Universidad Católica de Salta

Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias

Carrera de Ciencias Veterinarias

Cátedra de Genética
Cartilla de Trabajos Prácticos

-2024-
 Universidad Católica de Salta

Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias

Carrera de Ciencias Veterinarias

Cartilla de Trabajos Prácticos

Cátedra de Genética
-2024-

Equipo Docente

Dr. Antonio D. BARRERA Profesor Titular

Lic. Norma N. TOLABA Auxiliar Docente
M.V. Pamela E. BARRIOS Auxiliar Docente
M.V. Mario E. CÉSPEDES GARCÍA Ayudante Docente Adscripto
Srta. Sofía NOUGUÉS Ayudante Alumno

1|Página
ÍNDICE
1. Fundamentos de la Cátedra................................................................................. 3
2. Objetivos ..................................................................................................................... 4

3. Programa de Trabajos Prácticos ......................................................................... 6

4. Cronograma............................................................................................................... 6

5. Contenido de los Trabajos Prácticos

. Trabajo Práctico N° 1............................................................................................ 9

. Trabajo Práctico N° 2............................................................................................ 18

. Trabajo Práctico N° 3............................................................................................ 23

. Trabajo Práctico N° 4............................................................................................ 28

. Trabajo Práctico N° 5............................................................................................ 34

. Trabajo Práctico N° 6............................................................................................ 49

. Trabajo Práctico N° 7............................................................................................ 81

. Trabajo Práctico N° 8............................................................................................ 85

6. Actividades complementarias
- Taller de Bioinformática .................................................................................. 91

7. Bibliografía ................................................................................................................. 110

8. Anexo ........................................................................................................................... 111

2|Página
UNIDAD ACADÉMICA: FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y VETERINARIAS

PERIODO LECTIVO: 2024

MODALIDAD: PRESENCIAL

CARRERA: GRADO

CARRERA/S CIENCIAS VETERINARIAS

CÁTEDRA: Año Régimen Plan Créditos

GENÉTICA 2° Semestral 2009 5

1- FUNDAMENTOS DE LA CÁTEDRA
La Genética es el campo de la biología que se enfoca en comprender cómo se
almacena, traduce y transmite el material hereditario que determina los rasgos o
características biológicas de los organismos vivos, en cualquier nivel de organización
(individual, poblacional) o dimensión (actual, pasada, futura).
En la actualidad, la Genética se destaca como una disciplina que ha adquirido un
protagonismo fundamental no solo por el avance logrado del conocimiento que ha tenido
como ciencia per se en organismos de diversos niveles de complejidad, sino también en las
potenciales aplicaciones que pueden derivarse de este conocimiento. La información
contenida en los genes de un organismo proporciona un anteproyecto biológico acerca de
cómo serán su aspecto, sus funciones y capacidad de supervivencia; y define ampliamente
sus similitudes y diferencias con respecto a otros organismos. Por tanto, la Genética ocupa
un lugar central en la biología, con impacto en la cría, mejoramiento y salud animal, siendo
esencial para los profesionales que trabajan con animales comprender sus conceptos,
generalidades y aplicaciones.
La asignatura Genética brinda el espacio curricular en el cual los estudiantes exploran
conceptos, desafíos y metodologías específicas, adquiriendo competencias en este campo
científico y las herramientas necesarias para adoptar posturas críticas, identificar problemas
y definir estrategias. Durante el curso, se busca que los alumnos desarrollen la habilidad de
comprender, relacionar y aplicar conceptos fundamentales de Genética, incluyendo los
principios de la herencia, la expresión génica, la variabilidad genética en poblaciones y las
nuevas biotecnologías aplicadas al mejoramiento genético y la genómica animal. Además, se
promueve la familiarización con líneas de investigación en genética de interés veterinario,
estimulando el razonamiento crítico y la construcción del pensamiento científico, así como la
reflexión sobre implicaciones sociales, éticas y médicas; proyectando la formación de
profesionales que sean capaces de adquirir conocimientos que tienen nuevos horizontes en
forma constante.

3|Página
 Es importante destacar que los conceptos teóricos y prácticos de Genética deben
integrarse de manera clara y pedagógica con el conocimiento previo adquirido, y son
esenciales para comprender asignaturas en todos los ciclos de formación de la carrera de
Ciencias Veterinarias. Por lo tanto, esta materia abarca contenidos fundamentales para la
formación tanto general como específica del futuro graduado, preparándolo para su
desempeño profesional en los campos de competencia laboral.

2- OBJETIVOS
GENERALES

Los objetivos generales que se pretenden alcanzar son los siguientes:

 Adquirir los fundamentos conceptuales y metodológicos de la genética para poder

aplicarlos eficaz y eficientemente en el área profesional.
 Entender los procesos responsables del origen, mantenimiento y función de la
variabilidad genética a fin de realizar predicciones acerca de la herencia de caracteres
productivos de interés y comprender las formas en que es posible lograr una mejora
genética de los mismos.
 Conocer las bases conceptuales y las destacadas aplicaciones biotecnológicas de las
técnicas de ingeniería genética en el campo de la veterinaria.
 Desarrollar la capacidad creativa a través del razonamiento lógico y reflexivo,
permitiendo la asociación de conceptos interdisciplinarios.
ESPECÍFICOS

1. Objetivos conceptuales

 Entender las bases genéticas de la transmisión hereditaria y la expresión de los

caracteres en animales.
 Reconocer patrones de herencia, predecir el resultado de cruzamientos e inferir el
genotipo a partir del fenotipo.
 Conocer los mecanismos de determinación del sexo y distinguir las diferencias entre
herencia ligada al sexo, influenciada por el sexo o limitada al sexo.
 Conocer cómo se organiza, se expresa y regula la información genética.
 Reconocer que la realización e interpretación de los árboles genealógicos o pedigríes
es una herramienta necesaria para el estudio y diagnóstico de enfermedades de origen
genético.
 Conceptualizar a las mutaciones como mecanismo de variabilidad genética y como
fuente de variantes alélicas que pueden llegar a constituirse en patogénicas.
 Conocer la importancia de las alteraciones estructurales y numéricas de los
cromosomas.
 Conocer y entender las metodologías que permiten el estudio de cromosomas, genes y
marcadores genéticos a fin de poder interpretar resultados derivados de su análisis.

4|Página
  Interpretar el comportamiento de los genes en poblaciones y comprender el impacto
de la variabilidad genética a lo largo del tiempo.
 Realizar inferencias básicas sobre las fuerzas evolutivas que actúan en una población
para predecir los efectos genéticos que generarán en la población.
 Evaluar la importancia del genotipo y el ambiente en la expresión de caracteres
cuantitativos a fin de comprender el modelo básico del mejoramiento animal (fenotipo=
genotipo + ambiente).
 Entender las bases genéticas que sustentan los procedimientos de selección y
mejoramiento.
 Conocer los avances en biotecnología y genómica animal, y su aplicación en el
mejoramiento animal.
2. 2. Objetivos procedimentales
 Desarrollar habilidades para la interpretación crítica, el análisis y la evaluación de los
fundamentos que sustentan la genética.
 Ejercitar la aplicación práctica de los conocimientos adquiridos a través de la resolución
de problemas y/o situaciones experimentales.
 Mejorar su habilidad comunicativa incorporando la terminología específica de genética
que le permita comunicar de un modo apropiado los conocimientos aprendidos.
 Construir marcos teóricos que permitan la interrelación de los contenidos adquiridos de
la propia asignatura y la integración con conceptos de otras asignaturas y disciplinas.
 Adquirir adiestramiento en el manejo de material e instrumental de laboratorio.
 Lograr el aprendizaje de temas relacionados a la genética mediante el uso de recursos
y herramientas ofrecidas por las TIC transferidas a las prácticas pedagógicas.
3. Objetivos actitudinales

 Participar activamente en espacios de discusión grupal y colaborativa compartiendo

perspectivas, ideas y conocimientos en un contexto de respeto y cooperación frente al
docente y el compañero.
 Promover una fluida comunicación entre el docente y el estudiante.
 Responder en tiempo y de acuerdo a lo solicitado a las actividades propuestas por los
docentes.
 Valorar las implicancias y alcances de la genética en la práctica veterinaria.

5|Página
3. PROGRAMA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

El programa de Trabajos Prácticos de la asignatura abarca actividades prácticas

integradoras (API), actividades prácticas de laboratorio (APL) y de talleres teórico-prácticos
integradores (TPI) como se detalla a continuación:
 Trabajo Práctico N° 1 (API): Material hereditario: transmisión y expresión
(MODALIDAD: Discusión de contenidos y resolución de problemas).
 Trabajo Práctico N° 2 (API): Herencia mendeliana (MODALIDAD: Discusión de
contenidos y resolución de problemas).
 Trabajo Práctico N° 3 (API): Genética del sexo (MODALIDAD: Discusión de
contenidos y resolución de problemas).
 Trabajo Práctico N° 4 (API): Mutaciones (MODALIDAD: Discusión de contenidos y
resolución de problemas).
 Trabajo Práctico N° 5 (APL): Citogenética (MODALIDAD: Práctica de Laboratorio).
 Trabajo Práctico N° 6 (APL): PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
(MODALIDAD: Práctica de Laboratorio). Actividad complementaria: Resolución de
ejercicios sobre PCR.
 Trabajo Práctico N° 7 (API): Genética de poblaciones (MODALIDAD: Discusión de
contenidos y resolución de problemas).
 Trabajo Práctico N° 8 (API): Genética cuantitativa (MODALIDAD: Discusión de
contenidos y resolución de problemas).
Actividades complementarias (TPI):

 “Bioinformática” (MODALIDAD: Taller Teórico-Práctico. Búsqueda de información

biológica. Análisis de datos y/o secuencias con un objetivo determinado. Presentación
de tarea grupal.

 Taller Práctico Integrador (MODALIDAD: Búsqueda de información. Lectura de

artículos científicos. Coloquio. Discusión de contenidos).

4. CRONOGRAMA

FECHA ACTIVIDAD A DESARROLLAR

Teórico:
Jueves 07/03/24
Presentación de la Asignatura.
- Clase Teórica Nº 1: “Bases moleculares de la herencia”

Práctico:
- TP Nº 1: “Material hereditario: transmisión y expresión ”
Jueves 14/03/24
Evaluativo TP1
- Interrogatorio escrito al final del TP1

Teórico:
Jueves 14/03/24 - Clase Teórica Nº 2: “Genética Mendeliana”

6|Página
 Práctico:
- TP Nº 2: “Herencia mendeliana”
Jueves 21/03/24
Evaluativo TP2
- Interrogatorio escrito al final del TP2

Teórico:
Jueves 21/03/24 - Clase Teórica Nº 3: “Genética del sexo”

Práctico:
- TP Nº 3: “Genética del sexo”
Jueves 04/04/24
Evaluativo TP3
- Interrogatorio escrito al final del TP3

Teórico:
Jueves 04/04/24 - Clase Teórica Nº 4: “Mutaciones Génicas”
- Clase Teórica N° 5: “Variaciones Cromosómicas”

Práctico:
- TP Nº 4: “Mutaciones”
Jueves 11/04/24
Evaluativo TP4
- Interrogatorio escrito al final del TP4

Teórico:
Jueves 11/04/24
- Clase Teórica Nº 6: “Genética molecular I”

1º EXAMEN PARCIAL
Se evaluarán los contenidos desarrollados desde la Unidad 1 a la 4
Jueves 18/04/24
(Modalidad escrita y presencial)

Teórico:
Jueves 18/04/24 - Clase Teórica Nº 7: “Genética Molecular II”

- TP Nº 5: “Citogenética”
Jueves 25/04/24
Evaluativo TP5 Interrogatorio escrito al final del TP6

RECUPERATORIO 1º EXAMEN PARCIAL

Jueves 02/05/24 Se evaluarán los contenidos desarrollados desde la Unidad 1 a la 4
(Modalidad escrita y presencial)

Jueves 02/05/24 - Clase Teórica Nº 8: “Biotecnología, Transgénesis y Edición Genética”

- Teórico Práctico (TPI):

Jueves 09/05/24 “Bioinformática”
- Presentación de Tarea grupal

7|Página
 Teórico:
Jueves 09/05/24 - Clase Teórica Nº 9: “Genética de Poblaciones”

- TP Nº 6: “PCR”
Jueves 16/05/24 Evaluativo TP6
- Interrogatorio escrito al final del TP6

Práctico:
Jueves 23/05/24 - TP Nº 7: “Genética de Poblaciones”
Evaluativo TP8
- Interrogatorio escrito al final del TP8
Teórico:
Jueves 23/05/24 - Clase Teórica Nº 10: “Genética Cuantitativa”

Práctico:
- TP Nº 8: “Genética Cuantitativa”
Jueves 30/05/24
Evaluativo TP8
- Interrogatorio escrito al final del TP8

Teórico:
Jueves 30/05/24 - Clase Teórica Nº 11: “Aplicaciones de la Genética en Veterinaria I”

2º EXAMEN PARCIAL
Jueves 06/06/24 Se evaluarán los contenidos desarrollados desde la Unidad 5 a la 4
(Modalidad escrita y presencial)

Jueves 06/06/24 - Clase Teórica Nº 12: “Aplicaciones de la Genética en Veterinaria II”

Jueves 13/06/24 RECUPERATORIO 2° EXAMEN PARCIAL

(Modalidad escrita y presencial)

PRESENTACIÓN DEL TALLER PRÁCTICO INTEGRADOR

Jueves 20/06/24 (visualización de videos y exposición de los trabajos presentados en el
Aula Virtual de la Cátedra).

8|Página
 Trabajo Práctico N° 1
Material hereditario: transmisión y expresión

I. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

II. Objetivos:
 Profundizar los conocimientos aprendidos previamente respecto a la estructura,
composición y propiedades físico-químicas del material hereditario.

 Consolidar el aprendizaje de conceptos básicos en genética y la incorporación de

terminología específica.

 Entender similitudes y diferencias de los procesos de la división celular y reconocer

su importancia en la transmisión de la información genética.

 Aplicar los conocimientos teóricos impartidos en clase a la resolución de ejercicios

y problemas.

III. Contenido Teórico:

Bioquímica de la herencia: el material genético (ADN y ARN). Características y

propiedades del material genético. Replicación del ADN, transcripción y traducción.
Código genético. Cromosoma eucariota: estructura, número y función. El ciclo celular.
División celular: Mitosis y Meiosis. Célula diploide y haploide.

IV. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 1.
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica
Panamericana. 2010. Cap. 2: Pág. 17-35; Cap. 10: Pág. 268-270, 273-280; Cap.
12: Pág. 316-332. Cap. 14: Pág. 369-377. Cap. 15: Pág. 401-412.

V. Actividades a Desarrollar:
Resolución de Ejercicios y Problemas de aplicación

9|Página
Ejercicio 1
En el siguiente gráfico del ciclo celular describa brevemente qué ocurre en cada fase.

Ejercicio 2
Dibuje los cromosomas en las células durante las etapas indicadas.

10 | P á g i n a
Ejercicio 3
Indique si las siguientes frases son verdaderas (V) o falsas (F). En aquellas frases falsas indique
el enunciado correcto.

a) De una célula de 24 cromosomas que se divide por mitosis se obtienen 2 células hijas
con 12 cromosomas cada una.
b) La meiosis se lleva a cabo en todas las células diploides del cuerpo.
c) La segunda etapa de la meiosis es igual a una mitosis de una célula haploide.
d) Durante la meiosis el intercambio genético o crossing over se produce durante la
metafase.
e) De cada espermatogonia diploide 2n=44 en un simio macho, se producen 4
espermatozoides con n= 23 cromosomas.

Ejercicio 4
Una célula en G1 de la interfase posee 8 cromosomas.
¿Cuántos cromosomas y cuántas moléculas de ADN se encontrarán por célula a medida que
esta célula progrese a través de los siguientes estadios?

Fase G2:

Metafase de la mitosis:

Anafase de la mitosis:

Metafase II de la meiosis:

Tener en cuenta las reglas acerca del recuento de cromosomas y molécula de ADN:
a) para determinar el número de cromosomas cuente el número de centrómeros
funcionales
b) para determinar el número de moléculas de ADN cuente las cromátidas

11 | P á g i n a
Ejercicio 5
En la siguiente tabla se presentan los números cromosómicos somáticos de especies de interés
pecuario. Complete la tabla escribiendo los números cromosómicos gaméticos y básicos
correspondientes.

Nombre común Nombre científico 2n n x

Vaca Bos taurus 60

Caballo Equus caballus 64

Perro Canis lupus familiaris 78

Oveja Ovis orientalis aries 54

Conejo Oryctulagus cuniculus 44

Ejercicio 6
Relacione con números el concepto, la definición y en donde ocurre.

Proceso de producir
Replicación del
1 ARNm, a partir de las Núcleo
ADN
instrucciones del ADN.
Comprende el cambio
del “lenguaje” de ácidos
nucleicos (sucesión de
2 Transcripción
bases) al “lenguaje” de
las proteínas (sucesión
de aminoácidos). Citoplasma
La doble hélice se
desdobla, cada mitad
3 Traducción sirve como patrón para
la formación de una
nueva mitad.

12 | P á g i n a
Ejercicio 7
Complete el siguiente esquema de una molécula de ADN especificando lo que se indica con
flechas.

Ejercicio 8
Complete el siguiente cuadro comparativo entre la molécula de ADN y ARN:

Ácidos nucleicos ADN ARN

Azúcar

Bases nitrogenadas

Número de cadenas

Ubicación en la célula

Función

13 | P á g i n a
Ejercicio 9
El siguiente diagrama represente una molécula de ADN durante el proceso de replicación.
Dibuje las cadenas de ADN nuevas e identifique los siguientes elementos:

a) La polaridad de las cadenas nuevas

b) Las cadenas líderes y retrasadas
c) Los fragmentos de Okazaki
d) Los cebadores de ARN
e) Los sitios en donde se posicionan las diferentes enzimas (ARN primasa,
topoisomerasas, helicasas, SSP).

Ejercicio 10
La siguiente secuencia polinucleotídica corresponde a un fragmento del inicio de un gen en
una cepa bacteriana.

3’ CCTGTACAATTCCCGGGCAACACAC 5’

a) Escribe la secuencia de bases del ARNm que se puede sintetizar e indique su polaridad.
Señale dónde inicia la traducción.
b) ¿Cuál es el número máximo de aminoácidos que puede codificar este fragmento?
c) ¿Qué características del código genético se utiliza para determinar el número de
aminoácidos?
d) Si se detectara una variante de la cepa que produjera un polipéptido de cinco aminoácidos
¿cómo podría producirse esta variante?

14 | P á g i n a
Ejercicio 11
Se obtiene una muestra de ADN, se transcribe y se purifica. Se separan entonces las dos hebras
del ADN y se analiza la composición de bases de cada una por separado y del ARNm.
Se obtienen los datos contenidos en la tabla:

¿Qué hebra del ADN es la hebra transcripta que ha servido como molde para la transcripción?

Ejercicio 12
La siguiente secuencia de ADN codifica el ARN en una unidad de transcripción. La cadena
inferior es la cadena molde. Escriba la secuencia de la molécula ARN a partir de este ADN e
indique la polaridad en los extremos del ARN.

5´- ATAGGCGATGCCA-´3

3´- TATCCGCTACGGT-´5

Ejercicio 13
Escribir la secuencia de la molécula de ARNm sintetizada a partir de una cadena de ADN molde
que presente la siguiente secuencia.

3' TACGTACCGTATCATATC 5'

Ejercicio 14
Basándose en el código genético escriba la secuencia del péptido codificado por el siguiente
segmento de ADN.

3' TAC-GTA-CCG-TAT-CAT-ATC 5'

Ejercicio 15
La siguiente secuencia de ARNm codifica un segmento intersticial de un polipéptido.

5' AAUCUAUUCUCUAUUAAAACC 3'

15 | P á g i n a
 a) Determine la secuencia de las dos hebras del fragmento de ADN del que proviene este
ARN
b) Indique la correspondiente secuencia de aminoácidos que se originaria de la
traducción.

Ejercicio 16
En relación con la expresión y cambios en el material hereditario, indique dos diferencias entre
la transcripción de procariotas y eucariotas.

Ejercicio 17
Suponga que está estudiando un gen de E. coli que determina la siguiente proteína. Parte de
su secuencia es:
-Ala-Pro-Trp-Met-Ser-Glu-Lys-

¿Cuál es la secuencia y polaridad de la cadena de ADN, que determina esa parte de la

proteína? Indique solamente una de entre las posibles secuencias.

Ejercicio 18
Dibuje un gen eucariota típico, el Pre-ARNm (transcripto primario) y el ARNm que derivan de
él. Suponga que el gen contiene tres exones. Identifique los siguientes puntos y describa en
forma breve la función de cada uno de ellos:

a) Promotor
b) Sitio de inicio de la transcripción
c) Intrones
d) Exones
e) Casquete 5´
f) Cola de Poli A

16 | P á g i n a
Ejercicio 19
Analice el siguiente esquema e identifique en él los siguientes elementos:

a) Extremos 5´y 3´del ARNm

b) Codón de iniciación
c) Anticodón
d) ARN de transferencia
e) aminoácidos
f) Subunidad mayor ribosómica
g) Subunidad menor ribosómica
h) Secuencia de aminoácidos que se formará

Ejercicio 20
Indique el nombre de los cromosomas teniendo en cuenta la situación del centrómero. Realice
un esquema de cada tipo de cromosoma. Seleccione un tipo de cromosoma y ubique en el
brazo largo de un par homólogo el locus para un gen específico que presenta diferentes alelos
(A, a).

17 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 2
Herencia mendeliana

I. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

II. Objetivos:
 Consolidar el aprendizaje de la terminología genética específica y la interpretación
de conceptos y principios básicos de la transmisión de caracteres por herencia
genética de padres a hijos.
 Predecir los resultados de los cruzamientos genéticos e inferir genotipos a partir
de fenotipos.
 Distinguir y reconocer conceptos relacionados con la extensión del análisis
mendeliano.
 Aplicar los conocimientos teóricos adquiridos de Genética Mendeliana a la
resolución de ejercicios y problemas.

III. Contenido Teórico:

Comportamiento de los cromosomas en la meiosis. Gen, Alelo, Genotipo y Fenotipo.
Concepto de dominancia. Análisis mendeliano: cruzamientos monohíbridos y primera
ley de Mendel; cruzamientos dihíbridos y segunda ley de Mendel. Notaciones, genes y
gametos, cálculos de descendencias y proporciones genotípicas y fenotípicas
esperadas en la progenie (cuadrado de Punnet, método dicotómico). Retrocruza y
Cruzamiento de prueba. Extensiones del análisis mendeliano. Dominancia incompleta.
Codominancia; alelos múltiples, alelos letales. Penetrancia y Expresividad. Interacción
génica: epistasis.

IV. Material de estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 2.
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 3: Pág. 43-60; Cap. 5: Pág. 99-111.

V. Actividades a desarrollar:
Resolución de Ejercicios y Problemas de aplicación

18 | P á g i n a
Ejercicio 1
Complete con el término genético correspondiente.
a) Apariencia o manifestación de una característica:..................................................................
b) Conjunto de alelos que posee un organismo individual:......................................................
c) Una de las dos o más formas alternativas de un gen:............................................................
d) Factor hereditario que ayuda a determinar una característica:............................................
e) Lugar específico ocupado por un alelo en un cromosoma:.................................................
f) Individuo que posee dos alelos iguales en un locus determinado:...................................
g) Individuo que posee dos alelos diferentes en un locus determinado:..............................
h) Atributo o cualidad:..............................................................................................................

Ejercicio 2
Las leyes de Mendel son las reglas básicas para la transmisión de caracteres por herencia
genética de padres a hijos. Indique que postulan el Principio de la segregación y el Principio
de la segregación independiente.

Análisis mendeliano
Ejercicio 3
Una determinada raza de perros nace con cola corta y larga. Este carácter se define por los
alelos de un único gen. El carácter “cola larga” es dominante frente a “cola corta”. Se cruzaron
dos perros de raza pura, una de “cola larga” con otra de “cola corta”. La F1 se cruzó luego
consigo misma y en la F2 se obtuvieron los siguientes fenotipos: ¾ cola larga y ¼ cola corta.
Responda: ¿Cómo será el genotipo de los parentales, de los individuos de la F1 y de los de la
F2?

19 | P á g i n a
Ejercicio 4
El pelaje negro de los cobayos es una característica dominante y el blanco es el rasgo recesivo.
Cuando un cobayo negro puro es cruzado con uno blanco, ¿qué fracción de la F2 se espera
que sea heterocigota?

Ejercicio 5
En los conejos, el color del pelaje es una característica determinada genéticamente con
fenotipo dominante. Algunas hembras negras siempre producen progenie negra, mientras
que otras producen tanto progenie negra como blanca. Plantee los posibles cruzamientos y
explique cómo puede producirse este resultado.

Ejercicio 6
Joe tiene un gato blanco llamado Sam. Cuando Joe cruza a Sam con un gato negro, obtiene
50% de gatitos blancos y 50% de gatitos negros. Cuando se cruzan los gatitos negros entre
ellos todos los gatitos que producen son negros. Sobre la base de estos resultados, ¿llegaría
a la conclusión de que el color del pelaje negro en los gatos es un rasgo recesivo? Explique su
razonamiento planteando los cruzamientos genéticos.

Ejercicio 7
Se han cruzado dos conejillos de India Negros y, a lo largo de varios años, han producido 29
descendientes negros y 9 blancos. Explique este resultado, indicando los gametos y los
genotipos de los parentales y los descendientes.

Ejercicio 8
La raza vacuna Holstein típicamente presenta una coloración blanca y negra. Un detacado
semental blanco y negro llamado “Charly” fue adquirido por un ganadero.Todos los
descendientes engendrados por Charly eran de apariencia normal. Sin embargo, al cruzar
estos entre sí, algunas parejas produjeron descendientes de color rojo y blanco en una
frecuencia total de 25%. “Charly” fue retirado inmediatamente de las listas de sementales de
los criadores de Holstein. Explique lo que sucedió usando símbolos y terminología genética.
¿Fue correcta la decisión adoptada por los granjeros?

Ejercicio 9
El fenotipo pelado de los terrier enanos (rat terriers) americanos es recesivo respecto de la
presencia de pelo. Suponga que usted tiene un terrier enano con pelo. ¿Qué tipo de
cruzamiento debería realizar para determinar si este perro es homocigota o heterocigota para
este fenotipo? Plantee los cruzamientos y prediga los resultados de estos.

20 | P á g i n a
Ejercicio10
Observe la imagen que aparece a continuación mostrando el resultado del cruzamiento de
dos individuos que difieren en dos características (color de pelo y largo de pelo).

a) Represente el cruce de los padres

de estos gatitos.
b) Indique las proporciones
genotípicas y fenotípicas del
cruzamiento ¿Qué característica es
dominante? ¿Cuál es el genotipo del
gato gris de pelo largo y el de los
gatos negros de pelo largo?

B. Extensiones y Modificaciones del Análisis Mendeliano

Ejercicio 11
El color del pelaje de la raza Shorthorn de ganado vacuno representa el ejemplo clásico de
alelos codominantes. El rojo está gobernado por el genotipo CRCR, el roano (mezcla de rojo y
blanco) por CRCW, y el blanco por CWCW. Cuando ejemplares del ganado Shorthorn roanos se
aparean entre sí, ¿Qué proporciones genotípicas y fenotípicas se esperan entre su progenie?

Ejercicio 12
La ausencia de patas en el ganado vacuno (“amputado”) ha sido atribuida a un gen letal
completamente recesivo. Un toro normal es cruzado con una vaca normal y producen un
ternero amputado (generalmente muere al nacer).
a) Los mismos progenitores son apareados otra vez, ¿Cuál es la probabilidad de que le
siguiente ternero sea amputado?
b) ¿Cuál es la probabilidad de que estos progenitores tengan dos terneros, ambos
amputados?

Ejercicio 13
Una serie de alelos múltiples controla la intensidad del color del pelo del ratón; D = color
completo, d = color diluido; dl = es letal en homocigosis. El orden de dominancia es: D > d >

21 | P á g i n a
dl. Indique las proporciones fenotípicas de la descendencia viable. Un ratón de color completo
portador del gen letal es apareado con otro de color diluido también portador del gen letal.
¿Cómo será la descendencia viable?

Ejercicio 14
El color del plumaje de los patos silvestres depende de una serie de tres alelos: MR para patrón
silvestre restringido, M para silvestres y m para silvestre oscuro. La jerarquía de dominancia es
MR>M>m. Determine las proporciones genotípicas y fenotípicas esperadas en la F1 para los
siguientes cruzamientos:
a) MRMR x MRM
b) MRMR x MRm
c) MRM x MRm
d) MRm x Mm
e) Mm x mm

Ejercicio 15
En el perro Labrador Retriever el color del pelo está controlado por la acción de dos genes
con dos alelos cada uno de ellos (B,b y E,e). Los individuos con genotipos B_ presentan color
negro, mientras que los individuos bb tienen color marron. El segundo gen hace que el
pigmento negro o marron producido por el primer gen se deposite en el pelo. Por lo tanto,
mientras que en los individuos E_ el pigmento se deposita en el pelo, en los individuos ee el
pigmento no se deposita en el pelo y estos presentan color dorado.
a) Identificar el tipo de interacción génica que mantiene esos dos genes.
b) Individuos de color negro se cruzaron con razas puras de color dorado y la descendencia
presento composición fenotípica uno negro, uno amarillo y dos dorados ¿Qué genotipo
tenían los parentales?
c) ¿Que composición fenotípica se espera al cruzar los individuos negros de la F1 anterior?

Ejercicio 16
Se requiere determinar la posibilidad de que dos personas con fenotipo AB Rh+ puedan tener
los siguientes descendientes, especificando los posibles genotipos en caso de ser necesario:

a) A Rh+
b) A Rh-
c) 0 Rh+
d) 0 Rh-

22 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 3
Genética del sexo

I. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

II. Objetivos:
● Reconocer los diferentes mecanismos de determinación del sexo.
● Entender los patrones de herencia de caracteres controlados por genes
localizados en cromosomas sexuales.
● Distinguir la diferencia entre caracteres ligados al sexo e influenciados o
limitados por el sexo.
● Aplicar los conceptos teóricos adquiridos a la resolución de problemas.

III. Contenido Teórico:

Mecanismos de determinación del sexo. Sexo homogamético y heterogamético.
Herencia en relación con el sexo: Genes ligados a cromosomas sexuales. Cromatina
sexual: inactivación del cromosoma X y compensación de dosis. Caracteres
influenciados y limitados por el sexo.

IV. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 3.
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 4: Pág. 73-92; Cap. 6: Pág. 134-142.

V. Actividades a Desarrollar:
Resolución de Ejercicios y Problemas de aplicación

23 | P á g i n a
A. Herencia ligada al sexo

Ejercicio 1
Una pareja de perros de la raza Cocker spaniel, cuyos dos miembros poseen visión normal,
tienen un cachorro con atrofia progresiva de retina (APR). Esta enfermedad está vinculada al
cromosoma X en esta raza de perros cuyos síntomas pueden incluir problemas de visión
nocturna, dificultad para adaptarse a cambios de luz, pérdida progresiva de la visión y, en
casos más avanzados, ceguera. Teniendo en cuenta esto, indique:
a) Cuál es el genotipo de los padres
b) Cuál es el sexo y genotipo del cachorro

Ejercicio 2
El daltonismo es una alteración genética que causa dificultad para distinguir los colores y tiene
una herencia ligada al X recesiva. Una mujer de visión normal cuyo padre es daltónico se
casa con un hombre cuya madre era daltónica ¿Qué genotipo tendrá la descendencia de esta
pareja si,

a) son varones
b) son mujeres

Ejercicio 3
Juan y Catalina tienen visión normal de los colores. Después de diez años de estar casada con
Juan, Catalina dio a luz una hija con ceguera para los colores. Juan pidió el divorcio alegando
que él no era el padre de la niña. ¿Es justo el reclamo de Juan acerca de la falsa paternidad?
Explique por qué. Si Catalina hubiera dado a luz a un varón con ceguera para los colores,
¿hubiera sido justificado el reclamo de Juan?

Ejercicio 4
Se han cruzado dos conejillos de Indias y en la descendencia aparecen 52 hembras y 24
machos ¿Qué explicación puede tener esta distribución de sexos basada en las modificaciones
del mendelismo?

Ejercicio 5
En los pollos la calvicie congénita es causada por un gen recesivo ligado al Z. Se aparea un
gallo calvo con una gallina normal. Los F1 de este cruzamiento se cruzan entre sí para producir
la F2. Determine los genotipos y fenotipos, junto con las proporciones esperadas para las
progenies F1 y F2.

24 | P á g i n a
Ejercicio 6
En los organismos con sistema de determinación del sexo ZZ-ZW. ¿De cuál de las siguientes
posibilidades una hembra puede heredar su cromosoma Z?

a) La madre de su madre Sí No

b) El padre de su madre Sí No

c) La madre de su padre Sí No

d) El padre de su padre Sí No

Ejercicio 7
Existe un gen “B” dominante ligado al sexo que produce rayas blancas en el plumaje negro de
los pollos adultos, como se ve en la raza Plymouth Rock. Los pollitos recién nacidos que
posteriormente serán rayados, muestran una mancha blanca en la parte superior de la cabeza.
a) Haga un diagrama hasta la F2 de la cruza entre un macho rayado homocigoto y una
hembra no rayada.
b) Haga un diagrama de la cruza reciproca hasta la F1 entre un macho no barrado
homocigota y una hembra barrada.
c) ¿Servirán ambas cruzas para sexar a los pollitos F1 al momento de eclosionar?

B. Herencia influenciada y limitada por el sexo

Ejercicio 8
Un gen recesivo ligado al sexo produce daltonismo en los seres humanos cuando se
encuentra en condición hemicigota en hombres y homocigota en mujeres. Un gen influido por
el sexo para el patrón de la calvicie es dominante en los hombres y recesivo en las mujeres.
Un hombre heterocigota calvo y daltónico se casa con una mujer no calva con visión normal.
Es importante detallar que la mujer no calva con visión normal, con la que se casa, tiene un
padre que no es calvo pero si daltónico y la madre era no calva con visión normal. Teniendo
en cuenta esto último, plantee los genotipos de los parentales e indique los fenotipos de la
F1.

Ejercicio 9
Al patrón de rayas del plumaje en los pollos lo gobierna un gen dominante ligado al sexo,
el gen “B”. El gen para plumaje de gallo h es recesivo en los machos, y su alelo dominante H
produce plumaje de gallina. Las hembras normales tienen plumaje de gallina. Unas hembras
no rayadas heterocigotas para el locus del plumaje de gallina se cruzan con un macho
rayado con plumaje de gallina, cuyo padre tuvo plumaje de gallo y no era rayado. Plantee
los genotipos involucrados en el cruzamiento y responda: ¿Qué proporción fenotípica se
esperará entre la progenie?

25 | P á g i n a
Ejercicio 10
En la raza Ayrshire de ganado lechero, el color caoba y el blanco dependen de un gen CM que
es dominante en machos y recesivo en hembras. Su alelo para rojo y blanco CR actúa como
dominante en hembras y recesivo en machos.
a) Si un macho rojo y blanco se cruza con una hembra caoba y blanco. ¿Qué
proporción genotípica y fenotípica se espera en la F1 y en la F2
b) Si una vaca caoba y blanca tiene un ternero rojo y blanco, ¿cuál es el sexo de este?
c) ¿Qué genotipo no es posible en el progenitor masculino del ternero del inciso b?

C. Análisis del Pedigrí

Ejercicio 11
En el siguiente pedigrí se muestra la herencia de una pequeña mancha dorsal en cierta
variedad de perdiz silvestre. Indiqué qué tipo de herencia presenta esta característica y
justifique su respuesta.

Ejercicio 12
A qué tipo de herencia podría asociarse el siguiente pedigrí. Explique.

26 | P á g i n a
Ejercicio 13
¿A qué tipo de herencia podría asociarse el siguiente pedigrí? Explique.

Ejercicio 14
A continuación se dan tres genealogías o pedigríes. Considere en cada caso si es o no
consistente con un carácter recesivo ligado al X. Fundamente su respuesta.

27 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 4
Mutaciones

I. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

II. Objetivos:
 Interpretar el concepto de mutación como fuente de variación genética y origen de
una potencial alteración genética.
 Reconocer los diferentes tipos de mutaciones génicas y sus efectos.
 Conocer los mecanismos involucrados en la generación de variación en el número y
el reordenamiento de información genética de los cromosomas y sus consecuencias.
 Aplicar los conceptos teóricos adquiridos a la resolución de problemas.

III. Contenido Teórico:

Mutaciones y variación genética. Mutaciones génicas: definición y clasificación.
Mutaciones espontáneas e inducidas. Mecanismos de reparación del ADN.
Alteraciones cromosómicas estructurales: Deleciones, Duplicaciones, Inversiones,
Translocaciones. Alteraciones en el número de cromosomas: Aneuploidía y Poliploidía.

IV. Material de estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 4.
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 9: Pág. 238-260; Cap. 18: Pág. 472-495.
 Ángel Herráez. Biología Molecular e Ingeniería Genética. 2a edición. Ed. Elsevier. Cap.
23: Pág. 383-398.

V. Actividades a Desarrollar:
Resolución de Ejercicios y Problemas de aplicación

28 | P á g i n a
Ejercicio 1
El siguiente segmento de ARNm codifica un segmento intersticial de un polipéptido:

5´ …..AAU-CUA-UUC-UCU-AUU-AAA-ACC …..3´

Utilizando el código genético:

a) indique la secuencia de aminoácidos codificada por el segmento de ARNm.

b) indique una posible mutación en el tercer codón del ADN que dé lugar a un ARNm que no
origine ninguna alteración en la proteína codificada.
c) indique una posible mutación en el tercer codón del ADN que dé lugar a un ARNm que
origine un cambio de un aminoácido por otro en la proteína codificada.
d) indique una posible mutación en el ADN que dé lugar a un ARNm que origine la
interrupción de la síntesis de la cadena proteica.

Ejercicio 2
Un codón que codifica el aminoácido Glicina (Gly) sufre una sustitución de una base que
genera una mutación sin sentido o terminadora. De acuerdo con el código genético, ¿esta
mutación es una transición o una transversión? ¿En qué posición del codón se produce la
mutación?

Ejercicio 3
En la figura se muestra la secuencia de aminoácidos que forman parte de un polipéptido
codificado por un gen normal, así como los correspondientes segmentos de polipéptidos
codificados por tres mutaciones diferentes de ese gen. ¿Qué tipo de mutación puede haberse
producido en cada caso?

29 | P á g i n a
Ejercicio 4
La siguiente secuencia de nucleótidos se encuentra en la cadena molde del ADN.

3’- TAC TGG CCG TTA GTT GAT ATA ACT -5’
1 24

a) Determine los aminoácidos de la proteína codificada por esta secuencia.

b) Describa la secuencia de aminoácidos alterada de la proteína que se encontrará en cada
una de las mutaciones siguientes.

- Mutante 1: una transición en el nucleótido 11

- Mutante 2: una deleción en el nucleótido 7
- Mutante 3: una transversión T--- A en el nucleótido 15
- Mutante 4: una adición de TGG después del nucleótido 6

Ejercicio 5
Un gen codifica una proteína con la siguiente secuencia de aminoácidos:
Met-Trp-His-Arg-Ala-Ser-Phe

Una mutación de sustitución de base provocó la siguiente secuencia de aminoácidos:

Met-Trp-His-Ser-Ala-Ser-Phe

Una nueva sustitución de bases en la misma secuencia, pero en una posición diferente,
retorno la secuencia de aminoácidos a su estado original.
¿Qué tipo de mutación es? Describa los cambios que se produjeron en el ARN y el ADN.

Ejercicio 6
En bovinos, la doble musculatura o hipertrofia muscular (crecimiento anormal del tejido
muscular) produce un aumento de la masa muscular que se traduce en un mayor rendimiento
en carne pero de menor calidad. Responda las siguientes consignas, teniendo en cuenta los
diferentes fragmentos del gen que codifica para este carácter, representados en cada caso:
1.

a) En las razas Belga Azul y Asturiana se observa una inserción en la hebra 5´-3´de los
nucleótidos A y G luego de la posición 418. Explique el mecanismo que pudo dar origen a
dicha inserción.

30 | P á g i n a
 b) Existe también una mutación en posiciones anteriores a este segmento de ADN, sin
embargo, ésta no produce ningún efecto sobre el fenotipo de los animales. ¿Cómo puede
explicar este hecho?

Ejercicio 7
Responda: ¿Qué tipos de mutaciones cromosómicas
a) aumentan la cantidad de material genético de un cromosoma determinado?
b) aumentan la cantidad de material genético de todos los cromosomas?
c) disminuye la cantidad de material genético de un cromosoma determinado?
d) cambian la posición de las secuencias de ADN en un mismo cromosoma sin cambiar la
cantidad de material genético?
e) mueven el ADN de un cromosoma a un cromosoma no homólogo?

Ejercicio 8
El análogo de base 2-aminopurina (2-AP) sustituye a la adenina durante la replicación del ADN,
pero se puede emparejar con la citosina. El análogo de base 5-bromouracilo (5-BU) sustituye
a la timidina, pero se puede emparejar con la guanina. Siga la secuencia trinucleotídica de
doble cadena que se muestra a continuación durante tres ciclos de replicación. Suponiendo
que en el primer ciclo se encuentran los dos
análogos y que se incorporan donde sea posible.
a) ¿A qué secuencias finales conducen?
b) ¿Qué tipo de mutaciones inducen los
análogos de bases?

31 | P á g i n a
Ejercicio 9
Identifique que tipo de cambios cromosómicos se han producido considerando que las letras
mayúsculas son segmentos de un cromosoma y que el punto representa el centrómero.

Ejercicio 10
Interprete e indique que mutación dio lugar al cromosoma final (los números y las letras son
segmentos de cromosomas no homólogos y el punto indica la posición del centrómero):

Ejercicio 11
En relación con las mutaciones cromosómicas numéricas, identifique e indique a qué tipo de
alteraciones corresponden las siguientes expresiones:

a) 2n-1
b) 2n+1
c) 2n-2
d) 2n+2

Ejercicio 12
El perro tiene en sus células 2n=78 cromosomas. Cuántos cromosomas tiene en caso de:

a) Monosomía
b) Trisomía
c) Tetrasomía
d) Nulisomía
e) Doble Monosomía

32 | P á g i n a
Ejercicio 13
Al analizar la dotación cromosómica de un individuo de una especie en particular se observó
una mutación como se muestra en la figura. ¿En qué consiste esta mutación y cómo se
denomina?

Ejercicio 14
Las figuras A y B representan células en metafase de dos individuos de la misma
especie. El cariotipo de la figura A es normal. El que aparece en la figura B presenta
una mutación cromosómica obtenida tras un tratamiento con rayos X. Se trata de una
translocación recíproca. ¿Qué cromosomas del complemento aparecen afectados por
la mutación? Realice un esquema explicando en qué consiste esta mutación.

33 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 5
Citogenética

I. Modalidad: Actividad Práctica de Laboratorio (APL).

II. Objetivos:
 Reconocer la importancia que poseen las alteraciones cromosómicas en el campo
de la veterinaria.
 Conocer el procedimiento del cultivo de linfocitos de sangre periférica para la
obtención de cariotipos.
 Adquirir conocimientos sobre técnicas de obtención de cromosomas en metafase
para la observación con microscopía óptica.

III. Contenido Teórico:

¿Qué es la citogenética? Objetivos principales de la citogenética. Cariotipo e idiograma.
Morfología de los cromosomas y nomenclatura. Métodos de estudio de los
cromosomas. El cariotipo en diferentes especies. Alteraciones cromosómicas
estructurales. Alteraciones cromosómicas numéricas. Cultivo celular. Cultivo de
linfocitos de sangre periférica.

IV. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 5 (Variaciones
Cromosómicas).
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 9: Pag. 237-260.

V. Actividades a Desarrollar:
 Procesamiento de cultivos de linfocitos y observación al microscopio de
extendido de células en metafase. Preguntas de aplicación.

34 | P á g i n a
Introducción
A comienzos del siglo XX la Citogenética surge como una combinación de
conocimientos entre la Histología y la Genética, teniendo por objeto la observación del
material genético de un organismo que se encuentra organizado en los cromosomas a través
del microscopio en diferentes tejidos, analizando la estructura, el número de los cromosomas
y las implicancias que tienen las diferentes alteraciones en el fenotipo del organismo
estudiado. Por lo tanto, podemos decir que la Citogenética es el campo de la Genética que se
dedica al estudio de los cromosomas y sus anomalías. Los estudios citogenéticos se han
orientado hacia dos objetivos principales: a) la caracterización cromosómica de las distintas
especies y b) la detección de las diferentes alteraciones cromosómicas y sus variadas
manifestaciones clínicas. En este sentido, cabe mencionar, la importancia que poseen las
alteraciones cromosómicas en el campo de la medicina veterinaria. Esta radica en que casi
todas las alteraciones disminuyen la fertilidad de los animales portadores. Esta disminución se
debe a dos causas: 1) reducción o ausencia de gametas viables y 2) mortalidad de los
embriones. Por esta razón, los estudios citogenéticos son requeridos en varios países del
mundo para garantizar la calidad reproductiva de los animales y, además, son un requisito
para la importación de reproductores. Sin embargo, no fue hasta la década del `60 y del `70
que se hizo posible un avance considerable en el campo de la citogenética clínica y
experimental con el advenimiento de las nuevas técnicas de cultivo de linfocitos como una
forma accesible de obtener preparaciones de cromosomas y el desarrollo de técnicas de
bandeo. La posibilidad de observar cromosomas al microscopio óptico permitió verificar no
solo que el número de cromosomas era constante en cada especie, sino que además presentan
una morfología definida.
En bovinos, la caracterización citogenética fue objeto de estudio desde el siglo pasado.
Los primeros trabajos se realizaron sobre material testicular de toro (espermatogénesis). En
1982, Von Bardeleben indica que el número cromosómico en bovinos es 2n=16. Recién,
durante los años 1927 y 1930, Krallinger describe por primera vez el número cromosómico
que hoy caracteriza a esta especie 2n=60 (Bos taurus). El esclarecimiento completo de la
morfología cromosómica de Bos taurus se consolidó una vez que se empezaron a utilizar como
material de estudio los siguientes tipos de tejidos: médula ósea, fibroblastos y linfocitos
quedando establecido el número cromosómico 2n=60. Su cariotipo está constituido por 29
pares acrocéntricos y un par sexual de morfología submetacéntrica con un X de gran tamaño
y un Y pequeño. Estudios citogenéticos comparativos realizados en Bos taurus taurus y Bos
taurus indicus indicaron una morfología acrocéntrica en el cromosoma Y de esta última
subespecie.
Durante la división celular, específicamente durante la metafase, ocurre la máxima
condensación de los cromosomas y son visibles bajo el microscopio. El número y morfología
de los cromosomas, de una célula de una especie en particular son siempre constantes, en la
mayoría de las células de ese organismo. Los citogenetistas utilizan 3 rasgos para identificar
cada uno de los cromosomas: A) el tamaño, B) la posición del centrómero y C) el patrón de

35 | P á g i n a
bandas cromosómicas. Las dos primeras características son determinadas con el uso de
técnicas de coloración convencional (Giemsa), mientras que el patrón de bandas de cada
cromosoma sólo puede observarse mediante la aplicación de protocolos específicos (Fig. 1).

De acuerdo a la posición del centrómero se identifican tres categorías de cromosomas:

a. Metacéntricos: el centrómero está localizado en la parte central del cromosoma de manera
que ambos brazos tienen el mismo tamaño.

b. Submetacéntrico: el centrómero está cercano a uno de los extremos determinando

claramente un brazo corto (p) y un brazo largo (q).
c. Acrocéntrico: El centrómero se ubica muy próximo a uno de los extremos, quedando el
brazo corto muy reducido. Con frecuencia poseen constricciones secundarias en los brazos
cortos, formando tallos y satélites. Los tallos contienen genes que codifican ARN ribosómicos.
d. Telocéntrico: poseen el centrómero ubicado en posición terminal.

El cariotipo es el conjunto de los cromosomas o complemento cromosómico

característico de una persona o especie. El cariotipo también hace referencia al análisis
cromosómico de las células de un individuo. Los resultados de un cariotipo, por lo general,
implican el ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a su tamaño y a la localización del
centrómero (Fig. 2 y 3), y la representación gráfica de los mismos se conoce como ideograma.
Determinar el cariotipo de un individuo, tiene diferentes aplicaciones en la práctica,
dado que nos permite detectar anomalías cromosómicas numéricas y/o estructurales. Sin
embargo, es importante destacar que esta prueba no nos permite conocer si un individuo
presenta alteraciones genéticas “pequeñas” como las mutaciones puntuales o
inserciones/deleciones de unos pocos pares de bases.

36 | P á g i n a
Fig. 2: Cariotipo 46, XY. Cromosomas humano teñidos
con Giemsa. Las letras en mayúscula indican el grupo
al que pertenecen.

Fig. 3: Cariotipo 46, XY. Cromosomas con bandeo

G

37 | P á g i n a
Convencionalmente, los cromosomas humanos se organizan en siete grupos que se designan
con letras y un color particular al análisis con tinción sólida.
1. Grupo A (negro): los cromosomas de mayor tamaño del cariotipo. Incluyen los pares 1, 2
(metacéntricos) y 3 (submetacéntrico)
2. Grupo B (amarillo): pares 4 y 5, submetacéntricos y de morfología muy similar.
3. Grupo C (celeste): pares autosómicos submetacéntricos del 6 al 12. Por su tamaño se
incluye en este grupo al cromosoma X. Así se observan un total de 15 cromosomas en el ♂ y
un total de 16 cromosomas en las ♀.
4. Grupo D (verde): pares 13,14 y 15 acrocéntricos y con satélites en sus brazos cortos.
5. Grupo E (marrón): par 16 metacéntrico, 17 y 18 submetacéntricos.
6. Grupo F (marrón): pares 19 y 20 metacéntricos pequeños.
7. Grupo G (rojo): 21 y 22 acrocéntricos y con satélites. Por su tamaño se incluye en este
grupo al cromosoma Y.

En los animales podemos observar algunas diferencias en los cariotipos dependiendo

de la especie. Hsu y Benirschke (1967 y cols.) han compilado un catálogo ilustrado de los
cariotipos de mamíferos. En la siguiente Tabla podemos observar algunos de ellos resaltando
la gran proporción de cromosomas acrocéntricos que presentan sus cariotipos.

Especie Número diploide Autosomas Cromosomas sexuales

2n= Metacéntricos Acrocéntricos X Y
Gato, Felis catus 38 16 2 M M
Perro, Canis familiaris 78 0 38 M A
Cerdo, Sus scrofa 38 12 6 M M
Cabra, Capra Hircus 60 0 29 A M
Oveja, Ovis aries 54 3 23 A M
Vaca, Bos taurus 60 0 29 M M
Caballo, Equus caballus 64 13 18 M A
Asno, Equus asinus 62 24 6 M A

Uno de los animales más utilizados en investigación, el ratón de laboratorio posee un

juego de cromosomas todos acrocéntricos, 19 pares autosómicos más el par sexual (2n=40),
muy difícil de diferenciar sobre la base de su tamaño (Figura 4). La rata noruega (Rattus
norvegicus) posee 21 pares de cromosomas (2n=42), pero a diferencia del ratón, no son todos
acrocéntricos, sino que muchos de ellos presentan un brazo corto “p” y un brazo largo “q”
(metacéntricos), y se los agrupa en cuatro grupos designados con las letras A-D (Figura 5).

38 | P á g i n a
 Fig. 4. Cariotipo de ratón (Mus musculus)

Fig. 5: Cariotipo rata noruega (Rattus norvegicus)

39 | P á g i n a
 Los cariotipos de las aves difieren notablemente de los de los mamíferos debido a la
presencia de un mecanismo de determinación del sexo ZW. Además de los autosomas
ordinarios, las aves poseen un cierto número de cromosomas muy pequeños conocidos como
microcromosomas. Por ejemplo, el cariotipo de la gallina (2n= 78) consta de 8 pares de
macrocromosomas, junto con los cromosomas sexuales W y Z, y 30 pares de
microcromosomas indistinguibles que generalmente se ordenan arbitrariamente según su
tamaño decreciente. Estos microcromosomas representan aproximadamente un tercio del
genoma de la gallina y se ha demostrado que portan genes importantes.

Metafase de ave: Hembra normal. Se

Metafase de ave: Macho normal.
indican los cromosmas sexuales W y Z.
Se indican los cromosomas
sexuales ZZ.

Bandeo cromosómico
La aplicación de distintos tratamientos pone en evidencia características de la
estructura, organización y composición de los cromosomas, originando una distribución que
recibe el nombre de bandeo cromosómico. El bandeo está compuesto por bandas claras y
oscuras alternadas, que aparecen por toda la longitud del cromosoma luego de ser coloreados
con una tinción. Cada cromosoma presenta un patrón de bandeo único, por lo que es de gran
utilidad para identificar los cromosomas en el cariotipo. Las regiones que se tiñen muy
densamente están compuestas por heterocromatina con un alto grado de compactación,
mientras que las regiones menos teñidas están compuestas de eucromatina, menos compacta,
la cual contiene la mayoría de genes activos.

Tipos de bandeo:
- El bandeo G se ha convertido en el más utilizado y emplea el colorante Giemsa, el cual
colorea regiones del ADN ricas en AT. Esta técnica muchas veces requiere un pretratamiento
de los cromosomas con una enzima proteolítica como la tripsina.

40 | P á g i n a
- El bandeo R requiere el pretratamiento de las células con una solución salina caliente que
desnaturaliza el ADN rico en AT. Luego de este paso, los cromosomas son coloreados con
Giemsa. El bandeo que muestra es el inverso a las bandas G.

- El bandeo C colorea áreas de heterocromatina, que están densamente empaquetadas y

contienen ADN repetido. Los preparados se tratan con álcali moderadamente fuerte (NaOH,
Ba(OH)2) seguido por solución salina caliente y tinción con Giemsa. El tratamiento degrada el
ADN cromosómico y lo extrae selectivamente de las partes eucromáticas del cromosoma,
dejando que las zonas heterocromáticas se tiñan intensamente con Giemsa. El nombre de
bandeo C se debe a que produce bandas constantes que corresponden a regiones de
heterocromatina constitutiva que no se descondensa en interfase, siendo visibles durante todo
el ciclo celular y manteniendo su tamaño constante.

41 | P á g i n a
- El bandeo Q, es producido por coloración con fluorocromos (quinacrina, acridina, DAPI,
cromomicina, etc) y sus derivados, que colorean regiones ricas en AT. Para la observación, es
necesario utilizar microscopio de fluorescencia. - El bandeo NOR (nucleolar organizing región)
es un método que revela las regiones organizadoras nucleolares, sitio del cromosoma donde
se localizan los clusters de genes ribosomales (ADNr). Es una variante del bandeo C.

El alumno debe investigar para el día del Trabajo Práctico.

a) ¿Qué es un cultivo celular? ¿Cómo pueden ser y cuáles serían los componentes
necesarios para lograr un cultivo celular con éxito?
b) ¿Qué es la fitohemaglutinina y para qué se usa?
c) ¿Qué es el colcemid o colchicina? ¿Para qué es utilizada en citogenética?

42 | P á g i n a
Protocolo de trabajo
Material biológico:
Sangre periférica: perro doméstico (Canis familiaris)
Soluciones:

Heparina sódica
Medio de Cultivo (RPMI-1640)
Suero Fetal Bovino
Fitohemaglutinina PHA
Antibioticos (ATB): penicilina.
Colcemid
Solución hipotónica (0,05 % KCL)
Fijador Carnoy: Metanol Absoluto y Ácido acético glacial (3:1)
Colorante Giemsa.
Procedimiento
1) Extraer aprox. 3 ml de sangre periférica con jeringa estéril heparinizada. Luego de la
extracción cambiar la aguja por una nueva.
2) Colocar aprox. 35 gotas de sangre en un erlenmeyer conteniendo 9 ml de Medio de cultivo,
1 ml de SFB, 8 a 10 gotas de PHA y 1 o 2 gotas de ATB.
3) Incubar durante 72 hs. a 37ºC. Agitar suavemente le frasco durante el periodo de incubación.
4) Agregar 4 gotas de Colcemid al cultivo e incubar durante 30 min a 37ºC (10 min.)
5) Transferir las células tratadas con Colcemid a un tubo de 15 ml y centrifugar a 800 rpm
durante 10 min.
6) Descartar el sobrenadante dejando un pequeño resto del mismo.
7) Agregar 7 ml de Solución Hipotónica y homogenizar suavemente.
8) Incubar durante 40 min. A 37ºC con los tubos destapados (20 min.)
9) Pre-fijar las células agregando una gota de fijador Carnoy fresco por ml de Sn Hipotónica.
Aprox. 7 gotas. Homogenizar.
10) Centrifugar a 800 rpm durante 10 min y descartar el sobrenadante.
11) Fijar las células agregando aprox. 6 ml de Fijador Carnoy frío y dejar fijando como mínimo
1 h en heladera.
12) Centrifugar a 800 rpm durante 10 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet
en Fijador Carnoy y volver a centrifugar. Repetir este paso un mínimo de 2 veces.
13) Realizar un goteo de prueba del material sobre un portaobjeto bien limpio y frío. Dejar
secar, teñir con Giemsa y mirar al microscopio.

43 | P á g i n a
Parte Práctica de Laboratorio

1. Debemos preparar el medio de cultivo.

¿Cuáles son los componentes del medio de cultivo para lograr que
las células se dividan?

---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------

2. Luego de 72 h comenzamos la cosecha o procesamiento del cultivo.

¿Qué reactivo se coloca en este momento y qué función cumple?

---------------------------------------------------------------------------------
3. El siguiente paso es ---------------------------------------------------------------------------------
centrifugar, obtener un
---------------------------------------------------------------------------------
pellet o sedimento.
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------

3. El siguiente paso es centrifugar, obtener un pellet o sedimento.

¿Qué solución debemos colocar antes de

gotear el cultivo?

-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
4. Luego de centrifugar nuevamente -------------------------------------------------------
obtenemos un pellet. -------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
-----------------
44 | P á g i n a
 ¿Qué solución debemos colocar antes de gotear el
cultivo?

-----------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------
------------

5. Realizamos los extendidos

----------------------- y -----------------------

6. Finalmente podemos observar al microscopio.

45 | P á g i n a
Arme un cariotipo humano
a) Recorta los cromosomas
b) Ordena los cromosomas según el tamaño y posición del centrómero en el esquema
que se presenta a continuación:

46 | P á g i n a
47 | P á g i n a
En la siguiente imagen se muestra un ejemplar de Muntiacus muntajc y una metafase obtenida
por cultivo de células sanguíneas de un ejemplar de esa especie. Lea la leyenda y observe los
cromosomas detenidamente y luego responda los interrogantes que se presentan a
continuación:

Fenotipo y cariotipo del venado Muntiacus muntjac

Muntiacus muntjac de la India es el mamífero que tiene el menor número de cromosomas,

2n=6. La hembra tiene dos pares de autosomas y un par sexual. Los machos tienen 7
cromosomas
a) Escriba el cariotipo que representa la figura del cuadro superior.
b) Cuantos cromosomas sexuales posee.
c) Indique la morfología de cada par cromosómico.}
d) Indique si pertenece a un macho o a una hembra.

48 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 6
PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
I. Modalidad: Actividad Práctica de Laboratorio (APL)

II. Objetivos:

 Conocer el fundamento de las técnicas de extracción de ADN y ARN.

 Entender el fundamento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
 Analizar las diferencias entre PCR convencional, RT-PCR y PCR cuantitativa.
 Describir las alternativas y variantes de la técnica de PCR.
 Conocer el fundamento de metodologías basadas en la PCR para el estudio de la
variación genética.
 Adquirir conocimientos sobre los diferentes usos y aplicaciones de la técnica en
problemas prácticos

III. Contenido Teórico:

Aislamiento de ácidos nucleicos: fundamento y etapas del proceso. Reacción en cadena

de la polimerasa (PCR): fundamento, etapas, componentes, programa y cinética de la
reacción. Ventajas. Fundamento de la PCR reversa (RT-PCR). Variantes de la técnica de
PCR: PCR múltiple, PCR anidada, AS-PCR. PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR):
Fundamento y sistemas de detección. Metodologías basadas en la PCR para el estudio
de la variación genética: PCR-RFLP, PCR-STR. Usos y aplicaciones de la PCR.

IV. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 7 (Genética

molecular II).
 Guía de Trabajo Práctico

V. Actividades a Desarrollar:

Amplificación de fragmentos de ADN por PCR. Cargar un gel de agarosa y correr una
electroforesis. Interpretación y discusión de resultados. Resolución de Ejercicios.

49 | P á g i n a
GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO
1. AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
1.1. Extracción de ADN
1.1.1. Introducción
La extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico) es un proceso fundamental con una
amplia gama de aplicaciones en investigación y medicina. Estos usos abarcan desde la
secuenciación del ADN hasta la detección de virus y bacterias, así como la exploración de
enfermedades y trastornos de origen genético, entre otros. El ADN se encuentra presente en
todas las células, lo que permite su obtención a partir de una variedad de materiales
biológicos, como tejidos animales, células sanguíneas (donde los leucocitos son una fuente de
ADN), raíces del cabello y células bucales presentes en la saliva, obtenidas mediante un simple
frotamiento en el interior de la mejilla con un hisopo de algodón. La aplicación de diversas
técnicas moleculares comienza con la extracción de ADN, y la obtención de datos confiables
y reproducibles depende en gran medida de la extracción exitosa de ADN íntegro y puro.

1.1.2. Fundamento
El proceso de extracción implica el aislamiento y purificación de las moléculas de ADN,
basándose en sus características fisicoquímicas. El ADN está compuesto por dos cadenas de
nucleótidos que forman una doble hélice, unidas entre sí mediante enlaces fosfodiéster entre
el grupo fosfato y el azúcar, lo que constituye el esqueleto de la molécula. Las bases en las
cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno, manteniendo estable la estructura
helicoidal. Dado que los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, el ADN
tiene una carga neta negativa y es altamente polar, lo que se aprovecha en su extracción.
La extracción se lleva a cabo en un entorno alcalino, que favorece la estabilidad de la
molécula. Los grupos fosfato tienden a repelerse debido a su carga negativa, lo que permite
que el ADN se disuelva en soluciones acuosas y forme una capa hidratante alrededor de la
molécula. Sin embargo, en presencia de isopropanol, esta capa hidratante se rompe y los
grupos fosfato quedan expuestos, lo que permite su precipitación.
Se han desarrollado diversos protocolos con el fin de obtener cantidades y calidad
adecuadas de ADN, así como de garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que
podrían dificultar el tratamiento posterior de la molécula. En general, los protocolos
tradicionales constan de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular,
separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

1.1.3. Pasos para la extracción del ADN

a) Colecta de la muestra
La correcta recolección y manipulación de la muestra son fundamentales para lograr
una extracción exitosa de ADN. Un procedimiento adecuado garantiza la obtención de ADN
intacto y libre de contaminantes, los cuales pueden interferir con la actividad de las enzimas

50 | P á g i n a
durante el análisis del ADN, como en la reacción de PCR. Es crucial tener en cuenta las
consideraciones específicas para cada tipo de tejido.
Para tejidos, se recomienda cortarlos en trozos pequeños para facilitar la maceración,
y opcionalmente congelarlos con nitrógeno líquido. Para el transporte de la muestra, es
aconsejable utilizar un buffer especializado que inactive las endonucleasas, como el RNAlater.
Alternativamente, se puede homogeneizar el tejido en un buffer de lisis que contenga sales
de guanidina o β-mercaptoetanol para inhibir ADNasas y ARNasas. Las muestras deben
almacenarse de acuerdo con el método de recolección utilizado, ya sea en etanol a 4 °C o a -
80 °C si fueron congeladas con nitrógeno líquido.
En el caso de muestras de sangre, se debe utilizar agujas de calibre adecuado y respetar
la proporción muestra/anticoagulante. Es importante homogeneizar correctamente la muestra
para evitar la hemólisis, coagulación y contaminación bacteriana. Durante el transporte, se
deben evitar movimientos bruscos. Las muestras de sangre pueden conservarse por unos días
a 4 °C después de la recolección. Si se congela la muestra a -20 °C, debe descongelarse a
temperatura ambiente y procesarse en su totalidad, ya que una vez descongelada, comienza
la hemólisis. Por lo tanto, se recomienda realizar alícuotas para su almacenamiento.

b) Homogeneización del tejido

La homogeneización, ya sea mecánica o química, implica la ruptura de las uniones entre
las células con el fin de facilitar la interacción con las soluciones de lisis, las cuales ayudan a
liberar el material genético.

c) Lisis celular
Durante el proceso de lisis, las interacciones entre las moléculas que componen la
pared celular, la membrana celular y la membrana nuclear son modificadas o destruidas, lo
que permite la liberación de los ácidos nucleicos. Para lograr esto, se utilizan soluciones
básicas, detergentes o agentes caotrópicos que disuelven la membrana celular, junto con
inhibidores que desactivan las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones de lisis
también contienen EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg2+ e impide la actividad
de las ADNasas. Después de la lisis, los componentes celulares no solubles, como el material
fibroso y las proteínas, se separan del ADN mediante centrifugación.

d) Separación de proteínas y lípidos

En esta etapa, se lleva a cabo la separación del ADN de las proteínas y lípidos. Mediante
el uso de NaCl 6 M, se logra precipitar estos componentes después de una centrifugación
vigorosa. El ADN, por su parte, permanece en el sobrenadante, el cual debe ser transferido
cuidadosamente a otro tubo para los siguientes pasos de extracción.

e) Precipitación del ADN

Para este propósito, se agrega isopropanol, que desestabiliza la capa hidratante
alrededor de la molécula de ADN y expone los grupos fosfato. Esto conduce a que el ADN se
repliegue sobre sí mismo, volviéndose insoluble. Es esencial realizar una centrifugación para

51 | P á g i n a
asegurar que el ADN se deposite en el fondo del tubo mientras que el isopropanol se descarta.
Cualquier residuo de isopropanol se elimina mediante un lavado con etanol al 70%, y el exceso
se elimina por evaporación.

f) Redisolución del ADN

Después de eliminar el etanol, el siguiente paso es hidratar el ADN para mantenerlo en
solución. Si se utiliza agua, el pH debe ser de 7 para permitir la completa redisolución del ADN
y prevenir la hidrólisis ácida. Durante el proceso de disolución del ADN, es crucial evitar el
pipeteo y la agitación agresiva, ya que esto puede fragmentar las moléculas de alto peso
molecular. Una alternativa para evitar la fragmentación es incubar el ADN a 55 °C durante 1 a
2 horas con una agitación suave.

g) Métodos de análisis
g.1) Cuantificación del ADN
Una vez que se ha obtenido el material genético, es crucial determinar su rendimiento
mediante espectrofotometría. La ley de Lambert-Beer establece que la concentración de una
molécula en solución está directamente relacionada con la cantidad de luz absorbida por las
moléculas disueltas. El ADN, como característica distintiva, absorbe luz ultravioleta (UV) a una
longitud de onda de 260 nm, lo que permite estimar su concentración a través de la
espectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en la que se disuelve el ADN es de 1 cm,
la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO). Para el ADN genómico o de doble cadena,
una densidad óptica de 1 equivale a una concentración de 50 μg/ml. Se debe considerar el
factor de dilución para obtener la concentración en ng/μl.

Para evaluar la pureza del ADN, se analiza la relación entre la absorbancia a 260 nm y
280 nm. Una proporción entre 1,8 y 2,0 se considera indicativa de ADN puro, mientras que
proporciones inferiores sugieren la presencia de proteínas. Además, se evalúa la relación
260/230; los valores aceptables se encuentran típicamente en el rango de 2,0 a 2,2. Si la
relación es menor, puede indicar la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol.

g.2) Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis

Además de determinar la cantidad y calidad del ADN mediante espectrofotometría, es
crucial verificar si el ADN obtenido está íntegro. La integridad del ADN se puede evaluar
mediante electroforesis en gel de agarosa, una técnica que implica someter partículas
cargadas a un campo eléctrico para inducir su migración hacia un polo. La electroforesis en
gel de agarosa es especialmente adecuada para analizar la integridad del ADN debido a que
proporciona una matriz abierta, lo que permite la separación de moléculas de mayor tamaño.
En un gel de agarosa, el ADN íntegro generalmente se visualiza como una banda estrecha
cerca del punto de carga del ADN. Por el contrario, si el ADN está fragmentado, se observará
una banda más ancha de lo normal, de más de un centímetro de ancho, o una mancha difusa
en la calle de la muestra. El ADN fragmentado puede dificultar la amplificación de productos
de PCR de alto peso molecular y afectar la reproducibilidad de las técnicas (Figura 2.1).
52 | P á g i n a
h) Almacenamiento del ADN
Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y analizado mediante
electroforesis, una parte de la muestra se puede almacenar a 4 °C para análisis inmediatos,
mientras que el material restante se conserva a -20 °C o -80 °C para su preservación durante
varios meses. En el caso de almacenamiento a largo plazo, es recomendable que el ADN se
mantenga en soluciones con baja concentración de sales para inhibir la acción de ADNasas
contaminantes.

1.2. Extracción de ARN

1.2.1. Introducción
La preservación de la integridad del ARN es crucial para el análisis preciso de la
expresión génica. El éxito de cualquier proceso de extracción de ARN depende en gran medida
de la eliminación completa de cualquier contaminación potencial de ribonucleasas (ARNasas),
que pueden degradar el ARN durante y después del proceso de extracción, lo que resulta en
un rendimiento deficiente. Las ARNasas son enzimas altamente resistentes y poseen una gran
actividad catalítica:

a) Son resistentes al calor, manteniendo su actividad incluso después de un ligero

calentamiento.

b) Son activas en un amplio rango de pH.

c) Usualmente no requieren cofactores para su actividad.

d) Algunas, como las ARNasas pancreáticas, pueden renaturalizarse fácilmente después

de ser tratadas con agentes desnaturalizantes, como la urea.

Es importante tener en cuenta que el contenido de ARN en cualquier tejido es muy

bajo: una célula típica de mamífero contiene aproximadamente 10-5 μg de ARN total, y solo
un 1-5% corresponde a ARNm. Por esta razón, incluso una pequeña contaminación con
ARNasas, ya sea endógena (del propio tejido) o exógena (de los materiales utilizados,

53 | P á g i n a
soluciones, manos, polvo, etc.), puede representar un problema significativo, lo que subraya la
importancia de tomar precauciones adecuadas.

1.2.2. Consideraciones para evitar la degradación de ARN

A diferencia del ADN, el ARN es altamente inestable una vez obtenido debido a la
presencia de ARNasas celulares. Por lo tanto, resulta crítico congelar el tejido u
homogeneizarlo rápidamente en una solución desnaturalizante. Una fuente potencialmente
significativa de contaminación con ARNasas son las manos del operador, ya que
continuamente liberan células epidérmicas. Por lo tanto, es imprescindible el uso de guantes
tanto durante la extracción como al preparar las soluciones. Una vez puestos los guantes, se
deben evitar abrir refrigeradores, tocar picaportes u otras superficies que puedan estar
contaminadas con ribonucleasas, y deben desecharse inmediatamente después de cada
extracción. Por lo general, este proceso se realiza en una cabina de flujo laminar para minimizar
la contaminación, utilizando pipetas exclusivamente destinadas a este fin. Es crucial llevar a
cabo todas las fases del proceso lo más rápidamente posible para eliminar los riesgos de
contaminación. Se debe emplear material de plástico estéril y libre de ARNasas, y si se
prefieren recipientes de vidrio, es necesario calentarlos a 250 ºC durante al menos 24 horas,
ya que incluso el autoclavado no garantiza la inactivación de las enzimas. Todas las soluciones
deben estar libres de ARNasas contaminantes, y esto se logra tratándolas previamente con
DEPC (dietilpirocarbonato). El DEPC es un agente alquilante que reacciona covalentemente de
manera inespecífica con las proteínas, pero es especialmente reactivo con los sitios activos de
las ARNasas, inactivándolas de manera efectiva, aunque no absoluta. Cualquier exceso de
DEPC puede reaccionar con el ARN y, por lo tanto, debe eliminarse autoclavando las soluciones
antes de su uso; de esta manera, el DEPC se descompone en etanol y CO2, que son volátiles.

1.2.3. Fundamento y etapas para la extracción de ARN

a) Homogeneización del tejido y lisis celular
El primer paso en la extracción de ARN implica la disgregación del tejido a estudiar
mediante medios mecánicos, utilizando un homogeneizador de tejidos o Ultraturrax, en
presencia de una solución de lisis conocida como Solución D, o una solución comercial como
TRI Reagent. Aunque los componentes exactos de la solución comercial no son conocidos,
ambas soluciones suelen contener detergentes, como el laurilsarcocinato de sodio, que
ayudan a romper las membranas celulares, y agentes reductores, como el β-mercaptoetanol,
que contribuyen a la desnaturalización proteica mediante la ruptura de puentes disulfuro, que
son característicos de las ARNasas.
Durante la extracción, es crucial prevenir la degradación del ARN desnaturalizando
todas las proteínas celulares, incluyendo las ARNasas. Para ello, se emplean potentes agentes
caotrópicos, como el tiocianato de guanidina. Además, es importante que la solución tenga
un pH ácido (pH 4,5) para que el ADN se retenga selectivamente en la fase orgánica y en la
interfase, mientras que el ARN permanece en la fase acuosa.

54 | P á g i n a
b) Separación de proteínas y lípidos
Después del homogeneizado del tejido y la desnaturalización de las proteínas, el
siguiente paso es aislar físicamente el ARN del resto de los componentes celulares. Una de las
técnicas utilizadas para esta separación es la Extracción Fenólica, también conocida como
extracción en fenol ácido, que se basa en la propiedad de los ácidos nucleicos de ser más
solubles en soluciones acuosas que en solventes orgánicos. Por lo general, el fenol está
presente en la solución comercial utilizada para este fin.
El principio básico de la extracción fenólica es la desproteinización del homogeneizado
celular y la eliminación de los componentes no hidrosolubles mediante una separación de
fases con diferentes niveles de solubilidad. Esto resulta en la formación de dos fases distintas:
una fase orgánica (fenólica) en la parte inferior, que contiene lípidos, proteínas, fragmentos
subcelulares y ADN, y una fase acuosa (menos densa) en la parte superior, que contiene ARN,
debido al pH ácido. Entre estas dos fases, se encuentra una interfase donde se encuentran
principalmente el ADN y las proteínas, debido a su contenido de aminoácidos hidrofóbicos e
hidrofílicos. En esta técnica, el fenol se suele combinar con cloroformo para aumentar la
eficiencia de la extracción: la alta densidad del cloroformo y su capacidad para disolver lípidos
y proteínas ayudan a obtener fases acuosas menos contaminadas.

c) Precipitación del ARN

La transferencia cuidadosa de la fase acuosa a un nuevo tubo es un paso crítico en el
proceso de extracción, ya que se debe evitar la contaminación. Las etapas siguientes están
diseñadas para purificar aún más el ARN mediante precipitaciones a baja temperatura con
alcoholes, como etanol absoluto e isopropanol, seguidas de centrifugaciones secuenciales.
Esto resulta en la formación de un "pellet" cada vez más libre de contaminantes.

d) Redisolución del ARN

La resuspensión de dicho “pellet” debe realizarse en agua estéril libre de ARNasas.

d) Almacenamiento
Existen diversas formas de almacenar el ARN. En términos generales, la solución acuosa
de ARN se mantiene estable a -80ºC durante más de un año sin experimentar degradación.
Sin embargo, el Mg+2 y otros metales pueden catalizar clivajes no específicos en el ARN, por
lo que es recomendable utilizar agentes quelantes para garantizar su almacenamiento íntegro,
como el EDTA libre de ARNasas.

e) Métodos de análisis
e.1) Cuantificación del ARN
La cantidad de ARN extraído puede estimarse mediante espectrofotometría,
determinando la densidad óptica (DO) de las soluciones que contienen ARN a una longitud
de onda de 260 nm. Es importante tener en cuenta que una DO de ARN igual a 1,0 corresponde

55 | P á g i n a
a una concentración de aproximadamente 40 μg/ml. Para evaluar la pureza del ARN, se
considera la relación entre la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Se acepta que una proporción
entre 1,7 y 2,2 indica ARN puro, mientras que proporciones inferiores a este valor sugieren la
presencia de proteínas u otros contaminantes en la muestra.

e.2) Comprobación de la integridad del ARN por electroforesis

La presencia de ARNasas contaminantes en el estudio de expresión génica en un tejido
específico puede resultar en la falla completa del experimento o en conclusiones erróneas
debido a la degradación del ARN durante la electroforesis, lo que dificulta su visualización.
Además, es posible que el ADN contaminante afecte una muestra de ARN extraído, lo que se
manifestaría como una banda de peso molecular mayor, generalmente cerca del punto de
siembra (consulte la Figura 2.2 y la Figura 2.3).

2. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

2.1. Introducción
La Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como PCR (Polymerase Chain
Reaction) en inglés, es una técnica de biología molecular que posibilita la amplificación
considerable del número de copias de una secuencia específica de ADN, mediante replicación
enzimática y prescindiendo del uso de organismos vivos.
La PCR es una técnica in vitro, lo que facilita su aplicación en una amplia variedad de
muestras y su adaptación para llevar a cabo manipulaciones genéticas. Desarrollada por Kary
Mullis en 1985 para la Corporación Cetus, esta técnica le valió el premio Nobel de Química en
1993. La PCR permite obtener rápidamente y de manera eficiente cantidades suficientes de

56 | P á g i n a
una secuencia de ADN determinada, aproximadamente un millón de copias en menos de una
hora, para su posterior análisis molecular.
El uso de la PCR se ha extendido significativamente en diversas áreas de la genética,
medicina y biología en los últimos años, simplificando y ampliando las posibilidades
diagnósticas de la tecnología del ADN recombinante. La PCR posibilita un diagnóstico preciso
de patologías genéticas hereditarias o adquiridas, y facilita la investigación sobre defectos
moleculares aún no definidos. En medicina forense y legal, la aplicación de la PCR marca un
nuevo hito en esta disciplina. Por último, la PCR permite la detección de una amplia variedad
de patógenos responsables de enfermedades infecciosas. La revolución que la PCR ha
generado en el campo de la investigación genética y molecular es comparable a la provocada
por el descubrimiento de las enzimas de restricción y los polimorfismos del ADN.

2.2. Fundamentos
La reacción de PCR se fundamenta en la amplificación de una secuencia de interés
utilizando una ADN polimerasa. Se realiza en varias etapas de reacción a diferentes
temperaturas. La cadena de ADN sintetizada sirve como molde para la síntesis de una nueva
cadena complementaria. Las etapas de la PCR son:

Desnaturalización del ADN molde: Los ciclos de la reacción de PCR comienzan con
una etapa de desnaturalización a una temperatura que oscila entre 94-98 °C durante 15-30
segundos. Previamente a esta primera etapa, se lleva a cabo un calentamiento a temperaturas
de 94-96 °C (o 98 °C si se emplean polimerasas muy termoestables), manteniendo esta
temperatura durante 1 a 9 minutos. Esta etapa, denominada "hold", se realiza con el fin de
garantizar la desnaturalización de los templados y los cebadores, homogeneizar la mezcla de
reacción mediante agitación térmica, inactivar enzimas que puedan interferir en la reacción,
como la transcriptasa reversa, y activar las enzimas empleadas en la técnica de PCR en caliente.
Hibridación de los cebadores (primers) con el molde: Después de la
desnaturalización, sigue la etapa de hibridación o annealing. En esta fase, la temperatura de
reacción se reduce para facilitar la unión de los cebadores al ADN de cadena sencilla. Debido
al movimiento Browniano, los cebadores se mueven alrededor de los templados, y los enlaces
de hidrógeno se forman y rompen constantemente entre los cebadores y los templados.
Cuando la secuencia del cebador coincide exactamente con la del templado, se forma un
fragmento de doble hebra estable, al cual se une la ADN polimerasa para comenzar la síntesis
de la hebra complementaria de ADN. Los cebadores se diseñan de manera que hibriden en
los extremos opuestos de cada hebra de la región de interés, permitiendo que las nuevas
cadenas de ADN sintetizadas se extiendan hacia la posición del cebador en la hebra opuesta.
De esta forma, se generan nuevos sitios de unión a los cebadores en cada cadena de ADN
recién sintetizada. La temperatura a la cual se lleva a cabo esta etapa depende de la
temperatura de fusión (Tm) de los cebadores, que generalmente se encuentra entre 50-64 °C
y se mantiene durante 20-50 segundos.
Síntesis de la nueva hebra de ADN: Después de la etapa de annealing, sigue la etapa
de síntesis, extensión o elongación, en la cual la ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de

57 | P á g i n a
ADN complementarias a las monohebras de ADN molde. La temperatura de esta etapa
depende de la ADN polimerasa utilizada; por ejemplo, la Taq polimerasa tiene una
temperatura óptima de 70-74 ºC, y se fija comúnmente en 72 ºC. Durante esta etapa, los
enlaces de hidrógeno entre el templado y los cebadores extendidos soportan el aumento de
temperatura, mientras que los cebadores que se aparearon con secuencias de ADN moldes
no complementarios se disocian. La ADN polimerasa añade dNTPs, complementarios al
templado, en dirección 5'-3', mientras lee el templado en dirección 3’-5’. El tiempo de
extensión varía según la polimerasa empleada y la longitud del fragmento a amplificar;
generalmente, una ADN polimerasa polimerizará alrededor de 1.000 bases por minuto. Se
suele realizar un paso de extensión durante 5-10 minutos (dependiendo de la longitud
amplificada) después del último ciclo para asegurar la síntesis completa de todas las
monohebras remanentes. Además, es conveniente realizar una última etapa a 4-10 ºC para
conservar la reacción hasta que se almacene adecuadamente.
El resultado de una reacción de PCR es que, al final de n ciclos, la reacción contiene un
máximo teórico de 2n moléculas de ADN de doble cadena que son copias de la secuencia de
ADN comprendida entre los cebadores específicos. Si se realizan 20-30 ciclos del proceso de
PCR señalado anteriormente, se pueden obtener varios millones de copias de la secuencia de
interés. El número de copias depende de la cantidad de ADN templado inicial.

2.3. Componentes de la reacción

La reacción típica de PCR consta de:

- Muestra de ADN
La muestra de ADN puede consistir en 100 ng de ADN genómico, lo que equivale
aproximadamente a 100.000 copias del ADN molde a amplificar. También puede consistir en
ADN obtenido de una única célula, lo que representa solo una a dos copias del ADN,
aproximadamente 5 pg de ADN.

- ADN polimerasa
Existen varios tipos de enzimas ADN polimerasa (ver Tabla 1). Inicialmente, se
empleaba la ADN polimerasa procedente de E. coli. Sin embargo, su actividad disminuye
considerablemente por encima de los 37 °C, y la exposición a las altas temperaturas de
desnaturalización necesarias para separar las dos cadenas de ADN inactiva la enzima tras cada
ciclo de amplificación. Por ello, en la reacción de PCR se utilizan ADN polimerasas
termoestables, aisladas a partir de microorganismos que viven en ambientes de temperaturas
elevadas. La ADN polimerasa del microorganismo Thermus aquaticus (Taq ADN polimerasa)
permite la síntesis del ADN por encima de los 70°C, resistiendo temperaturas de hasta 94°C.
Una desventaja de la Taq polimerasa es que carece de actividad exonucleasa 3'-5', la cual
permite corregir errores durante la síntesis de ADN, lo que puede resultar en un error cada
50.000-100.000 bases incorporadas a 70°C durante la copia del ADN molde. Otras enzimas
termoestables incluyen la Tfl ADN polimerasa obtenida del Thermus flavus, la Vent o Tli

58 | P á g i n a
polimerasa de Thermococcus litorales, la Tth polimerasa de Thermus thermophilus y la Pfu
ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus, esta última con mayor termoestabilidad que la Taq
polimerasa y además presenta actividad exonucleasa 3’ a 5’ que le permite corregir los
nucleótidos incorporados erróneamente. Sin embargo, esta enzima polimeriza el ADN a menor
velocidad que la Taq. Actualmente, existen combinaciones de ambas enzimas que
proporcionan una alta procesividad (alta velocidad de polimerización) y una alta fidelidad. Las
ADN polimerasas utilizadas en la PCR son recombinantes, lo que ha facilitado su obtención y
permite su modificación para mejorar la eficacia y fidelidad de la síntesis.

- Cebadores
Los primers o cebadores son secuencias cortas de ADN de 20 a 30 bases obtenidas por
síntesis, diseñadas específicamente para la amplificación del fragmento de ADN deseado. En
el proceso de diseño de los primers, es fundamental considerar varias consideraciones:

- Es importante que las bases que componen los primers estén distribuidas de manera
homogénea a lo largo de la secuencia, evitando regiones con alta concentración de
polipurinas, polipirimidinas u otras secuencias poco comunes. Se debe procurar que el
contenido de CG sea similar al del fragmento a amplificar.

- Ambos cebadores deben tener una temperatura de melting (Tm) similar. La Tm se

puede calcular utilizando fórmulas específicas, como Tm = (A+T) x 2 + (C+G) x 4, para primers
con más de 20 nucleótidos.

- Se debe evitar la presencia de secuencias que puedan formar estructuras secundarias,

especialmente en el extremo 3' del primer.

- Es conveniente asegurarse de que no existan regiones de complementariedad entre

los primers (entre sí), para evitar la formación de artefactos de amplificación como los "dímeros
de primers". Estos dímeros pueden aparecer como producto de la reacción de PCR,
especialmente cuando se realizan múltiples ciclos de amplificación en muestras con pocas
copias iniciales del material a amplificar. Los dímeros de primers son fragmentos de ADN cuya

59 | P á g i n a
longitud es muy similar a la suma de las longitudes de los dos primers, y su formación ocurre
cuando un primer se "extiende" sobre el otro durante la reacción de PCR.

- Los cebadores se unen a la secuencia complementaria del templado mediante su

extremo OH-3'. Es beneficioso que esta región contenga bases G o C, ya que facilitan la unión.

Cabe destacar que existen programas informáticos diseñados para facilitar el diseño
de primers, ayudando a garantizar la eficiencia y especificidad de la amplificación.

- Buffer de reacción
El buffer de reacción es crucial para proporcionar el pH y la fuerza iónica óptimos que
favorecen la actividad enzimática, la estabilidad de la ADN polimerasa y afectan la cinética de
hibridación y la temperatura de melting (Tm) de los cebadores. Esta solución de buffer
generalmente se encuentra concentrada 10 veces (10X). Los componentes principales de esta
solución incluyen:

- KCl: 500 mM
- Tris-HCl: 100 mM, pH 8.3; o una solución de (NH4)2SO4: 150-200 mM con Tris-HCl: 500-700
mM, pH 9.0
- Triton X-100: 1-2%; o Tween: 0.1%

Es importante diluir este buffer 10 veces antes de su uso para alcanzar la concentración
adecuada.

- Desoxinucleótidos trifosfatos
Los desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) son los componentes básicos utilizados por
la ADN polimerasa para sintetizar las cadenas complementarias al ADN molde durante la
reacción de PCR. Estos dNTPs incluyen:

- Desoxiadenosina trifosfato (dATP)

- Desoxitimidina trifosfato (dTTP)
- Desoxiguanosina trifosfato (dGTP)
- Desoxicitidina trifosfato (dCTP)

Estos nucleótidos se encuentran en forma de trifosfatos, lo que significa que tienen

tres grupos fosfatos unidos a la molécula de desoxirribosa. Durante la síntesis del nuevo ADN,
la ADN polimerasa utiliza estos dNTPs para agregar nucleótidos complementarios a la cadena
molde de ADN, formando así una nueva cadena complementaria.

- Catión divalente
Los iones divalentes empleados en la reacción de PCR son el Mg++ o Mn++. El más
comúnmente utilizado es el magnesio (Mg++) debido a su papel como cofactor de la enzima,
lo que contribuye a mantener su estabilidad y favorece la actividad de la ADN polimerasa. Por
otro lado, el manganeso (Mn++) se emplea en enzimas especiales que requieren este ion,
como aquellas con actividad transcriptasa reversa en su presencia y actividad polimerasa en

60 | P á g i n a
presencia de magnesio. Además, el manganeso puede ser utilizado en reacciones de
mutagénesis mediadas por PCR, ya que concentraciones elevadas de este ion aumentan la
tasa de error durante la síntesis del ADN.

2.4. Diseño de una reacción de PCR

La optimización de la reacción de PCR es fundamental para mejorar su eficiencia,
especificidad y reproducibilidad. Esto implica ajustar la reacción según las características
específicas de cada laboratorio, los pares de cebadores utilizados y el tipo de muestra
analizada. Dado que la PCR tiene una amplia gama de aplicaciones, no existen condiciones
estándar que garanticen el éxito en todas las situaciones. Sin embargo, se pueden considerar
algunos parámetros como referencia para el diseño de la reacción.
La reacción de PCR típicamente se lleva a cabo en un volumen de 25 a 50 μl en un
ciclador térmico programado para alcanzar las temperaturas y ciclos deseados. Un ciclo
habitual incluye una desnaturalización a 94 °C durante 20 segundos, una etapa de hibridación
de los cebadores con el ADN molde a 55 °C durante 20 segundos, y una síntesis a 72 °C durante
30 segundos. Sin embargo, antes de decidir el programa de ciclado, se deben considerar
algunos factores adicionales.
Cuando se trabaja con ADN molde complejo o con un alto contenido de G/C, es
necesario aumentar la temperatura y el tiempo de desnaturalización antes de comenzar con
los ciclos de PCR. La temperatura y el tiempo de hibridación dependen de la longitud,
secuencia y concentración de los cebadores utilizados. La temperatura óptima de hibridación
es aproximadamente 5 °C por debajo de la temperatura de fusión de los cebadores, y si estos
tienen más de 20 pares de bases, se debe aumentar el tiempo de hibridación. La temperatura
de hibridación influye en la especificidad de la reacción, siendo mayor a temperaturas más
altas, lo que reduce la probabilidad de amplificaciones inespecíficas.
El tiempo de extensión a 72 °C varía según la longitud de la secuencia a amplificar,
generalmente alrededor de 1 minuto por cada 1 kb. El número de ciclos se calcula en función
del número de moléculas de partida del ADN molde. Por ejemplo, para 10^5 moléculas de
partida se necesitan entre 25 y 30 ciclos, mientras que para 10^4 se necesitan entre 30 y 35
ciclos, y para 10^3 se necesitan entre 35 y 40 ciclos.
Los aparatos de PCR disponibles en el mercado permiten alcanzar las temperaturas
deseadas a una velocidad de entre 0,3 y 1 °C por segundo, lo que hace que cada ciclo dure
menos de 5 minutos y que el proceso completo de amplificación pueda durar menos de 3
horas.
Respecto a la mezcla de reacción, cada empresa comercializa una enzima polimerasa
con un buffer 10x específicamente desarrollado para esa variedad, por lo que no es
recomendable intercambiar enzimas y buffers. Además, es importante recordar que
concentraciones de NaCl superiores a 50 mM inhiben la actividad de la Taq polimerasa.
La concentración de iones Mg++ puede tener un efecto significativo en la especificidad
y el rendimiento de la amplificación. Generalmente, una concentración de 1,5 mM de MgCl2
es óptima cuando se trabaja con concentraciones de 200 mM de cada desoxinucleótido

61 | P á g i n a
trifosfato (dNTP), aunque pueden ser necesarias cantidades diferentes en algunas
circunstancias. Un exceso de Mg++ (>3,5 mM) puede producir productos de amplificación no
específicos, mientras que una cantidad insuficiente (<0,5 mM) puede reducir el rendimiento
de la amplificación.
Los desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) se utilizan normalmente en concentraciones
equimolares y entre 20 y 200 mM cada uno. Concentraciones más altas pueden resultar en
incorporaciones erróneas por parte de la ADN polimerasa. Si se utilizan nucleótidos marcados,
como dATP-biotinilado o dUTP-digoxigenina, deben estar presentes en una concentración
mayor que el resto de los dNTPs.
La cantidad de cebador utilizada en la amplificación depende de varios factores, pero
generalmente las concentraciones están entre 0,05 y 0,5 mM para cada oligonucleótido.

2.5. Cinética de una reacción de PCR

La reacción de PCR exhibe una cinética de orden dos o cinética sigmoidea, lo que se
refleja en una curva sigmoidal al graficar la cantidad de sustrato en función del número de
ciclos. Esta curva presenta tres fases distintas:

1. Fase inicial: Durante los primeros ciclos, la reacción de PCR no es exponencial, ya que se
están generando fragmentos específicos flanqueados por los cebadores. La síntesis comienza
desde los extremos 3’ hasta detenerse debido al aumento de temperatura hasta el punto de
fusión. Los productos de esta etapa, conocidos como "productos largos", poseen secuencias
de cebadores y se extienden más allá del sitio de unión del segundo cebador. En los ciclos
siguientes, los cebadores hibridan tanto con el ADN original como con los productos largos
generados, lo que conduce a la síntesis de nuevos productos. Sin embargo, la dificultad para
cuantificar la cantidad de producto se debe al "ruido de fondo" generado por los colorantes
empleados para la visualización de los amplicones.

2. Fase exponencial: En esta etapa, los productos de amplificación se acumulan de manera

exponencial a una velocidad constante, siendo los componentes de la reacción en exceso y
los templados el único factor limitante. La cantidad de amplicones generados teóricamente es
igual a 2n (n: número de ciclos), lo que permite mediciones cuantitativas de los genes.

3. Fase de meseta: En esta fase, los componentes de la reacción se agotan y la reacción

alcanza una meseta imprevisible. Esto se debe a la pérdida de actividad de la enzima, la
acumulación de pirofosfato resultante de los enlaces fosfodiéster, el consumo de dNTPs y
cebadores, entre otros factores. En esta etapa, la cantidad de producto no varía a lo largo del
tiempo, lo que dificulta la cuantificación o comparación de la expresión de genes.

La cinética de la reacción de PCR es compleja ya que el sustrato es igual al producto, y

tanto la enzima como otros componentes de la reacción, como los dNTPs y Mg++, pueden
ser factores limitantes en diferentes etapas del proceso.
La reacción de PCR es regida por la fórmula:

62 | P á g i n a
 N = n (1 + E)C

Donde n es la cantidad inicial de producto

N es la cantidad final de producto
E es la eficiencia de la amplificación
c es el número de ciclos

Figura 2. Cinética de una reacción de PCR. A. Se representa en una gráfico

semilogarítmico la intensidad de los productos en función del número de ciclos.
1) Fase inicial; 2) Fase exponencial; 3) fase de meseta. B. Fotografía de gel de
agarosa en donde se observa la cantidad de producto formado (Intensidad de
fluorescencia) en cada ciclo de una reacción de PCR.

2.6. Reacción de PCR a partir de ARN (PCR Reversa o RT-PCR)

Uno de los desafíos en biología molecular es la síntesis y clonación de ADN
complementario (ADNc). Se requiere una serie de reacciones enzimáticas para copiar el ARNm
en ADNc de doble cadena y, en algunos casos, modificar sus extremos para la posterior
ligación con un vector y su clonación en bacterias. La PCR acoplada a la transcripción reversa
(RT-PCR) es una variante de la técnica de PCR que permite detectar la presencia de un
transcripto, estimar sus niveles de expresión y clonar productos de ADNc de manera rápida y
eficiente, produciendo una cantidad adecuada de producto.
En la RT-PCR, el material inicial es ARN, pero como la PCR utiliza una ADN polimerasa
dependiente de ADN, se requiere una primera etapa para copiar el ARN a ADNc. Esto se logra
mediante una transcripción reversa del ARN total o del ARNm a ADNc utilizando una
transcriptasa reversa. El ADNc resultante sirve como sustrato en la reacción de PCR utilizando
cebadores específicos.

63 | P á g i n a
 La transcriptasa reversa, una ADN polimerasa dependiente de ARN, se emplea para
sintetizar in vitro la primera hebra de ADNc a partir del ARN como molde. Para garantizar la
reproducibilidad y eficacia de la transcripción, es crucial evaluar la calidad y cantidad del ARN
molde. Para la detección o cuantificación de ARNm, se transcribe el ARN a una sola hebra
utilizando cebadores específicos, oligo-dT (que se unen a la cola poli-A) o cebadores
aleatorios. Por otro lado, para clonar los transcriptos, es necesario sintetizar ambas hebras del
ADNc. En este caso, la transcripción se realiza con cebadores específicos, seguida de la síntesis
de la hebra complementaria catalizada por enzimas como la Taq ADN polimerasa (en la
reacción de PCR) o el fragmento Klenow de E. coli.
La RT-PCR se utiliza para diversos propósitos, como la detección de la presencia de
ARN viral y la expresión génica en muestras biológicas.

2.6.1. Componentes de la reacción de RT-PCR

- Muestra de ARN
El ARN es una molécula lábil y susceptible a la degradación, por lo que es crucial tomar
precauciones durante su manipulación para preservar su integridad. Tanto la integridad como
la cantidad de la muestra son factores críticos que influyen en la eficacia de la transcripción
reversa.
La cantidad de ARN obtenida puede variar según el origen de la muestra, y la presencia
de posibles contaminantes, como la hemoglobina, puede afectarla. Las muestras pueden
consistir en ARN total, ARNm o incluso microARN, y es fundamental evitar la contaminación
con ADN y proteínas, ya que estas pueden generar resultados falsos positivos y contribuir a la
degradación de la muestra.
La concentración de la muestra de ARN puede variar según el método empleado, pero
en general, se puede trabajar con cantidades mínimas de muestra, incluso tan bajas como 0,1
pg para la transcripción reversa. Sin embargo, la cantidad óptima de ARN para este proceso
suele ser alrededor de 2 μg, lo que garantiza una transcripción eficiente con resultados
confiables.

- Transcriptasa reversa.
La transcripción reversa se lleva a cabo utilizando una enzima llamada
retrotranscriptasa, que es una ADN polimerasa dependiente de ARN. Esta enzima viral es
multifuncional, con tres actividades principales: la actividad de ADN polimerasa dependiente
de ARN, una actividad de exorribonucleasa (Rnasa H) y una actividad de ADN polimerasa
dependiente de ADN. En su función natural in vivo, estas actividades combinadas permiten la
transcripción de un genoma viral de ARN monocatenario a ADN bicatenario.
En el mercado, existen varias retrotranscriptasas disponibles, algunas de ellas son
enzimas recombinantes. Entre las más comunes se encuentran la AMV-RT (Avian
Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase), la MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus
Reverse Transcriptase) y la Thermus thermophilus (Tth) ADN polimerasa. La elección de la

64 | P á g i n a
enzima adecuada depende de la aplicación específica del ensayo, ya que cada una tiene sus
propias ventajas y desventajas.
Por ejemplo, la MMLV-RT se utiliza para transcribir ARNm de gran tamaño (>5 kb)
debido a su débil actividad Rnasa H, pero su procesividad es menor, lo que significa que se
necesita una mayor concentración de la enzima para obtener el mismo rendimiento que con
otras retrotranscriptasas. Además, es termolábil, lo que puede ser una desventaja en ciertos
casos.
La AMV, por otro lado, tiene una mayor procesividad que otras enzimas, pero exhibe
una mayor actividad Rnasa H. Sin embargo, su característica de ser termoestable la hace
adecuada para trabajar con ARNm que presentan estructuras secundarias estables.
La Tth es capaz de sintetizar ADN en presencia de Mg++ y ADNc en presencia de
Mn++, y posee actividad exonucleasa 5'-3'. Es termoestable, lo que aumenta la especificidad
de la transcripción reversa y la hace adecuada para trabajar con ARNm que presentan
estructuras secundarias estables. Sin embargo, su tiempo de vida media a 95 °C es menor en
comparación con otras enzimas.
La selección de la retrotranscriptasa adecuada dependerá de la naturaleza de la
muestra y los requisitos específicos del experimento.

- Cebadores
La síntesis de la primera hebra de ADNc se puede llevar a cabo utilizando diferentes
tipos de cebadores, cada uno con sus propias características:

1. Oligo(dT): Estos cebadores son oligonucleótidos complementarios a la cola poli-A presente

en la mayoría de los ARNm. Al hibridarse específicamente con esta región, permiten iniciar la
síntesis de ADNc. Este método es preferido cuando el ARNm no ha sido degradado y se
encuentra en alta concentración.

2. Cebadores al azar (Random Primers): Estos cebadores consisten en hexanucleótidos de

secuencia aleatoria. Al no tener una secuencia específica, pueden hibridar en múltiples sitios
dentro de la molécula de ARN, lo que permite la síntesis de ADNc incluso en ausencia de una
cola poli-A. Este enfoque es útil cuando se trabaja con ARNm que no poseen una cola poli-A
o cuando se requiere una amplificación no selectiva.
3. Cebadores específicos: Estos cebadores están diseñados para hibridar con una secuencia
específica de ARN, generalmente correspondiente a un gen de interés. Para utilizar cebadores
específicos, es necesario conocer previamente la secuencia del gen que se desea
retrotranscribir. Aunque este método ofrece una alta especificidad al permitir estudiar genes
individuales, su principal limitación es que solo se puede analizar un gen a la vez.
La elección del tipo de cebador dependerá de las características del ARN de partida y
de los objetivos específicos del experimento.

65 | P á g i n a
 Figura 3. Esquema del modo de acción de los cebadores empleados
durante la transcripción reversa.

- Buffer de reacción
La composición del buffer puede variar dependiendo del proveedor y del tipo de
enzima que se esté utilizando. Uno de los tampones más comúnmente empleados tiene la
siguiente composición:

- Tris-HCl, pH 8,3: 250 mM

- KCl: 375 mM
- MgCl2: 15 mM
- DTT (ditiotreitol): 50 mM
Este buffer proporciona las condiciones óptimas de pH y fuerza iónica para la actividad
enzimática, estabilidad de la enzima y eficacia de la reacción de PCR. La concentración
específica de cada componente puede variar según las necesidades de la reacción y las
especificaciones del fabricante del kit de PCR utilizado.

- Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)

Se emplea una concentración de 10 mM de cada deoxinucleótido en la reacción de
PCR.

- Catión divalente
Estas enzimas al igual que la ADN polimerasa necesitan de cofactores como el Mg++
o Mn++, pueden ser provistos en el buffer de reacción.

66 | P á g i n a
2.6.2. Diseño de una reacción de RT-PCR
La transcripción reversa debe ser ajustada considerando varios factores, como el tipo
de cebadores utilizados, la calidad y cantidad de la muestra de origen, el propósito del ensayo
(por ejemplo, cuantificación, PCR, diagnóstico clínico, etc.), y el tipo de ciclador térmico
disponible. Este proceso puede llevarse a cabo en uno o dos pasos, es decir, realizar la
transcripción reversa y la amplificación del ADNc en el mismo tubo o en tubos separados.
En el primer caso, se minimiza la manipulación excesiva de la muestra, lo que previene
la contaminación, pero la muestra solo se puede utilizar en ese ensayo. En el segundo caso,
después de la transcripción, se toma una pequeña cantidad del ADNc recién sintetizado y se
procede a su amplificación por PCR, mientras que el resto del ADNc se almacena para futuros
usos.
La temperatura de la reacción varía entre 37 a 50 ºC dependiendo de la enzima
empleada, y esta variable influye en la eficiencia de la reacción. Es fundamental contar con
ARN intacto como molde, ya que incluso trazas de ribonucleasas pueden causar degradación
del ARN, lo que resulta en productos de ADNc más cortos. Además, impurezas como proteínas,
polianiones (heparina), sales, EDTA, etanol, fenol u otros solventes pueden afectar la actividad
y procesividad de la transcriptasa.

2.5. Separación de fragmentos de ADN por electroforesis en geles

Los productos de una amplificación por PCR pueden ser separados mediante
electroforesis en geles. En este proceso, se someten partículas cargadas a un campo eléctrico
para que migren hacia un polo. En el caso del ADN y ARN, que son macromoléculas con carga
negativa, se pueden separar según su peso molecular (determinado por el tamaño del
fragmento) al pasar a través de los poros de un gel. La electroforesis puede llevarse a cabo en
geles de agarosa o de poliacrilamida, siendo estos últimos los de mayor resolución, lo que
permite separar fragmentos con una diferencia de tamaño muy pequeña, incluso de un solo
nucleótido, lo que facilita la detección de pequeñas deleciones. Los geles de agarosa ofrecen
una matriz más abierta, lo que les otorga menor resolución pero los hace más adecuados para
separar moléculas de mayor tamaño.
El procedimiento implica cargar una solución con la mezcla de fragmentos de ADN en
los pocillos ubicados en un extremo del gel. También se puede cargar un marcador de peso
molecular como referencia para estimar el tamaño del ADN de interés. Este marcador consta
de fragmentos de ADN de tamaños conocidos y está disponible comercialmente. El gel de
agarosa se sumerge en una cuba de electroforesis horizontal con una solución buffer
conductora de corriente eléctrica. El voltaje y el tiempo de la corrida pueden ajustarse según
sea necesario.
Para visualizar los fragmentos de ADN en el gel, se utilizan diversos métodos de tinción,
como colorantes fluorescentes que se intercalan entre las bases de las dos cadenas del ADN,
como el bromuro de etidio, Gel Red o SYBR Green. Luego, el gel se observa utilizando un
transiluminador para visualizar las bandas de ADN.

67 | P á g i n a
Electroforesis en gel de agarosa al 2% para observar productos amplificados por PCR. M
(marcador de peso molecular); A, B, C, D y E (productos obtenidos de diferentes muestras):

68 | P á g i n a
Esquema mostrando la preparación de un gel de agarosa:

3. OTROS TIPOS DE PCR

3.1. PCR anidada: La PCR anidada es una variante de la PCR básica que implica el
uso de dos juegos de cebadores. En primer lugar, se lleva a cabo la reacción de PCR utilizando
un juego de cebadores diseñados para amplificar una porción específica de ADN. Luego, en
una segunda reacción, se utiliza un juego de cebadores interno a la secuencia amplificada en
la primera reacción, utilizando como molde el producto de la primera amplificación. Este
enfoque se emplea para aumentar la especificidad de la amplificación de fragmentos del
material genético. Al utilizar un segundo juego de cebadores interno, se reduce la posibilidad
de amplificar productos no deseados, lo que mejora la selectividad y la precisión del método.

3.2. PCR múltiple: La PCR múltiple implica la amplificación simultánea de más de un

fragmento de ADN en una sola reacción. Para lograr esto, se utilizan varios pares de cebadores
diseñados para amplificar diferentes regiones de interés del material genético. Esta técnica
permite obtener información adicional al analizar varios genes o regiones genómicas en una
sola reacción de PCR.

69 | P á g i n a
 Es crucial optimizar la temperatura de hibridación de cada par de cebadores para evitar
interferencias entre ellos. Los cebadores deben ser compatibles, lo que significa que deben
tener características similares como la temperatura de fusión (Tm) y evitar la formación de
heterodímeros debido a regiones de complementariedad. Además, se debe considerar el
tamaño de los productos de amplificación resultantes, que deben ser lo suficientemente
diferentes entre sí para poder distinguir las bandas en un gel de electroforesis.
En la PCR múltiple, los diferentes pares de cebadores compiten por el ADN molde y
otros componentes de la reacción. Esta técnica es útil para estudiar deleciones, mutaciones y
polimorfismos, como los STRs (short tandem repeats).

3.3 AS-PCR; PCR alelo-específica (AS, del inglés allele specific): La PCR alelo-
específica (AS-PCR) es una técnica que permite distinguir las variantes alélicas de un marcador
o detectar mutaciones puntuales utilizando dos cebadores específicos para cada alelo y un
cebador común. Estos cebadores alelo-específicos difieren en una base hacia el extremo 3'. En
cada análisis se realizan dos PCR simultáneas utilizando el mismo ADN molde. En un tubo se
agrega un cebador específico para uno de los alelos junto con el cebador común, mientras
que en el otro tubo se añade el cebador complementario para el otro alelo junto con el mismo
cebador común. Posteriormente, los productos de PCR se someten a electroforesis y se
determina el genotipo del individuo según la presencia o ausencia de las bandas
correspondientes a cada reacción.

3.4. PCR-RFLP: Esta técnica se fundamenta en la detección de polimorfismos en la longitud

de los fragmentos de restricción dentro de una secuencia de ADN específica. Primero, la
secuencia se amplifica mediante PCR y luego se somete a la acción de diversas enzimas de
restricción. En este caso, el análisis suele llevarse a cabo en geles de poliacrilamida.

Esquema mostrando un análisis por PCR-RFLP:

70 | P á g i n a
3.5. ARMS-PCR: Otra adaptación de la técnica combina la amplificación con el análisis. El
sistema de PCR de mutación refractiva y amplificación (ARMS) tiene su utilidad en la
amplificación de secuencias específicas. El razonamiento para esta técnica es que para que la
Taq ADN polimerasa inicie la síntesis debe de haber un perfecto apareamiento entre bases en
el extremo 3' del híbrido cebador- molde. De modo que si existen diferentes alelos del mismo
locus es posible amplificarlos diferencialmente mediante el diseño de cebadores específicos
para cada alelo. Sus extremos 3' serán complementarios a una posición en el molde que tiene
una diferencia específica de base de uno de los alelos. A diferencia de la PCR alelo-específica,
en la que se diseñan cebadores para amplificar selectivamente el alelo mutado o el alelo
normal en una sola reacción de PCR, en la técnica ARMS, se utilizan cebadores específicos para
amplificar selectivamente el alelo mutado y otro par de cebadores para amplificar el alelo
normal, en dos reacciones de PCR separadas. Ambas técnicas proporcionan una manera eficaz
de detectar y genotipar variantes genéticas de interés en muestras de ADN.

3.6. PCR-SRT: El uso de la técnica de PCR se ha ampliado más allá del análisis de genes
estructurales, abarcando también la amplificación de secuencias repetidas conocidas como
microsatélites o STR (repeticiones cortas en tándem). Estas secuencias consisten en
repeticiones consecutivas de 2, 3 o 4 nucleótidos que se distribuyen ampliamente en todo el
genoma. En los loci de microsatélites, las diferencias entre alelos radican en variaciones en el
número de repeticiones.
La técnica de PCR-STR se fundamenta en la amplificación de estas secuencias repetidas
mediante el uso de cebadores adyacentes a la región de interés. Los productos amplificados
se separan luego mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, y las diferentes bandas
se visualizan mediante tinción con nitrato de plata. Alternativamente, las distintas variantes
pueden detectarse utilizando secuenciadores automáticos, empleando cebadores marcados
con fluorescencia. Esta técnica se utiliza para la caracterización genética y el análisis de la
estructura de poblaciones.
3.7. PCR cuantitativa o en tiempo real (del inglés Real Time): El objetivo de la PCR
en tiempo real es detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante
el uso de reporteros fluorescentes. El término en tiempo real se refiere a que la detección de
los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término
cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a
diferencia de la PCR convencional en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar
la secuencia blanco. Es muy utilizada para analizar la expresión de los genes. Además, la
tecnología de PCR en tiempo real se ha aprovechado ampliamente para respaldar el
diagnóstico de enfermedades virales y bacterianas de importancia veterinaria. La primera gran
ventaja de la PCR en tiempo real es su rapidez, puesto que no se necesita ningún proceso
adicional de detección. Otra ventaja muy importante de la PCR a tiempo real es que al utilizar
sistemas cerrados, el riesgo de contaminación disminuye de forma muy importante.
Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya que en el mismo
instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos, cuantitativos, determinación de

71 | P á g i n a
mutaciones, PCR múltiple, etc. Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante
la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado,
simplemente añadiendo unos controles externos de concentraciones conocidas y crecientes
de ADN blanco. Con estos datos se obtiene una curva patrón, de la cual se puede obtener la
concentración inicial de ADN (o ARN). En la PCR en tiempo real se va registrando el incremento
de fluorescencia en cada ciclo, y esta información se refleja gráficamente en curvas de cinética
de la reacción para cada una de las muestras y controles. Esto permite conocer y registrar en
todo momento la cinética de la reacción de amplificación. Los termocicladores para llevar a
cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder
medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se
realice la amplificación.
Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser
de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos.
- Agentes intercalantes. Los agentes intercalantes son fluorocromos que muestran un
aumento significativo en la emisión de fluorescencia cuando se unen al ADN de doble hélice.
Uno de los más comúnmente utilizados en la PCR en tiempo real es el SYBR Green I. Este
fluorocromo permite detectar el incremento de ADN en cada ciclo mediante un aumento
proporcional en la fluorescencia emitida.
El uso de agentes intercalantes presenta varias ventajas. En primer lugar, la
optimización de las condiciones de reacción es relativamente sencilla, lo que facilita su
implementación. Además, este método es más económico en comparación con el uso de
sondas específicas. Sin embargo, una desventaja importante de los agentes intercalantes es
su baja especificidad, lo que puede conducir a resultados menos precisos.
Otro aspecto a considerar es que los agentes intercalantes no permiten la identificación
de polimorfismos en la secuencia diana. Esto significa que, si bien son útiles para cuantificar la
cantidad de ADN amplificado, no ofrecen información sobre posibles variaciones en la
secuencia de ADN.
- Sondas de hibridación específicas. Las sondas de hibridación específicas son fragmentos
de ADN marcados con fluorocromos, uno donador y otro aceptor. Este método se basa en la
transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre ambas moléculas.
Entre las sondas de hibridación específicas más empleadas se encuentran las sondas de
hidrólisis, conocidas también como sondas TaqMan, las sondas Molecular Beacons y las
sondas FRET.
Estas sondas son herramientas eficaces para detectar la presencia de secuencias
complementarias al ADN diana u objetivo. Mediante la detección de la fluorescencia emitida,
se puede inferir la presencia y la cantidad de la secuencia específica de ADN en la muestra.
Este enfoque ofrece una mayor especificidad en comparación con los agentes intercalantes,
ya que se basa en la hibridación específica entre la sonda y el ADN diana.

72 | P á g i n a
Sondas de hidrólisis o TaqMan. Las sondas de hidrólisis son oligonucleótidos que presentan un
fluorocromo donador en el extremo 5', el cual emite fluorescencia cuando es excitado, y un
fluorocromo aceptor en el extremo 3', que absorbe la fluorescencia emitida por el donador.
Para que este proceso ocurra, es necesario que las moléculas donadora y aceptora estén
cercanas en el espacio, y que los espectros de emisión del donador y de absorción del aceptor
se solapen.
Durante la amplificación del ADN diana, la sonda se hibrida con su cadena
complementaria. A medida que la Taq ADN polimerasa sintetiza nueva cadena de ADN,
desplazándose a lo largo de la cadena, hidroliza el extremo libre 5' de la sonda, lo que resulta
en la liberación del fluorocromo donador. Esta liberación separa físicamente al donador y al
aceptor, lo que permite que la fluorescencia emitida por el donador sea detectada por el lector.
De esta manera, la presencia y la cantidad de la secuencia diana de ADN pueden ser
determinadas durante la amplificación.

Mecanismo de acción de las sondas de hidrólisis:

4. USOS Y APLICACIONES DE LA PCR

La PCR tiene una amplia variedad de usos. Se emplea en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas con alta especificidad y sensibilidad, lo que permite detectarlas
antes de que aparezcan los anticuerpos. Además, se utiliza en la detección de enfermedades
hereditarias y prenatales. En el ámbito de las enfermedades monogénicas, la PCR tiene dos
aplicaciones principales: primero, el análisis indirecto de procesos hereditarios mediante el
estudio de polimorfismos asociados a los genes responsables de dichos procesos; segundo, la
detección directa de mutaciones a través de métodos como hibridación, digestión con
enzimas de restricción, secuenciación directa del ADN o simple visualización de fragmentos.
También desempeña un papel importante en la identificación de individuos y en pruebas de
filiación o de paternidad.
73 | P á g i n a
 En el campo agronómico, la PCR tiene aplicaciones cruciales, como la detección de
enfermedades o el análisis de genes relacionados con variables deseables como resistencia o
productividad.
En la investigación, la PCR se utiliza para una variedad de propósitos, incluido el
clonado de genes, la generación de mutaciones puntuales o deleciones, la secuenciación,
estudios de expresión génica, amplificación de secuencias desconocidas, entre otros.

5. RESOLUCIÓN DE EJERCICIOS
5.1 Defina a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
5.2 Observe la figura, ¿Qué componentes de la PCR son los que faltan? ¿Qué sucede si no lo incluimos
en la reacción?

1) cebadores 2) ADN molde 3) ADN polimerasa 4) MgCl2 5) dNTPs

5.3. ¿Cuál es la función de los primers o cebadores?

5.4. Una enfermedad está asociada a la ausencia de actividad de una enzima determinada. En
cada miembro de la familia que se muestra a continuación, se amplificó por PCR el exón 2 del
gen que codifica dicha enzima y se digirió con la enzima de restricción EcoRI, obteniéndose
los siguientes resultados:

74 | P á g i n a
 a) De acuerdo a su criterio ¿Se puede utilizar este marcador como método de
diagnóstico?
b) ¿Qué tipo de enfermedad se describe en el pedigrí?
c) Indique el genotipo de cada individuo analizado.

5.5) Se realizaron estudios de expresión de los receptores Toll-like (TLR2 –TLR3 – TLR4) en tres
muestras diferentes. Se realizó la extracción de ARN total y una RT-PCR. La amplificación del
ARNm de beta-actina, se usa como control para confirmar si la reacción está funcionando y se
han utilizado cantidades similares de ARN total en las tres muestras.

a) ¿Qué puede decir de los resultados obtenidos?

75 | P á g i n a
 b) ¿Qué se sembró en la calle 9?
c) A qué control podrían corresponder las calles 4, 8, 17?
d) Después de analizar la imagen del gel, ¿cuál es la razón por la cual no se observan
bandas en las calles correspondientes a TRL3?

5.6) En un centro de protección de fauna silvestre, han rescatado a un ave psitácida de

cautiverio. Para avanzar en su proceso de recuperación y reproducción, es crucial determinar
su sexo. Sin embargo, la identificación fenotípica no es factible, ya que estas aves no muestran
dimorfismo sexual evidente. Para resolver este interrogante, se procede a aislar una muestra
de ADN y amplificar el gen CHD1 mediante PCR. Este gen está presente tanto en el cromosoma
W como en el Z. Se ha observado que el alelo CHD-Z, proveniente del cromosoma Z, es de
mayor tamaño que el alelo CHD-W derivado del cromosoma W.

a) Luego de evaluar el resultado obtenido ¿Podría confirmar cual es el sexo del ave
rescatada?
b) De acuerdo al resultado de los controles incluidos en la PCR ¿Funcionó correctamente
la reacción?

5.7) La imagen presentada muestra la electroforesis de productos de PCR obtenidos

utilizando los mismos pares de cebadores. Sin embargo, es importante destacar que la calle 5
representa el producto de una PCR realizada a una temperatura de hibridación diferente.

76 | P á g i n a
Indique:
a) ¿A qué corresponde la primera calle?
b) ¿Qué significa que en la banda de la calle 1 se encuentre más arriba que las bandas de las
calles 2 y 4, y a qué puede deberse?
c) ¿Cuáles pueden ser las razones por las que no se observa banda en la calle 3?
d) ¿Qué sucedió en la calle 5? Recuerde que esta corresponde a una PCR con temperatura de
hibridación de los cebadores diferentes.

77 | P á g i n a
6. DESARROLLO DEL TRABAJO DE LABORATORIO
6.1. Evaluación de la presencia de una mutación puntual utilizando la técnica de
PCR.
Objetivo del práctico: Se empleará la técnica de ARMS-PCR (Amplificación Refractaria de la
Mutación) para detectar la presencia de la mutación V617F en el exón 14 del gen JAK2,
utilizando muestras de sangre periférica humana. Para ello, inicialmente, se procede a la
extracción y cuantificación del ADN. La AS-PCR implica el uso de dos pares de cebadores
diseñados para amplificar selectivamente tanto el alelo mutado como el normal, además de
un control interno para verificar la presencia de ADN y la reacción de PCR. Se realizarán
reacciones de PCR separadas para cada alelo, cada una con su propio control interno. Los
cebadores utilizados han sido diseñados específicamente para amplificar fragmentos de 364
pb (control interno) y 203 pb correspondiente al alelo mutado o al normal.

Los cebadores poseen la siguiente secuencia:

JAK2 F/IC: ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG

JAK2 Fmt: AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT

JAK2 Fwt: GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAC

JAK2 R: CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA

78 | P á g i n a
Reacción de PCR
Las reacciones de PCR se realizan en tubos de 0,2 ml de paredes delgadas. En un tubo por
cada reacción medir los siguientes reactivos:
Mezcla de amplificación para alelo mutado:
Taq polimerasa
dNTPs
Mg++
Buffer (medio salino)
Cebador directo de control interno
Cebador directo específico del alelo mutado
Cebador reverso
Muestra de ADN
Volumen final: 20 µl

Mezcla de amplificación para alelo normal:

Taq polimerasa
dNTPs
Mg++
Buffer (medio salino)
Cebador directo de control interno
Cebador reverso
Cebador reverso específico de alelo normal
Muestra de ADN
Volumen final: 20 µl

Etapa de PCR Temperatura Tiempo Nro. de ciclos

Desnaturalización inicial 95°C 3 minutos

Desnaturalización 95°C 45 segundos

Hibridación 58°C 35 segundos

34 ciclos
Extensión 72°C 1 minuto

Extensión final 72°C 10 minutos

Mantenimiento 4°C ∞

Visualización de los productos de PCR

Preparar un gel de agarosa al 1,5% en 20 ml de buffer TAE 1X. Calentar hasta ebullición para
fundir la agarosa. Dejar reposar unos minutos y agregar 1,0 µl del colorante GelRed Gel
Staining cada 10 ml de buffer. Volcar en el soporte y dejar enfriar. Una vez listo el gel, sacar el
peine y colocarlo en la cuba de electroforesis submarina. Sembrar 10 µl de cada reacción en
los pocillos. En la primera calle sembrar 3 µl de marcador de peso molecular, de 100 pb. Correr
el gel a 80 V. Observar en transiluminador. Anotar los resultados obtenidos y discutir en clase
la interpretación de los mismos.

79 | P á g i n a
Orden de siembra Muestra Resultado
Calle 1
Calle 2
Calle 3
Calle 4
Calle 5
Calle 6
Calle 7
Calle 8
Calle 9
Calle 10
Calle 11

80 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 7
Genética de Poblaciones
I. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

II. Objetivos:

 Describir la composición genética de una población a partir de sus frecuencias

genotípicas y alélicas.
 Aplicar los principios de la ley de equilibrio de Hardy-Weinberg para la predicción
de cambios del acervo genético por efecto de fuerzas evolutivas en una población.
 Entender cómo pueden cambiar las frecuencias alélicas la mutación, la migración,
la deriva genética y la selección natural.
 Aplicar conceptos teóricos a la resolución de problemas.

III. Contenido Teórico:

Concepto de población. Estructura genética de una población: frecuencias génicas y

genotípicas. Ley del equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W). Aplicación en la resolución
de problemas. Prueba de chi-cuadrado χ². Fuerzas evolutivas que alteran las
frecuencias alélicas: mutación, migración, selección y deriva genética.

IV. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 9.

 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 25: Pág. 679-701.

V. Actividades a Desarrollar:

Resolución de ejercicios y problemas de aplicación.

81 | P á g i n a
Ejercicio 1
Defina los conceptos de: Población- acervo génico-panmixia.

Ejercicio 2
Escriba la relación matemática que hay entre las frecuencias génicas y genotípicas de una
población en equilibrio.

Ejercicio 3
Los ratones de campo (Microtus ochrogaster) fueron capturados en los campos antiguos del
sur de Indiana y se sometieron a genotipificación para un locus de transferrina. Se registraron
los siguientes números de genotipos:

TeTe = 407 TeTf = 170 TfTf = 17

Calcule las frecuencias genotípicas y génicas del locus de la transferrina para esta población.

Ejercicio 4
En el ganado Shorthorn, se observa un caso de alelos autosómicos codominantes. El genotipo
CrCr se asocia con el color rojo, CrCw con un patrón ruano (una mezcla de rojo y blanco) y CwCw
con el color blanco.

a) Si 108 animales rojos, 48 blancos y 144 ruanos se encuentran en una muestra de ganado
Shorthorn del valle de California, calcule las frecuencias estimadas del alelo Cr y del alelo
Cw en el pool génico de la población.

b) Si ésta población es completamente panmítica, ¿qué frecuencias genotípicas deben

esperarse en la siguiente generación?

Ejercicio 5
La coloración de la lana en las ovejas de la raza Rambouillet está determinada por un alelo
dominante B para la lana blanca y un alelo recesivo b para la lana negra. Supongamos que
en una muestra de 900 ovejas de esta raza en Idaho (EEUU), se encontraron 891 ovejas con
lana blanca y 9 ovejas con lana negra. Se solicita estimar las frecuencias alélicas.

82 | P á g i n a
Ejercicio 6
En una población se observaron los siguientes genotipos:

Genotipos Individuos
observado

HH 40

Hh 45

hh 50

a) Calcule las frecuencias genotípicas y génicas observadas para la población en estudio.

b) Calcule los nº de genotipos esperados si ésta población estaba en equilibrio Hardy-

Weinberg.

c) Mediante el uso de una prueba de Chi cuadrado (X2), determine si la población está en
equilibrio de Hardy- Weinberg.

Ejercicio 7
Se hallaron 3 genotipos (R2R2, R2R3 y R3R3) en un locus que codifica la enzima peroxidasa en
los árboles pino ponderosa que crecen en el Lago Glaciar, Colorado. Los Nº observados de
estos genotipos fueron:

GENOTIPOS Nº OBSERVADO

R2 R2 135

R2 R3 44

R3 R3 11

Total

83 | P á g i n a
Ejercicio 8
Las mutaciones de pérdida de función en un gen del cromosoma 15 de humanos que codifica
una enzima lisosómica son responsables de la enfermedad de Tay-Sachs, la cual ocasiona una
degeneración progresiva del sistema nervioso central. Esta enfermedad se hereda de manera
recesiva autosómica. En la población judía Ashkenazi, aproximadamente 1 de cada 3,600 niños
nacen con esta enfermedad. ¿Qué proporción de individuos en esta población son portadores?

Ejercicio 9
a) Calcule cuál es la frecuencia del heterocigota Aa en una población panmíctica donde la
frecuencia del genotipo recesivo aa es 0,09.

b) Calcule la frecuencia del heterocigota Aa en una población panmíctica en la que la

frecuencia del fenotipo dominante es 0,19.

Para resolver considere que la población se encuentra en equilibrio. Las frecuencia genotípica en el
equilibrio son: p², 2pq y q² las suma es igual a la unidad. También recuerde que p + q = 1

Ejercicio 10
El tipo sanguíneo MN está determinado por dos alelos codominates LM y LN. Se determinó el
grupo sanguíneo de una población de 600 personas con los siguientes resultados: 300 del
tipo MM (LMLM), 240 MN (LMLN), 60 NN (LNLN).

a) Indique si se trata de una población Mendeliana en equilibrio de Hardy-Weinberg.

b) Si fuese así, ¿cuál debería ser el número de personas en cada genotipo en condiciones
de equilibrio?

84 | P á g i n a
 Trabajo Práctico N° 8
Genética Cuantitativa
VI. Modalidad: Actividad Práctica Integradora (API)

VII. Objetivos:

 Entender las diferencias entre caracteres cuantitativos y cualitativos.

 Reconocer la contribución de genotipo y ambiente en la expresión de caracteres
cuantitativos.
 Comprender el concepto de heredabilidad y su importancia en el mejoramiento de
caracteres cuantitativos.
 Aplicar los conceptos aprendidos a la resolución de problemas.
VIII. Contenido Teórico:

Genética Cuantitativa: diferenciación entre caracteres cualitativos y cuantitativos.

Caracteres cuantitativos con variación continua y no continua. Descriptores estadísticos
de los caracteres cuantitativos: media, varianza, desviación estándar, error estándar.
Valor fenotípico, genotípico y desviación ambiental. Varianza fenotípica: definición
conceptual y por fórmulas. Heredabilidad en sentido amplio y en sentido estricto:
definición conceptual y por formulas. Valores. Repetibilidad: definición conceptual y
por formulas. Relación entre heredabilidad y repetibilidad. Correlación entre caracteres.

IX. Material de Estudio:

 Presentación en PowerPoint correspondiente a la Clase Teórica Nº 10.
 Pierce, B. Genética: un enfoque conceptual. 3a edición. Ed. Médica Panamericana.
2010. Cap. 24: Pág. 645-669.

X. Actividades a Desarrollar:

Resolución de ejercicios y problemas de aplicación.

85 | P á g i n a
Ejercicio 1
a) ¿En que difiere un carácter cuantitativo de un carácter cualitativo? Indique cuatro
diferencias entre caracteres cualitativos y caracteres cuantitativos. Especifique ejemplos
de cada uno de los tipos de caracteres.
b) Responda. ¿Por qué las características poligénicas presentan tantos fenotipos?

Ejercicio 2
a) Indique y describa los componentes de la Varianza Fenotípica (VF).
b) Defina que es la Heredabilidad conceptualmente y por fórmulas.

Ejercicio 3
Complete con la palabra correcta:

1) La heredabilidad en sentido amplio equivale al cociente entre…..y la varianza fenotípica.

2) Medida del índice de confiabilidad de una muestra.
3) Tipo de variación de una característica cuantitativa.
4) Resultado del ambiente y el genotipo.
5) Efecto acumulativo de muchos genes.
6) Variabilidad de un grupo de medidas.
7) Componente del Valor Genotípico que considera las relaciones epistáticas.
8) Efecto combinado de todos los factores no genéticos.
9) Tendencia que tiene dos genes o más genes a variar juntos.
10) Característica que presenta solo dos fenotipos y es influida por factores genéticos y
ambientales.
11) Caracteres con alta heredabilidad.
12) Caracteres con mediana-alta heredabilidad.
13) Repetición de la medición de un carácter cuantitativo.
14) Raíz cuadrada de la Varianza.
15) Tipo de heredabilidad de importancia para la selección en la mejora animal.
16) Proporción de la variación de un rasgo que es atribuible a diferencias genéticas en un
ambiente determinado.
17) Parámetros que son necesarios estudiar para un carácter cuantitativo.
18) Tipo de variación de un carácter cualitativo.
19) Componente principal del Valor Genético.
20) Valor que indica la capacidad de transmitir buenos genes a la próxima generación.

86 | P á g i n a
1- -------- G---------
2- E---- ---------
3- --N-----
4- -E------
5- ---T---
6- ---I----
7- ------C----
8- A--------
9- C----------
10- U-----
11- A---------
12- ---------N
13- ----T--------
14- ----I----- ---------
15- --T-----
16- -----A-------
17- --T---------
18- -I------
19- V---- -------
20- ----- -- ---A

87 | P á g i n a
Ejercicio 4
La varianza genética total del peso corporal de 180 días en una población de cerdos es de
112,5 Kg. La varianza debido a efectos de dominancia es de 22,5 Kg. La debida a efectos
epistáticos es de 9 Kg y la varianza ambiental es de 157,5 Kg. ¿Cuál es la heredabilidad
estimada de este rasgo (en sentido estricto)?

Ejercicio 5
Se analiza la variación fenotípica de la producción de leche de un rebaño de ganado lechero
y se obtienen los siguientes componentes de la varianza:

Varianza genética aditiva: 0,4

Varianza genética por dominancia: 0,1
Varianza por interacción génica: 0,2
Varianza ambiental: 0,5
Varianza de interacción genético-ambiente: 0,0

a) ¿Cuál es la heredabilidad en sentido amplio de la producción de leche?

b) ¿Cuál es la heredabilidad en sentido estricto de la producción de leche?

Ejercicio 6
Suponga que la longitud de la oreja humana es influida por múltiples factores genéticos y
ambientales. Suponga además que usted mide la longitud de las orejas en tres grupos de
individuos, a saber, el grupo A constituido por cinco personas no emparentadas, el grupo B
compuesto por cinco hermanos y el grupo C formado por cinco primos hermanos.
a) Si el ambiente de cada grupo es similar, ¿Qué grupo debería tener la varianza
fenotípica más alta? Explique por qué.
b) ¿Es realista suponer que la varianza ambiental de cada grupo es similar?
Explique su respuesta.

88 | P á g i n a
Ejercicio 7
En un estudio hipotético se investigó la cantidad de vitamina A y de colesterol en huevos de
una población grande de gallinas. Se muestran las varianzas calculadas:

Carácter
Varianza Vitamina A Colesterol
VE 96,2 484,6
VA 12,0 192,1
VD 15,3 185,3

a) Calcule la heredabilidad en sentido estricto para ambos caracteres.

b) ¿Cuál de ellos responderá probablemente a la selección?

Ejercicio 8
Un ganadero que tiene que eliminar una de sus vacas después de examinar los datos de la
primera lactación, se encuentra con la duda de que vaca eliminar. Rubí produce por encima
de la media de la población, pero le costó varios servicios quedar preñada. Esmeralda se quedó
gestante con menos servicios, pero da poca leche. La repetibilidad del número de
servicios/concepción es de 0,15 y la repetibilidad para la producción de leche es de 0,5.
Basándonos en esta repetibilidades, ¿con que vaca se quedaría? ¿Por qué?

Ejercicio 9
Se han obtenido mediante cruces endogámicos dos líneas de individuos homocigotos (líneas
puras) de raza ovina Merino que presentan una longitud de fibra de 12 cm y 18 cm. Suponga
que este rasgo está controlado por cinco genes que contribuyen de forma igual y aditiva, y
que la línea de menor longitud es de genotipo aa bb cc dd ee, y la de mayor longitud es AA
BB CC DD EE. Al cruzar ambas líneas ¿Qué valor fenotípico tendrá la F1?

89 | P á g i n a
Ejercicio 10
En una explotación de vacuno de carne se han obtenido los siguientes datos:

Animal Peso nacimiento (kg) Peso sacrificio (kg)

1 60 430
2 70 500
3 68 489
4 62 430
5 65 440
6 75 525
7 60 460
8 65 400
9 62 425
10 63 410

a) Estime la media y la varianza de los datos para cada uno de los caracteres.

b) Analizando los datos, obtiene que los mismos tienen un coeficiente de correlación de 0,78.
¿Cree que el mayor peso de sacrificio esta ocasionado por un incremento en el peso al
nacimiento? ¿Qué tipo de asociación presentan estos dos caracteres?

Ejercicio 11
El granjero cría conejos, y el peso corporal promedio de su población de conejos es de 3 kg.
Luego, el granjero selecciona los 10 conejos más grandes de su población, cuyo peso corporal
promedio es de 4 kg, y los cruza entre ellos. Si la heredabilidad del peso corporal de la
población de conejos es de 0,7, ¿Cuál es el peso esperado entre la descendencia de los conejos
seleccionados?

Ejercicio 12
Un ranchero determina que la cantidad promedio de lana producida por las ovejas de su
rebaño es de 22 kg por año. Con la intención de aumentar la producción del rebaño, el
ranchero selecciona a los cinco machos y a las cinco hembras que producen la mayor cantidad
de lana; cuyos valores promedios de producción es de 30 kg. Cruza estas ovejas seleccionadas
y encuentra que la producción promedio de lana entre la progenie resultante es de 28 kg ¿Cuál
es la heredabilidad en sentido estricto de la producción de lana entre las ovejas del rancho?

90 | P á g i n a
 Taller Teórico-Práctico
Bioinformática
I. Modalidad: Taller Teórico-Práctico de Laboratorio.

II. Objetivos:

 Realizar la búsqueda de información biológica en repositorios de acceso público.

 Interpretar la información presente en bases de datos moleculares y hacer inferencias
a partir de estos datos.
 Identificar secuencias nucleotídicas utilizando herramientas bioinformáticas a fin de
consolidar los conceptos aprendidos.

III. Contenido Teórico:

Bioinformática: concepto y generalidades. Bases de datos biológicas. Aplicaciones

básicas de la bioinformática en las ciencias veterinarias. Análisis de secuencias:
secuencias homólogas, parálogas y ortólogas. Identidad y similitud. Búsqueda y
comparación de secuencias homólogas en bases de datos.

IV. Material de Estudio:

Guía de Trabajo Teórico-Práctico.

V. Actividades a Desarrollar:

Búsqueda de secuencias e interpretación de la información disponible en bases de

datos de secuencias nucleotídicas. Familiarización con el interfaz web del servidor
BLAST del NCBI. Aplicación de criterios para limitar la búsqueda. Reconocimiento de
secuencias: exones, intrones, regiones 5’ y 3’ no traducidas, codones de inicio y de
terminación. Búsqueda de secuencias homólogas utilizando BLAST. Interpretación de
la información obtenida (Score, E-value, identidad, similitud). Análisis molecular de un
defecto genético a través de la identidad de una secuencia de ADN mediante la
comparación de secuencias y la búsqueda de información en base de datos.

91 | P á g i n a
1. Concepto y Generalidades
A fines del año 1977 nació una nueva rama de la ciencia cuando Frederick Sanger y sus
colaboradores dieron a conocer un nuevo método para secuenciar ácidos nucleicos, usando
didesoxinucleótidos para interrumpir la polimerización de las cadenas de ADN y determinar
su secuencia. “El método de Sanger”, como pasó a ser conocido, se convirtió en el método
estándar de la secuenciación del ADN e hizo posible la obtención de los primeros genomas
completos. Diez años después, el editorial del primer número de la revista “Genomics: A new
discipline, a new name, a new journal”, oficializó el nombre Genómica no solo para la revista,
sino también para esa nueva rama de la ciencia. Hoy entendemos por Genómica el conjunto
de conocimientos, técnicas y herramientas para estudiar la estructura, la secuencia, el
funcionamiento, el origen y la evolución de los genomas completos, sus partes y sus
productos–ARN y proteínas. Asimismo, a partir de 2004 surgieron nuevas tecnologías que
permitieron secuenciar ADN de manera más rápida y a un menor costo que el método de
Sanger. Se las llamó segunda generación, NGS (del inglés Next Generation Sequencing), o
secuenciación masiva, porque amplifican y fragmentan el ADN, para luego generar
paralelamente miles de secuencias cortas de cada molécula. Por consiguiente, el volumen de
información depositado en las bases de datos biológicas en las últimas décadas ha crecido
de manera exponencial debido al gran número de proyectos de secuenciación de genomas
completos que se han concluido o que están en marcha. Al mismo tiempo, se han desarrollado
las potentes tecnologías “omicas” (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica,
etc.) que son capaces de aportar gran cantidad de resultados y de tipo global sobre los genes
o proteínas implicados en un determinado estado o proceso celular. Por lo tanto el manejo,
tratamiento y estudio de la información biológica que cada vez es mayor, requiere de la ayuda
de las tecnologías informáticas y computacionales. Es por ello que ha emergido la
Bioinformática y la Biología Molecular Computacional.

La Bioinformática es el campo de la ciencia en la cual la biología, la informática y la

tecnología de la información se fusionan en una sola disciplina. Su labor consiste en
investigar, desarrollar y aplicar herramientas informáticas y computacionales para permitir
y mejorar el manejo de datos biológicos, gracias al uso de herramientas que reúnen,
almacenan, organizan a gran escala, analizan y permiten interpretar estos datos,
fundamentalmente procedente de macromoléculas biológicas.
El principal desafío de la Bioinformática es la racionalización de la masa de información
de secuencias, con vistas no solo a derivar medios más eficaces de almacenamiento de los
datos, sino también a diseñar herramientas más incisivas. Esto surge de la necesidad de
convertir la información de secuencias en conocimiento bioquímico y biofísico, y descifrar las
pistas estructurales, funcionales, y evolutivas codificadas en el lenguaje de las secuencias
biológicas. La sencillez de los métodos de clonado y la accesibilidad a técnicas secuenciación
del ADN de avanzada han generado una gran cantidad de datos de secuencias de nucleótidos;
y esta información es inútil hasta que puedan deducirse las características significativas de las
secuencias. Los posibles patrones son difíciles de detectar, y las secuencias que contienen

92 | P á g i n a
muchas pares de bases resultan de difícil análisis ocular. Por lo que la bioinformática cumple
un importante rol a través del uso de computadoras y el desarrollo de nuevos programas en
el almacenamiento, manejo y acceso de los datos almacenados en diferentes bases de datos
biológicas.

2. Bases de datos
En la actualidad, la Biología de ser una ciencia puramente experimental (con base en el
laboratorio) está siendo transformada en una ciencia de la información; y la información
acumulada no sólo es información genética (secuencias de ADN), sino que también se
almacena información acerca de estructuras tridimensionales de proteínas, expresión de ARN,
interacción entre proteínas, dominios y motivos proteicos, etc. Además es importante remarcar
que cada vez más son los estudios que comienzan con el análisis de bases de datos para luego
formular hipótesis o diseñar experimentos. También, en muchos casos, el trabajo de
laboratorio termina en la acumulación de colecciones masivas de datos que deben luego ser
analizadas.
Una base de datos biológica puede definirse como una colección de datos crudos,
teóricos o experimentales que está organizada y almacenada en sitios electrónicos. Los
contenidos de dicha información deberán ser fácilmente recuperables, manejables, accesibles
y renovables.
Una base de datos simple puede ser un fichero de texto que contiene varias entradas
delimitadas por un formato específico. Por ejemplo, una entrada o registro en una base de
datos de secuencias nucleotídicas puede incluir, además de la secuencia como tal, información
acerca del organismo a partir del cual esta fue aislada, del tipo de molécula y del grupo de
investigación que obtuvo la secuencia, así como las citas de (los) artículo(s) en que se publicó
la investigación original que demandó la obtención de esa secuencia, etc. En el ámbito
biológico las bases de datos suelen clasificarse en primarias o secundarias.
Las bases de datos primarias son los principales depósitos de información; son
aquellas que almacenan secuencias de ácidos nucleicos y proteínas, estructuras de
biomoléculas y perfiles de expresión génica, es decir contienen información obtenida por
trabajo experimental. En este caso la institución receptora organiza la información pero no
añade nada. Ejemplos de bases de datos primarias son EMBL, Genbank, DDBJ, PDB. Mientras
que las bases de datos secundarias almacenan información derivada de las bases de datos
primaria. Contienen información adicional procesada manual o automáticamente y los datos
son revisados, corregidos y se añade información bibliográfica. Ejemplos de bases de datos
secundarias son SWISS-PROT, PFAM, PROSITE, entre otras.
Bases de datos de secuencias genéticas
GenBank: es la base de datos de ADN del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) e incorpora secuencias de fuentes disponibles públicamente,
principalmente envíos directos de autores y de proyectos de secuenciación a gran escala.

93 | P á g i n a
 EMBL: es la base de datos de secuencias nucleotídicas del Instituto Europeo de
Bioinformática, e incluye tanto secuencias enviadas directamente por autores y por grupos de
secuenciación de genomas, como de la literatura científica y las solicitudes de patentes.

DDBJ: es el banco de datos de ADN de Japón. Pueden enviarse secuencias desde

cualquier parte del mundo mediante una herramienta de envió de datos de la web.

Las tres bases de datos actúan en conjunto (constituyen el INSDC -International

Nucleotide Sequence Database Collaboration), y cada uno de los grupos participantes recoge
una fracción del total de datos de secuencias producidas en todo el mundo y todos los
registros nuevos y los actualizados son intercambiados diariamente.

3. Aplicaciones básicas de la bioinformática en las ciencias veterinarias.

Sin duda, la Bioinformática constituye un campo multidisciplinar y transversal que
puede aplicarse en diferentes áreas de las ciencias veterinarias incluyendo la salud y la
producción animal.
La Bioinformática se aplica en el manejo de las secuencias de genomas grandes
utilizándose para ello recursos computacionales específicos. En la actualidad, la Bioinformática
desarrolla software para catalogar, manejar, analizar, comparar y graficar secuencias de ADN,
ARN y proteínas, para que esos datos se conviertan en información con significado biológico.
Se aplica para la comparación y alineamiento de secuencias de ADN en el ensamblado de
fragmentos de ADN de genomas completos y la identificación de genes.
La Bioinformática también se aplica para identificar y mapear variaciones genéticas
(SNPs, inserciones, deleciones y variantes estructurarles) entre individuos y poblaciones para
conocer las bases genéticas de la salud y la enfermedad animal. Un análisis adecuado de la
información genómica es útil para diagnosticar enfermedades de origen genético y variantes
genéticas asociadas a la susceptibilidad o resistencia a infecciones causadas por
microorganismos como así también seleccionar animales. Respecto a este último punto, cabe
mencionar que la integración de la tecnología de marcadores genómicos a la selección y
mejoramiento tradicional ha aumentado la tasa de progreso genético para rasgos de
importancia económica. A partir del genotipado y el análisis derivado de estos datos se
pueden obtener DEPs enriquecidos.
Las aplicaciones descriptas anteriormente se basan en los aspectos estructurales de la
secuencia del ADN. Pero una gran rama de la genómica se dedica a medir la expresión o
transcripción de los genes. La transcriptómica estudia simultáneamente los genes que se
transcriben en un tejido específico, bajo condiciones particulares o durante una etapa del
desarrollo o una condición fisiológica permitiendo hacer comparaciones y sirviendo de puente
entre el estudio del genoma y de su función. Para ello, la Bioinformática proporciona diferentes
recursos y herramientas que permiten analizar, comparar y visualizar datos derivados de la
expresión génica en diferentes condiciones que fueron depositados en bases de datos
biológicas.

94 | P á g i n a
4. Análisis de secuencias genéticas
Antes de describir lo referente al análisis de secuencias es importante tener en cuenta
los conceptos de homología, identidad y similitud, que nos van a permitir comprender
algunos aspectos del análisis de secuencias.
Se dice que dos o más secuencias son homólogas cuando las mismas están
relacionadas por divergencia con un ancestro común. La homología no es una medida de
similitud y no es cuantificable, por lo que es un error decir que "dos secuencias son 80%
homólogas" o que "las secuencia son muy homólogas"; por lo que estas frases no tienen
sentido y deben evitarse. Comprender el significado de homología nos permite entender el
concepto de analogía. Si pensamos que la evolución tiende a conservar la función, y la función
depende directamente de la estructura, más que de la secuencia; entonces la estructura es
más conservada que la secuencia. En muchos casos hay proteínas que comparten
plegamientos pero que no tienen una similitud de secuencia demostrable. Se cree que tales
relaciones son el resultado de la convergencia evolutiva, y podemos decir que tales
plegamientos son análogos. Dentro de lo que es la homología hay que distinguir dos
conceptos importantes: ortología y paralogía. Las secuencias ortólogas son secuencias que
surgieron de la especiación. Por lo tanto las proteínas ortólogas son proteínas que
desempeñan la misma función en especies diferentes (ej. α-tubulina humana y α-tubulina de
levadura).
La secuencias parálogas divergieron por duplicación génica. Por lo tanto podemos
decir que dos proteínas son parálogas si desempeñan distinta función en un mismo organismo
(ej. α- tubulina humana y β-tubulina humana). Otro concepto relacionado con la homología,
es la xenología, la cual se puede definir como el evento que involucra la transferencia
interespecie de material genético (Transferencia horizontal).
La identidad es un concepto cuantificable (se lo expresa en porcentaje) que indica el
número de nucleótidos o aminoácidos que poseen en común dos secuencias en posiciones
alineadas, mientras que en la similitud, se tiene en cuenta las mutaciones conservativas
producidas durante la evolución y se la utiliza en la comparación de secuencias de
aminoácidos.

5. Pasos a seguir en la búsqueda de secuencias homólogas en bases de datos

La comparación de secuencias tanto de nucleótidos como de proteínas, pertenecientes
a organismos similares o diferentes, constituye una importante herramienta en la biología
molecular. De esta manera mediante la búsqueda de similitud entre secuencias se pueden
inferir la función de secuencias nuevas, como así también analizar su relación evolutiva con
otras secuencias.
A continuación, se describen de manera didáctica los pasos para comparar una
secuencia utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del National
Center for Biotechnology Information (NCBI). Este servicio fue diseñado para tomar secuencias
de ácidos nucleicos y proteínas y compararlas contra las bases de datos del NCBI y es uno de
los programas computacionales más frecuentemente utilizados para la búsqueda de
95 | P á g i n a
similaridades de secuencias de ADN y proteínas. Los programas BLAST mejoraron la velocidad
total de búsquedas sin perder sensibilidad (un hecho importante a medida que las bases de
datos continúan creciendo) al descomponer en fragmentos (“palabras”) a las secuencias
problema y las de la base de datos, y buscando correspondencia entre los fragmentos. Por
este motivo, el algoritmo BLAST realiza alineamientos locales de secuencias, lo cual aumenta
la sensibilidad de la búsqueda frente a alineamientos globales.
La búsqueda inicial se hace para una palabra de longitud “W” (por defecto = 3 en el
BlastP) que tiene un puntaje de por lo menos “T” cuando se compara a la secuencia problema
usando una determinada matriz de substitución. Las “palabras” en la base de datos que tengan
el puntaje “T” o mayor que éste son extendidas en ambas direcciones para intentar generar
una alineación con un puntaje que tenga por lo menos el valor umbral “S” o un valor “E” menor
que el del umbral especificado al realizar la búsqueda. El parámetro “T” determina la velocidad
y la sensibilidad de la búsqueda.
Dos parámetros importantes para analizar en la salida que da el programa BLAST son
el Score y el E-value. El Score es el puntaje asignado al alineamiento, mientras que el E-value
es un valor estadístico que indica la probabilidad que el alineamiento se haya producido al
azar. Los scores son clasificados de mayor a menor. Las posiciones en las cuales una letra se
empareja con una falta de información se llaman “gaps”.
Los puntajes de un gap son negativos. Puesto que un simple evento de mutación
puede causar la inserción o cancelación de más de un residuo, con frecuencia, la presencia de
un gap es más significativa que la longitud del mismo. Por lo tanto el gap se penaliza con
rigurosidad, mientras que a cada subsiguiente residuo en el gap se le asigna una penalización
menor. No existe una teoría extensamente aceptada para seleccionar los costes del gap. Es
raramente necesario cambiar valores del gap del valor establecido por defecto en el programa
utilizado.
Es importante destacar que cada alineación debe ser vista por un “ojo humano crítico”
antes de ser validada o aceptada como significativa.

96 | P á g i n a
 Existen varios integrantes en la familia de programas BLAST que pueden seleccionarse
antes de realizar una búsqueda de secuencias similares a la secuencia problema. Los diferentes
programas BLAST se listan en la siguiente Tabla:

1. Así que lo primero en una búsqueda de información de secuencias es ingresar a la página

del Centro Nacional de Información Biotecnológica de los Estados Unidos (NCBI)
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

97 | P á g i n a
2. Una vez situados en la página, ir a la ventana desplegable y seleccionar la base de datos
“Nucleotide”.

3. Realizar la búsqueda de la secuencia del ARNm del gen SLC4A2, ingresando las palabras
“solute carrier family 4 member 2” en el campo de búsqueda.

¿Qué cantidad de secuencias nucleotídicas se han encontrado para su búsqueda?

98 | P á g i n a
4. Los resultados de la búsqueda incluyen secuencias completas del ARNm en cuestión, y otras
secuencias parciales. Para limitar su búsqueda seleccione la base de datos no redundantes
RefSeq que aparece en el lado izquierdo de la pantalla.

RefSeq (Reference Sequence) es una base de datos secundaria del NCBI. Posee una
colección de secuencias de ADN, ARN y proteínas completas, no redundantes y
revisada (sólo tiene una secuencia por gen y organismo), e incluye sólo a los
principales organismos.

¿Qué cantidad de secuencias nucleotídicas se han encontrado con el nuevo parámetro de

búsqueda?

5. En el lado derecho de la pantalla podrá observar un pequeño recuadro donde figuran los
detalles de su búsqueda. Al lado del texto “solute carrier family 4 member 2” observará que
entre corchetes figura el texto All Fields, lo que indica que la búsqueda del término “solute
carrier family 4 member 2” se realiza en todo el texto del registro de la secuencia. Reemplace
All Fields por Title, para limitar la búsqueda del término “solute carrier family 4 member 2”
sólo al título del registro de la secuencia y añada el término “Bos taurus” para especificar la
busquede de datos procedentes de bovinos. Luego presione el botón search.

99 | P á g i n a
Analice los resultados obtenidos:

¿Cuántas secuencias obtiene?

¿Encontró la secuencia que buscaba? Anote el número de acceso.

6. Ingrese al enlace de la secuencia Bos taurus solute carrier family 4 member 2 (SLC4A2),
mRNA

100 | P á g i n a
El registro de la secuencia en GenBank ofrece la siguiente información:

A partir del registro de la secuencia de nucleótidos indique:

¿En qué proceso biológico participa SLC4A2?
¿En qué cromosoma se encuentra el gen?
¿Qué longitud tiene la secuencia del ARNm?
¿Cuántos exones posee la secuencia?
Indique la posición del exón 4 y 8.
¿En qué posición de la secuencia se encuentra el codón de inicio de la traducción y cuál es
su secuencia?
¿En qué posición de la secuencia se encuentra el codón de terminación de la traducción y
cuál es su secuencia?
Registre el número de acceso de la proteína codificada por dicho ARNm.

101 | P á g i n a
7. Realice una búsqueda de secuencias homólogas empleando el algoritmo BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

8. Ingrese al enlace Nucleotide BLAST.

El recuadro Enter Query Sequence proporciona un espacio para cargar la secuencia que se
desea analizar (formato FASTA o número de acceso). Puede limitar el análisis a regiones
específicas de la secuencia indicando su posición en Query subrange. También puede indicar
un título, que aparecerá en la parte superior del informe proporcionado por el programa
BLAST.
El recuadro Choose Search Set permite seleccionar la base de datos y limitar la búsqueda a uno
o más organismos en particular.
El recuadro Program Selection proporciona tres opciones con diferente velocidad y
sensibilidad para optimizar los alineamientos de secuencias de nucleótidos. Megablast es
adecuado para identificar secuencias de interés ya que compara con secuencias
estrechamente relacionadas en las bases de datos. Discontiguous megablast es adecuado para
encontrar secuencias relacionadas en otros organismos. Blast es adecuado para secuencias
cortas.

102 | P á g i n a
9. El resultado del BLAST se divide en varias secciones. La primera sección nos brinda
información general (versión del programa BLAST utilizado, nombre de la base de datos, etc.).
A continuación, aparece una figura donde se observa una barra o rectángulo de color por cada
una de las secuencias similares encontradas. Las barras poseen distintos colores en base a los
puntajes o scores de los alineamientos. Luego se observa una tabla con un resumen de los
resultados (descripción de la secuencia, puntaje o score del alineamiento, porcentaje de
cobertura para el alineamiento, E-value, y porcentaje de identidad entre secuencias). Al final
de la página de resultados se muestran los alineamientos de la secuencia problema (Query)
con las secuencias encontradas en la base de datos (Sbjct).

103 | P á g i n a
104 | P á g i n a
 Score: es un puntaje asignado al alineamiento. Cuantas más coincidencias o “match” haya
entre las secuencias mayor será el score.
E-value: es un valor estadístico que indica la probabilidad que el alineamiento se haya
producido por azar. Cuanto más próximo a cero sea el valor E, más significativo es un
alineamiento (no se produjo por azar).
Identidad: número de bases (o aminoácidos) idénticas que comparten dos secuencias en
posiciones alineadas, normalmente expresado en porcentaje.

Indique a que especies corresponden las tres secuencias que presentan los mayores
porcentajes de identidad con la secuencia analizada.

¿Cuáles son los scores y porcentajes de cobertura para los alineamientos con dichas
secuencias?
11. Diríjase al alineamiento con la secuencia de Ovis aries (oveja).
Indique el número total de bases alineadas, la cantidad de bases coincidentes, el porcentaje
de identidad que ello representa, y el número de gaps para dicho alineamiento.

12. Posteriormente, ingrese a la base de datos “Online Mendelian Inheritance in Animals” de

la Universidad de Sidney (https://omia.org/home/).

Una de las herramientas de gran utilidad para las Ciencias Veterinarias es la base de datos
online OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animal); una base de información de
trastornos genéticos y de características heredables en animales domésticos accesible a
nivel global. La misma fue desarrollada por el Prof. Emérito Frank Nicholas de la
Universidad de Sydney (Australia). A partir de la década de 1970 hubo un importante y
continuo crecimiento de publicaciones científicas relacionadas con mecanismos de
herencia y enfermedades en animales domésticos producto del desarrollo de la
citogenética y genética molecular. Este creciente número de publicaciones motivó a
Nicholas a pensar en una manera de organizar electrónicamente la información que se
venía generando.

105 | P á g i n a
13. En la pestaña de búsqueda ingrese el símbolo del gen analizado “SLC4A2” y presione
search.

14. Ingrese posteriormente haciendo click en el código de acceso del defecto genético en la
base de datos (“OMIA ID”). Indique a que enfermedad de base genética está asociado este
gen, que mutación está involucrada en el defecto, que modo de herencia presenta y describa
brevemente el mecanismo de la enfermedad y que otra especie de mamíferos que podría
presentar el defecto genético.

106 | P á g i n a
Actividad grupal a desarrollar

Usted deberá completar la actividad práctica obligatoria y enviarla como informe a

través del recurso “Tarea” del Aula Virtual de la asignatura hasta las 23:59 hs del día
especificado por la Cátedra, nombrando al archivo como TTPB_Apellidos de los
integrantes del grupo. Por favor en el archivo especificar además Apellido y Nombre
de cada integrante del grupo de trabajo (4-5 integrantes). Si la actividad no fuera
presentada en tiempo y forma se considerará desaprobada.

A) Un ganadero de Salta reporta el nacimiento de terneros con poco pelo o que carecen
totalmente de pelos como se muestra en las siguientes imágenes.

Ante esta característica inusual, recurre a Ud. para poder investigar el defecto en estos
animales. De acuerdo al fenotipo observado, sospecha que se trata de una alteración genética
congénita que cursa con la ausencia de folículos de pelo o desarrollo folicular anormal e
incluso puede estar asociada con defectos en el desarrollo.
Luego de la búsqueda en bibliografía arriba a la conclusión que las queratinas son el
principal componente el folículo piloso por lo que alteraciones en genes que forman esta
familia podrían ser el origen genético del defecto manifestado. En particular, la queratina
KRT71 juega un papel clave en el moldeado del tallo del pelo por lo que puede ser un gen
candidato en la generación de este defecto. Por este motivo, se realizó la extracción de sangre
de un ternero con el defecto, se purificó el ADN y se amplificaron por PCR utilizando cebadores
específicos los diferentes exones del gen KRT71 para luego purificar los amplicones obtenidos
de la reacción de amplificación. Posteriormente, se enviaron los fragmentos de ADN a un
servicio de secuenciación (Macrogen) a fin de obtener su secuencia de nucleótidos. En el
recuadro siguiente se muestra la secuencia de nucleótidos resultante del exón 1:

GTGGGAATTTGCCTTCGTTCCTCCAGCATCCAAGCTCCATCTCCACCAGAAGCATGAGCCGCCAATTCAC
CTGCAAGTCGGGAGCTGCTGCCAAGGGAGGCTTCAGCGGCTGCTCAGCTGTGCTCTCCGGAGGCAGCACA
TCCTCCTACCGGGCAGGAGGCAAAGGGCTCAGCGGGGGCTTCGGAAGTCGGAGCCTTTACAACCTGGGCG
GCGTCCGGAGCATCTCCTTCAATGTGGCCAGCGGCAGTGGGAAGAGTGGAGGTTATGGATTTGGCCGGGG
CCGGGCCAGTGGTTTCGCCGGCAGCATGTTTGGCAGCGTGGCCCTGGGGCCCAACTGTGTGC
CCACCTGGAGGCATCCACCAGGTCACTGTCAATGAGAGCCTCCTGGCCCCCCTCAACGTGGAGCTGGACC
CCGAGATCCAGAAAGTGCGTGCCCAGGAGCGGGAGCAGATCAAGGCTCTGAACAACAAGTTCGCCTCCTT
CATCGACAAG

107 | P á g i n a
A1) Utilizando la ficha de registro de información del ARNm de KRT71 de Bos taurus en la
base de datos GenBank. En base al resultado obtenido complete la siguiente Tabla:

Número de acceso y versión de la secuencia

Tamaño de la secuencia
Número de exones
Cromosoma en donde se localiza el gen

Título del trabajo y revista donde fue publicada

dicha secuencia (más reciente)

A2) Con la información obtenida realice una comparación de secuencias utilizando el

programa Nulceotide Blast o Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), indicando
para la búsqueda en la sección “Choose Search Set”, casillero de “organism”, la palabra Bos
taurus para limitar los alineamientos. Una vez que obtenga el resultado, ingrese en la sección
“Alignments” y analice los alineamientos. Tenga en cuenta que “Query” corresponde a la
secuencia que Ud. ingresó para la comparación y “Sbjct” corresponde a la secuencia presente
en la base de datos. ¿Qué tipo de mutación está involucrada en el defecto? ¿En cuantos
nucleótidos se diferencian?

Score más alto del alineamiento

E-value del alineamiento con mayor Score
Identidad entre las secuencias
Número de gaps del alineamiento

¿Qué variante genética estaría involucrada en el defecto? ¿En cuántos nucleótidos se

diferencian las secuencias?

B) Ingrese a la base de datos OMIA (https://www.omia.org/home/) y el casillero “search”

ingrese el símbolo KRT71. Presione “search”.

B1) Del resultado obtenido, ingrese a la ficha del defecto genético correspondiente a Bos
taurus y complete el siguiente cuadro:

108 | P á g i n a
 Nombre del defecto genético
Código de acceso a OMIA
Gen implicado
Tipo de herencia
Variante genética relacionada al defecto
Raza bovina asociada
Otras especies de animales en las que las
variantes en el gen pueden producir el defecto
genético

*para traducir al español la página web, hacer click con el botón derecho en la pantalla, ir a
“traducir”, seleccionar idioma español y hacer click en “traducir”.

B2) Busque información en el artículo de acceso libre detallado en la ficha de OMIA sobre el
defecto genético encontrado analizando la información de la Tabla 1 del mencionado artículo.

Artículo: Romanenkova, O; Kostyunina, O; Gladyr, E: The molecular bases study of the inherited
diseases for the health maintenance of the beef cattle. Genes (Basel) 12:678, 2021.
(https://www.mdpi.com/2073-4425/12/5/678)

Indique:

a) Nombre de la enfermedad
b) Descripción de los signos clínicos
c) Mutación que la causa
d) Raza productora de carne afectada

109 | P á g i n a
7. BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA BÁSICA (Formato Papel)

AUTOR TÍTULO EDITORIAL LUGAR Y AÑO DE EDICIÓN

Buenos Aires/5° Ed.

Genética, un enfoque Editorial Médica (2016);
Pierce, B.
conceptual Panamericana 3° Ed. (2010);
2° Ed. (2006)
Montevideo:
Cardellino, R.; Mejoramiento genético R.O. del Uruguay, 2000
Agropecuaria
Rovira, J. animal
Hemisferio Sur
Giovambattista Genética de Animales Buenos Aires/1° Ed.
Interamericana
G.; Peral García P. Domésticos (2010)
Falconer D.S.; Introducción a la
Acribia España, 2006
Mackay T.F.C. genética cuantitativa
De Robertis E.; De Robertis: Biología Buenos Aires,
Promed
Hib J. celular y molecular 2012
Mejoramiento Genético
Miquel M.C. Animal: Algunos Eudeba Buenos Aires, 2011
elementos prácticos

BIBLIOGRAFÍA BÁSICA (Formato Digital)

Fernández
Genética Ariel España, 2004
Piqueras, J.
López Santillán,
J. A.; Cienfuegos Plaza y Valdés, S.A. de
Genética General México, 2011
Rivas, E. G.; C.V.
Castro Nava S.
Piñero, D.;
Barahona Genética: la FCE - Fondo de
México, 2010
Echeverría, A. continuidad de la vida Cultura Económica

110 | P á g i n a
8. ANEXO

CÓDIGO GENÉTICO

111 | P á g i n a