EJERCICIOS
Unidad didáctica 3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos
1. Indica qué tipo de pretratamientos aplicarías a las siguientes muestras para iniciar
un proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos y qué materiales o
reactivos emplearías.
a) Cultivo celular en monocapa. Hay dos posibilidades, 1 - Deberemos de utilizar el
frasco para realizar la extracción correctamente o 2 - Debemos de utilizar otro
recipiente para traspasar el cultivo celular a un tubo de ensayo. Las sustancias a utilizar
serian las soluciones tampón, las enzimas o las soluciones salinas.
b) Esputo Para iniciar a operar con el esputo deberemos de someterlo a un proceso de
fluidificación del mismo por medio de un agente mucolítico como lo son los
pertenecientes al grupo N-Actetil-L-Cisteína o comunmente llamados NAC, todo ello
trabajando con un disolución de nitrato sódico como base.
c) Sangre Esta compuesto por 4 pasos principales que serían los siguientes : 1 - Lísis de
los hematíes, 2 - Centrifugación de la muestra de sangre, 3 - Eliminación del
sobrenadante después de realizar la centrifugación y por último, 4 - Conservación de las
sustancias sedimentadas o pellet. La solución lisante es muy utilizada en este
procedimiento.
d) Tejido vegetal fresco. Para poder tratar con una muestra de este material deberemos
de homogenizarlo primero para luego someterlo a un tratamiento especial para lograr
eliminar la pared celular. Al tratarse de un tratamiento con células con presencia de
pared celular se usan muchos reactivos diferentes.
e) Biopsia de tejido animal fijado en formol e incluido en parafina. Para tratar con este
tipo de sustancias deberemos de someter la muestra a la desparanificación, que
consiste en la eliminación de la parafina de los tejidos FFPG, para ello se utiliza
principalmente el microtomo.
2. Relaciona las siguientes muestras con el pretratamiento adecuado previo a la
extracción de ácidos nucleicos:
1 - e, 2 - d, 3 - a, 4 - b, 5 - c
3. Respecto de la extracción de ácidos nucleicos, nombra:
a) Dos procesos fundamentales para conseguir una buena extracción. Lisis celular e
inactivación de las nucleasas
b) Dos detergentes utilizados en soluciones de lisis celular. SDS y CTAB
c) Dos agentes inactivadores de nucleasas. Proteasas o EDTA
d) Dos enzimas que digieran la pared bacteriana o vegetal. Lisozima o Zimolasa
4. A continuación se especifican los componentes principales de tres soluciones de
lisis utilizadas para extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas:
Solución de lisis 1 Solución de lisis 2 Solución de lisis 3
EDTA EDTA EDTA
SDS SDS CTAB
Proteinasa K Lisozima Proteinasa K
A la vista de estos componentes:
a) Especifica qué solución usarías para extraer ADN de las siguientes muestras.
Muestra Solución de lisis
Tejido animal congelado Solución de lisis 1
Cultivo de bacterias grampositivas Solución de lisis 2
Leucocitos de sangre periférica Solución de lisis 1
Cultivo de células animales Solución de lisis 1
Suspensión de células vegetales Solución de lisis 3
Biopsia fijada en formol e incluida en parafina Solución de lisis 1
Células nucleadas de médula ósea Solución de lisis 1
b) ¿Qué componente añadirías a estas soluciones de lisis para poder extraer ARN?
Isocianato deguanidinio
5. Explica brevemente en tu cuaderno la funcionalidad de las siguientes enzimas
empleadas en la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas:
a) Proteinasa K Inactiva nucleasas
b) Lisozima Digiere la pared celular de las bacterias gram +
c) Liticasa Digiere la pared celular de las bacterias, hongos y levaduras.
d) ARNasa Elimina el ADN de las muestras biológicas.
6. Se quieren purificar ácidos nucleicos a partir de un lisado de células de mucosa oral
utilizando el método de purificación con solventes orgánicos. Para ello, en un tubo
limpio se mezcla 1 ml de lisado con 1 ml de una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1). Tras agitar y centrifugar se obtienen dos fases. Indica el nombre
de cada fase, sus componentes principales, los procesos implicados y los reactivos
empleados.
1. Precipitación del ADN, 2. Lavado del ADN, 3. Resuspensión del ADN
A. Fase acuosa, B. Fase orgánica, C. Isopropanol + Acetato Sódico, D. Fase acuosa, E.
Etanol, F. Solución Tampón TE.
7. Relaciona los métodos de purificación de ácidos nucleicos siguientes con los
respectivos fundamentos que corresponden:
1 - D, 2 - E, 3 - A, 4 - B, 5 - F, 6 - C
8. Escribe la función que cumplen los siguientes reactivos en la purificación de
plásmidos por el método de lisis alcalina: dodecilsulfato sódico en el tampón de lisis,
hidróxido sódico en el tampón de lisis, acetato potásico en la solución de
neutralización a pH 4,8 y ARNasa.
● Dodecil sulfato sódico en el tampón de lisis (SDS). Funciona como detergente.
Interviene en la solubilización de membranas y paredes, liberando el contenido
citoplasmático al medio.
● Hidróxido sódico en el tampón de lisis. Desnaturalización del ADN
● Acetato potásico en la solución de neutralización a pH 4,8. Provoca reasociaciones
aleatorias de la cadena de ADN y la precipitación de proteínas. El ADN plasmídico
renaturaliza perfectamente.
● ARNasa. Degradan el ADN presente en el medio.
9. Escribe si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones relativas a la
purificación de ARN y justifica la respuesta:
a) Las ARNasas se pueden eliminar esterilizando con autoclave. La tempeatura del
autoclave para eliminar las ARNasas.
b) La solución de lisis debe contener un agente caotrópico, como el isotiocianato de
guanidinio. Verdadero
c) Las soluciones de trabajo deben contener EDTA porque inhibe las ARNasas. La
solución EDTA no inhibe las ARNasas sino que inhibe las ADNasas.
d) Todos los reactivos empleados deben fabricarse con agua tratada con DEPC.
Verdadero
e) El agua tratada con DEPC tiene que autoclavarse antes de su utilización. Verdadero
10. Escribe si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones relativas a la
integridad de los ácidos nucleicos tras la purificación y justifica la respuesta:
a) La electroforesis en gel de agarosa es la técnica de elección para comprobar la
integridad de los ácidos nucleicos. Verdadero
b) En la electroforesis de una muestra de ARN total no degradado de un organismo
eucarionte se observan dos bandas nítidas correspondientes a los ARNr 28S y 18S,
junto con un ligero smear por el ARNm. Verdadero
c) La mejor muestra para purificar ADN es el tejido fijado en formol e incluido en
parafina, porque la fijación con formol conserva perfectamente la integridad de los
ácidos nucleicos. Falso. No se recomienda realizar este proceso por su elevada
inexactitud y por la falta de integridad de la muestra
d) Cuando el ADN se degrada, en la electroforesis se observa un smear, cuya amplitud e
intensidad depende del grado de fragmentación y degradación del ADN. Verdadero
e) En la electroforesis de ADN plasmídico íntegro se observan múltiples bandas por la
formación de dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. En la electroforesis de ADN
plasmídico íntegro se observa una única banda nítida correspondiente al ADN
plasmídico en su estructura nativa. También se puede observar una segunda banda
correspondienteadímeros.
