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Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

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Procesamiento de alimentos y bioproductos

página de inicio de la revista: www.elsevier.com/locate/fbp

Inmovilización de una preparación comercial

de enzima Aspergillus aculeatus con
actividad fructosiltransferasa en perlas de quitosano:
Un estudio cinético/termodinámico y
producción continua de fructooligosacáridos en
reactor enzimático.
Rodrigo Lira de Oliveiraa, Marcos Fellipe da Silvab,
Suzana Pedroza da Silvab, Jorge Vinícius Fernandes Lima Cavalcanti c,
Attilio Converti d, Tatiana Souza Porto b,
a Red de Biotecnología del Nordeste/RENORBIO, Universidad Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Dom Manoel de
Medeiros, Dois Irmãos, 52171­900 Recife, PE, Brasil
b Unidad Académica de Garanhuns/UAG, Universidad Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Garanhuns , Av. Bom
Pastor, Boa Vista, 55296­901 Garanhuns, PE, Brasil
C
Departamento de Ingeniería Química, Universidad Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rêgo, 1235,
Cidade Universitária, 50670­901 Recife, PE, Brasil
d
Departamento de Ingeniería Civil, Química y Ambiental, Polo de Ingeniería Química, Universidad de Génova,
via Opera Pia 15, 16145 Génova, Italia

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Pectinex Ultra SP­L, una preparación enzimática de calidad alimentaria con alta actividad transfructosilante, se inmovilizó
Recibido el 16 de noviembre de 2019 covalentemente en perlas de quitosano. El mayor rendimiento de inmovilización (95,9%) se obtuvo utilizando glutaraldehído al 4,0%
Recibido en forma revisada el 30 de abril. durante 60 min y 80 rpm a 25 ± 1 ◦C. El biocatalizador inmovilizado mostró buena estabilidad operativa, pudiendo retener, después del
2020 tercer ciclo de reutilización, no menos del 100,0 y 73,9% de las actividades hidrolítica y transfructosilante de partida, respectivamente.
Aceptado el 4 de mayo de 2020 Los resultados de los experimentos de actividad residual permitieron estimar, para la inactivación térmica irreversible de la enzima
Disponible en línea el 27 de mayo de 2020 libre e inmovilizada, la energía de activación (E*d = 234,3 y 242,2 kJ∙mol−1), la entalpía (234,4 ≤ H*d ≤ 234,2 kJ∙ mol−1 y 239,4 ≤ H*d

≤ 239,3 kJ∙mol−1), entropía (381,2 ≤ S*d ≤ 379,8 J∙mol−1∙K−1 y 390,4 ≤ S*d ≤ 389,7 J∙mol−1∙ K−1) y energía libre de Gibbs (109,3 ≤

Palabras clave: G*d ≤ 103,9 kJ∙mol−1 y 111,3 ≤ G*d ≤ 103,6 kJ∙mol−1). El uso de la enzima inmovilizada en un reactor de lecho compacto permitió

Fructooligosacáridos obtener, después de 100 minutos, una mezcla de fructooligosacáridos que contenía más de 25 g L­1 de 1­kestosa. © 2020 Institución

Fructosiltransferasa de Ingenieros Químicos. Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.
Perlas de quitosano

Parámetros cinéticos y termodinámicos.

pectinex
Reactor de lecho empaquetado

Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: [email protected] (TS Oporto).
https://doi.org/10.1016/j.fbp.2020.05.001 0960­3085/©
2020 Institución de Ingenieros Químicos. Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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170 Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

1. Introducción Facilita el proceso en comparación con otros reactivos. En

Además, este agente reticulante se caracteriza por una impresionante

La gente está cada vez más interesada en la atención sanitaria. multifuncionalidad, pudiendo establecerse con proteínas.
y una dieta segura; por tanto, nutracéuticos y alimentos funcionales tres tipos diferentes de interacciones, a saber, hidrofóbicas,

Recientemente han recibido especial atención en el desarrollo de de intercambio iónico y covalentes (Barbosa et al., 2014). Allá

nuevos productos alimenticios (Bali et al., 2015). Fructooligosacáridos No hay estudios que informen la inmovilización de la FTasa contenida en la

(FOS) han sido objeto de especial atención debido a preparación comercial Pectinex Ultra SP­L en

sus importantes beneficios para la salud, entre los que se encuentran los bifidogénicos quitosano, los únicos informes que tratan de su inmovilización

y propiedades no cariogénicas, estimulación del calcio y en Sepabeads activados con epoxi (Ghazi et al., 2005), alginato

absorción de magnesio, consumo por pacientes diabéticos, (Fernández­Arrojo et al., 2013), Eupergit (Tanriseven y
Prevención del cáncer de colon y reducción del colesterol total. Aslan, 2005) y resina de intercambio aniónico (Csanadi y Sisak,

fosfolípidos y triglicéridos en suero (Domínguez et al., 2006).

2013; Ganaie et al., 2014). Los datos termodinámicos de reacciones catalizadas por enzimas son

FOS, formado principalmente por 1­kestosa, nistosa y 1­ esencial para predecir su alcance en cualquier proceso donde

fructofuranosil­nistosa, puede sintetizarse por la acción ocurren, mientras que la estabilidad térmica de la enzima afecta tanto

de dos clases de enzimas, a saber, fructosiltransferasas Aspectos termodinámicos y cinéticos. Mientras que la actividad

(FTasas) y ­fructofuranosidasas (FFasas), comúnmente llamadas de una enzima se mide mediante la reacción bioquímica

invertasas, donde la primera clase posee una mayor actividad de transferencia catalizada por él, su estabilidad está relacionada con su actividad residual
ˇ
de anillos que la segunda (Antosová y Polakovic,ˇ 2001). (Gohel y Naseby, 2007). termodinamica y cinética

Aunque estas enzimas están presentes en vegetales o parámetros como energía de activación, entropía, entalpía

Fuentes microbianas, la mayoría de las preparaciones enzimáticas comerciales. y la energía libre de Gibbs, así como la vida media (t1/2) pueden proporcionar

con alta actividad FTasa utilizadas en la industria alimentaria, especialmente información valiosa sobre la actividad de las enzimas y

en el procesamiento de zumos de frutas, se obtienen a partir de filamentos su termoestabilidad a determinadas temperaturas de funcionamiento, por lo que

hongos (Vega­Paulino y Zúniga­Hansen, 2012). Entre ellos, permitiendo una mejor comprensión y predicción de la libertad

Pectinex Ultra SP­L y otras preparaciones obtenidas de y comportamiento de enzimas inmovilizadas en aplicaciones industriales.

Aspergillus aculeatus se ha utilizado en varios estudios para producir

fructooligosacáridos (Fernández­Arrojo et al., 2013; Por lo general, estos parámetros mejoran mediante la inmovilización,

Nemukula et al., 2009) y oligosacáridos a base de lactulosa indicando una estabilización de la estructura de la proteína con respecto a

(Nguyen et al., 2018, 2019). Estas preparaciones contienen muchos desnaturalización térmica. La alta estabilidad generalmente se considera un

enzimas como pectinasa, ­galactosidasa, celulasa y ventaja desde el punto de vista económico porque reduce

fructosiltransferasas (Tanriseven y Aslan, 2005). pérdida de enzima. Por lo tanto, antes de proceder con el desarrollo de

El uso de enzimas solubles en procesos industriales como formulaciones enzimáticas, es necesario adquirir

La síntesis de FOS a menudo se ve obstaculizada por una baja estabilidad operativa información sobre la estabilidad de la enzima en diferentes condiciones (Souza

durante largos períodos de tiempo y la dificultad de recuperarse y et al., 2015). Debido a la importancia de

reutilizar la enzima. Estos inconvenientes suelen reducirse mediante Parámetros cinéticos/termodinámicos enzimáticos, varios estudios.

inmovilizar las enzimas (Sheldon y van Pelt, 2013), es decir se realizaron en diferentes clases de enzimas importantes para

Confinar o unir enzimas libres o solubles en un espacio determinado. la industria alimentaria como las pectinasas (Silva et al., 2018a),

región, conservando así sus actividades catalíticas (Edet et al., proteasas (Silva et al., 2018b), amilasas (Karam et al., 2017),

2013). ­galactosidasa (Ji et al., 2019) y lipasas (Ferreira et al.,

Entre la gran cantidad de soportes utilizados para la inmovilización, el 2018). Sin embargo, hasta donde sabemos, no existe ninguna
quitosano se considera un excelente y económico La investigación termodinámica se ha realizado hasta la fecha en

soporte gracias a su composición no tóxica, hidrófila, inerte y la actividad y termoestabilidad de la FTasa libre o inmovilizada

características biocompatibles, además de su compatibilidad inmunológica presente en la preparación enzimática comercial utilizada en este

(Wahba, 2017). El quitosano es tan versátil estudiar.

Biopolímero formado por cadenas lineales de poliglucosamina de alto peso En este contexto, los objetivos de este estudio fueron covalentemente

molecular con grupos amino e hidroxilo reactivos. unirse a la preparación enzimática comercial de calidad alimentaria Pectinex

que pueden reticularse utilizando diversos compuestos. La elección Ultra SP­L, con alta actividad FTasa, a perlas de quitosano utilizando

del quitosano como apoyo a la inmovilización también se justifica por su glutaraldehído como agente reticulante, para realizar una cinética

atractivo económico, dado que se prepara por desacetilación de la quitina, que y estudio termodinámico de ambas formas de enzimas y para producir FOS

es el segundo polímero más abundante mediante un proceso continuo en un reactor de lecho empaquetado utilizando

en la naturaleza después de la celulosa (Muxika et al., 2017). Por lo general, Biocatalizadores inmovilizados.

se prepara de forma económica a partir de conchas de mariscos (especialmente

camarones, cangrejos, langostas y krill), así como desechos del procesamiento
2. Materiales y métodos
de mariscos. Finalmente, su reciclaje como material de inmovilización.
reduce el impacto ambiental causado por la acumulación de quitina en los
lugares donde se genera o almacena (Bakshi et al.,
2.1. Fuente de enzimas y reactivos.
2019; Krajewska, 2004).
El preparado enzimático de calidad alimentaria Pectinex® Ultra SP­L
La inmovilización por unión covalente suele realizarse
(P2611), con actividad transfructosilante, sacarosa y quitosano de cáscaras
utilizando reactivos bifuncionales como el glutaraldehído, uno
de camarón (grado de desacetilación ≥75%) fueron
de cuyos dos grupos aldehído terminales reacciona con una amina
adquirido de Sigma – Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El glutaraldehído fue
grupo de quitosano y el otro con la enzima amino
adquirido de Dinâmica Química Contemporânea
grupo terminal (Klein et al., 2012; Mohamed et al., 2013).
(Diadema, SP, Brasil). Los demás reactivos utilizados en esta investigación.
A pesar de su toxicidad, se utiliza en condiciones de pH, temperatura y fuerza
eran reactivos de grado analítico.
iónica cercanas a las fisiológicas, lo que
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2.2. Inmovilización enzimática mediante unión covalente a perlas fructosa (F) y fructosa transferida (F') según las siguientes ecuaciones
de quitosano. propuestas por los mismos autores:

La inmovilización enzimática se realizó según Klein et al. (2012), con algunas F = RS ­ GRAMO (2)
adaptaciones. Brevemente, las perlas de quitosano se prepararon mediante la
adición gota a gota de una solución de quitosano (2,0 % p v­1 en ácido acético F = GRAMO − F = 2G − RS (3)
0,35 M) a una solución coagulante que contenía 26 % (p v­1) de etanol en NaOH
1,0 M. Las perlas formadas se lavaron minuciosamente con agua destilada y se
La concentración de proteínas se midió según Bradford (1976) utilizando
activaron mediante incubación durante 180 min a 25 ± 1 ◦C bajo agitación (130
albúmina sérica bovina como estándar. Se utilizaron valores de concentración de
rpm) con soluciones de glutaraldehído a diferentes concentraciones, manteniendo
proteína para calcular kcat para la enzima libre o inmovilizada (ver Sección 2.5).
una relación 1:10 (w v­1) entre quitosano. perlas y solución de glutaraldehído.
El contenido de proteína del sistema inmovilizado se determinó por la diferencia
Después de la activación, las perlas se eliminaron mediante filtración y se lavaron
entre la concentración de proteína inicial ofrecida a la inmovilización (enzima
minuciosamente para eliminar el glutaraldehído no unido, cuya presencia se
libre) y la de proteína no unida al final de la inmovilización.
comprobó mediante mediciones de absorbancia a 245 nm como lo describen Pal
y Khanum (2011). El acoplamiento de las perlas de quitosano activadas con la
preparación enzimática se aseguró incubándolas en una proporción de 1:1 (w
v­1) a temperatura ambiente para diferentes tiempos de contacto y usando
2.4. Efecto de la temperatura y el pH sobre las actividades de
diferentes velocidades de agitación. Después del acoplamiento, se filtraron y se
lavaron con agua destilada hasta que la actividad enzimática desapareció casi preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas.
por completo.
Las temperaturas óptimas para las actividades de FTasa se determinaron
realizando pruebas de actividad en el rango de temperatura de 20 a 80 ◦C,
aumentando la temperatura en 10 ◦C entre un experimento y otro. La estabilidad
Los experimentos de inmovilización se realizaron según un diseño factorial
térmica de las preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas se evaluó
completo de 23 más tres puntos centrales, donde las variables independientes
incubándolas a diferentes temperaturas durante diferentes intervalos de tiempo
fueron la concentración de glutaraldehído (2,0, 3,0 y 4,0% v v­1), la velocidad de
(hasta 180 min), enfriando rápidamente alícuotas a temperatura ambiente para
agitación (80, 100 y 120 rpm) y el tiempo de contacto. (60, 120 y 180min). La
replegarse las moléculas de la enzima inactivadas de forma reversible, y luego
respuesta del diseño experimental fue el rendimiento de inmovilización (Y). Y se
retirar muestras cada 60 minutos para determinar la actividad residual. El efecto
calculó como la relación entre la actividad de la enzima inmovilizada (A) y la
del pH sobre las actividades FTasa se estudió en el rango entre 3,0 y 9,0,
actividad inicial de la enzima libre antes de la inmovilización (A0) como se
variando el pH en media unidad entre un experimento y otro.
describe en la ecuación:

Para ello, el sustrato se disolvió en diferentes tampones a una concentración de

A 0,1 M: citrato de sodio (3,0­4,5), citrato­fosfato (4,5­6,0), fosfato de sodio
Y(%) = ∙ 100 (1)
A0 (6,0­7,5) y Tris­HCl (7,5­9,0).

Los resultados experimentales se analizaron utilizando el software Sta­tistica 2.5. Parámetros cinéticos de reacciones catalizadas por
7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, EE. UU.) asumiendo p <0,05 como nivel preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas.
estadísticamente significativo. Se realizó el análisis de varianza (ANOVA),
permitiendo comprobar la calidad de ajuste del modelo lineal la prueba F y el La constante de Michaelis­Menten (Km) y la velocidad de reacción máxima
coeficiente de determinación (R2 ≥ 0,90). (Vmax) para reacciones catalizadas por preparaciones libres e inmovilizadas se
determinaron a partir de un gráfico recíproco doble (Lineweaver­Burk) de actividad
hidrolítica o transfructosilante versus concentraciones de sacarosa (73,0 ≤ S0 ≤
2045,3 mm).
2.3. El número de recambio (kcat) se calculó para ambas reacciones como la relación entre
Determinaciones analíticas
Vmax y el contenido de proteína como se describe en la Sección 2.3.

Las actividades hidrolítica (UH) y transfructosilante (UTF) de la preparación

enzimática comercial se analizaron de acuerdo con la metodología descrita por
Sangeetha et al. (2004) con algunas adaptaciones como sigue. Se incubaron 2.6. Reutilizabilidad y estabilidad en almacenamiento de inmovilizados.
alícuotas de la solución de enzima libre (0,25 ml) o de la enzima inmovilizada enzima
en perlas de quitosano (0,25 g) a 55 ◦C durante 60 minutos junto con 0,75 ml de
solución de sacarosa al 60% (p v­1) (0,1 M). tampón acetato, pH 5,0). La La reutilización del biocatalizador inmovilizado se determinó realizando ciclos
concentración de glucosa en las muestras colectadas al final de la reacción (G) repetidos de hidrólisis de sacarosa o reacción de transfructosilación. Un ciclo de
fue determinada por un kit colorimétrico de glucosa oxidasa (Liquiform, Labtest, uso se ha definido como una conversión por lotes de sacarosa en glucosa
Lagoa Santa, MG, Brasil), mientras que los azúcares reductores totales (RS) por (actividad hidrolítica) o transferencia de grupos fructosilo (actividad
el método de 3'5 '­ ácido dinitrosalicílico (Miller, 1959). Chen y Liu (1996) transfructosilante) utilizando la preparación enzimática inmovilizada a 55 ◦C y pH
definieron una unidad de actividad hidrolítica como la cantidad de enzima 5,0 durante 60 min. La estabilidad durante el almacenamiento de la enzima
responsable de la hidrólisis de un mol de sacarosa por minuto, y una unidad de inmovilizada se evaluó determinando las actividades hidrolítica y transfructosilante
actividad transfructosilante como la requerida para transferir un mol de fructosa durante 45 días. Para ello, las perlas que contenían enzima se mantuvieron
por minuto. Para el cálculo de la actividad transfructosilante, estimamos las sumergidas en tampón acetato (0,1 M, pH 5,0) a 4 ◦C. Ya sea para estudios de
concentraciones de libre estabilidad en almacenamiento o de reutilización, la actividad residual (%) se
determinó considerando la FTasa.
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actividades del primer día de observación o del primer ciclo igual al 100%. mientras que este último a partir de la pendiente de la curva del Tiempo de
Muerte Térmica, es decir, logD versus T ( ◦C), según Pal y Khanum (2011).

2.7. Debido a la desnaturalización, la actividad FTasa se convierte en una

Estudios cinéticos y termodinámicos.
función dependiente del tiempo. Luego se estimó la actividad integral, P (mM),

La termoestabilidad de la enzima se estudió en rangos de temperatura de 55 a para las preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas integrando el producto

70 ◦C y de 55 a 75 ◦C para la enzima libre e inmovilizada, respectivamente, de la actividad hidrolítica inicial y

durante un tiempo de incubación de 180 minutos. La selección de un rango de como lo describen Porto et al. (2006):

temperatura más amplio para la enzima inmovilizada se basó en su mayor

termoestabilidad observada durante los experimentos en comparación con la A0
P(t) = A0 dt = A0 exp(−kdt)dt = [1 − exp(−kdt)] (10) kd
enzima libre. Suponiendo que la inactivación térmica a largo plazo de una enzima
puede describirse mediante una reacción irreversible de primer orden, su
Según esta ecuación, la actividad integral hasta el
constante de velocidad de primer orden (kd) se estimó a cada temperatura a
La vida media de la enzima (P1/2) se estimó como:
partir de la pendiente de la línea recta en el semilogaritmo. gráficas de ln vs.
tiempo de exposición, siendo el coeficiente de actividad definido como la relación
A0
entre la actividad FTasa residual y la del inicio del tratamiento térmico ( = A/Ao). P1/2 = (11)
2kd
Sólo se utilizaron los resultados de la actividad hidrolítica para determinar los
valores y estimar los parámetros cinéticos/termodinámicos relacionados. El Las energías de activación (E*a) de las reacciones catalizadas por
análisis estadístico de la constante de velocidad de primer orden (kd) se basó
preparaciones libres e inmovilizadas se estimaron a partir de las pendientes de
únicamente en la desviación estándar y el coeficiente de determinación (R2) de los gráficos tipo lnA0 frente a 1/T Arrhenius. Las otras cantidades
gráficos semilogarítmicos. termodinámicas, es decir, la energía libre de Gibbs de activación (G*), la
entropía (S*) y la entalpía (H*), se calcularon mediante las ecuaciones. (5)–(7)
La energía de activación de la inactivación irreversible de la enzima (E*d) con algunas adaptaciones: E*d fue reemplazado por E*a y kd por kcat. Todos
se estimó, según la forma logarítmica de la ecuación de Arrhenius, a partir de la estos parámetros se estimaron a una temperatura de referencia de 55 ◦C, es
pendiente de la recta en la gráfica semilogarítmica de lnkd versus 1/T: decir, la misma temperatura utilizada para determinar las actividades enzimáticas.

El cociente de temperatura (Q10) es un parámetro importante para evaluar

lnkd = −E d/RT + ln A (4) el efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción, que se define como
el grado de aumento en la actividad de una enzima como resultado de un

donde R (8,314 Jmol−1 K−1) es la constante del gas ideal. aumento de temperatura de 10 ◦C. Dicho parámetro se estimó tanto para las
formas de reacción como para las enzimas mediante la ecuación propuesta
La entalpía de activación (H d), la energía libre de Gibbs (G d) y la
inicialmente por Dixon y Webb (1979):
entropía (S d) se estimaron mediante las ecuaciones:

mi × 10
a
H dd= mi − RT (5) Q10 = antirregistro
RT2
(12)

kdh 2.8. Síntesis enzimática de FOS

G = −RT ln d (6)
kbT
La producción de FOS utilizando la preparación de enzimas inmovilizadas se
H − G dd realizó en una columna de lecho relleno de acrílico (altura: 13,0 cm y diámetro
= (7)
S d t interior: 1,3 cm) equipada con salidas laterales adicionales en la parte inferior y
superior para la recirculación del agua para mantener la temperatura a 50 ◦C.
donde h (6,626 × 10−34 J s) es la constante de Planck y kb (1,381 × 10−23 J Se usó solución de sacarosa (600 g L­1 en tampón acetato 0,1 M, pH 5,0) como
K−1) la de Boltzmann. sustrato y se bombeó a un caudal de 1,0 ml min­1 durante 100 min. Las muestras
La vida media de la enzima (t1/2) es el tiempo necesario para reducir la recolectadas del reactor fueron analizadas con un sistema HPLC provisto de una
actividad enzimática a la mitad de su valor inicial, que a menudo se utiliza para bomba isocrática (serie CG 480­E, Instrumentos Cientí­ficos, São Paulo, SP,
predecir la viabilidad del uso a largo plazo de preparaciones de enzimas Brasil) y un detector de índice de refracción (HP 1047A, Hewlett Packard, Valley
inmovilizadas en procesos continuos y se puede calcular. por la siguiente Forge, Pensilvania, EE.UU.). Para separar FOS, se utilizó una columna Luna
ecuación (Melikoglu et al., 2013; Souza et al., 2015): C­18 (250 mm × 4,6 mm) (Phenomenex, Torrence, CA, EE. UU.). La elución se
realizó utilizando H2SO4 5,0 mM preparado con agua ultrapura a un caudal de
1,1 ml min­1 a temperatura ambiente (25 ± 1 ◦C). Los estándares de FOS,
ln2 concretamente 1­kestosa (GF2) y nistosa (GF3), se adquirieron de Sigma­Aldrich
t1/2 = (8)
kd (St. Louis, MO, EE. UU.) y se utilizaron para las curvas de calibración.

El valor D, o tiempo de reducción decimal, se define como el tiempo de

incubación de la enzima a una temperatura determinada necesaria para alcanzar
el 10% de actividad residual, mientras que la constante de resistencia térmica
(valor Z) es el aumento de temperatura que provoca que el valor D disminuya. 3. Resultados y discusión
disminuir en una unidad logarítmica, es decir, en un 90%. El primero se calculó,
según Heldman y Hartel, 1997) mediante la ecuación: 3.1. Inmovilización covalente de Pectinex sobre quitosano.
rosario

ln10
re = Pectinex Ultra SP­L, la preparación enzimática comercial utilizada en este
(9)
kd estudio, tiene actividades hidrolíticas y transfructosilantes.
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Tabla 1 – Condiciones experimentales y resultados de la inmovilización de la preparación enzimática comercial Pectinex Ultra SP­L
mediante enlace covalente a perlas de quitosano realizado según un diseño factorial completo de 23.
Correr Concentración de glutaraldehído (%) Tiempo de acoplamiento (min) Tasa de agitación (rpm) Rendimiento de inmovilización (%)

1 2.0 60 80 75.1
2 4.0 60 80 95,9
3 2.0 180 80 69,6
4 4.0 180 80 92.1
5 2.0 60 120 33.2
6 4.0 60 120 93.0
7 2.0 180 120 53,8
8 4.0 180 120 86,4
9 3.0 120 100 73,9
10 3.0 120 100 75,4
11 3.0 120 100 83,8
12 3.0 120 100 68.0

Tabla 2 – Efectos estimados e interacciones de la

Variables independientes utilizadas para inmovilizar Pectinex Ultra.
Preparación enzimática comercial SP­L por vía covalente.
unión a perlas de quitosano según el 23­completo
diseño factorial que se muestra en la Tabla 1.
Variable o interacción Estimados

(1) Concentración de glutaraldehído 7,35*

(2) tiempo de acoplamiento 0,26

(3) Tasa de agitación 1 −3,59*

×2 −1,38
1×3 2.66
2×3 1.25
1×2×3 −1,57

Estadísticamente significativo al nivel de confianza del 95% (p < 0,05).

de 378,0 y 301,7 UmL­1, respectivamente. Su actividad FTasa fue

reportado por primera vez por Hang y Woodams (1995). La efectividad
de su inmovilización covalente fue investigada a través de un conjunto
de corridas realizadas según un diseño factorial de 23 completos donde
concentración de glutaraldehído, tiempo de contacto entre enzimas
y las perlas de quitosano y la velocidad de agitación se eligieron como variables
independientes, mientras que el rendimiento de inmovilización como respuesta
(Tabla 1). El rendimiento máximo de inmovilización (Y= 95,9%) fue
Fig. 1 – Efecto del pH sobre la hidrolítica (A) y
obtenido a una concentración de glutaraldehído del 4,0%, póngase en contacto
actividades transfructosilantes (B) de Aspergillus aculeatus
tiempo de 60 min y velocidad de agitación de 80 rpm. Se obtuvieron rendimientos similares
preparación enzimática comercial, ya sea libre () o
reportado para inmovilización covalente en el mismo tipo de soporte de
inmovilizados en perlas de quitosano ( ).
­fructofuranosidasa parcialmente purificada de un diferente
preparación comercial (90,0%) (Lorenzoni et al., 2014) y una
serina proteasa (87,5%) (Singh et al., 2011), pero usando más tiempo
Se realizaron experimentos adicionales para confirmar el rendimiento de
tiempo de contacto (3 y 24h, respectivamente). El análisis estadístico
inmovilización previsto y verificar la reproducibilidad del proceso.
de los resultados del diseño experimental revelaron que el contacto
Se obtuvieron resultados bastante similares de dos repeticiones realizadas en
El tiempo o la concentración de glutaraldehído ejercieron efectos
las mejores condiciones, lo que proporcionó una media Y
estadísticamente significativos con un nivel de confianza del 95% (Tabla 2).
valor de 94,59 ± 1,81%.
En particular, la concentración de glutaraldehído tuvo un efecto positivo.
efecto, lo que significa que su aumento mejoró el rendimiento de la
inmovilización. Este resultado está de acuerdo con lo conocido 3.2. Influencia del pH en las actividades enzimáticas.
Capacidad de ambos grupos terminales aldehídos del glutaraldehído para reaccionar.
con grupos amino de D­glucosamina, lo que lleva a la irreversible El efecto del pH sobre las actividades hidrolítica y transfructosilante de ambas
formación de una base de Schiff entre las cadenas de quitosano capaz de preparaciones enzimáticas se muestra en la Fig. 1. No
estabilizar las perlas (Singh et al., 2011). En consecuencia, cuanto mayor Se observaron cambios en el pH óptimo de la enzima inmovilizada o libre, en
Cuanto mayor sea la concentración de glutaraldehído, mayor será el número. el sentido de que las actividades relativas más altas
de grupos amino activados y mayor será la inmovilización se observaron para ambos a valores de pH en el rango de 4,5 a 6,0
producir. Según ANOVA, el modelo lineal obtenido para este y de 5,0, respectivamente. Smaali et al. (2012) informaron un pH óptimo similar
el diseño experimental no tuvo falta de ajuste y el rendimiento de inmovilización para Aspergillus oryzae ­fructofuranosidasa
fue muy alto (95,9%). Sin embargo, dado que esto es sólo inmovilizados sobre perlas de quitosano. La FTasa inmovilizada fue
una evaluación estadística matemática y no bioquímica, ligeramente más activo que el libre en condiciones alcalinas (7,0 ≤ pH ≤ 8,5)
el modelo fue validado experimentalmente. Para este propósito, probablemente debido a conformacional positiva
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174 Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

con más detalle en la Sección 3.7 en lo que respecta a la cinética y termo­

Se trata de la dinámica de la termoinactivación.

3.4. Estabilidad de reciclaje y almacenamiento de la preparación de

enzimas inmovilizadas.

La inmovilización de enzimas tiene la principal ventaja de que permite

reutilizar una preparación enzimática en ciclos posteriores.
Esta posibilidad es a menudo un factor clave para la viabilidad
económica de emprender un bioproceso con enzimas inmovilizadas
(Rehman et al., 2013). La preparación enzimática inmovilizada en
perlas de quitosano retuvo el 100,0 y el 73,9% de las actividades
hidrolíticas y transfructosilantes iniciales después de tres ciclos de
reutilización, e incluso el 74,0 y el 42,4% después de ocho ciclos,
respectivamente. Wahba (2017) informó una retención similar de la
actividad hidrolítica después de ocho ciclos (70%) para perlas de
quitosano que contienen ­galactosidasa tratadas con carbonato de sodio.
Se propuso que la disminución de la actividad enzimática inmovilizada
después de la reutilización puede ser el resultado de frecuentes
colisiones de moléculas de sustrato con el sitio activo que pueden
distorsionar su disposición tridimensional regular (Kishore y Kayastha,
2012), o de la fuerte actividad covalente. unión de la enzima al soporte
que reduce la 'lixiviación' de la enzima durante la catálisis (Pal y
Khanum, 2011).
La estabilidad en almacenamiento es otra característica importante
de las enzimas industriales porque son susceptibles a una pérdida de
actividad prolongada incluso a las bajas temperaturas utilizadas para
el almacenamiento. En general, las enzimas libres son menos estables
durante el almacenamiento que las inmovilizadas, y la estabilidad
mejorada inducida por la inmovilización, especialmente por la unión
covalente a perlas de quitosano, se informó para varios biocatalizadores
industriales como las amilasas (Nwagu et al., 2013). , lipasas (Chiou y
Wu, 2004) e invertasas (Koli y Gaikar, 2017). Nuestra construcción
inmovilizada retuvo no menos del 100,0 y el 80,7% de las actividades
Fig. 2 – Efecto de la temperatura sobre las actividades iniciales hidrolíticas y transfructosilantes después de 45 días de
hidrolítica (A) y transfructosilante (B), y la estabilidad térmica almacenamiento a 4 ◦C, respectivamente, lo que denota una excelente
hacia la actividad hidrolítica (C) del preparado enzimático estabilidad de almacenamiento a largo plazo que puede explotarse para uso industrial.
comercial de Aspergillus aculeatus , ya sea libre () o Se informaron retenciones de actividad comparables para la
inmovilizado en perlas de quitosano ( ). levansucrasa inmovilizada en perlas de quitosano después de 7
semanas de almacenamiento prolongado (90%) (Sangmanee et al.,
2016) y para la amilasa inmovilizada en el mismo soporte usando unión
cambios en la estructura terciaria de la enzima como resultado de la covalente multipunto sobre poliglutaraldehído (100%) después 30 días (Nwagu et al., 20
unión covalente a perlas de quitosano (Rehman et al., 2014).
3.5. Cinética de reacciones catalizadas por ambas enzimas.
3.3. Influencia de la temperatura en las actividades y la estabilidad formas
de las enzimas.
La Tabla 3 enumera los parámetros cinéticos de las reacciones
Los perfiles de las actividades hidrolítica y transfructosilante a diferentes catalizadas por ambas preparaciones de enzimas, que se estimaron a
temperaturas se ilustran en la Fig. 2, paneles A y B, respectivamente. partir de gráficos tipo Lineweaver­Burk (Material complementario, Fig.
La temperatura óptima de la primera actividad fue de 60 ◦C usando S1) con un ajuste satisfactorio (0,945 ≤ R2 ≤ 0,994). Ambas formas de
cualquiera de las preparaciones enzimáticas, mientras que la de la fructosiltransferasa (FTasa) siguieron la cinética de Michaelis­Menten,
segunda se redujo de 60 a 50 ◦C mediante inmovilización. Por otro lado, como ya se observó para otras FTasas de diferentes fuentes, como la
la Fig. 2C muestra que la FTasa inmovilizada era más estable FTasa libre de Aspergillus aculeatus (Huang et al., 2016) y la FTasa
térmicamente, pudiendo retener, en el rango de temperatura 40­60 ◦C, inmovilizada de Rhodotorula sp.
no menos del 85,2­74,5% de la actividad hidrolítica inicial después de (Alvarado­Huallanco y Maugeri­Filho, 2010), considerando tanto
180 min de incubación. en comparación con sólo el 75,1­43,4% del actividades hidrolíticas como transfructosilantes. También se informó
gratuito. Esta termoestabilidad mejorada puede deberse a una forma la cinética de Michaelis­Menten para la FTasa contenida en Pectinex
más rígida adquirida por la enzima unida a las perlas de quitosano que Ultra SP­L considerando solo la actividad hidrolítica (Tanriseven y
preservan su conformación del sitio activo (Rehman et al., 2014). De Aslam, 2005) y para una FTasa recombinante de Aspergillus niger
hecho, una mayor termoestabilidad de la enzima es una propiedad considerando solo la actividad transfructosilante (Guo et al., 2016).
deseable para cualquier aplicación industrial, ya que a menudo se
utilizan altas temperaturas para mejorar la velocidad de reacción, el Los Km de hidrólisis de sacarosa fueron 191,0 mM para la enzima
grado de conversión y la solubilidad de algunos reactivos. Se discutirá libre y 232,4 mM para la inmovilizada, respectivamente. El aumento de
la termoestabilidad de ambas formas de la enzima. Km resultante de la inmovilización de enzimas indica
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Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182 175

Tabla 3 – Parámetros cinéticos de reacciones catalizadas por la enzima comercial Aspergillus aculeatus libre e inmovilizada
preparaciones que utilizan sacarosa como sustrato.
enzima libre

Reacción aKm(mM) bVmáx(mMmín­1) ckcat(min­1) R2

Hidrólisis 191.0 400.0 7.4 0,945

transferencia de fructosilo 278,2 370,4 6.9 0.994

enzima inmovilizada

Reacción Kilómetros (mm) Vmáx (mMmín­1) kcat (min­1) R2

Hidrólisis 232,4 384,6 10.2 0.987

transferencia de fructosilo 265,7 357.1 9.5 0.963

una constante de Michaelis.

b Velocidad de reacción máxima.
C Número de recambio.

indica que se requiere una mayor concentración de sustrato para

saturar la enzima inmovilizada de lo que normalmente se requiere
saturar la enzima en su forma libremente soluble, lo que lleva a
a una disminución de su afinidad por el sustrato. Otro posible
La razón es que la reticulación inter e intramolecular puede tener
llevó a la reducción de la superficie, la inaccesibilidad del sustrato
al sitio activo y a la limitación de la transferencia de masa (Nwagu et al.,
2013). Se informó un comportamiento similar para diferentes enzimas.
cuando fueron inmovilizados covalentemente en perlas de quitosano
como la peroxidasa (Mohamed et al., 2013), ­galactosidasa
(Wahba, 2017) e invertasa (Koli y Gaikar, 2017).
En cuanto a la reacción de transferencia de fructosilo, una disminución de Km de
Se observaron 278,2 a 265,7 mM después de la inmovilización, lo que
significa que, al contrario de la hidrólisis, la inmovilización
favoreció la síntesis de fructooligosacáridos (FOS). Ghazi et al.
(2007) informaron valores de Km de 27 ± 3 y 535 ± 45 mM para reacciones
de hidrólisis y transferencia de fructosilo, respectivamente, utilizando un
FTasa purificada de una preparación comercial similar. Semejante
una comparación sugiere que la presencia de otras enzimas en
la nueva preparación cruda utilizada en este estudio puede haber afectado
la primera actividad y fortaleció la segunda.
La inmovilización provocó una disminución de la Vmax de 400,0
a 384,6 mMmin­1 y de 370,4 a 357,1 mM min­1 para
las reacciones de hidrólisis y transferencia de fructosilo, respectivamente,
que puede atribuirse a una accesibilidad limitada del sustrato Fig. 3 – Gráficas tipo Arrhenius utilizadas para estimar la
moléculas al sitio activo, así como una interacción de enzimas energía de activación de la hidrólisis de sacarosa (A) y fructosilo
moléculas con grupos funcionales en la superficie del soporte (de transferencia (B) catalizada por Aspergillus aculeatus comercial
Oliveira et al., 2018). Las cifras de facturación aparente (kcat) preparación enzimática, ya sea en forma libre () o inmovilizada
de ambas reacciones catalizadas por la FTasa inmovilizada fueron en perlas de quitosano ( ), utilizando sacarosa como sustrato.
superiores a los obtenidos con la enzima libre. Tal
El aumento no se observa comúnmente después de la inmovilización.
proceso. Una posible explicación para este comportamiento es que la hidrólisis estimamos valores E*a muy cercanos usando libre
inmovilización condujo a una enzima más activa, como puede suceder con (44,94 kJmol−1; R2 = 0,933) e inmovilizado (45,51 kJmol−1;
enzimas multiméricas que tienen sitios activos más flexibles que R2 = 0,966) enzima. Por otro lado, para la transferencia de fructosilo
sus homólogos monoméricos (Ionata et al., 2018). E*a fue un poco menor con el primero (50,14 kJmol−1; R2 = 0,923)
que con el último biocatalizador (53,03 kJmol­1; R2 = 0,938).
Estos resultados sugieren que para la transferencia de fructosilo existe una mayor dificultad.
3.6. Parámetros termodinámicos de libre y de la enzima inmovilizada para lograr la conformación óptima necesaria para
actividades enzimáticas inmovilizadas la formación de la enzima­sustrato
complejo, mientras que no se produjo ninguna variación apreciable para
Como es bien sabido, la energía de activación (E*a) de una reacción es la hidrólisis de sacarosa, al contrario de lo observado para covalente
energía necesaria para evolucionar a partir de la reacción. inmovilización de la invertasa (Cadena et al., 2010).
estado al estado de transición. Valores E*a de hidrólisis de sacarosa y H*, G* y S* de las reacciones catalizadas ya sea por
transferencia de fructosilo catalizadas por vía libre e inmovilizada. enzima libre o inmovilizada se dan en la Tabla 4. H* y
Las preparaciones de enzimas se estimaron con una correlación satisfactoria Los valores de S* de las reacciones de hidrólisis de sacarosa y
a partir de gráficos de tipo Arrhenius (Fig. 3). para sacarosa transferencia de fructosilo catalizadas por el biocatalizador inmovilizado fueron mayores
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176 Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

Tabla 4 – Parámetros termodinámicos de la sacarosa

reacciones de hidrólisis y transferencia de fructosilo catalizadas por
comercial de Aspergillus aculeatus libre e inmovilizado
preparaciones enzimáticas.
Parámetro hidrólisis de sacarosa transferencia de fructosilo

Gratis Inmovilizado Gratis Inmovilizado

aH* (kJmol−1) bG* 42.21 42,68 47,41 50.30

(kJmol−1) cS* 86,32 85,46 86,54 85,66

(Jmol−1 K−1) −134,44 −130,38 −119,23 −107,77

a Entalpía de activación.
b Activación de energía libre de Gibbs.
c Entropía de activación.

que los obtenidos con el gratuito. Comparado con otros

sistemas enzimáticos (Porto et al., 2006; Silva et al., 2018b; Wehaidy
et al., 2018), los valores relativamente bajos de H* de ambas reacciones
utilizando ya sea libre (42,21 y 47,41 kJmol­1) o inmovilizado
(42,68 y 50,30 kJmol­1) de la enzima sugieren que la
complejo enzima­sustrato activado o estado de transición
formado efectivamente. Se obtuvieron valores S* negativos para ambos
reacciones catalizadas por cualquiera de las formas enzimáticas, lo que indica que la
La estructura del Estado de transición era más ordenada que la del
el complejo enzima­sustrato (Silva et al., 2018b; Xiong et al.,
2005). Además, los valores más bajos de S* observados utilizando el método libre
La enzima puede deberse a estructuras más ordenadas de estados de transición
en comparación con la inmovilizada. es probable
que la falta de especificidad de la reacción de inmovilización condujo a
muchas formas estables de enzimas inmovilizadas, es decir, una cantidad mucho mayor
Fig. 4 – Gráficos semilogarítmicos de inactivación térmica irreversible
grado de libertad. Por el contrario, sólo había uno más estable.
de Aspergillus aculeatus libre (A) e inmovilizado (B)
forma de la enzima libre.
Preparación enzimática comercial, que utiliza actividad hidrolítica.
G* es la verdadera cantidad termodinámica capaz de arrojar luz sobre el
alcance y la viabilidad de una reacción química.
Por lo tanto, los valores relativamente bajos de G* obtenidos para ambas El borde de sus parámetros cinéticos y termodinámicos es de gran importancia.
reacciones catalizadas por preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas importancia, y la resistencia enzimática a la termoinactivación ha
indican que la formación de productos a partir del sustrato enzimático convertirse en una propiedad ventajosa en varios procesos industriales (Mateo
El complejo debería ocurrir muy rápidamente (Riaz et al., 2007; Wehaidy et al., 2007). En cuanto a la termoestabilidad de FTase
et al., 2018). En lo que respecta a la preparación de enzimas libres o inmovilizadas.
El coeficiente de temperatura (Q10), que representa la fue sometido a pruebas de actividad residual en función del tiempo en
aumento de la tasa debido a un aumento de temperatura de 10 ◦C, es una los rangos de temperatura de 55 a 70 ◦C o 55 a 75 ◦C, respectivamente,
parámetro que se puede utilizar para establecer si un catalizador cuyos resultados en términos de coeficiente de actividad residual ( ) son
la reacción se controla la temperatura o no. Generalmente la enzima ilustrado en los gráficos semilogarítmicos de las figuras 4A y B. En ambos casos
las reacciones se caracterizan por valores de Q10 en el rango 1­2, la actividad siguió la típica decadencia del clásico primer orden
con desviaciones de este rango que indican la participación de patrón de desnaturalización también observado por Onderková et al. (2010)
parámetros distintos de la temperatura para controlar la velocidad de reacción FTasa libre de Aureobasidium pullulans.
(Wehaidy et al., 2018). Los valores Q10 estimados Los principales parámetros cinéticos de termoinactivación de ambos.
en el rango de temperatura de 20 a 60 ◦C para la hidrólisis de sacarosa Las formas de la enzima se estimaron con correlación satisfactoria a partir de las
Las reacciones fueron prácticamente coincidentes usando enzima libre e líneas rectas de la Fig. 4 y se reunieron en la Tabla 5.
inmovilizada, variando de 1,88 a 1,63 y de 1,89 a 1,64. Para ambas preparaciones de enzimas, la constante de velocidad de primer orden
respectivamente, mientras que los de la reacción de transferencia de fructosilo fueron (kd) demostró aumentar gradualmente con la temperatura, mientras que
apreciablemente más bajo con el libre (2,02–1,72 a 20–60 ◦C) en lugar la vida media (t1/2) disminuye, lo que significa que la inactivación
que la forma inmovilizada (2,10­1,78 a 20­50 ◦C). el ligeramente se aceleró progresivamente y se redujo la termoestabilidad.
valores más altos de Q10 para la reacción de transfructosilación catalizada por Los valores de kd obtenidos a 60 ◦C libres e inmovilizados
la enzima inmovilizada indica que su velocidad aumentó con FTasa fueron 0,0050 y 0,0024 min­1, y las correspondientes
temperatura más que usar el gratuito. Por otro lado, los de t1/2 140,0 y 293,4min. A la misma temperatura, ambas preparaciones
los dos biocatalizadores se comportaron casi coincidentemente con respecto mostraron mayor termoestabilidad que
a la reacción de hidrólisis. ­fructofuranosidasa libre presente en la preparación comercial Viscozyme­L de
A. aculeatus que también exhibe actividad FTasa
3.7. Cinética y termodinámica de la FTasa térmica. (kd = 0,222 min−1; t1/2 = 192 min) (Lorenzoni et al., 2014). El
inactivación la termoestabilidad a 55­65 ◦C de FTasa inmovilizada fue mejor
que el de la FTasa libre a 55­60 ◦C, como lo demuestra un sistema decimal más largo.
La inactivación térmica irreversible de enzimas es uno de los principales tiempos de reducción (D) (3070–668,7 min vs. 1397–465,2 min) y
limitaciones en los procesos enzimáticos a largo plazo. Por lo tanto, el conocimiento t1/2 (924,2–201,3 min frente a 420,5–140,0 min). Tal enzima pro­
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Tabla 5 – Parámetros cinéticos y termodinámicos de la inactivación térmica irreversible de preparaciones comerciales de FTasa de Aspergillus aculeatus libres e inmovilizadas .

Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

Temperatura (◦C) akd(min­1) R2 bt1/2(mín.) valor CD (min) Valor dZ (◦C) fG*d(kJmol−1) hS*d(Jmol−1
eE*d(kJmol­1)
K−1) gH*d(kJmol­1) IP1/2(mm)

enzima libre
55 0.0017 0.942 420,5 1397 9.1 237.0 109.3 234,4 381.2 53.083
60 0.0050 0.996 140.0 465.2 107,9 234.3 379,4 17,911
sesenta y cinco 0.0258 0.993 26,92 89,42 105.0 234.3 382,4 1880
70 0.0648 0.996 10.71 35,56 103.9 234.2 379,8 928.4

enzima inmovilizada
55 0.0008 0,976 924.2 3070 9.0 242.2 111.3 239,4 390,4 118.873
60 0.0024 0,948 293,4 974,6 110.0 239,4 388,5 38.964
sesenta y cinco 0.0035 0.968 201.3 668,7 110,6 239,4 380,7 22,983
70 0.0321 0.913 21.56 71,62 105,9 239,3 388,7 1649
75 0,1240 0.902 5.59 18.57 103.6 239,3 389,7 159.0

a Constante de tasa de primer orden.

b Vida media.
c Tiempo de reducción decimal.
d Resistencia térmica constante.

e Energía de activación.
f Activación de energía libre de Gibbs.
g Entalpía de activación.
h Entropía de activación.
i
Actividad integral hasta la vida media.

177
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178 Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182

Los altos valores positivos de entalpía de activación de desnaturalización (H*d)

estimados utilizando enzima libre e inmovilizada significan que se necesitó una
alta energía total para desnaturalizarla en ambas preparaciones (Souza et al.,
2015).
Además, la enzima inmovilizada mostró valores de H*d ligeramente más
altos (239,4–239,3 kJmol−1) que la libre (234,4–234,2 kJmol−1), lo que sugiere
que la inmovilización aumentó ligeramente la energía total requerida para
desnaturalizar la enzima a través de modificaciones conformacionales en la
estructura causada por la unión covalente, estabilizándola así (Wahab et al.,
2018). Los resultados resumidos en la Tabla 5 también muestran que un
aumento en la temperatura redujo ligeramente el H*d de ambas preparaciones
de enzimas, haciendo que la enzima sea más sensible a la desnaturalización,
como resultado probable de la alteración de los enlaces no covalentes,
Fig. 5 – Gráficos tipo Arrhenius utilizados para estimar los
incluidas las interacciones hidrófobas (Melikoglu et al. ., 2013). Se ha informado
parámetros termodinámicos de la inactivación térmica de la preparación
que la eliminación de un grupo ­CH2­ de un enlace hidrofóbico requiere una
enzimática comercial de Aspergillus aculeatus , ya sea en forma libre
energía de aproximadamente 5,4 kJmol­1 (Pace, 1992). Por lo tanto, podemos
() o inmovilizada en perlas de quitosano ( ), utilizando actividad hidrolítica.
estimar que la formación del estado de transición que precede a la
desnaturalización de la FTasa libre e inmovilizada requirió, en promedio, la
ruptura de 43,4 y 44,3 enlaces no covalentes, respectivamente. En otras
La protección contra la inactivación por calor inducida por la inmovilización se palabras, se puede inferir que la inmovilización covalente de FTasa pudo evitar
puede atribuir a la formación de una serie de cova­ la ruptura de uno de estos enlaces.
enlaces prestados entre las perlas de quitosano y la enzima, que pueden haber
disminuido la flexibilidad conformacional, el despliegue, las vibraciones térmicas
y, en consecuencia, la desnaturalización de la enzima (Karam et al., 2017) y/o El desarrollo de la estructura enzimática suele ir acompañado de un mayor
la interacción restringida entre las moléculas de la enzima (Pal y Khanum, grado de desorden o aleatoriedad, que se describe mediante la entropía de
2011) . Tal aumento de la estabilidad fue confirmado por el llamado factor de activación de la desnaturalización (S*d), es decir, la cantidad de energía por
estabilización, es decir, la relación entre las vidas medias de las enzimas libres grado de temperatura involucrada en la transformación de un estado nativo a
e inmovilizadas, que varió entre 2,19 y 2,01 en el rango de temperatura de 55 un estado natural. uno desnaturalizado (Marangoni, 2003). Los valores
a 70 ◦C, de manera consistente con lo informado por otros estudios. autores positivos de este parámetro para ambas preparaciones enzimáticas (Cuadro
para la inmovilización covalente de diferentes enzimas utilizando como reactivo 5) son consistentes con un aumento en tal grado (Saqib et al., 2010)
bifuncional (Mateo et al., 2007). cualitativamente similar al reportado para Rhodutorula sp. libre e inmovilizada.
FTasa (Aguiar­Oliveira y Maugeri, 2011).
Las gráficas semilogarítmicas de los valores D vs. la temperatura
permitieron obtener curvas de Tiempo de Muerte Térmica, a partir de cuyas El G*d es el parámetro más preciso y confiable para predecir y evaluar la
pendientes estimamos constantes de resistencia térmica (valores Z ) casi termoestabilidad enzimática porque incorpora las contribuciones entálpicas y
coincidentes para libres (9,1 ◦C; R2 = 0,989) e inmovilizados (9,0). ◦C; R2 = entrópicas. Un valor menor o negativo de dicho parámetro se asocia con un
0,953), destacando así una sensibilidad similar al aumento de temperatura proceso más espontáneo, es decir, la enzima se vuelve menos estable y se
(Tayefi­Nasrabadi y Asadpour, 2008). Por lo tanto, el valor Z ligeramente desnaturaliza más fácilmente, mientras que un aumento en G*d es un índice
inferior de la enzima inmovilizada en comparación con la libre sugiere que la de mejor resistencia a la desnaturalización ( Souza et al., 2015). Los valores
inmovilización ha hecho que la FTasa sea ligeramente más sensible a un de G*d para la FTasa libre e inmovilizada fueron bastante altos, variando en
aumento de temperatura que a la duración del tratamiento térmico. los rangos 109,3­103,9 kJmol­1 y 111,3­103,6 kJmol­1, respectivamente, con
valores ligeramente más altos para la inmovilizada. El aumento observado en
Es probable que la inmovilización covalente, debido a su falta de especificidad, G*d y el aumento relacionado en la termoestabilidad inducido por la
involucrara varios grupos amino laterales diferentes de las moléculas de enzima inmovilización covalente ya se informó para diferentes enzimas (Karam et al.,
o, mejor aún, cada molécula de enzima haya reaccionado a través de diferentes 2017; Pal y Khanum, 2011; Silva et al., 2018a). Estos parámetros
grupos amino. Por tanto, la termoestabilidad resultante puede haber sido un termodinámicos tomados en conjunto confirman la excelente termoestabilidad
resultado medio, mejor o peor que el de la enzima libre dependiendo de los de ambas preparaciones, así como la capacidad intrínseca mejorada de las
grupos amino principalmente implicados en la unión. Por el contrario, se cadenas polipeptídicas enzimáticas para enfrentar el despliegue térmico a
informó una disminución en los valores Z inducida por la inmovilización para altas temperaturas debido a la inmovilización.
la xilanasa unida covalentemente a perlas de alginato (Pal y Khanum, 2011) y
la pectinasa unida a perlas de gel de alginato­agar (Wahab et al., 2018).

Los gráficos de tipo Arrhenius de la Fig. 5 nos permitieron estimar energías 3.8. Actividad integral de ambas formas de Pectinex.
de activación de la inactivación térmica irreversible (E*d) de 237,0 kJmol­1 (R2
= 0,989) para libre y 242,2 kJmol­1 (R2 = 0,998) para FTasa inmovilizada. . Como se analizó en otras secciones, las preparaciones de enzimas libres e
Estos valores pueden considerarse particularmente altos en comparación con inmovilizadas mostraron características operativas deseables que les
los de la mayoría de los sistemas enzimáticos (Porto et al., 2006), lo que permitirían aplicarse industrialmente en la síntesis continua de FOS (Aguiar­
confirma la alta termoestabilidad de ambas formas de la enzima evidenciada Oliveira y Maugeri, 2011; Vanková et al., 2008). En vista de esta posibilidad,
ˇ
tempranamente por los otros parámetros. Además, cuanto mayor era el valor estudiamos el comportamiento temporal de la actividad hidrolítica integral de la
E*d estimado para la enzima inmovilizada, mayor era el aumento de enzima, P (t), como se define en la ecuación. (10), que está relacionado con la
temperatura necesario para inactivarla, es decir, era más compacta y resistente cantidad de sustrato (sacarosa) hidrolizada por 1,0 g de biocatalizador en
al calentamiento que la libre (Pal y Khanum, 2011). El condiciones de alimentación continua. Tal parámetro fue estimado
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Procesamiento de alimentos y bioproductos 1 2 2 ( 2 0 2 0 ) 169–182 179

3.9. Síntesis de FOS en reactor de lecho compacto.

La síntesis de FOS, catalizada por la preparación enzimática comercial Pectinex

Ultra SP­L inmovilizada en perlas de quitosano, se estudió bajo alimentación
continua en un reactor de lecho compacto durante 100 minutos de operación. La
mezcla final de FOS contenía 25,73 g/L de FOS y estaba compuesta de 1­
kestosa (23,77 g L­1) y nistosa (1,96 g L­1), sin embargo, no se detectó
producción de 1­fructofuranosilnistosa. Estos resultados indican que el tiempo de
reacción fue insuficiente para que la 1­kestosa haya sido utilizada como donante
de residuo de fructosilo para completar el alargamiento de la cadena glicosídica,

lo que sugiere que sólo la sacarosa pudo haber actuado como aceptor y donador
de fructosilo para FOS. formación (Antosová et al., 2008). Nascimento et al.
(2016) informaron un comportamiento similar para una ­fructofuranosidasa cruda
ˇ
de Penicillium citreonigrum, pero con una concentración de sacarosa más baja
(20% w v­1).

4. Conclusiones

Pectinex Ultra SP­L, una preparación enzimática de calidad alimentaria con

actividad transfructosilante, se inmovilizó satisfactoriamente en perlas de quitosano
mediante enlaces covalentes manteniendo altos niveles de actividad FTasa
después del proceso de inmovilización (rendimiento de inmovilización > 95%). La
enzima inmovilizada exhibió muchas propiedades industrialmente interesantes,
Fig. 6 – Gráfico del logaritmo de la actividad hidrolítica integral (lnP) versus el
como una mayor termoestabilidad que la enzima libre, así como una alta
logaritmo del tiempo (lnt) de FTasa libre (A) de Aspergillus aculeatus
reutilización y estabilidad en almacenamiento. El estudio cinético/termodinámico
y FTasa inmovilizada en perlas de quitosano (B) a diferentes temperaturas.
de la enzima libre e inmovilizada indicó que ambas preparaciones eran altamente
termoestables, especialmente la última. La enzima inmovilizada pudo producir
FOS de manera eficiente en un reactor de lecho compacto. Estos resultados
podrán aprovecharse para el desarrollo de un nuevo bioproceso para la producción
de fructooligosacáridos utilizando sacarosa como sustrato.
acoplados en los rangos de temperatura de 55 a 65 ◦ C y 55 a 70 ◦ C para
preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas, respectivamente, y representados
versus el tiempo en gráficos bi­log (Fig. 6). Todas las curvas crecieron linealmente
con casi la misma tasa inicial, que disminuyó apreciablemente cuando se Conflictos de interés
aumentó la temperatura debido a una desnaturalización más rápida de la enzima
a largo plazo. Una posible razón para la actividad inicial significativamente menor Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
de la enzima inmovilizada a 75 ◦C es una disminución de la actividad inicial
dependiente de la temperatura, que no pudo evidenciarse a 55­70 ◦C para ambas Reconocimiento
formas de la enzima. El mismo comportamiento cualitativo fue reportado por Silva
et al. (2018b) para la proteasa de Aspergillus tamarii purificada . Rodrigo Lira de Oliveira agradece a FACEPE (Fundación para Ciencia y
Tecnología del Estado de Pernambuco, Brasil) por la beca de doctorado (beca
Dado que una termoestabilidad mejorada de la enzima a menudo se ve IBPG­0141 5.07/16).
contrarrestada por una disminución de la actividad a largo plazo, se debe buscar Tatiana Souza Porto agradece a la Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de
un equilibrio entre estas tendencias opuestas para seleccionar las mejores Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES), Código de Finanzas:
condiciones para la conducción del bioproceso (Porto et al., 2006). En vista de 23038.003634/2013–15, y al CNPq(Consejo Nacional de Desarrollo Científico y
esto, se calcularon las actividades integrales hasta la vida media (P1/2) para Tecnológico, Brasil), Finanzas código 471773/2013–1, para el apoyo financiero.
ambas preparaciones de enzimas, cuyos valores también se enumeran en la Los autores agradecen la financiación proporcionada por la Universidad Federal
Tabla 5. A todas las temperaturas probadas, los valores de P1/2 de la enzima Rural de Pernambuco también para la infraestructura del laboratorio.
inmovilizada fueron mayores. que los del libre, confirmando su preferencia por
realizar un proceso continuo. La simulación de la actividad hidrolítica integral es estructura.

especialmente útil para la síntesis de FOS porque la hidrólisis de sacarosa es

responsable de la liberación de glucosa y fructosa, y los grupos fructosilo se Apéndice A. Datos complementarios
transfieren posteriormente formando oligosacáridos. Tal simulación indica una
termoestabilidad satisfactoria de ambas preparaciones enzimáticas a temperaturas Los datos complementarios asociados con este artículo se pueden encontrar, en
superiores a las comúnmente utilizadas en la síntesis industrial de FOS (50 ◦C) la versión en línea, en https://doi.org/10.1016/j.fbp.2020.05.001 .
mediante un proceso enzimático continuo (Vanková et al., 2008). Sin embargo,
la implementación exitosa del uso de enzimas libres e inmovilizadas requeriría
ˇ
investigar su estabilidad durante períodos de tiempo más largos y relacionar su Referencias
actividad residual con las variaciones de formulación bajo diferentes condiciones
de reacción. Aguiar­Oliveira, E., Maugeri, F., 2011. Estabilidad térmica del
fructosiltransferasa inmovilizada de Rhodotorula sp. Braz. J.
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