BIOLOGIA
Ingeniería en alimentos- Lic. en Análisis Qcos. y Bromatológicos
MICROSCOPIA
El microscopio es una de las herramientas básicas en el estudio de la biología. Mediante
un conjunto de lentes, aumenta el tamaño de objetos que son demasiado pequeños para
ser visualizados a simple vista. Dos principios están involucrados en el uso del
microscopio: la magnificación (capacidad de aumentar el tamaño de una imagen) y la
resolución (capacidad de producir una imagen nítida o dar imágenes bien definidas de
puntos situados muy cerca uno del otro).
Existen distintos tipos de microscopios, cada uno con un propósito particular, ya que cada
técnica microscópica permite observar estructuras dentro de cierto rango de tamaño,
dependiendo del límite de resolución del microscopio empleado, es decir, la separación
mínima que permite que dos objetos puedan ser distinguidos como diferentes.
Microscopios actuales
Desde su invención, la microscopía ha experimentado increíbles adelantos, aumentando
no solo su capacidad de resolución sino también el poder de amplificación. Se los puede
clasificar en dos grandes grupos: microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
La gran diferencia entre ambos tipos es la radiación que emplean para iluminar el objeto
de interés, el límite de resolución depende de las características físicas de la radiación
empleada. En el caso de los microscopios ópticos, la radiación utilizada es la luz visible.
En los microscopios electrónicos, es un haz de electrones, posibilitando un poder de
resolución mayor.
Microscopio óptico compuesto: Es sin duda el elemento más importante para el
estudio de la morfología celular, el más usado es el microscopio óptico, siendo el más
simple una lente convexa doble con una distancia focal corta, y el compuesto es el que
dispone de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores.
Tan importante como el aumento de un microscopio es su poder de resolución que es
una medida de la capacidad para distinguir un objeto de otro; es la distancia mínima que
debe haber entre dos objetos para que sean percibidos como objetos separados.
Para el ojo humano es de aproximadamente 1/10 mm, o 100 micrómetros en cambio para
el microscopio óptico 0,2 μm.
Poder de resolución y aumento son dos cosas diferentes ya que usando lentes más
potentes se puede incrementar el aumento, pero esto no mejorará la resolución.
Con el microscopio óptico podemos distinguir las estructuras más grandes dentro de las
células eucariotas y también células procariotas individuales. Sin embargo, no podemos
observar la estructura interna de las células procariotas ni distinguir entre las estructuras
más finas de las células eucariotas.
En el Microscopio óptico compuesto se distinguen los siguientes sistemas:
Sistema mecánico: formado por aquellas piezas que no intervienen en la formación
de la imagen ni en el camino de la luz (ej: tornillos micro y macrométrico, columna,
pié, platina, tubo, étc.);
Sistema de iluminación: lo integran aquellos componentes encargados de colectar
la luz, dosificarla y dirigirla a través del preparado (ej: fuente de iluminación,
diafragma);
Sistema óptico: incluye todos los elementos que colaboran en la ampliación de la
imagen, es decir: objetivos y oculares que son las lentes del microscopio.
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Sistema mecánico
Base sirve de soporte al microscopio y por su peso le proporciona estabilidad al
aparato.
Tubo proporciona sostén a los oculares y objetivos y mantiene unidos a unos y a
otros separados por la distancia de trabajo correcta.
Revolver es una pieza giratoria que posee diferentes lentes objetivos, cada uno de
ellos posee un aumento distinto. Al girar esta pieza es posible utilizar estas lentes
para la observación.
Brazo: une al tubo con la platina.
Tornillos de focalización el enfoque se realiza modificando la distancia entre el
preparado y el objetivo. El ajuste se realiza con dos tornillos; el macrométrico que se
usa para el ajuste grueso y el micrométrico para el ajuste fino o de precisión. Este
último tiene una escala graduada, donde cada marca representa un avance de dos
micrones
Platina: consiste en una plataforma horizontal móvil, con un orificio central por donde
pasa la luz. Es aquí donde se ubica el preparado.
Pinzas: sostienen el preparado con firmeza sobre la platina.
Sistema óptico
La fuente luminosa se ubica debajo del condensador y se encuentra incorporada a
la base del microscopio.
El condensador consiste en un sistema de lentes que concentra la luz en el
preparado posee un tornillo que permite mover este dispositivo hacia arriba y hacia
abajo.
Diafragma o iris, se localiza en el condensador y permite regular la cantidad de luz
que sale de este.
Anillo porta filtro sostiene un filtro azul de poca densidad, anexo al condensador con
la finalidad de disminuir el tono amarillento de la luz artificial.
Lentes Oculares se encuentran en la parte superior del tubo, están formados
generalmente por un sistema de dos lentes planos convexos simples o compuestas,
separadas por un diafragma interno. El lente inferior se denomina lente de campo y
tiene por función recoger la mayor cantidad de rayos divergentes que vienen al
objetivo. Tiene su foco en el diafragma y allí la imagen es aumentada por la lente
superior.
Lentes objetivos se encuentran ubicadas en un sistema revolver que permite
intercambiarlo durante la observación. Los fabricantes marcan en la montura de cada
objetivo por ejemplo 10:1 el número de apertura numérica AN 0.25 junto con el
aumento 10X. El objetivo de menor aumento 4X o lupa, conjuntamente con los de
10X, 40X, 60X se denominan objetivos secos porque entre el preparado y la lente
existe aire, por el contrario en el de 100 X se utilizan aceites de cedro o sintético y la
lente se sumerge en ellos de ahí el nombre de inmersión, de este modo se aumentar
el índice de refracción entre el preparado y la lente. Una propiedad importante de los
objetivos es que normalmente invierten la imagen en todo sentido (de derecha a
izquierda y de arriba abajo) y, como el ocular no puede reinvertirla, nosotros la
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observamos completamente al revés. Esto no es un problema porque ¿quién sabe
qué es arriba y qué abajo en una célula? pero conviene tenerlo en cuenta porque
cuando movemos el preparado, la imagen se desplaza ante nuestros ojos en sentido
contrario a lo que esperaríamos
Relación entre aumento, diámetro y distancia
Existe una estrecha relación entre el aumento, el diámetro de la lente y la distancia al
preparado. El diámetro de la lente se relaciona de manera inversa con el aumento (a
mayor aumento, menor diámetro), esto se debe al campo que debe abarcar cada uno (al
aumentar el tamaño se debe reducir el campo, sino la imagen sería terriblemente grande,
por ejemplo, desde un avión se observa mucha superficie campo pero muy pequeña y
poco detallada, a medida que se acerca, se observan más grande los detalles pero
menor superficie). En cuanto a la distancia al preparado, a mayor aumento que se quiera
conseguir, más cerca se debe estar del preparado y entender esto es fundamental para
comprender el porqué de las lentes de inmersión: sin ahondar en cuestiones físicas, llega
un momento en que a través del aire no se puede acercar más, entonces, para poder
seguir "acercándose" hay que modificar las propiedades de refracción del medio. El
efecto que se logra aumenta el índice de refracción consiste en que para la luz, el
preparado esté más cerca del objetivo.
Modo de uso
Encienda la fuente de iluminación; regule la intensidad de la luz con el reóstato y la
distancia entre los oculares acercando y separándolos, luego observe la escala graduada
que indica la separación conveniente para cada observador, según la distancia Inter
pupilar
Tenga en cuenta con qué objetivos va a trabajar, cuando lo haga con objetivos secos el
condensador debe estar en posición baja y el diafragma casi obturado, en cambio cuando
lo haga con objetivo de inmersión, el condensador debe estar en posición alta y el
diafragma abierto.
Gire el sistema de revolver para que el objetivo de menor aumento se oriente hacia el eje
de observación; este posee un tope que deberá sentirse al llegar al lugar debido.
Mueva el tornillo macrométrico hacia el observador, de este modo aumenta la distancia
entre el objetivo y la platina lo que permitirá que ubique el portaobjeto con el cubreobjetos
sobre la platina del microscopio.
Ubique el objeto de estudio de tal modo que quede centrado sobre el orificio de la platina.
Para ello mueva los tornillos denominados Vernier, ubicados a ambos lados de la platina,
los mismos desplazan a esta en sentido antero posterior y a los clips de sujeción del
preparado de derecha a izquierda.
Realice el enfoque grueso, acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico en sentido contrario al observador. Esto debe hacerse
mirando directamente y no a través del ocular, ya que corre el riesgo de incrustar el
objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. A
continuación, mire a través de los oculares, y acerque lentamente con el macrométrico el
preparado al objetivo y cuando observe nítida la muestra, gire el micrométrico hasta
obtener un enfoque fino. Para mover los tornillos de aproximación deben usarse las dos
manos para no desajustar la cremallera.
Empleo del objetivo de inmersión
Baje por completo la platina. Suba totalmente el condensador para ver claramente el
círculo de luz que indica la zona que va a visualizar y donde habrá que colocar el aceite.
Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el
de 40x.
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Coloque una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
Suba la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite, se nota como si la
gota ascendiera y se adosara a la lente
Enfoque cuidadosamente con el micrométrico.
Una vez haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no puede volver a usar
el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar
otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación.
Una vez finalizada la observación, baje la platina y coloque el objetivo de menor aumento,
girando el revólver retire la preparación de la platina.
Nunca retire con el objetivo de inmersión en posición de observación.
Limpie el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Compruebe también que el objetivo 40x esté perfectamente limpio.
Una vez terminada con las observaciones apague la fuente de luz y coloque el objetivo
de menor aumento en la posición de observación.
Nunca deje el microscopio con el objetivo de mayor aumento en la posición de
observación.
Mantenimiento y precauciones
Para transportar el microscopio tome el brazo del mismo con una mano y con la otra
sostenga su base. Nunca transporte invertido ni muy inclinado ya que la lente ocular no
está fija y se puede caer
Deposítelo con cuidado sobre una mesada que debe ser lisa y fija, orientándolo con el
lado libre de la platina hacia el observador y con el brazo hacia el lado opuesto.
Nunca toque las lentes con las manos. Si se ensucian, limpie muy suavemente con un
papel tisú.
No fuerce los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador).
Gire el revólver y dirija la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la
muestra cuando cambie de objetivo. No cambie de objetivo mientras esté observando a
través del ocular.
Mantenga seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,
secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpie con un paño humedecido en xilol.
Al finalizar el trabajo, deje puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresalga del borde
de la misma y cúbralo con una funda.
Microscopio Óptico
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MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO DE DISECCIÓN O LUPA
MICROSCOPIO ESTEREOSCOPICO O LUPA
El microscopio estereoscópico o de disección es muy útil para objetos opacos que por
su tamaño deben ser observados con poco aumento. Permite la observación de objetos
demasiado pequeños para ser observados a simple vista, pero relativamente grandes
para ser vistos completos con el menor aumento del microscopio compuesto.
El aumento habitual del microscopio estereoscópico varía entre 4X y 40X a 60X
aumentos. Este tipo de microscopio está compuesto por dos objetivos y dos oculares,
construcción que permite obtener una imagen tridimensional del objeto.
El objeto se observa generalmente por la luz reflejada en su superficie.
Fig. 2 microscopio estereoscópico
Modo de uso
Coloque el material biológico en estudio en un vidrio de reloj o una caja de Petri y luego
sobre la platina del microscopio
Ajuste la distancia interpupilar, moviendo los oculares para ver cómodamente al mismo
tiempo con ambos ojos.
Desplace los objetivos tan abajo como sea posible y después vaya subiéndolos hasta que
el objeto aparezca en foco.
Mientras examina al objeto, muévalo hacia la izquierda y hacia la derecha.
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Variantes en la microscopía óptica
Se pueden distinguir variantes que ofrecen diferentes imágenes de un mismo objeto de
estudio. Según el material de estudio, características y la finalidad deseada, se elegirá el
tipo de objetivo como la técnica.
Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa
directamente y se aprecian detalles que están naturalmente coloreados, o
simplemente contornos.
Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste
entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para
especimenes delgados, o células aisladas. El tipo de iluminación que emplea provoca
variaciones en cómo refractan la luz algunos especimenes “invisibles”, haciéndolos
visibles. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por
lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.
Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC): Utiliza dos rayos de
luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera
proyectando sombras hacia un lado. Se usa cuando la muestra es muy gruesa. Fue
diseñado para observar relieves de especimenes difíciles de manejar. Es muy
utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro.
Microscopía en campo oscuro: el microscopio utiliza una luz muy intensa en forma
de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. Las porciones claras del ejemplar
aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando
aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza
para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.
Una vez obtenidas las secciones, usualmente el siguiente paso es teñirlas con
colorantes específicos que poseen afinidad por distintos componentes celulares,
permitiendo su identificación al microscopio. Algunos ejemplos de colorantes muy
empleados son la hematoxilina y la eosina. El primero tiene afinidad por las moléculas
cargadas negativamente, por lo que se emplea para teñir los núcleos celulares (por su
contenido de ADN) que adquieren un color violáceo. El segundo tiene afinidad por las
sustancias básicas, otorgando un color rosado al citoplasma celular cuya carga neta
es positiva.
Microscopía de campo brillante con tinción: Los colorantes específicos aumentan
el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera.
Microscopía de fluorescencia: Se emplean sustancias naturales de la célula o
colorantes que tienen la capacidad de absorber determinadas longitudes de onda, y
emitir luz fluorescente. Se utiliza para detectar proteínas u otras moléculas
específicas en una célula. Para lograrlo se puede acoplar la molécula fluorescente a
otra molécula capaz de reconocer al componente que interesa visualizar, o emplear
moléculas fluorescentes que directamente tengan afinidad con determinados
componentes celulares. Se pueden combinar distintos compuestos fluorescentes para
detectar distintas moléculas en la misma muestra.
Microscopía con focal: Permite obtener imágenes tridimensionales, a diferencia de
la microscopía óptica. El microscopio óptico convencional enfoca un determinado
“plano focal” dentro de una estructura tridimensional; por encima y por debajo de
dicho plano la muestra está iluminada pero no en foco, y esto genera una imagen
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borroneada. El microscopio con focal combina dos enfoques: óptico y computacional.
Esto elimina las imágenes provenientes de otros planos que no sean los que se
desea enfocar en cada momento. Las imágenes se integran mediante computadoras
para obtener una imagen tridimensional.
Microscopios electrónicos
Permiten una ampliación del objeto mucho mayor que el microscopio óptico, con muy alta
capacidad de resolución. Se puede observar virus y organelas subcelulares, entre otras
estructuras. Básicamente, dos tipos de microscopios electrónicos fueron desarrollados
para diferentes usos:
Microscopio electrónico de transmisión (MET): Proyecta electrones (partículas
subatómicas con carga negativa) a través de una fina capa de tejido o material a
observar. Al hacerlo, produce una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla
fosforescente, donde el brillo en un área particular de la imagen es proporcional al
número de electrones que son transmitidos a través del material.
Microscopio electrónico de barrido (MEB): Produce una imagen que parece
tridimensional. Emplea dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones
que escanean la superficie del espécimen a observar y salen del mismo siendo
detectados por un sensor.
La mayor parte del conocimiento actual de la estructura celular se obtuvo con la ayuda de
tres tipos de instrumentos: el microscopio óptico compuesto, el microscopio electrónico
de transmisión y el microscopio electrónico de barrido.
Comparación entre microscopio óptico y electrónicos de transmisión y barrido.
Microscopio
Microscopio
Microscopio Óptico Electrónico de
electrónico de Barrido
Transmisión
Lámpara de
Fuente de energía Filamento de tungsteno Filamento de tungsteno
incandescencia
Refracción de rayos Dispersión de
Imagen dada por Barrido de electrones
luminosos electrones
Tubo Aire Vacío Vacío
Bobinas Bobinas
Guía de radiación Lentes
electromagnéticas electromagnéticas
Material biológico Vivo o muerto Muerto Muerto
Límite de resolución 0.4 a 3 Å 60 Å
Longitud de onda 5000 Å 0.05 Å 0.05 Å
Aumento 1000 - 1500 750.000 - 1.000.000 150.000
Glutaraldehido. No es necesario. se
Fijadores FAA/Carnoy
Tetróxido de osmio puede utilizar FAA
Inclusión Parafina/Resina epoxi Resina epoxi/acrílico No
Mano
Corte Ultramicrótomo No
alzada/Micrótomo
Espesor de corte 5 a 10 m 100 a 900 Å No
Granos de polen
Usos Estructuras –organelas estructuras
esporas de hongos
Tipos de
Morfología Cortes ultra finos Detalles de la superficie
observaciones
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TÉCNICA PARA EL ANÁLISIS CITOLÓGICO
Como el microscopio óptico compuesto utiliza luz transmitida, los objetos que van a ser
observados deben ser muy delgados para que la luz los atraviese en diverso grado y
llegue hasta el ojo del observador. Lo ideal en muchos casos sería observar una sola
capa de células, lo cual es muy difícil.
Preparados
Este tipo de preparaciones se realizan para la observación de una célula o tejido, en
estado vivo, permite también la observación de movimientos celulares.
Su aplicación está restringida, pues se pueden emplear solamente con objetos muy
delgados y transparentes. No permiten realizar observaciones muy prolongadas, y
muestran pocos detalles de la estructura celular.
Si la observación tiene que ser prolongada, y de acuerdo al material a observar conviene
recurrir a un portaobjeto excavado en la parte central. Sobre el que se invierte un
cubreobjeto con una gota de líquido fisiológico en el que se suspende el material.
*La observación al estado vivo resulta insuficiente para lograr el conocimiento de la
estructura celular, dado que las partes constituyentes poseen más o menos el mismo
índice de refracción. Para subsanar este inconveniente hay que colorear la célula, a fin de
suplir las escasas diferencias de refringencia por diferencias de coloración.
Los colorantes que se utilizan se denominan vitales, por ejemplo, azul de metileno, rojo
neutro, verde Jano, estas preparaciones se denominan temporarias.
*Es necesario efectuar el proceso de fijación que inmoviliza, preserva y provoca la muerte
celular, de tal manera que conserven las características morfológicas y químicas que
tuvieron durante su vida y las prepara para la coloración.
La acción de los fijadores consiste en transformar el coloide protoplasmático en geles
insolubles e irreversibles, es decir actúan solidificando el protoplasma por medio de la
coagulación o precipitación.
Los fijadores químicos más usados son de composición variable, orgánicos o inorgánicas
de un solo tipo o bien formando parte de mezclas y los físicos como el calor o la
congelación.
*Para que una muestra permanezca intacta en el tiempo, y permita observarla al
microscopio todas las veces que se desee, preparaciones permanentes, es necesario
(que los tejidos que son generalmente blandos y frágiles aún fijados), sean embebidos
en un medio que actúe de soporte para poder seccionarlo. Generalmente se emplea para
ello parafina también algunas resinas, que en su estado líquido penetra el tejido fijándolo,
y luego forma un bloque sólido junto a la muestra.
Para poder hacer los cortes histológicos, muy delgados, se utiliza un micrótomo. Se retira
la parafina con un disolvente, se tiñe el material para el cual existen numerosas técnicas.
Por último, previa deshidratación, se coloca una gota de resina sintética (bálsamo de
Canadá) y se pone el cubreobjeto, la preparación está lista para ser observada y
conservada en forma permanentemente.
Bibliografía Consultada
De Robertis y De Robertis. Biología celular y molecular. Editorial El Ateneo
Albert, Bray, Lewis, Raff, Roberts y Watson. Biología molecular de la célula. Editorial
Omega.
