Unidad 7 – Clonación de ácidos nucleicos

7.1. Los métodos de clonación molecular

Hasta el desarrollo de la PCR, la técnica de amplificación más utilizada era la clonación molecular.
La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de
ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante.
La tecnología del ADN recombinante es una aplicación importante de las endonucleasas de restricción en
biología molecular que permite crear las moléculas de ADN recombinante que serán introducidas en una
célula huésped. Por hoy multiplicación de estas células en cultivo se consiguen multitud de copias del
ADN recombinante y, en consecuencia, del fragmento amplificado de interés.
Pese a ser una técnica manual y aquí requiere dedicar varios días a su realización, ofrece importantes
ventajas:

• Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.

• Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño, mucho mayores que las que se pueden
amplificar mediante PCR (incluso de millones de pares de bases), dependiendo del vector
utilizado.
• En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo, fragmentándolo
previamente, lo que permite al creación de librerías genómicas.
• Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés, para la producción de proteínas,
hormonas (insulina), OMG (organismos modificados genéticamente), terapia génica, etc.

Fig. 7.1. Esquema general de la clonación Una vez que

se ha conseguido la molécula de NDA recombinante
adecuada y se ha introducido en el huésped adecuado,
se genera un clon de células genéticamente idénticas
(todas portan el vector recombinante) que es pueden
almacenar y propagar en cultivo indefinidamente.

Comparación de técnicas PCR/clonación molecular

Clonación molecular PCR
Técnica in vivo Técnica in vitro
El fragmento de ADN de interés se introduce El fragmento de ADN se replica en un tubo de
adecuadamente en una célula viva y se aprovecha ensayo en el que se generan artificialmente las
la maquinaria replicativa de la célula para condiciones apropiadas.
amplificarlo.
La técnica es manual y dura varios días. La técnica está automatizada y se lleva a cabo en
horas. (Muy positivo de la PCR)

Permite obtener prácticamente cantidades Las cantidades de secuencias de interés están

ilimitadas de la secuencia de interés. limitadas por el número de ciclos de replicación
que es realicen (25-40).

Permite amplificar secuencias de ADN de incluso Niveles de amplificación menor (hasta 3,5 kb).
millones de pares de bases dependiendo del
vector utilizado.

7.2. Componentes de la clonación

Los componentes principales que intervienen en un proceso de clonación molecular son los vectores de
clonación en los que insertar el ADN de interés y las células hospedadoras que incorporarán el vector y
que lo multiplicarán por replicación.
7.2.1. Los vectores de clonación
Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una célula
huésped y que permiten la inserción de ADN extraño, sin perder esa capacidad de replicación autónoma.
El fragmento de ADN de interés que se introduce en el vector de clonación recibe el nombre de inserto.
Características de los vectores de clonación
Para poder ser utilizada como vector una molécula de ADN debe reunir varias características:

• Tener un origen de replicación (ORI) que le permita replicarse en la célula huésped junto con el
fragmento de ADN extraño que transporta.
• Tener, como mínimo, un sitio de inserción de ADN extraño. Normalmente, los sitios de inserción
son secuencias diana de enzimas de restricción, presentes una única vez en toda la molécula.
Los vectores de última generación suelen tener múltiples dianas de restricción diferentes y únicas,
para posibilitar la inserción de prácticamente cualquier ADN extraño. Incluso, en algunos vectores,
todas sal dianas de restricción se concentran en un segmento corto del vector, denominado sitio
múltiple de restricción o sitio múltiple de clonación (polylinker en inglés).
• Contener algún marcador de selección, que permita seleccionar las células que portan el vector
de aquellas que no lo portan. Normalmente son genes de resistencia a antibióticos o genes que
codifican enzimas que no tiene de manera natural al célula huésped.
• Contener un marcador de identificación, que permita distinguir las células que portan un vector
recombinante, con ADN extraño, de aquellas que portan un vector sin ADN extraño.
Algunos vectores contienen también un promotor, que posibilita al transcripción del inserto y su posterior
traducción a proteína. Estos vectores especiales se denominan vectores de expresión.
Tipos de vectores
Hay varios tipos de vectores, que se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los distintos
elementos que lo integran y el tamaño del fragmento de ADN hola extraño que puede incorporar. Entre
los más utilizados se encuentran los plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos y cromosomas artificiales.
Plásmidos
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN
bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con
capacidad autónoma de replicación.
Algunos de los plásmidos más utilizados el pUC18,
utilizado por su capacidad de aceptar insertos de hasta 10
kb y su alta tasa de replicación (alrededor de 500 copias
por célula).
Bacteriófagos
Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias.
Una vez que el fago introduce su material genético en el interior de la bacteria, se adueña del control de
la maquinaria metabólica de la célula infectada y desarrolla un ciclo lítico, consistente en la replicación
del cromosoma vírico, la síntesis de proteínas víricas, el empaquetamiento de nuevos virus y la liberación
de los mismos al medio previa lisis celular.
Algunos tipos de fagos pueden, alternativamente, insertar temporalmente su material genético en el
cromosoma bacteriano mediante recombinación, en lo que se denomina ciclo lisogénico. Este es el caso
de uno de los fagos más utilizados como vector de clonación: el fago lambda (fago λ). En estos vectores
se pueden incluir insertos de hasta 20 kb.
Cósmidos
Los cósmidos son vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago λ y parte de un
plásmido bacteriano.
Fagémidos
Los fagémidos son también vectores híbridos compuestos por un plásmido (con su origen de replicación
bacteriano) al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13.
Cromosomas artificiales
Los cromosomas artificiales son vectores de clonación con capacidad de transportar fragmentos de
gran tamaño.
Los más utilizados son los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y los cromosomas artificiales de
levaduras (YAC).
• Cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Pueden transportar insertos de ADN extraño de
hasta 300 kb.
• Cromosomas artificiales de levaduras (YAC). Son los vectores de mayor capacidad, ya que
pueden transportar insertos mayores de 1Mb.
Vectores lanzadera
Los vectores lanzadera o vectores transbordadores son un tipo de vectores híbridos que contienen
orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes, normalmente uno de plásmido bacteriano y otro
de levadura o de virus animal, como el SV40.
Además, se construyen con marcadores genéticos que permiten su selección en ambos sistemas
huésped. Se usan para transportar insertos entre dos hospedadores distintos, habitualmente para
estudios de expresión génica: en el primero se amplifica el inserto y en el segundo se expresa el gen
amplificado.
7.2.2. Células hospedadoras
Las células hospedadoras son aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su
amplificación mediante replicación. Los hospedadores pueden ser: células procariotas (bacterias) o
células eucariotas.
Células hospedadoras bacterianas
Las bacterias son las células más ampliamente utilizadas como hospedadoras para clonar plásmidos,
fagos y cósmidos, por la escasa complicación técnica que supone su manipulación, su gran versatilidad
y la rapidez con que crecen.
Se suelen usar cepas defectivas especiales que carecen de algunas actividades enzimáticas para
favorecer la estabilidad de los vectores. Así, por ejemplo, pueden carecer de exonucleasas para evitar la
degradación de vectores de clonación lineales y suelen carecer de genes que controlan la recombinación
génica, para evitar la integración del vector en el cromosoma bacteriano. La bacteria más utilizada en
clonación es E. coli, en concreto la cepa K12.
Células hospedadoras eucariotas
Levaduras
Las levaduras son organismos eucarióticos unicelulares que crecen de manera similar a las bacterias. Se
utilizan como hospedadores para clonar YAC y plásmidos de levaduras. Ej: Saccharomyes cerevisae y
Pichia pastoris.
Células vegetales y animales
Las células vegetales y animales también pueden ser utilizadas como hospedadores, pero normalmente
para obtener organismos transgénicos.
7.3. Fases del proceso de clonación
Independientemente del vector empleado y de la célula hospedadora elegida, el proceso de clonación se
desarrolla en tres fases:
• I. Creación de un vector recombinante.
• Il. Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
• III. Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
7.3.1. Creación de un vector recombinante
Se define un vector recombinante como aquel que contiene un inserto de ADN extraño.
Para su creación es necesario preparar el ADN que se va clonar y el vector de clonación, de manera que
ambos puedan unirse mediante una ligasa Para ello es necesario crear extremos cohesivos y
complementarios en los extremos de ambas moléculas.
Preparación del ADN que se va a clonar
La forma más habitual de dotar a un ADN bicatenario de extremos cohesivos con enzima de restricción
que genere ese tipo de extremos.
Lo normal es partir del ADN genómico completo y purificado, y digerirlo con una enzima de restricción
compatible con el vector que se va a utilizar y que no tenga una diana de restricción en el interior de la
secuencia que se quiere clonar. La compatibilidad con el vector implica que este debe tener una diana de
restricción para la misma enzima.
Esta digestión genera múltiples fragmentos de diferentes tamaños.
Es muy útil para generar librerías genómicas, pero no lo es tanto cuando se quiere amplificar un único
gen o secuencia concreta.
Cuando se quiere clonar solo un gen es preferible amplificar previamente el ADN que se quiere clonar
mediante PCR. Curiosamente, las polimerasas sin actividad correctora, como la Taq ADN polimerasa,
generan amplicones con una A extra en cada extremo 3, desapareada y sobresaliendo de la doble hélice.
Estos amplicones se pueden insertar en vectores que tienen sendas T desapareadas en sus extremos 3',
llamados vectores-T.
Preparación del vector de clonación
La preparación del vector de clonación para aceptar una molécula de ADN extraño consiste
principalmente en digerirlo con la misma enzima de restricción que se utilizo para preparar el ADN que se
va a clonar. Hay varias situaciones posibles:
a. Vector circular, con diana de restricción única.
b. Vector circular con dos dianas de restricción.
c. Vector lineal con diana de restricción única.
d. Vector lineal con dos dianas de restricción.
Inserción del ADN extraño en el vector
Se realiza mezclando ambos en las concentraciones adecuadas e incubándolos en las condiciones
óptimas para que las dos moléculas se unan a través de los extremos cohesivos generados por la misma
enzima de restricción mediante complementariedad de bases, en presencia de una ADN ligasa.
La ligación es la reacción con la que la ligasa sella covalentemente las mellas en la doble hélice de ADN,
produciendo el vector recombinante.
¡Tenlo en cuenta! En el caso de que el ADN que se va a clonar se haya preparado mediante PCR con
ADN polimerasa sin actividad correctora, el vector debe ser lineal con una T no apareada sobresaliendo
en cada extremo 3'.
Tras la ligación se obtiene una mezcla compleja de moléculas, una de las cuales es el vector recombinante
específico. Pero también se obtienen muchos productos no deseados: vectores recircularizados sin ADN
extraño, etc.
Todos estos productos van a ser introducidos en células hospedadoras y habrá que irlos eliminando en
fases posteriores de la clonación.
7.3.2. Introducción del vector en la célula hospedadora
Transformación bacteriana
La transformación bacteriana consiste en la captación e internalización por parte de una bacteria de
moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo.
No todas las bacterias pueden realizar este proceso, solo aquellas que se denominan «competentes».
La especie bacteriana más utilizada como hospedadora es E. coli, no es competente de forma natural,
por lo que hay que transformarla en competente de forma artificial.
El método de transformación más habitual para E. coli consiste en un tratamiento químico (con cloruro
cálcico) y físico (choque térmico), que aumenta la permeabilidad de la pared y la membrana celulares.
Finalizado el protocolo, las bacterias se siembran en placas con el medio de cultivo sólido adecuado para
proceder a la selección de los clones recombinantes.
Transfección
La transfección es un proceso similar a la transformación bacteriana, pero en células hospedadoras
eucarióticas, principalmente animales.
En términos amplios la transfección se podría definir como la introducción de vectores recombinantes
en células eucarióticas no mediada por virus.
Se utilización de agentes químicos. El más sencillo consiste en añadir el vector recombinante en una
solución tamponada de fosfato cálcico sobre un cultivo de células animales en monocapa. El vector
coprecipita junto con el fosfato cálcico sobre las membranas celulares y es introducido en el interior de la
célula por endocitosis.
Transducción
La transducción consiste en la introducción de material genético extraño en una célula por la acción de
un virus.
El vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus con el que se infecta un cultivo de
células hospedadoras. La situación más habitual es la infección de cultivos bacterianos con fagos
recombinantes o cósmidos empaquetados en fagos.
Electroporación
La electroporación consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células
hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución.
Estos pulsos aumentan la permeabilidad de las membranas, permitiendo el paso de los vectores al interior
de la célula. Es un método de gran eficiencia y se puede aplicar con todo tipo de células hospedadoras
(levaduras).
7.3.3. Selección e identificación de clones recombinantes
Una vez terminado el proceso de introducción del vector se obtiene una mezcla con tres tipos de células:

• Células no transformadas, que no han captado ninguna molécula de ADN extraño.

• Células transformadas que portan el vector recombinante específico.
• Células transformadas que portan un vector no recombinante o alguna molécula de ADN no
deseada producida durante la ligación.
Es necesario, por lo tanto, un proceso de selección (eliminación de células no trasformadas) e
identificación de los clones recombinantes mediante: genes de resistencia a antibióticos, enzimas que
producen reacciones coloreadas, proteínas fluorescentes, genes letales, etc.
Genes de resistencia a antibióticos
Se en el empleo de vectores con dos genes de resistencia a antibióticos, normalmente ampicilina y
tetraciclina.
El punto de inserción del ADN extraño se encuentra en el interior de la secuencia de uno de los genes de
resistencia (por ejemplo, tetraciclina), de manera que en los vectores recombinantes ese gen no es
funcional. Cuando se introduce este vector en bacterias sensibles a la ampicilina y la tetraciclina se
obtienen tres tipos de células:

• Células no transformadas, sensibles a la ampicilina y la tetraciclina.

• Células transformadas con el vector recombinante, resistentes a la ampicilina y sensibles a la
tetraciclina.
• Células transformadas con el vector no recombinante, resistentes a la ampicilina y la tetraciclina.
Con este sistema, la selección se realiza cultivando las células en un medio de cultivo sólido con
ampicilina, en el que solo crecerán las bacterias transformadoras. La identificación se realiza replicando
la placa con ampicilina en otra placa con tetraciclina, en la que solo crecerán las bacterias transformadas
con el vector no recombinante.
En consecuencia, los clones recombinantes serán las colonias que crecen en la placa con ampicilina y no
crecen en la placa con tetraciclina.
Estrategia cromogénica
Esta estrategia se utiliza cuando se combinan:

• Bacterias hospedadoras defectivas lactosa negativas o lac - (incapa-ces de producir B-

galactosidasa). La bacteria es además sensible al antibiótico para el que porta resistencia el vector.
(Doc. 7.2)
• Vectores que contienen un gen de resistencia a un antibiótico y el gen LacZa con un polylinker en
su interior. En los vectores recombinantes este gen no es funcional, ya que su secuencia se
interrumpe por el inserto de ADN extraño.
Con esta estrategia, la selección y la identificación se realizan simultáneamente. Cuando se introduce el
vector en bacterias sensibles al antibiótico se obtienen tres tipos de células:

• Células no transformadas, sensibles al antibiótico y lac -.

• Células transformadas con el vector recombinante, resistentes al antibiótico y lac -.
• Células transformadas con el vector no recombinante, resistentes al antibiótico y lac +.
Con esta estrategia, la selección y la identificación se realizan simultáneamente cultivando las bacterias
en un medio de cultivo sólido con el antibiótico, un inductor del operón lac (IPTG) y el sustrato
cromogénico X-gal. En este medio solo crecen las bacterias transformadas. Además, las bacterias que
portan el vector recombinante (lac -) producen colonias blancas y las bacterias que portan el vector no
recombinante (lac +) producen colonias azules.
Proteínas fluorescentes
Se basa en el empleo de vectores con un gen de resistencia para realizar la selección y un gen que
codifica una proteína fluorescente para la identificación. La región polylinker se incluye en el gen de la
proteína fluorescente, de manera que los insertos inactivan el gen. La proteína más utilizada es la proteína
verde fluorescente (GFP), cuyo gen se aisló de una medusa.
Una vez más, la selección de bacterias transformadas se realiza por crecimiento en medios de cultivo
sólidos con antibiótico y la identificación se realiza iluminando las placas de cultivo con luz ultravioleta.
Las colonias de bacterias transformadas con plásmidos no recombinantes presentarán fluorescencia
verde, mientras que las colonias transformadas con plásmidos recombinantes no tendrán fluorescencia.
Genes letales
Una metodología relativamente reciente utiliza vectores con un gen de resistencia a un antibiótico
(marcador de selección) y un gen que codifica para una proteína letal para las bacterias (marcador de
identificación) con un polylinker en su interior. En los vectores recombinantes la proteína letal no es
funcional porque la secuencia génica queda interrumpida por el inserto de ADN extraño.
La selección e identificación se realiza simplemente cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico
en cuestión. En este medio únicamente se desarrollan las bacterias que porten el vector recombinante.
Las bacterias no transformadas no crecen porque son sensibles al antibiótico y las bacterias
transformadas con el vector no recombinante mueren por efecto de la proteína letal.
7.3.4. Tasa de transformación
La tasa de transformación mide la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora.
Matemáticamente se expresa como:
𝑈𝐹𝐶 𝑥 𝑉𝑇
Tasa de transformación = 𝐶 𝑥 𝑉𝑠

Donde Vt, es el volumen total de la solución en la que se realiza la transformación (µl); C, la cantidad del
vector empleado (mezcla que incluye vector recombinante y vector no recombinante) (µg); V, el volumen
de suspensión bacteriana transformada utilizada para sembrar una placa de medio de cultivo sólido con
antibiótico y UFC, las unidades formadoras de colonias que crecen en dicha placa.
7.4. Bibliotecas de ADN
Una biblioteca o librería de ADN es una colección de vectores recombinantes clonados cuyas
secuencias de ADN extraño se han obtenido de un único organismo.
7.4.1. Tipos de bibliotecas de ADN
Las bibliotecas de ADN pueden ser de tres tipos, dependiendo del origen del ADN clonado: genómicas,
cromosómicas y de ADNc.

• Bibliotecas genómicas. Son colecciones de vectores recombinantes clonados que incluyen el

genoma completo de un organismo. Para organismos superiores, las bibliotecas se suelen realizar
en fagos, cósmidos, BAC o YAC.
En una biblioteca genómica están representados, supuestamente, todos los genes de un organismo. En
teoría, una biblioteca genómica debe contener al menos una copia de cualquier secuencia presente en el
genoma. El número mínimo de clones necesario está relacionado con el tamaño del genoma y el tamaño
medio de los insertos clonados, que dependerá del vector.
• Bibliotecas cromosómicas. Son bibliotecas de ADN construidas a partir de un único cromosoma
o de una fracción aislado de células mitóticas en metafase.
• Bibliotecas de ADNc. Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una población celular, previa
transcripción inversa con una retrotranscriptasa. Por lo tanto, representan solo genes que se están
expresando en un tipo celular y un estado metabólico concretos. Cada clon porta un gen completo,
pero su secuencia difiere de la secuencia genómica de ese mismo gen, puesto que carece de
intrones, promotores ni secuencias reguladoras.
7.4.2. Análisis de una biblioteca de ADN
Al final del proceso de clonación se obtiene una colección que contiene miles o cientos de miles de clones
en forma de colonias bacterianas, etc.
1. La identificación del clon o clones que contienen una secuencia concreta (inserto determinado).
Se utiliza técnicas de hibridación:

• Bacterias: técnicas de hibridación en colonias.

• Clonadas en fagos: técnicas de hibridación en placas virales.
Alternativamente, en bibliotecas clonadas en vectores de expresión (con promotor) se puede utilizar un
método indirecto no basado en hibridación para localizar un gen específico, consistente en detectar la
proteína codificada por el gen mediante técnicas inmunológicas.
2. El paseo cromosómico o identificación de clones que porten secuencias consecutivas. Permite
localizar dentro de una biblioteca de ADN clones que portan una secuencia adyacente a la de un clon
dado. Se basa en el empleo de bibliotecas obtenidas mediante digestión parcial del ADN de partida con
una enzima de restricción, de forma que se producirán fragmentos con regiones solapantes.
Se utilizaran los extremos de un inserto como sonda para buscar la secuencia adyacente contenida en
otro clon.
3. La secuenciación. El análisis definitivo de un clon consiste en descifrar la secuencia del ADN insertado
que porta el vector recombinante.
La secuenciación de todos los clones de una biblioteca obtenida mediante digestión parcial del ADN
permite, con la ayuda del software adecuado, obtener la codificación completa del genoma clonado,
alineando las distintas secuencias con base en los solapamientos.
7.5 Aplicaciones de la clonación molecular
Las aplicaciones de la clonación molecular son innumerables, no solo por facilitar la obtención de
cantidades prácticamente ilimitadas de cualquier gen o secuencia de interés, sino también por posibilitar
la expresión de esos genes e incluso integrarlos en el genoma de un organismo.
En investigación básica la clonación molecular es una herramienta clave para descifrar las secuencias
génicas completas de cualquier organismo, para estudios filogenéticos, de diversidad génica y de
expresión génica.
En investigación aplicada tiene especial interés:

• La clonación en vectores de expresión: producción de proteínas recombinantes.

Nivel industrial:

• Insulina, hormona de crecimiento, Factor VIII, enzimas, catalizadores, microorganismos que

metabolicen petróleo, productos tóxicos y materiales de desecho, etc.
• OMG o GMO.
En medicina hay dos aplicaciones de la clonación molecular que tienen actualmente un singular interés:
la creación de ratones transgénicos y la terapia génica.

• Ratones transgénicos. Con ADN modificado, por introducción de gen nuevo o por eliminación de
gen propio. Importante en el estudio de enfermedades genéticas.
• Terapia génica. Transferir genes normales a células somáticas para corregir enfermedades
genéticas.
• GMO, la terapia génica está sometida a un riguroso control legislativo y ético.