina (IVM) se excreta principalmente por las
heces. Sin embargo, en hembras en lactancia una fracción significativa del fármaco se
excreta por la leche, en donde tiene una prolongada vida media.

3.8.2Triclabendazol

Figura 2.4 Estructura química de triclabendazole

46
 3.8.3. Prazicuantel

Figura 2.5 Estructura química de prazicuantel

Fuente ( Wolfram Alpha 2012)

C19H24N2O2 Mr 312,4

Contenido: 97.5 por ciento a 102.0 por ciento (sustancia seca)

Características:
Apariencia: polvo cristalino, blanco a casi blanco
Solubilidad: ligeramente soluble en agua, muy soluble en alcohol y cloruro de meti

47
CAPÍTULO 4

Metodología a implementar

48
4.1. Diagrama general de la metodología a implementar

Preparación de las muestras

Análisis cualitativo de los 3 APIS

(Ivermectina, Triclabendazole y
Prazicuantel).

Curva de calibración de cada API

en base a la aplicación GRAMS sacando
el área bajo la curva.

Análisis cuantitativo al producto

final (desparasitante inyectable)
identificando los 3 APIS.

Cálculos estadísticos de promedio

y desviación estándar para validación.

49
 4.2. Preparación de las muestras

4.2.1 Preparación de muestras de principio activo para análisis cualitativo

Procedimiento

a) Cada materia prima de principio activo se trituro en el mortero con pistilo hasta tener
cada uno de los principios activos de un tamaño homogéneo.
b) Se pesaron 0.800g de cada lote de principio activo (Ivermectina, Triclabendazole y
Prazicuantel) en la balanza portátil.
c) Se coloco esta cantidad de principio activo en los viales de vidrio.
d) Por cada principio activo se usaron 7 viales para tener 7 replicas de 0.800g por cada
principio activo.
e) Se corrieron estas muestras con sus respectivas replicas en el equipo espectroscópico
Raman para el análisis cualitativo.

4.2.2. Preparación de muestras de desparasitante para análisis cuantitativo

El desparasitante inyectable con los 3 APIS, es un producto inyectable el cual ya se ha

realizado en trabajos previos su adecuada formulación, por eso partiremos de un patrón de
formula ya definida que combina efectiva y adecuadamente la mezcla de Ivermectina,
Triclabendazole y Prazicuantel.

Procedimiento

a) En base a la formulación previamente establecida, se procedió a elaborar 2 lotes de

desparasitante cuya formula cuali-cuantitativa se describe más adelante en resultados.

b) Los 2 lotes de numero PL-0552 y PL-0553 de 200ml cada uno se elaboraron en

diferentes fechas.

50
 c) De los 2 lotes preparados, se tomaron 3 muestras de cada uno y se midió con
jeringas 1.5ml de producto (desparasitante).

d) Se agregaron los 1.5 ml de producto en viales de vidrio. En general tendremos 3

viales por cada lote.

e) Las muestras se analizaron en el equipo espectroscópico Raman.

Cabe mencionar que estos 2 lotes de desparasitante nos servirán al final de los
resultados. El propósito de estos es comparar los resultados arrojados por la curva de
calibración (cantidades que se consideran desconocidas) con estos 2 lotes que tienen
cantidades conocidas para ver la precisión.

4.2.3. Preparación de muestras de desparasitante para curva de calibración

Para obtener el análisis cuantitativo se preparo una curva de calibración del producto
final. Para realizar la curva de calibración se prepararon diferentes lotes de desparasitante
inyectable variando en cada lote las concentraciones de cada principio activo (Ivermectina,
Triclabendazole y Prazicuantel), esto con el objetivo de corroborar la cantidad obtenida de
cada principio activo en el equipo Raman.

a) Para definir que concentraciones variar y en qué cantidad de principio activo,

se realizo el cálculo necesario ajustando una determinada cantidad de principio activo y de
esta forma variando el porcentaje de concentración.
b) Para el principio activo Ivermectina se manejaron los porcentajes de
concentración de: 0.18, 1.07, 0.53, 0.89, 1.42 y 1.96 %.
c) Para Prazicuantel se prepararon porcentajes de: 2.31, 5.16, 6.04, 8.89, 10.22 y
12.09%.

51
 d) Para Triclabendazole se prepararon los porcentajes de: 8.00, 16.89, 21.33,
23.11, 24.00 y 24.44%.
e) Las cantidades exactas de cada materia prima usadas en cada concentración
se detallan en resultados.
f) Se extrajo con jeringas 1.5 ml de cada concentración y se coloco en viales.
g) Por cada porcentaje de concentración de cada principio activo, se realizaron 5
replicas de cada uno.
h) Se analizaron en el equipo Raman para obtener los espectros.

52
 4.3. Análisis cualitativo de los 3 APIS (Ivermectina,
Triclabendazole y Prazicuantel

Basándonos en las referencias bibliográficas de que en el equipo Raman se puede

realizar el análisis cualitativo, se a realizo el análisis cualitativo de los 3 principios activos:
Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel que se utilizarían en el desparasitante inyectable
para de esta manera conocer los grupos funcionales que componen a cada principio activo,
corroborando de esta manera la utilidad y aplicación que tiene el equipo Raman para realizar
la determinación cualitativa.

Un espectro basado en la técnica Raman, es necesario identificar los picos que se

representan en dicho espectro. En los espectros como sabemos podemos encontrar ruidos y
bandas representativas de cada molécula por esto, se realizo el siguiente procedimiento para
realizar la determinación cualitativa.
.

4.3.1 Proceso de determinación de análisis cualitativo (grupos funcionales).

a. Para encontrar los grupos funcionales de los 3 APIS, se usaron los espectros
obtenidos en las muestras de principio activo para análisis cualitativo.
b. Para esto se uso un espectro por cada API, pero como teníamos 7 replicas de
cada principio activo, se uso la réplica 1 de cada API.
c. Lo que nos interesa ver en cada espectro es la longitud de las ondas y esto se
expresa en las unidades de Raman shift que nos arroja cada espectro. Por esto se
precedió a leer en cada espectro y ver los picos más altos que son los
representativos.
d. Se anoto la longitud de los picos representativos y estas longitudes se introdujeron
en una lista correspondiente de sitios web que contienen determinadas longitudes
en un rango limitado específico.
e. De esta forma se obtuvo una lista de longitudes de los espectros de cada principio
activo y así se identifico el grupo funcional para cada uno.

53
 4.4. Preparación de curva de calibración con diferentes
concentraciones de desparasitante inyectable.

a. Se usaron los espectros que se obtuvieron de las muestras de desparasitante para

curva de calibración. Se partió de estos espectros que previamente preparamos a
diferentes concentraciones de producto final porque necesitamos tener variaciones de
los 3 principios activos para obtener una curva de calibración por cada principio activo.
b. Tenemos espectros de las diferentes concentraciones de desparasitante para poder
realizar esta curva de calibración y por cada concentración tenemos 5 replicas.
c. A cada espectro con su respectiva replica se determino, usando el programa de
GRAMS que es una herramienta del equipo Raman, el área bajo la curva, para con
estos datos obtener una curva de calibración.
d. De esta manera, tendremos 3 curvas de calibración, una por cada principio activo.

4.5. Análisis cuantitativo del producto final para determinar el

contenido de Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel.

Usando la curva de calibración de cada principio activo se determinara en base a la

grafica de la ecuación atraves de la técnica de mínimos cuadrados el contenido de cada
principio activo para cuantificar de esta forma el contenido de cada uno.

De esta forma tendremos el contenido de cada principio activo en la curva de

calibración y este será nuestro resultado de muestras con cantidades conocidas de cada
API.
Posteriormente se determinara el área bajo la curva de los espectros obtenidos de los lotes
PL-0552 y PL-0553 y se compararan con este los resultados anteriores para obtener los
resultados para validación.

54
 4.6. Cálculos estadísticos para validación

Los resultados obtenidos se introducirán en el programa de Excel para realizar los

cálculos necesarios como obtener el promedio y la desviación estándar.

También se usara el programa estadístico origin 5.0 para auxiliarnos en la obtención

de cálculos estadísticos y las graficas de la curva de calibración.

55
CAPÍTULO 5

Resultados

56
 5.1 Análisis cualitativo de los 3 APIS (Ivermectina, Triclabendazole y
Prazicuantel.

5.1.1. Análisis cualitativo Ivermectina (grupos funcionales)

Espectro de Ivermectina corrido en los parámetros:

Tiempo de integración: 30
Average: 3
Boxcar: 1

Se estableció que las condiciones serian las mismas para todas las corridas en el equipo,
determinándose lo siguiente:

Temperatura: 20°C expuesto a sistema de aire acondicionado

Humedad: No se posee un psicrómetro para medir la humedad relativa

Hora: 15:00hrs. A partir de esta hora se empezaría todo el proceso

Iluminación: sin luz para disminuir cualquier efecto en las corridas de los espectros.
Intensidad: 100%

57
 La Figura 2.6 es el espectro obtenido en el equipo Raman del principio activo
Ivermectina. En las herramientas que maneja el software del equipo Raman encontramos
una aplicación, que nos muestra las longitudes de onda de los picos que se muestran en el
espectro. Aquí se observa con esta herramienta, el valor en (cm-1) de algunos picos pero
los demás se obtuvieron con esta misma aplicación.

La
aplicación nos
mostro los
picos
representativos,
del espectro.

Figura 2.6 Espectro de Ivermectina

Fuente (Espectroscopia Raman)

La aplicación del equipo Raman que nos arroja la longitud de onda, como se observan
en la imagen anterior nos sirvió para realizar la determinación de los grupos funcionales, ya
que dependiendo de las longitudes de onda se conocerán a qué grupo funcional corresponde
cada uno.

A continuación en la siguiente tabla se observaran los espectros de las 7 replicas que

se obtuvieron de las muestras corridas para el análisis cualitativo de Ivermectina.
58
Espectro Nº de Replica
1

59
En base a las longitudes de onda (cm-1) del espectro de Ivermectina obtenidos
anteriormente, localizamos en la página: http://www.science-and-fun.de/tools/ el rango en el
que se encuentra nuestro grupo funcional. La lista de longitudes de onda, grupos funcionales
e intensidad de las señales de observa en la siguiente tabla.

Longitud (cm-1) Rango (cm-1) Grupo funcional Señal

280 260-390 Mediano

433 435-570 Mediano

572 565-585 Mediano

729 720-770 Mediano

831 815-835 Mediano

870 870-890 Mediano

911 915-940 Débil

60
1065 1010-1070 Mediano

1200 1180-1260 Débil

1275 1270-1285 Dèbil

1305 1285-1350 Fuerte

1382 1370-1390 Dèbil

1438 1430-1470 Mediano

1603 1610-1630 Dèbil

1679 1620-1680 Fuerte

61
 Al observar los espectros mediante la funciòn “modo de capas” (mode stacked), vemos
los 7 espectros de las replicas de Ivermectina y se nota que coinciden uno sobre otro en la
misma longitud de onda.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

Aquí observamos los mismos espectros en la función “modo sobrepuesto” (overlaid

mode) y también se nota que coinciden todos los espectros.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1) 62

 Las funciones “modo de capas” y “modo sobrepuesto” son parte de la aplicación que trae
el equipo Raman, llamado GRAMS el cual nos resulto muy útil por las diversas funciones que
nos ayudaron a determinar los grupos funcionales de la Ivermectina.

Espectros de Ivermectina en modo sobrepuesto, con zoom

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

También esta función nos permitió aumentar el zoom del espectro en “modo
sobrepuesto” para observar mejor como coinciden los espectros.

63
 5.1.2. Análisis cualitativo de Prazicuantel (grupos funcionales)
Parámetros
Tiempo de integración: 90
Average: 1
Boxcar: 1

Figura 2.6 Espectro Prazicuantel

Fuente (Equipo Raman)

La figura 2.6 es el espectro obtenido de las muestras corridas para el análisis

cualitativo o determinación de grupos funcionales de Prazicuantel, la aplicación del equipo
nos muestra los valores de las longitudes de onda que nos servirán para el análisis
cualitativo en unidades (cm-1)

64
 Con los mismos parámetros descritos anteriormente se realizaron todas las
replicas de Prazicuantel y en las mismas condiciones antes establecidas:

Temperatura: 20°C expuesto a sistema de aire acondicionado.

Humedad: No se posee un psicrómetro para medir la humedad relativa.
Hora: 15:00hrs.Apartir de esta hora se empezaría todo el proceso.
Iluminación: sin luz para disminuir cualquier efecto en las corridas de los espectros.
Intensidad: 100%

En la siguiente tabla se observan los espectros obtenidos para las 7 replicas de Prazicuantel
corridas en el equipo Raman.

Estos espectros nos sirvieron para encontrar los grupos funcionales del Prazicuantel, las
replicas que se obtuvieron nos sirvieron también para ver que las longitudes no variaran
entre un espectro y otro. Por eso más adelante se observan las funciones que nos muestran
que los espectros tienen en todas las replicas, las misma longitudes de onda.

65
Espectro Nº de Replica
1

66
 En la función “modo de capas” (mode stacked). Es importante esta función ya que
nos sirve para ver que los 7 espectros obtenidos son iguales y no se produjo ningún error
durante la preparación de las muestras, ya que si hubiera interferencias no obtendríamos los
mismos espectros.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

Función “modo sobrepuesto” de las 7 replicas de Prazicuantel, este nos sirve para
ver los 7 espectros unos sobre otros y así ver que son las mismas longitudes de onda ya que
coinciden todos los espectros.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1) 67

 Espectros de Ivermectina en modo sobrepuesto, con zoom

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

Se siguió la misma metodología para encontrar los grupos funcionales de Prazicuantel,

basado en las longitudes de onda (cm-1) de los espectros de Prazicuantel, localizamos en la
página: http://www.science-and-fun.de/tools/ el rango en el que se encuentra cada grupo
funcional.

En la siguiente tabla se enlistan las longitudes de onda, grupos funcionales e intensidad de

las señales a los que corresponde los espectros de Prazicuantel.

68
Longitud en Rango en Grupo Señal
cm-1 cm-1 funcional
527 435-570 Media

499-555 Media

792 770-820 Alta

1446 1440-1450 Alta

69
 5.1.3. Análisis cualitativo de Triclabendazole

Tiempo de integración: 40
Average: 1
Boxcar: 1

Figura 2.7 Espectro Triclabendazole

Fuente (Equipo Raman)

En el espectro obtenido se observo las longitudes de onda para determinar los grupos
funcionales de Triclabendazole, se siguió el mismo procedimiento que con los otros 2
principios activos. Con una de las herramientas del equipo Raman, se obtuvo la aplicación
que nos permite identificar los valores de las longitudes de onda del espectro.

70
 En la figura 2,7 solo se observa un valor de longitud de onda, los otros valores que se
enlistan más adelante se obtuvieron con esta misma aplicación pero no todos se pudieron
hacer visibles en un solo espectro.

En la siguiente tabla se ven los espectros de las 7 replicas de Triclabendazole que se

corrieron en el equipo para el análisis cualitativo o determinación de grupos funcionales.

71
Espectro Nº de Replica
1

72
Función “modo de capas” de los espectros de las 7 replicas de Triclabendazole, como ya se
explico anteriormente, con esta función vemos que los 7 espectros son iguales y no tienen
variación unos con otros.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

Función “modo sobrepuesto” de los espectros de las 7 replicas de Triclabendazole y se
nota que coinciden en la misma longitud de onda todos los espectros.

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1) 73

 Espectros de Triclabendazole en modo sobrepuesto, con zoom

I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

Raman shift (cm-1)

En la siguiente tabla se enlistan las longitudes de onda (cm-1) de Triclabendazole que

se determinaron con la aplicación del equipo Raman, estas se localizaron en la página:
http://www.science-and-fun.de/tools/ y en el rango que esta nos marcaba, identificamos los
grupos funcionales y la intensidad de las señales.

74
Longitud (cm-1) Rango (cm-1) Grupo funcional Señal
303 260-390 Mediano

392 355-445 Mediano

465 415-470 Mediano

593 505-760 Dèbil

693 685-710 Mediano
718 700-800 Dèbil

1223 1220-1270 Debil

1050 820-1140 Variable

1032 960-1030 Mediano

1380 1370-1390 Dèbil
1415 1415-1440 Mediano
1453 1445-1475 Mediano
1502 1470-1520 Mediano

75
 1577 1560-1660 Mediano

5.2. Curva de calibración de producto final (desparasitante inyectable)

En este proceso se corrieron las muestras para la curva de calibración.

1. Los lotes preparados de desparasitante son PL-0552 y PL-0553.

2. Los 2 lotes fueron preparados a las siguientes concentraciones y técnica de

manufactura.

Desparasitante 3D
200ml

Materia prima (g)

Alcohol bencílico____________________ 8.000

Butilato de Hidroxianisol (BHA) _________ 3.000
Ivermectina_______________________ 2.000
Metiliden_________________________ 20.000
Pharmasolve (solophor) (M-Pyrol) ______ 108.000
Prazicuantel_______________________ 20.000
Propilenglicol______________________ 16.000
Triclabendazole____________________ 48.000

76
 Técnica de manufactura

I. .______ Disolver 2.000g de ivermectina en 8.000g de alcohol bencílico en un

vaso de precipitado de 250ml (Mezcla 1).

II. .______ En otro vaso de precipitado de 250ml, mezclar 20.000g de Metiliden,

108.000 g de Pharmasolve y 16.000 g de Propilenglicol (Mezcla 2). Mezclar
muy bien y posteriormente añadir 3.000 g de Butilato de Hidroxianisol (BHA).

III. _____ Incorporar ambas mezclas (Mezcla 1 y 2). Mezclar y agitar bien.

IV. _____ Agregar 20.000g de Prazicuantel a la mezcla y agregar 48.000g de

Triclabendazole, agitar bien.

V. .____ Medir la solución y aforar con Propilenglicol (solo si es necesario) para

ajustar a 200ml.

3. Se determino que para realizar la curva de calibración se necesitaba variar el

producto final (desparasitante) a diferentes concentraciones, variando en cada
producto el API (Ivermectina, Triclabendazole y Prazicuantel) para realizar la
curva de calibración.

5.2.1. Muestras de desparasitante con diferentes concentraciones de

Ivermectina.
Ivermectina
0.18%
Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)
Alcohol bencílico 2.400g 4.27
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.100g 0.18
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.000

77
 Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

Ivermectina
1.07%
Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)
Alcohol bencílico 1.900 3.38
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.600g 1.07
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.000
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

Ivermectina
0.53 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 2.200g 3.91
BHA 0.750g 1.34
Ivermectina 0.300g 0.53
Metiliden 5.000g 8.94
Pharmasolve 27.000g 48.26
Prazicuantel 5.000g 8.94
Propilenglicol 4.000g 7.15
Triclabendazole 12.000g 21.45
Cantidad total 56.250g 100.00

78
 Ivermectina
0.89 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 2.000g 3.56
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

Ivermectina
1.42 %
Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)
Alcohol bencílico 1.700g 3.02
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.800g 1.42
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

79
 Ivermectina
1.96 %

Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 1.400g 2.49

BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 1.100g 1.96
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

5.2.2. Muestras de desparasitante con diferentes concentraciones de

Prazicuantel.
Prazicuantel
2.31 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 5.700g 10.13
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 1.300g 2.31
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

80
 Prazicuantel
6.04 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 3.600g 6.400
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 3.400g 6.04
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

Prazicuantel
5.16 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 4.100g 7.29
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 2.900g 5.16
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

81
 Prazicuantel
8.89 %

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 2.000g 3.560
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

Prazicuantel
10.22%

Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 1.250g 2.22
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.750g 10.22
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

82
 Prazicuantel
12.09%

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 0.200g 0.36
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 6.800g 12.09
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

5.2.3 Muestras de desparasitante con diferentes concentraciones de triclabendazole

Triclabendazole
8.00%
Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)
Alcohol bencílico 9.500g 16.89
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 4.500g 8.00
Cantidad total 56.250g 100.00

83
 Triclabendazole
16.89%

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 4.500g 8.00
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 9.500g 16.89
Cantidad total 56.250g 100.00

Triclabendazole
21.33%

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 2.000g 3.56
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 12.000g 21.33
Cantidad total 56.250g 100.00

84
 Triclabendazole
23.11%

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 1.000g 1.78
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 13.000g 23.11
Cantidad total 56.250g 100.00

Triclabendazole
24.44%

Materia prima Cantidad(g) Concentración (%)

Alcohol bencílico 0.250g 0.44
BHA 0.750g 1.33
Ivermectina 0.500g 0.89
Metiliden 5.000g 8.89
Pharmasolve 27.000g 48.00
Prazicuantel 5.000g 8.89
Propilenglicol 4.000g 7.11
Triclabendazole 13.750g 24.44
Cantidad total 56.250g 100.00

85
 5.3. Área bajo la curva

A las muestras corridas se les determino el área bajo la curva, esto se realizo en la
aplicación GRAMS en la función de integración, que nos muestra directamente al ubicarle la
longitud de onda, el área bajo la curva que a su vez nos sirvió para la determinación
cuantitativa.

5.3.1 Área bajo la curva de Ivermectina

Concentraciones 0.18 0.53 0.89 1.07 1.42 1.96

(%)
Replica 1 46349.7000 46241.6800 49969.8100 45875.3700 50748.7300 54140.1600
Replica 2 41892.0900 46569.5200 48451.1500 47087.6800 53556.5500 57115.6000
Replica 3 41337.5100 46613.0100 41115.0100 48448.7900 46808.5000 52019.7600
Replica 4 41504.0200 52864.0300 49840.4000 51956.0500 37989.3800 52188.7800
Replica 5 41733.6500 46014.3600 40611.4900 57524.2800 41365.9500 48376.1800

Como se observa en las diferentes áreas bajo la curva de las diferentes

concentraciones, se nota que conforme aumenta la concentración, el área bajo la curva para
cada concentración aumenta. Esto nos denota la sensibilidad que tiene el equipo
espectroscópico Raman para detectar el aumento en las concentraciones.

También corroboramos que en la preparación de las diferentes concentraciones, se

realizaron los cálculos correctamente ya que algún error en las cantidades de principio activo,
no nos hubiera notado el aumento en el área bajo la curva.

86
5.3.2. Área bajo la curva de Prazicuantel

Concentraciones 12.09 10.22 8.89 6.04 5.16 2.31

(%)
Replica 1 19333.12 14087.94 12649.39 11133.84 12784.91 9178.73
Replica 2 16838.90 16663.39 14701.45 11474.72 7769.09 9837.68
Replica 3 16490.01 18155.04 15168.18 11322.56 11399.82 9099.23
Replica 4 17996.06 15336.40 13584.78 9710.05 9980.72 6425.01
Replica 5 15996.04 13595.05 13155.47 11442.98 9154.49 5519.79

En esta tabla se ilustro de modo inverso para observar como al disminuir la

concentración de Prazicuantel, disminuye notablemente el área bajo la curva.

5.3.3. Área bajo la curva de Triclabendazole

Concentración 8 16.89 21.33 23.11 24 24.44

(%)
Replica 1 74283.99 119106.3 145426 178389.1 193349.5 246031.2
Replica 2 80099.6 129945.3 147982 219626.1 210515.5 243347.2
Replica 3 81642.57 129361.9 149360.9 219787.1 261907.8 291839.9
Replica 4 85112.45 123379.7 146859.8 216933.7 248801.3 229315.3
Replica 5 72135.74 120085.6 169475.8 221931.1 275372.3 213944.5

Aquí también se observa que aumenta en cada concentración los valores del área bajo
la curva. Cabe mencionar que al hacer estas observaciones, aseguramos que nuestra
determinación cuantitativa de los principios activos serán acertados.

87
 5.4 Análisis cuantitativo de Ivermectina

Usando los lotes de desparasitante (producto terminado) a diferentes concentraciones de

porcentaje de Ivermectina y usando la aplicación de GRAMS para calcular el área bajo la
curva. Tenemos la siguiente grafica:

Esta grafica en el proceso de validación nos representa, por lo que establece la FEUM y los
datos para validación, como la grafica de linealidad del sistema que nos ilustra el
comportamiento del analito o principio activo a diferentes concentraciones.

A partir de la ecuación del grafico que nos resulta de

Ecuación de la curva: Y= A + B * X

En donde:
A = 43,129.4515
B = 4377.7072
r2 = 0.7781- Linealidad del sistema
X = 0.91 %

88
 Àrea bajo la desv. Estandar
promedio curva x di di2 Sumatoria di2 varianza (s)
46349.7000 42563.3940 3786.3060 14336113.13 18100302.1449 4525075.5362 2127.2225
41892.0900 -671.3040 450649.06
41337.5100 -1225.8840 1502791.58
41504.0200 -1059.3740 1122273.27
42563.3940 41733.6500 -829.7440 688475.11

46241.6800 47660.5200 -1418.8400 2013106.95 34087024.2114 8521756.0529 2919.2047

46569.5200 -1091.0000 1190281.00
46613.0100 -1047.5100 1097277.20
47660.5200 52864.0300 5203.5100 27076516.32
46014.3600 -1646.1600 2709842.75

49969.8100 45997.5720 3972.2380 15778674.73 89415337.7629 22353834.4407 4727.9842

48451.1500 2453.5780 6020045.00
45997.5720 41115.0100 -4882.5620 23839411.68
49840.4000 3842.8280 14767327.04
40611.4900 -5386.0820 29009879.31

45875.3700 50178.4340 -4303.0640 18516359.79 88182160.5425 22,045,540.14 4695.2678

50178.4340 47087.6800 -3090.7540 9552760.29
48448.7900 -1729.6440 2991668.37
51956.0500 1777.6160 3159918.64
57524.2800 7345.8460 53961453.46

46093.8220 50748.7300 46093.8220 4654.9080 21668168.49 165905996.1139 41476499.0285 6440.2251

53556.5500 7462.7280 55692309.20
46808.5000 714.6780 510764.64
37989.3800 -8104.4420 65681980.13
41365.9500 -4727.8720 22352773.65
52768.0960
54140.1600 52768.0960 1372.0640 1882559.62 40967890.5979 10241972.6495 3200.3082
57115.6000 4347.5040 18900791.03
52019.7600 -748.3360 560006.77
52188.7800 -579.3160 335607.03
48376.1800 -4391.9160 19288926.15

En la tabla anterior se describen los valores estadísticos del promedio y la desviación

estándar que se obtuvieron de los valores del área bajo la curva de Ivermectina.

89
5.5 Análisis cuantitativo de Triclabendazole

Ecuación de la curva: Y= A + B * X
En donde:
R2 = 0.8825---- Este valor es la linealidad del sistema
A = -17288.9645
B = 9788.6018
Y = Valor obtenido de el análisis de una muestra de estudio.
X = Resultado obtenido de el despeje de la ecuación.

Donde:

A= 17288.9645
B= 9788.6018
Y= 219842.5
X= ?

Con la ecuación despejada nos da;

X=Y–A/B

Por lo tanto:

X = 20.70 %

90
 desviacion con respecto a la
Media media
Sumatoria desv. Estandar desv. Relat.
x di di2 di2 varianza (s) Stand

8.00% 74283.9900 78654.8700 -4370.8800 19104591.97 114317583.5 28579395.86 5345.970058 0.067967439

8.00% 80099.6000 1444.7300 2087244.773
8.00% 81642.5700 2987.7000 8926351.29
8.00% 85112.4500 6457.5800 41700339.46
8.00% 72135.7400 -6519.1300 42499055.96

16.89% 119106.3000 124375.7600 -5269.4600 27767208.69 103046185 25761546.24 5075.58334 0.040808461

16.89% 129945.3000 5569.5400 31019775.81
16.89% 129361.9000 4986.1400 24861592.1
16.89% 123379.7000 -996.0600 992135.5236
16.89% 120085.6000 -4290.1600 18405472.83

21.33% 145426.0000 151820.9000 -6394.9000 40894746.01 397991506.4 99497876.61 9974.862235 0.065701509

21.33% 147982.0000 -3838.9000 14737153.21
21.33% 149360.9000 -2460.0000 6051600
21.33% 146859.8000 -4961.1000 24612513.21
21.33% 169475.8000 17654.9000 311695494

23.11% 178389.1000 211333.4200 -32944.3200 1085328220 1369235425 342308856.2 18501.59064 0.087546923

23.11% 219626.1000 8292.6800 68768541.58
23.11% 219787.1000 8453.6800 71464705.54
23.11% 216933.7000 5600.2800 31363136.08
23.11% 221931.1000 10597.6800 112310821.4

24.00% 193349.5000 237989.2800 -44639.7800 1992709958 4834004106 1208501026 34763.50135 0.146071711

24.00% 210515.5000 -27473.7800 754808587.5
24.00% 261907.8000 23918.5200 572095599
24.00% 248801.3000 10812.0200 116899776.5
24.00% 275372.3000 37383.0200 1397490184

24.44% 246031.2000 244895.6200 1135.5800 1289541.936 3408170772 852042692.9 29189.77035 0.119192701

24.44% 243347.2000 -1548.4200 2397604.496
24.44% 291839.9000 46944.2800 2203765425
24.44% 229315.3000 -15580.3200 242746371.3
24.44% 213944.5000 -30951.1200 957971829.3

91
 6. CONCLUSIONES

El presente trabajo cumplió con los objetivos establecidos ya que se aplico el uso del
equipo espectroscópico Raman y se establecieron diversos pasos para su correcto uso, así
como también se aplicaron distintas funciones que eran parte de las herramientas del equipo
Raman, como son: La función modo sobrepuesto y modo de capas.

También realizamos un análisis cualitativo de los APIS (Ivermectina, Triclabendazole y

Prazicuantel) de un producto desparasitante inyectable de línea veterinaria, usando los
espectros de cada uno de ellos en el equipo Raman. Esto se aplico en base a la teoría
establecida de que el equipo Raman puede realizar análisis cualitativos y cuantitativos.

Se realizo el análisis cuantitativo de los 3 APIS del desparasitante empleando para ello 6
diferentes concentraciones de cada principio activo y 5 respectivas replicas para ver la
reproducibilidad de los resultados en base al promedio y a la desviación estándar. Para el
análisis cuantitativo se realizo una curva de calibración basándonos en el área bajo la curva
de las diferentes concentraciones a las que se vario el desparasitante inyectable.

Los resultados obtenidos de los valores de la curva de calibración, nos muestran

conforme aumenta la concentración el aumento en el área bajo la curva. Esto nos demuestra
que el equipo espectroscópico Raman es sensible y detectable para diversos anàlisisi
cuantitativos que pudieran hacerse en un futuro a otros productos en la empresa
farmacéutica Casal`s internacional.

Es importante destacar la importancia actual y aceptación que está teniendo en las

empresas farmacéuticas tanto de línea humana como veterinaria el uso de un equipo
espectroscópico Raman ya que tiene múltiples ventajas comparado con otras técnicas
analíticas como son el poco tiempo que lleva correr las muestras, que se necesita una

92
cantidad pequeña y esta puede estar en estado sólido o líquido y no lleva un alto costo por
realizar esta técnica y solo necesita el uso de viales de vidrio pequeños.

En resumen podemos notar que el equipo espectroscópico Raman por su aceptación

ante la FDA como un método analítico alternativo al HPLC con resultados reproducibles.

93
 7. BIBLIOGRAFÍA

British Pharmacopoeia (2009) publication by the secretary of state for health (6th ed.)
London, Great Britain.

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM 2008) Publicación por la

secretaría de salud (7th ed.) Mèxico, D.F.

Douglas A. Skoog (2008) Principios de análisis instrumental (5ta. Edición), México

D.F. Mc Graw Hill.

Underwood A.L. & Day R.A, Jr. (1989) Quìmica analìtica cuantitativa (5ª Edición).
México D.F. Prentice-Hall hispanoamericana.

Morera Fernández Yelina (1998) .Validación de técnicas analíticas utilizadas en el

control de calidad. Revista cubana de farmacia, 106-107

Rubinson, Kenneth A. & Rubinson F. Judith (2001) Análisis instrumental (3ra.

Ediciòn).Madrid, España Pearson

CAMERO, J. (2004) Trabajo para optar al grado de Ingeniero de Producción Animal.

Universidad Nacional Experimental del Táchira. San Cristóbal, Venezuela. Recuperado 20 de
junio, 2012 de
http//www. monografias.com. pp 48-64 (10-07-2008)

Metodología analítica espectroscopia de absorción molecular uv-vis fluorescencia

análisis cuantitativo, recuperado el 04 de julio de 2012 de
http://es.scribd.com/doc/18030546/quimica-analitica

94
 Morales De la Cruz Cesar(2010) Desarrollo y validación prospectiva de una técnica
analítica por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) para el enalapril 10mg
tabletas recubiertas. Tesis digitales UNMS. Recuperado 18 de junio 2012 de
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/morales_cc/gener.pdf

_Science and fun pages (2012) IR- wizard results. Recuperado 04 de julio de 2012 de
http://www.science-and-fun.de/tools/

Wolfram Alpha LLC (2012) Triclabendazole. Recuperado 21 de junio, 2012 de

http://www.wolframalpha.com/input/?i=C14H9Cl3N2OS&lk=1&a=ClashPrefs_*Chemical-

95
 8. ANEXOS

Materiales y reactivos utilizados

_Ivermectina lote 201202036 de proveedor CPQ

_Triclabendazole lote PB003705 proveedor Prode

_Prazicuantel lote 20100526 proveedor Básicos Feed Grade

_ Balanza portátil YS202 200x0, 01 gr Ohaus

_ Viales de vidrio

_Mortero con pistilo de porcelana PLMSA numero 105

_Raman (Enwave optronics Ezraman system), laser output

__Vasos de precipitado de 100ml

_Vasos de precipitado de 250ml

_Vasos de precipitado de 50ml

_Barra magnética agitadora SPI

_Agitador magnético Corning pc-420D

_Viales de vidrio

_Raman (Enwave optronics Ezraman system), laser output

_ Balanza portátil YS202 200x0, 01 gr Ohaus

_ Ivermectina lote 201202036 de proveedor CPQ

__Triclabendazole lote PB003705 proveedor Prode

_Prazicuantel lote 20100526 proveedor Básicos Feed Grade

_Propilenglicol

_Metiliden

_Pharmasolve
96
_Alcohol bencílico

_Butilato de hidroxianisol (BHA)

_Jeringas

97