eet aera aery ERE rect real sel Wie eatu) UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA PROTOCOLO DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA 201504 - MICROBIOLOGIA San Juan de Pasto Junio de 2022 Powered by (9 CamScannerler (me meal) ERE rect real sel eure ween 1, ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO La primera versién de las guias que se proponen para el componente practico de! curso de Microbiologia, fueron disefiadas en el afia 2004 por la Doctora Carmen Eugenia Pifia Lopez, docente de la UNAD. El contenido didactico de este componente practico ha sido apoyado por las profesoras Angélica Yare y Rocio Gomez. Ha tenide actualizaciones 2 partir de su creacién desarrolladas por Marta Cecilia Vinasco Guzmdn y Yurby Salazar, quienes han apoyado el proceso de revision de estilo e hizo aportes disciplinares, didacticos y pedagdgicos. La Ultima version de este componente practico (2023) ha sido creada y actualizada por Mery Liliana Lopez Martinez, Docente Asistente de la UNAD, quien actualmente se desempefia como directora nacional del curso de Microbiologia. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure 2. CARACTERISTICAS GENERALES La microbiologia estudia los microorganisms u organismos generaimente microscépicos, aunque Introduccién | algunos pueden ser observados a simple vista. Su estudio comprende la identificacion y clasificacion de los microorganismos, su origen y evolucién, la dindmica del crecimiento, el rol interactivo de los microorganismos con el sistema inmunoldgico, las enfermedades que pueden producir y su importancia en la produccién industrial. EI curso de Microbiologia hace parte del Campo de Formacién Disciplinar Comun, constituyéndose en dustificaci6n | herramienta fundamental de los procesos de desarrollo cientifico y que posibilitan la insercién de nuestro pais en las dindmicas globales del desarrollo. Por lo tanto, su objetivo primordial es comprender y reconocer la importancia de los microorganismos en la vida del planeta, conocer su morfologia, fisiologia, bioquimica, distribucién y sus efectos beneficiosos y/o perjudiciales para el hombre. Meta: Desarrollar la totalidad de las practicas que se Intencionalid | presentan en esta guia. ades formativas Resultado de Aprendizaje: Implementar métodos Y protocoles de cultivo, aisiamiento e identificacién de microorganismos con fines académicos investigativos. Practica 1: Normas generales de bioseguridad Practica 2: Preparacién de medios de cultivo. Practica 3: Siembra de microorganismos. Practica 4: Evaluacién de sensibilidad a desinfectantes y antisépticos, Denominacién de practicas | practica 5: Descripcién macroscépica de colonias de microorganismos Practica 6: Técnicas de Tincion. Practica 7: Hongos Horas 12 horas laboratorios Puntaje 120 puntos Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure 3, DESCRIPCION DE PRACTICAS PRACTICA 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD. Propés Conocer los principales equipas con los cuales se trabaje en un laboratorio de microbiologia y conocer y aplicar las normas de bioseguridad que se deben tener en un laboratorio. Objeti Establecer normas y principios basicos de comportamiento en el laboratorio. Fundamentacién Teérica La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas encaminadas a reducir el riesgo de transmisién de enfermedades infecciosas, las plagas de cuarentena, las especies exéticas invasoras, organismos vivos modificados, Cuando se trabaja en laboratorio con microorganismos se deben poner en practica varias normas de bioseguridad para evitar accidentes y adquirir enfermedades. Descripcién de la practica A continuacién, encuentra las normas de bioseguridad basicas de cualquier laboratorio y los cuidados que se deben tener al lavar material de! vidrio. Por favor realice una buena lectura, pero principalmente ponga en practica todas las recomendacienes, y Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas, jugar, correr a gritar. ¥ No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que no porten sus implementos de bioseguridad adecuados. “No se permitiré el ingreso de personas bajo efectos de bebidas alcohdlicas 0 sustancias psicoactivas. ¥ Para el ingreso a los laboratorios, préstamo de material o equipo se debe presentar el carné vigente. Todas las superficies de trabajos se limpiaran y desinfectaran diariamente y siempre que se produzca un derrame. Powered by (9 CamScannerler (me meal) ERE rect real sel eure ~ Usar bata de manga larga con pufios, |a cual debe estar completamente cerrada. ¥ Usar guantes de nitrile, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y todos los elementos de seguridad solicitados dependiendo del riesgo. ¥ Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas. ¥ Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas, manillas, reloj 0 elementos que puedan entorpecer la manipulacién de los materiales 0 equipos, y En ninguna circunstancia se permitird comer, beber o fumar en el laboratorio. ¥ En ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las sustancias quimicas 0 biolégicas utilizadas en e| desarrollo de las practicas. ¥ No trabajar nunca solo en el laboratorio. y No pipetear sustancias con la boca, ¥ Cuando en el desarrollo de las practicas se utilice écido y agua en diluciones, agregue el Acido sobre el agua. v No devoiver reactivos a los frascos, asi no hayan sido utilizados. ¥ Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por e| docente responsable del laboratorio. ~ Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde nadie corra peligra de quemarse. ¥ Los residuos y muestras de procedimientos de microbiologia que van a ser incinerados fuera del laboratorio deber ser sometidos a desactivacin en autoclave. ¥ Como norma general no se podra verter ninguna sustancia peligrosa para el medio ambiente por el desagile. ¥ Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesén, devolver los elementos y materiales perfectamente limpios, aseaurese de dejar cerrado el gas, agua y lavarse las manos. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure y Para la eliminacién de los residuos se deben utilizar los recipientes destinados para este fin siguiendo las indicaciones del docente responsable del laboratorio. ¥ Cualquier accidente por pequefio que sea debe comunicarse al docente responsable del laboratorio. ¥ Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar que queden sobre ellos. Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Revisar el reglamenta de normas de bioseguridad de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia disponible en: htt ‘academia. [Link]/laboratorios-normas-de-biosequridad Observar el siguiente video: [Link] 59s Realice el informe segtin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. PRACTICA No. 2. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Propésito: Conocer jos principales medias de cultivo, la forma de preparacién y presentacion. Objetiv. Aprender la preparacién y manipulacion de los medios de cultivo, Fundamentacién Teérica E| medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composicion precisa dependerd de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varian considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratario normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero 0 sangre para crecer. Descripcién de la practica Revise las etiquetas de los recipientes de diferentes medios de cultivo, anote el nombre, la composicién y forma de preparacién. En las instrucciones de forma de preparacién le dicen la cantidad en gramos de medio deshidratado que se necesitan para disolver en un litro de agua. En muchas ocasiones no es necesario preparar un litro de medio, Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure por lo tanto, mediante un calculo matematico sencillo ustedes pueden preparar una cantidad menor. Supongamos que desean preparar 325 mililitros de medio de cultivo, al leer las instrucciones de preparacidn en la etiqueta dice que para preparar 1 litro (1000 ml) de medio se necesitan 20 gramos medio deshidratado. Para hacer el cdlculo se realiza una regia de tres simple: 20 gr. [1000 mi [X= (20 qr. x 325ml) /1000= 6.5 gr. X gr. 325ml Esto quiere decir que se necesitan 6,5 gramos de medio deshidratado para preparar 325 ml de medio de cultivo. Para preparar el medio se hace el siguiente procedimiento: Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. E! erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erienmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador. A continuacién, lleve la preparacién a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio haste que ebulla para lagrar la disalucion total del Agar. Tape la boca del erlenmeyer papel aluminio. Si las normas de preparacién no indican otra cosa, la esterilizacién se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centigrados, durante 15 minutos. Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C. Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas, Las burbujas de aire en le superficie de la placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie can la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique Los medios de cultivo liquidas se preparan de la misma forma y se sirven en tubos con tapa rosca. Posteriormente lieve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. Finalmente tenga en cuenta que, para preparar Agar inclinado en tubo, Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado. Tome un medio de cultivo al azar y realice los calculos para preparar voliimenes de 356 mi, 1567 mi, 131 ml y 24 ml Experimentalmente prepare 20 mi de medio de cultivo sélido y sirvalo en 2 cajas de Petri. Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Recipientes con diferentes medios de cultivo, Erlenmeyer, Prabeta, Agua destilada, Cajas de petri, balanza, papel aluminio, estufa, autoclave, cémara de flujo. Realice el informe segtin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. PRACTICA No. 3. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS.. Propésito: Conocer y aplicar las diferentes técnicas de siembra que existen, Objetivi Determinar ias condiciones necesarias para realizar la siembra de microorganismos Reconocer los distintos sistemas de siembra y su utilidad. Fundamentacién Teérica Sembrar es colacar una muestra de inécule, en un medio de cultive para obtener el crecimiento de los microoraanismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un medio compuesto por las sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A veces se afiaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podrian contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultive, como tubos de vidrio con gel, frascos con liquidos nutritivos para los microorganismos. Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerdn "colonias" de bacterias en el medio de cultivo, Estas colonias tienen caracteristicas de color, forma, tamafio etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarias. También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquimicas o de otro tipo para lograr su identificacién. Algunas bacterias Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure son muy dificiles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar. Descripcién de la practica 1. Siembra de medio liquido a medio liquido Marque correctamente los tubos con el nimero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de é!, Esterilice un asa de argolla en la llama de un mechero y déjela enfriar. Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tépelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destdpelo, flameando la boca @| tubo con el mechere e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacién con el asa para emulsionar con el caldo las paredes de! tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37°C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente 2. Siembra de media liquido a sélido Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de él. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar. Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en el tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tépelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de agar nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Powered by (9 CamScannerler (me meal) ERE rect real sel eure Introduzea el ineculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37°C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. 3. Siembra de medio sélido a sélido Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de él. Esterilice un asa de argolla en la llama de un mechero y déjela enfriar. Los medios sdlidos contienen agar en proporcién de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios métodos: como estrias, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultive puro, a, Siembra por agotamiento Tome el asa 0 el escobillén y realice estrias en toda la caja de petri en forma cansecutiva y sin recargar el asa. Se desliza suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. b. Siembra por estrias Tome una placa de agar, divida la base de la caja de Petri en cuartos y mérquelos con los nimeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el ndmero 1, realice estrias hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estrias y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estrias ya hechas. Incube las cajas a 37°C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. 4. Siembra en agar inclinado Esta se realiza por agotamiento, Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca dei tubo antes y después de /a siembra. Powered by (9 CamScannerler (me meal) ERE rect real sel eure Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formacién de una pelicula o por el crecimiento de colonias en la superficie. 5. Siembra en profundidad Marque la caja de Petri estéril con el nimero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. ‘Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plastica, transfiera 1 mi de este cultivo a la base de la caja de Petri estéril. Descarte ia pipeta en el frasco de boca ancha con hipoclorito de sodio. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesén, en el sentido de las agujas de! reloj luego, al contrario, en forma de L y L invertida, y por Ultimo en forma de 8. Esto garantiza una distribuciGn homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Incube las cajas a 37°C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido, Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Para un grupo: 1 tubo de ensayo con caldo nutritive y S. aureus en crecimiento 1 tubo de ensayo con caldo nutritivo 1 tubo de ensayo con agar nutritivo recto 1 tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado 1 caja de Petri con agar nutritivo y S. aureus en crecimiento 2 cajas de Petri con agar nutritivo 1 caja de Petri estéril sin agar 10 ml de Agar nutritivo caliente Mecheros Incubadora Asas de punta recta y argolla Pipetas Pasteur Realice el informe segin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure PRACTICA 4. EVALUACION DE SENSIBILIDAD A DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS. Propésito: Se va a demostrar en la siguiente serie de experimentos que los métodos que se utilizan para eliminar los microorganismos no son iguaimente efectivos. De igual forma se va a comparar la efectividad de varios desinfectantes que se utilizan comunmente. Objeti Explicar la diferencia entre los resultados obtenidos al utilizar diferentes métodos de esterilizacian de bacterias. Explicar cémo se hace un ensayo comparativo de la eficiencia de varios desinfectantes. Fundamentacion Te6rica Se define esterilidad a la condicién de ausencia de cualquier microorganismo. Significa destruccién de toda forma de vida microbiana incluyendo esporas. Los métodos de esterilizacién mas usados en el laboratorio son calor seco, calor humedo, flameado, utilizacion de saluciones quimicas. La desinfeccién se refiere a la reduccién de los organismos patégenos (organismos que ocasionan enfermedades). Los desinfectantes de acuerdo con su composicién quimica se clasifican en: Fenoles, Hipocloritos (clora), Yodoformos (yodo Povidana), Amonio Cuaternario, Formaldehidos, Peréxidos. Los desinfectantes pueden ser de bajo nivel, de nivel intermedio o de aito nivel. Los desinfectantes de bajo nivel (Fenoles, amonio cuaternario) pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto grampositivas como gramnegativas, algunos virus (virus con envoltura lipidica) y hongos (levaduras), pero no Mycobacterium sp, ni las esporas bacterianas. Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, la mayoria de los virus (virus con y sin envoltura) y hongos filamentosos, pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas. En cambio, los desinfectantes de alto nivel (formaldehidos, peréxidos, hipocloritos) cansiguen destruir todos los microorganismos, excepto algunas esporas bacterianas. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias bere ema retel er itel eae Seneca Descripeién de la practica Tome un desinfectante y coloque 1 mi. en un tubo de ensayo Marque 4 cajas de petri con agar nutritivo asi: 15, 30, 45 y 60 segundos Afiada 3 mi. de cultivo de Staphylococcus aureus o E. coli al tubo que contiene el desinfectante. Apenas afiada el cultive inicie a contar el tiempo. De acuerdo con los tiempos marcados en la caja de agar nutritive vaya tomando una muestra del tubo (desinfectante + cultivo) y siémbrela en la caja de agar nutritivo correspondiente. Utilice escobillones y siembre por agotamiento. Incube la caja a 37 0 C por 24 horas Repita el proceso anterior por cada uno de los desinfectantes que va a evaluar. Anote los resultados obtenidos en la tabla 1 TABLA 1. Desinfectante TIEMPO EN SEGUNDOS 15 30 45 60 Alcohol Yadepovidona Hipoclorito de sodio Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Cultivos de Staphylococcus aureus o Escherichia coli en caldo nutritive Pipetas Escobillones 3 tubos de ensayo estériles 12 cajas de petri con Agar nutritive Solucién de hipoclorito de sodio 2ppm Alcohol antiséptico Isodine (Yadopovidona) Realice el informe segiin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure PRACTICA 5, DESCRIPCION MACROSCOPICA DE COLONIAS DE MICROORGANISMOS. Propésito: Cultivar microorganismos de diferentes ambientes y realizar una descripcién macroscépica de las colinas que crezcan. Objetivos: Explicar cémo se puede demostrar la presencia de microorganismos en diferentes sitios. Describir las caracteristicas macroscépicas de las colonias bacterianas. Fundamentacién Teérica En esta prdctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en el ambiente que nos rodea. Con este fin se toman muestras de diferentes sitios y se las siembra en un medio de cultivo que contiene las sustancias nutritivas que los microorganismos necesitan para desarrollarse, se las lleva a incubar a la temperatura apropiada y se las deja el tiempo necesario para que crezcan y se puedan observar las colonias a simple vista y asi determinar las caracteristicas macroscépicas de esas colonias, Descripcién de la practica Marcar cada caja de Petri que se va a utilizar con los siguientes datos Nombre, Sitio del cual se tomé la muestra, Fecha de la practica. Tome cajas de Petri que contengan agar nutritive y tome muestras de los diferentes sitios que se relacionan a continuacion: ¥ Pase un copito sobre la superficie del mesén en el cual esta trabajando y siembre en una caja de Petri, ¥ Pase sus dedos por el cabello y rasque suavemente para que el producto que salga caiga sobre la caja de Petri. ¥ Toque con sus dedos la superficie de una caja de Petri. ¥ Tosa 0 estornude sobre una caja de Petri. ¥ Introduzca un copito en su oido y siembre en una caja de Petri. v Siembre una muestra tomandola del sitio que desee. Todas las cajas se llevan a incubar durante 24-48 horas a 37 grados. Powered by (9 CamScannerler (me meal) bere ema retel er itel eae | “Tome 2 cajas de Petri que contengan Agar PDA o Agar Sabouraud, destdpelas y déjelas al aire libre durante 30 minutos en el sitio que desee y luego tapelas. Déjelas a temperatura ambiente y en las oscuridad durante 48- 72 horas. Resultados Observe las colonias y basdndose en Ia figura 1, llene los datos de la tabla Idescribiendo las caracteristicas de las colonias y la cantidad de crecimiento (mucho, abundante, regular, poco). Describa 2 colonias de cada caja teniendo en cuenta las siguientes caracteristicas: Tamaiio Forma: circular, irregular, extendida Elevacién: Plana, convexa, Umblicada. irregular, aserrado, discreto, regular, entero ondulado. : pigmentada, incolora. Textura: Granular, friable, himeda, seca, membranosa. Superficie: suave, aspera, rugosa, opaca, resbalosa. lor: inodora, aromatica desagradable. TABLA 1. CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS ‘SITIO DE TOMA DE CARACTERISTICAS DE LAS LAS MUESTRAS COLONIAS Superficie del meson Cabello Dedos Estornudo Oido Libre Agar PDA 1 ‘Agar PDA 2 Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure FIGURA 1. FORMA, ELEVACION Y BORDE DE LAS COLONIAS MICROBIANAS Fuente: Valencia (2004) Manual de practicas de microbiologia basica. Coleccién Notas de Clase. Editorial UNIBIBLIOS. Universidad Nacional de Colombia Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Para un grupo: 6 cajas de Petri con agar nutritive 2 cajas de Petri con agar PDA o agar Sabouraud Incubadora Hisopos Realice el informe segtin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. PRACTICA 6. TECNICAS DE TINCION. Propési Realizar diferentes tipos de tinciones para identificar microorganismos. Objetivo: Preparar frotis de bacterias para abservaciones microscpicas Observar las bacterias teflidas al microscopio y clasificarlas por su forma y Su reaccién a la coloracién de Gram. Fundamentacién Teéri La observacién microseépica de las bact: coloreadas. Se acostumbra a fijar las bacte! para poder tefiirlas con facilidad. ‘jas se facilita cuando han sido s en la ldmina portaobjetos La fijacién puede hacerse con solventes 0 con calor. En cualquier caso, se trata de deshidratar la célula y coagularla con proteinas. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante © compuestas cuando se utilizan 2 6 mas colorantes. También se puede hacer una coloracién negativa en la cual se tifie el fondo, ademas de la bacteria, para poder observar la cépsula. Descripcién de la pr: 1. Coloracién Simple Para la coloracién simple se utiliza azul de metileno y se trabaja con Staphylococcus aureus. Se toma una pequefia muestra del microorganisma y se fija con calor, posteriarmente se afiade una gota pequefia de azul de metileno, se coloca la laminilla 0 cubre objetos y se observa al microscopio en un aumento de 100x. 2. Tincién de Gram La tincién de Gram se realiza en cultivos de Staphylococcus aureus, y Escherichia coli. La tincién de Gram, Es una coloracién compuesta porque en ella se utilizan 2 colorantes, uno primario: cristal violeta o violeta de genciana y uno de contraste, safranina o fucsina de Gram, Es una tincion diferencial porque segiin la composicién quimica de la pared celular las bacterias quedan tefiidas con el cristal violeta o la safranina, como mordiente o sustancia fijadora del color se utiliza lugol. El agente diferenciador, es decir, el que acttia de modo diferente sobre la pared celular de las Gram. Positivas y las Gram negativas es la solucién alcohol cetona 0 alcohol- dcido. Los pasos de la tincién de gran son los siguientes: y Fijar la muestra al calor ¥ Affadir el violeta de genciana o cristal violeta y dejarlo actuar durante iminuto v Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante ¥ Afiadir lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto ¥ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante ¥ Afjadir alcohol- dcido y dejario actuar durante 15 segundos y lavar répidamente con agua ¥ Afjadir fucsina y dejar actuar durante 1 minutos Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure ¥ Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante ¥ Secar al aire libre 0 con una toalla absorbente segiin las indicaciones de! profesor ¥ Observar en el microscopio a un aumento de 100x. Observe todas las bacterias con las diferentes coloraciones, determine su morfologia y trate de identificar sus partes, determine si son bacterias Gram. Positivas 0 bacterias gran negativas. Dibuje lo observado. Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Para un grupo: Cajas de Petri con Agar nutritivo y cultivos de £. colfy S. aureus. Porta Objetos Cubre Objetos 1 microscopic 2 mi de violeta de genciana o cristal violeta 2 mi de lugol 2 ml de alcohol- dcido 2 mi de fucsina 2 mi de azul de metileno 2 mi de azul de Lactofenot Mechero Pinzas Aceite de Inmersion Asas Realice el informe segiin las orientaciones que le suministre su profesor de laboratorio. PRACTICA 7. HONGOS. Propés Realizar observaciones de estructuras flngicas. Objetivos: Identificar las estructuras reproductoras y vegetativas de algunos hongos. Distinguir entre hongos filamentosos y levaduras Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel Tana Fundamentacién Teérica Los hongos no poseen clorofila, adquieren su energia de los compuestos erganicos que estan en el suelo y en el agua. E| alimento lo pueden obtener de los materiales muertos o se nutren coma pardsitos de huéspedes vivos, por eso se consideran heteratrofos. Son descomponedores de la madera, las hojas y otros restos vegetales, formando el humus que enriquece el suelo y sintetizando el didxido de carbone que vuelve a la atmésfera, para ser aprovechado por las plantas. Los hongos, se utilizan industrialmente en la fermentacién para producir dcidos, alcoholes, antibidticos y otros compuestos importantes en industrias alimenticias y farmacéuticas. Los hongos pueden deteriorar productos textiles, cuerdas, aislamientos eléctricos e infinidad de articulos comerciales e industriales. For lo tanto, las hongos pueden se beneficiosos 0 patégenos. Descripeién de la pra a Previo a la practica observe el siguiente recurso: Universidad de Antioquia. Escuela de Microbiologia. Micologia Veterinaria. [Link] En el laboratorio: 1. Observacién de hongos pluricelulares: Previamente en casa, cada estudiante prepara las muestras con crecimiento de hongos. Rhizopus sp: Tome una tajada de pan fresco, rocie con agua y coléquela dentro de una bolsa de plastico que se pueda cerrar. Guarde la bolsa en un lugar caliente, himedo y alejado de la luz. Este procedimiento se debe hacer una semana antes del laboratorio. No abra la bolsa, hagalo Gnicamente si observa que el pan pierde la humedad. No manipule, ni inhale, ni consuma el contenido de la bolsa Penicillium sp: En casa conserve en una bolsa cerrada una naranja o limén en el cual se evidencia el crecimiento del hongo. La naranja con hongos toma un color verde y/o blanquecino. En el laboratorio, observe la morfologia de Rhizopus sp. y Penicillium sp. Examine el hongo a simple vista, describa el color, consistencia, textura y apariencia general Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure Para la observacion microscopica, tome con un asa una muestra de hifas y coléquela en portaobjetos, tefiir con azul de lactofenol y observe al microscopio. Dibuje lo observado y describa. 2. Observaci6n de levaduras Compre un sobre de levadura seca, la que se utiliza en panificacién y pasteleria. Para realizar una solucién acuosa de levedura, ponga agua con azticar en beaker, caliente a una temperatura maxima de 50 grados, agrégale un poco de levadura seca y agitelo hasta que quede totalmente disuelta y con un aspecto lechoso hamogéneo, deje en reposo 30 minutos. Con una pipeta pasteur tome una gota de la solucién preparada y méntela en un portaobjetos y observe en fresco al microscopio. Tome otra gota, fije la muestra, afiada azul de lactofenol y observe al microscopio, Recursos a utilizar en la practica (Equipos / instrumentos) Para un grupo: Porta Objetos Cubre Objetos Beaker 1 microscopio Mechero Pinzas Aceite de Inmersion Asas Opcional: Rhizopus sp. Cultivo en agar sabouraud Opcional: Penicillium sp. Cultivo en agar sabouraud Realice el informe segtin las orientaciones que le suministre su tutor de laboratorio. Powered by (9 CamScannerEscuela de Ciencias ERE rect real sel eure 4, BIBLIOGRAFIA vy APHA, AWWA. WPCF. 1989. Standar Methods for the examination of water and wasterwater. ¥ GARCES, Emira. 2003. Morfologia y Clasificacién de los hongos. Notas de clase Universidad Nacional de Colombia. Editorial UNIBIBLIOS. ¥ GRANT Y LONG. 1999. Microbiologia Ambiental. Editorial Acriba. Espafia. ¥ MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M. Y PARKER, J. 2003. Brock: Biologia de los Microorganismos, Prentice Hall. ¥ MONTOYA, Olga Inés. 2004. Manual de Microbiologia. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellin. ¥ SALDARRIAGA, Yamile y PINEDA, Fabio, 2001. Manual de Micologia Aplicada. Editorial Universidad de Antioquia. y SANCHES, Marina, MARMOLEJO, Fernando y BRAVO, Nelson. 2000. Microbiologia Aspectos Fundamentales. Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. Feriva S.A. Y VALENCIA. Hernando. 2004. Manual de Practicas de microbiologia bdsica. Notas de clase Universidad Nacional de Colombia. Editorial UNIBIBLIOS, Powered by (9 CamScanner