Guía a los laboratorios de

Microbiología

Área Injuria 2023

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología
Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Rosario
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Introducción
P lantel docente
Objetivos generales de la asignatura
Distribución y carga horaria
Bibliografía sugerida por la Cátedra
Laboratorio de habilidades Nº1: El personal de salud como agente injuriante
Bioseguridad
Riesgo biológico
Ignaz Semmelweis: ¡Dejen vivir a las madres!
El lavado de manos para la Salud
La zona del paciente
Indumentaria y accesorios en el equipo de salud
Residuos hospitalarios
Clasificación y manejo de los residuos - Ley Nac. Nº 24051/92 (Decreto Reglamentario 831/93 P EN. Resolución
349/94).
Almacenamiento y transporte
T ratamiento de los residuos
Inmunizaciones obligatorias para el personal de salud (P revención primaria)
Inmunización COVID-19
P revención secundaria para el personal de salud
¿Cómo actuar una vez ocurrido el accidente cortopunzante?
Lo que te corresponde como alumno de la Facultad de Ciencias Médicas UNR: ¿Que hacemos si tenemos un accidente
corto punzante?
Material complementario 1: Equipo de P rotección P ersonal (EP P )
Barbijos
P recauciones o medidas de aislamiento
BIBLIOGRAFÍA
Laboratorio 2: Ciclo diagnóstico. Toma de muestras, conservación y transporte
Elección de métodos de laboratorio microbiológico clínico
Recolección de muestras biológicas
Conservación y transporte
En el laboratorio de Microbiología Clínica
Métodos directos
Observaciones macroscópicas
Observaciones microscópicas
Observación en fresco
Observación por campo oscuro
Observación por coloración
Examen microscópico de infecciones bacterianas
Examen microscópico de infecciones fúngicas
Observación microscópica en fresco
Observación microscópica por coloraciones
Examen microscópico de infecciones parasitarias
Observación microscópica en fresco
Observación microscópica por coloraciones
Examen microscópico de infecciones virales
Laboratorio 3: Métodos directos (P arte I)
Cultivo y aislamiento del agente etiológico
Medios de cultivo
Ver el video
Temperatura de crecimiento
P otencial de hidrógeno (pH)
Atmósfera
Humedad
T iempo de incubación
Siembra y aislamiento
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Incubación
Desarrollo
Cultivo micológico
El cultivo en parasitología
El cultivo en virología
Identificación de microorganismos
- Antibiotipo
Métodos moleculares
Identificación de hongos filamentosos
Laboratorio de habilidades N° 4: Métodos directos (P arte 2)
Antimicrobianos: reseña histórica
Definición y clasificación de los fármacos antimicrobianos
Mecanismos de resistencia antimicrobianos
T ipos de resistencia
Mecanismos de resistencia
P ruebas de sensibilidad antimicrobiana (P SA)
¿P ara qué se realizan?
¿En qué consisten?
¿P or qué son importantes?
T écnicas para determinar la sensibilidad antimicrobiana in vitro
¿Cuáles y cuántos AMB ensayamos?
T écnicas de dilución
T écnica de difusión (Método de Kirby-Bauer)
T écnica mixta (método epsilométrico o por gradiente de concentración AMB)
Detección de mecanismos de resistencia a los AMB
Interacción antimicrobiana
Bacterias especiales: Micobacterias
Método de las proporciones
Diagnóstico molecular genómico
Hongos
P arásitos
Virus
Laboratorio de habilidades Nº5 - Diagnóstico Clínico Molecular
Objetivos
Mapa conceptual
Las “ Ómicas”
T ranscriptómica
Metabolómica
P roteómica (huella peptídica)
Genómica aplicada al diagnóstico clínico molecular
T écnicas de hibridación
T écnicas de amplificación (P CR)
Son las técnicas genéticas mas utilizadas en los laboratorios de microbiología clínica, existen numerosas variantes pero la
mas usada para estos fines es la P CR (reacción en cadena de la polimerasa).
- Reacciòn en cadena de la polimerasa (P CR)
¿Cómo funciona la P CR convencional?
¿Cómo vemos el resultado?
¿Qué otros tipos de P CR existen?
Detecciòn de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos
T écnicas de secuenciación
Epidemiología molecular
Glosario
Laboratorio de Habilidades Nº 6: Métodos Inmunológicos (Directos e Indirectos)
Inmunidad
Antígeno
Anticuerpo

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La interacción in vitro Ag - Ac
P roducción de anticuerpos monoclonales
P roducción de anticuerpos monoclonales por medio de la técnica de hibridación.
T itulación
¿Qué necesitamos para la realización de estas técnicas?
Aglutinación
Inmunofluorescencia - Directa (IFD) o Indirecta (IFI)
EIA (Enzimoinmunoanálisis)
Quimioluminiscencia (CLIA: ChemiLuminescent Immunoassay)
Electroquimioluminiscencia (ECLIA: Electro Chemi Luminescent ImmunoAssay)
Inmunocromatografía
Western blot
Inmunidad Celular

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Introducción
Desde la antigüedad, los seres humanos observaron que los alimentos se deterioran y algunas veces se
transforman bajo ciertas condiciones. Asimismo, se sospechaba que era posible la transmisión de
ciertos elementos de personas enfermas a sanas. Girolamo Fracastoro en 1546 llamó a estos últimos
“gérmenes de contagio ”.

Con el desarrollo de la Física, la Química y la Medicina en la época del Renacimiento y durante el

período de la Revolución Industrial, en Europa Occidental y en Rusia se acumularon observaciones y
resultados de investigaciones científicas acerca de las enfermedades infecciosas.

Por su parte, la Microbiología comienza a desarrollarse gracias a los progresos de la óptica; a

comienzos del siglo XVIII, los investigadores comienzan a descubrir el mundo misterioso de los
microorganismos que era desconocido hasta entonces. Fue el mercader holandés Antony Van
Leeuwenhoek (1632-1723) el primero en ver y describir los microbios al construir su primer
microscopio simple con el objetivo de evaluar la calidad de las telas que comerciaba. Su enorme
curiosidad le hizo dirigir su microscopio hacía muestras de agua provenientes de estanques donde pudo
observar pequeños organismos unicelulares de vida libre que llamó “animálculos”. Los microscopios
simples lograron un aumento de hasta trescientas veces.

Un siglo después, el Dr. Robert Koch enunció sus postulados y puso a los microorganismos en el
centro de una nueva ciencia, que los estudiaba como agentes etiológicos de algunas enfermedades.
Nace aquí la especialidad que hoy llamamos MICROBIOLOGÍA MÉDICA.

En la actualidad, los laboratorios que se ocupan del diagnóstico microbiológico clínico, desarrollan su
actividad en distintos niveles de complejidad, dependiendo de la cantidad, tipo y calidad de las muestras
y sobre todo de la disponibilidad y recursos económicos de cada uno.

Numerosos equipos de investigación, tienen el propósito de lograr pruebas diagnósticas cada vez más
rápidas, sensibles, específicas, precisas, de bajo costo y que puedan llegar a resolver problemas donde
la infraestructura es mínima. Esta innovación diagnóstica va camino al desarrollo de la nanotecnología
que tiende a la miniaturización de pruebas confiables donde se determinen biomarcadores específicos
para cada patología.

Cuanto más preciso sea un resultado emitido, el tratamiento será más adecuado y el seguimiento más
oportuno, reduciendo significativamente el número de pacientes tratados sin necesidad o de modo
incorrecto.

Hoy por hoy, todo el equipo de salud afronta nuevos desafíos para el control de las infecciones (ej:
pandemia de Covid-19) que hacen esencial disponer de resultados fiables, rápidos y de calidad desde el
laboratorio de microbiología clínica. Hoy, más que nunca, los profesionales que trabajan en ellos
necesitan dar soluciones que acompañen el cambio, al mismo tiempo que refuerzan a diario la calidad
de los resultados.

En estos laboratorios deseamos presentarle cómo, desde el laboratorio microbiológico clínico, podemos
descubrir el fascinante mundo microbiano capaz de injuriar al ser humano.

Equipo docente de la cátedra

Plantel docente
Prof. Tit. Dra. Telma Gambandé
Prof. Asoc. Dra. Adriana Ponessa

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Prof. Adj. Dra. Marcela Raimondi

Beltramo, Celeste Gandini, Virginia Ortiz, Nadia

Benzzo, Guillermo Gonzalez, Daniel Paz, Natalí
Brandolisio, Nahuel Faggi, Celina Radzivoncik, Verónica
Bulfoni, Mariana Levy, Bruno Rateni, Liliana
Careno, Ernesto Madohery,Roberta Vila, Helvio
Córdoba, Laura Margaría, Verónica
Fernández, Germán Morbidoni, Héctor

Ayudantes:
Cipolatti, Bruno
Martín, Julieta
Morello, Bruno
Forte, Martín

Personal técnico: Rádice, Giselle

Secretario: Fornasari, Adrián

Objetivos generales de la asignatura

1. Fomentar el autoapre ndizaje facilitado, como una excelente herramienta para incorporar
sistemáticamente nuevos conocimientos y habilidades.
2. Concientizar acerca de la necesidad del trabajo colaborativo e n e l e quipo de salud a fin de
utilizar y/o interpretar el diagnóstico microbiológico temprano y certero para el abordaje
terapéutico precoz y la mejora pronostica del proceso infeccioso.
3. Establecer las prioridade s de re cursos e n salud, en el medio y la sociedad, en los cuales el
futuro profesional desarrollará sus actividades.

Distribución y carga horaria

a. 1 se minario se manal (2 hs. de duración – 14 e n total)
En estos seminarios se presentarán los agentes microbianos más frecuentes causantes de patología
infecciosa humana (bacterias, hongos, parásitos y virus). Metodología: Exposición oral con recurso de
presentaciones en Powerpoint. Los videos serán subidos al canal oficial de Youtube de la Cátedra,
cuyo link figura al comienzo de esta guía.

b. Laboratorios de habilidade s (2 hs. de duración - 6 e ncue ntros e n total)

Se analizarán exclusivamente los recursos de diagnóstico microbiológico disponibles en los laboratorios
en la actualidad.
Material: guías de estudio, disponible en versión electrónica, para descargar desde el aula virtual de la
Cátedra o drive cuyo link está en la cuenta oficial de Twitter y videos subidos al canal oficial de
Youtube de la Cátedra

c. Tare as e xtramuro
Preguntas de autoevaluación sobre cada tema del seminario. Estarán disponibles para los alumnos con
posterioridad al dictado del seminario correspondiente. Esta actividad es de carácter optativo.
Lectura y resolución de actividades propuestas en las guías de laboratorios.

d. Horarios de consulta se manale s (optativos)

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El cronograma de horarios de consulta está disponible en el transparente de la cátedra y será publicado

en el transparente virtual de la Facultad. Pasados 15 minutos del horario de comienzo de la consulta sin
presentación de alumnos se da por finalizada la misma. Mientras estén abiertas las mesas de examen
no se atenderán consultas.

e. Toda la información re le vante se rá publicada e n Twitte r y transpare nte virtual (Links

más adelante)

Bibliografía sugerida por la Cátedra

1. Guías para los laboratorios y material complementario de Injuria 2023, elaborados por la
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología. Facultad de Ciencias Médicas.
2. Presentaciones correspondientes a los seminarios dictados por la Cátedra de Microbiología,
Virología y Parasitología. Facultad de Ciencias Médicas.
3. Prats G. Microbiología y Parasitología Médicas. Ed. Médica Panamericana. 2013.
4. Picazo, JJ; Prieto, J. Compendio de microbiología. 2da. edición. Elsevier. 2016.
5. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Microbiologia Médica. 8va. ed. Elsevier. 8va. edición.
Elsevier. 2017.

Para tener en cuenta antes de comenzar los laboratorios disciplinares…

1. Concurrir con guardapolvo, este último restringido únicamente al interior del laboratorio. Debe
ser de uso exclusivo y personal del alumno, no prestarse, lavarse periódicamente y
preferentemente guardarlo en bolsa de polietileno antes de salir.
2. Traer leído el material bibliográfico para cada laboratorio.
3. Prohibido beber, comer y/o fumar dentro del área interior de la cátedra.
4. No ingresar al laboratorio de habilidades con libros, mochilas, bolsos, etc. Estos deben
guardarse en los armarios para tal fin dispuestos al ingreso.
5. Si lleva celular, este deberá permanecer apagado (con excepción, por causa justificada lo
autorice previamente el docente a cargo).
6. Si la actividad a realizar lo requiere, se deben utilizar guantes de látex o manoplas.
7. No salir del laboratorio con ningún elemento de protección mientras dure la actividad
programada.
8. Desechar los materiales contaminados y cortopunzantes en los recipientes adecuados.
9. No comenzar a trabajar hasta que el docente no haya terminado con las indicaciones y
aclarado todas las dudas.
10. En caso de un accidente cortopunzante, derrame de material contaminado, etc. que pudiera
ocurrir: no se mueva del lugar, avisar de inmediato al docente.

Al finalizar el laboratorio y antes de salir: Lavarse las manos con agua y jabón,
secándose con papel absorbente o utilizar alcohol-gel.

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Dirección postal: Santa Fe 3100 - CUAS IV- 1er. Piso

- Ala Norte – (2000) Rosario

E-mail: [email protected]

Twitter: @microfcmunr

Canal de youtube

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Laboratorio de habilidades Nº1: El personal

de salud como agente injuriante

Obje tivos de l laboratorio:

- Incorporar nociones de bioseguridad, riesgo biológico y niveles de bioseguridad.
- Jerarquizar al lavado de manos como instrumento de prevención.
- Desechar correctamente todos los residuos producidos en un ambiente hospitalario.
- Conocer las inmunizaciones necesarias en el equipo de salud.
- Comprender el concepto de accidente de riesgo en el trabajo (ART). Accidentes
cortopunzantes: secuencias de pasos a seguir.

“Parece un principio extraño de enunciar, que el primer requerimiento en un hospital sea “no
producir daño a los enfermos”
Florence Nightingale (Enfermera - 1820-1910)

"Uds. deben ser capaces de ver con los ojos de la mente los gérmenes, de forma tan
diferenciada como vemos moscas u otros insectos con el ojo corporal. Si Uds. pueden verlos
realmente en esta forma diferenciada con su ojo intelectual, pueden tomar medidas contra
ellos, si no los ven, están expuestos constantemente a relajarse en sus precauciones"
Joseph Lister (1827-1912)

Bioseguridad
Es el conjunto de principios, normas, técnicas y prácticas que deben aplicarse para la prote cción de l
individuo, la comunidad y e l me dio ambie nte , frente al contacto natural, accidental o deliberado
con agentes que son potencialmente nocivos. Por lo tanto, implica la adopción sistemática de medidas
orientadas a re ducir e l rie sgo que puedan conllevar las actividades del ámbito sanitario.

Se debe pensar como una serie de re glas de comportamie nto destinada a lograr actitudes y
conductas que disminuyan el riesgo del personal de salud y del paciente.

La dirección de las instituciones sanitarias, los jefes de cada servicio, el sector de seguridad laboral e
higiene y el comité en control de infecciones institucional son los encargados de minimizar los riesgos
por medio de:
- Manuales de procedimientos: elaboración, actualización y cumplimiento
- Capacitación y educación permanente del personal sanitario
- Personal debidamente entrenado acorde a la actividad que realiza
- Establecimiento de precauciones estándar para todos los pacientes en toda instancia de
atención. (Llamamos precauciones estándar a la utilización de guantes, anteojos, lavado de
manos, utilización de contenedores rígidos para material punzante, etc).
- Calidad y cantidad suficiente de insumos necesarios para el desarrollo de las tareas.
- Relación adecuada entre paciente/personal de salud (cuanto mayor número de pacientes por
personal, mayor riesgo de accidente laboral)

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- Educación continua para todo el personal hospitalario.

Riesgo biológico
Se define como la posible e xposición a microorganismos que pue dan dar lugar a
e nfe rme dade s .

La transmisión puede ser por vía aérea, sanguínea, digestiva o por contacto directo de piel o mucosas:
- La transmisión por vía sanguíne a constituye uno de los principales riesgos laborales a los
que están expuestos los trabajadores de la Salud.
- Las manos de l pe rsonal de salud se colonizan con microorganismos del medio hospitalario
(patógenos o no) que pueden transferirse por contacto directo a los pacientes. Los estudios
realizados en el mundo demuestran que menos del 50% de los trabajadores de la salud realiza
en manera habitual el lavado de manos (Pittet D. “Improving compliance with hand hygiene
in hospitals” Infect Control Hosp Epidemiol 2000).

Las infe ccione s re lacionadas con la ate nción sanitaria (IRAS) suponen una tremenda carga de
enfermedad y tienen un importante impacto económico en los pacientes y los sistemas sanitarios de
todo el mundo.

Las medidas de prevención disminuyen el riesgo de transmisión del agente biológico, siendo
fundamental seguir las "precauciones estándar": Vacunación, higiene personal, uso de equipo de
protección (de barrera), prevención de accidentes cortopunzantes.

¿Qué e s una infe cción re lacionada con la ate nción sanitaria?

Se define como «aquella infección que afecta a un paciente durante el proceso de asistencia en un
hospital u otro centro sanitario, que no estaba presente ni incubándose en el momento del ingreso.
Incluye, también, las infecciones que se contraen en el hospital pero se manifiestan después del alta,
así como las infecciones ocupacionales del personal del centro sanitario».
Los microorganismos responsables pueden ser virus, hongos, parásitos y, con mayor frecuencia,
bacterias.

Ignaz Semmelweis: ¡Dejen vivir a las madres!

Joven médico húngaro (1818-1865) ejerció su profesión en la Primera División de Maternidad del
Hospital General de Viena (Austria) junto a médicos y estudiantes de medicina. En esa división, una
parte de las parturientas sufrían de la llamada fie bre pue rpe ral, hecho que, en el mismo hospital, en la
Segunda División de Maternidad atendidas por parteras, ocurría con una incidencia 4 veces menor. La
situación llegó a ser muy conflictiva puesto que todas las parturientas solicitaban ser atendidas en la
2da. división.
Semmelweis empezó a investigar el problema, haciendo gala de un espíritu científico verdaderamente
encomiable, sometió a prueba cuanta hipótesis se le presentó o pudo elaborar, por ejemplo:
1. "Influencias epidémicas”, que se describen como "cambios atmosférico-cósmico telúricos". No
se pudo sostener. Las divisiones estaban muy próximas una a otra y además observó que en
las mujeres que tenían sus hijos en las calles, la incidencia de fiebre puerperal era menor.
Descartada .
2. Hacinamiento de pacientes: Había más pacientes en la 2da. que en la 1era. División.
Descartada .

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3. Inexperiencia de alumnos frente a la experiencia de las parteras. Se redujo la intervención de

los alumnos y la situación no varió. Descartada .
4. Psicológicas: En la noche se aproximaba un sacerdote a darle la bendición final a la moribunda
acompañada de un acólito que tocaba una campanita. Semmelweis lo convenció a que
silenciara la campanita. La situación no cambió. Descartada .
5. Posición para la recuperación: en la 2da. División las parturientas se recuperaban decúbito
lateral mientras que en la 1era. lo hacían de espalda. Cambió la posición de recuperación sin
resultados favorables. Descartada .
6. ¿MANOS, MANOS, MANOS…?

El Dr. Kolletschka fue herido en la mano por un bisturí de uno de sus estudiantes durante una autopsia
y muere de síntomas similares a los de las parturientas. Los mé dicos daban clase s de anatomía y
participaban e n dise ccione s y ne cropsias, con ropa de calle y usando sus manos de snudas.
De spué s, sin lavarlas, re visaban a sus pacie nte s y ate ndían partos.
Hoy resulta evidente que un médico no diseca el cuerpo humano sin protegerse mediante barreras
apropiadas pero eso no era tan evidente para los médicos del siglo XIX, que ignoraban la existencia de
microorganismos productores de enfermedades.
Semmelweis comprendió que la "materia cadavérica" que el bisturí del estudiante había introducido en
la corriente sanguínea había sido la causa de la muerte del médico con síntomas semejantes al de las
mujeres de su clínica. Esto llevó a Semmelweis a la conclusión de que sus pacientes habían muerto por
un “envenenamiento de la sangre” del mismo tipo: é l, sus cole gas y los e studiante s de me dicina
habían sido los portadore s de la mate ria infe cciosa, porque é l y su e quipo solían lle gar a la
1ra. División inme diatame nte de spué s de re alizar dise ccione s e n la sala de autopsias .

HIPÓTESIS APROBADA.

Argumentaba que se podría prevenir la fiebre puerperal lavándose las manos antes de pasar a la
atención de las parturientas. Dictó, por lo tanto, una orden por la que se exigía a todos los estudiantes
de medicina que se lavaran las manos con una solución de cal clorurada antes de atender alguna
enferma. La mortalidad puerperal comenzó a decrecer, desde 1842 (33% mortalidad) hasta 1848 que
descendió a un 1,27%. A pesar de estos logros debido a que obligó a lavarse las manos a su jefe fue
despedido del hospital.
Las sociedades médicas de Amsterdam, Berlín, Londres y Edimburgo condenaron sus aberrantes
teorías manteniéndose sorda, hostil, engreída y egocéntrica. Todos ignoraron y rechazaron su
descubrimiento.
Semmelweis tenía la razón, pero no el poder, y los poderosos de su tiempo decretaron que estaba loco
y lo encerraron en un psiquiátrico.
En 1865 en una de sus salidas autorizadas se introdujo en una sala de disecciones y delante de los
alumnos, abrió un cadáver y después con el mismo bisturí se provocó una herida contaminándola así
con “materia cadavérica”, la misma que, según su descubrimiento, causaba la fiebre puerperal. Pronto
enfermó y murió dejando escrito a un amigo: “Debo confesarte que mi vida fue un infierno, que desde
siempre la idea de la muerte de mis enfermos me resultó insoportable, sobre todo cuando esa muerte
se desliza entre las dos grandes alegrías de la existencia, la de ser joven y la de dar la vida”
El descubrimiento de Semmelweis no se tomó en cuenta hasta mucho después de su muerte y aún hoy
sigue costando esfuerzos para que se cumpla.

Te invitamos ahora que veas un cortometraje realizado en 1938 sobre este relato:

That mothers might live (1938). The story of Dr. Ignaz Semmelweis

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El lavado de manos para la Salud

Su aplicación se extiende a todos los pacientes que reciben asistencia, al margen de su diagnóstico, sus
factores de riesgo y su presunto estado infeccioso, disminuyendo el riesgo de que el paciente y el
personal del hospital contraigan una infección. Existen distintos tipos de lavados de manos según la
actividad que vayamos a realizar:
a. Lavado social: Con agua y jabón líquido común. Elimina la suciedad por arrastre y un bajo
número de microorganismos en forma mecánica.
b. Lavado antisé ptico : Se diferencia del lavado social por la té cnica e mple ada y e l tie mpo de
re alización. Se puede utilizar agua y solución jabonosa o en ciertas circunstancias jabón
antiséptico. Remueve y elimina la microbiota transitoria de la piel de las manos.
c. Frotado con solucione s de base alcohólica: Con preparaciones que contengan alcohol. Las
preparaciones de alcohol al 70% en gel han demostrado poseer efecto antiséptico efectivo ya
que reducen 98% del contenido microbiano en 30 segundos, y hasta el 99% en un minuto. Es
el lavado de manos preferencial en el ámbito sanitario por su eficacia y accesibilidad si las
manos no están visiblemente sucias o no sospechamos contaminación de manos con esporas
(no elimina esporas). Ej. Si un paciente está colonizado por esporas de Clostridioides difficile
es necesario, antes del lavado en base alcohólica, realizar el lavado con agua y jabón por
arrastre.
d. Lavado de manos quirúrgico : Con agua y soluciones jabonosas antisépticas (previo lavado
social). Se deben lavar las manos y antebrazos hasta el codo.

Té cnica de lavado de manos (Guide line for Hand Hygie ne in He althcare Se ttings. MMWR
2002; vol. 51,Nº RR)

1. Mojar las manos con agua

2. Coloque en el centro de la palma de la mano suficiente jabón líquido o el alcohol gel
3. Extienda friccionando una palma sobre otra.
4. Pase la palma de una mano sobre el dorso de la otra con los dedos entrelazados y frote
5. Friccione el dorso de los dedos de una mano sobre la palma de la otra
6. Friccione el pulgar abrazándolo con la palma de la otra mano
7. Frote en forma rotativa la yema de los dedos de una mano sobre la palma de la otra
8. Enjuague sus manos con agua.
9. Seque bien sus manos con aire o toalla de papel.
10. De no tener cierre automático de agua, cierre la llave con la misma toalla que se secó y luego
descártela en recipiente con bolsa negra.

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¿Cómo realizar antisepsia de las manos?

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Fu e n te : O rgan iz ación Mu n dial de la S alu d.

(h ttp://www.wh o.in t/gpsc/in form ation _ce n tre /gpsc_de sin fe ctm an os_poste r_e s.pdf, con su ltado 03/2015)

Te invitamos a ver un video para reflexionar acerca de la importancia del lavado de manos
Click aquì

El entorno del paciente

Incluye al paciente y todas las superficies inanimadas que toca o que se encuentran en contacto físico
directo, tales como las barandillas de la cama, la mesita de noche, la ropa de cama, tubos de infusión y
otro equipo médico. Además incluye las superficies que suelen tocar los profesionales sanitarios
cuando atienden al paciente, como monitores, picaportes y botones y otras superficies de contacto.

«Los cinco mome ntos para la

higie ne de las manos»

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Indumentaria y accesorios en el equipo de salud

Se busca un profesional de la salud QUE NO PROPAGUE INFECCIONES, SEGURO Y
CONFIABLE.
Se han realizado múltiples estudios respecto al papel de la ropa del personal de salud en la transmisión
de agentes patógenos y si bien esta relación no ha sido aún bien establecida se han emitido
recomendaciones prudentes (por ejemplo: recomendaciones Programa VIDHA (Argentina); guías de
la SHEA-Sociedad de Epidemiología Hospitalaria de EEUU, etc.).

Recomendaciones sobre la vestimenta del personal de salud durante la práctica médica:

a. Brazos sin cubrir de sde e l codo para abajo (mangas cortas): Las mangas largas arrastran
más microorganismos del ambiente en sus puños, sobre todo si están húmedas por ejemplo por
un lavado de manos anterior.
b. Sin bolsillos late rale s .
c. Color blanco o claro . Fundamentalmente que identifique su función, actividad o sector de
trabajo. Contar al menos con 2 guardapolvos o ambos CON ALTA FRECUENCIA DE
LAVADO (debe evitarse la vestimenta de color oscuro)
d. La institución debería lavarlas o tener un servicio de bajo costo. Puede realizarse con jabón,
agua caliente y secado en secarropas de aire caliente o planchado. Hay también productos
específicos para el lavado que llevan enzimas (proteasas, celulasas, amilasas y lipasas) que
fragmentan moléculas y pigmento de algunas manchas, facilitando su remoción.
e. Batas limpias y de scartable s : se utilizan cuando existe riesgo de contaminación con
secreciones y/o fluidos. Forman parte del equipo utilizado cuando se requieren precauciones
de contacto (para disminuir la transmisión por contacto directo o indirecto de microorganismos
desde un paciente colonizado o infectado a otro).
f. Calzado : debe ser cerrado (dedos cubiertos), sin cordones y de fácil higiene. Para evitar
accidentes mecánicos se recomiendan tacos bajos y suelas antideslizantes.
g. Pe lo corto o re cogido .

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Accesorios:
a. Sin estetoscopios compartidos (higie nizar e ntre pacie nte s ) ni llevados al cuello
b. EL USO DE GUANTES NO DESCARTA EL LAVADO DE MANOS. Se contaminan en
su superficie por contacto con la unidad del paciente y pueden contaminar luego otras
superficies: mesadas, teléfonos, tela adhesiva, etc. Las bacterias pueden penetrar a través de
los guantes debido a fallas de fabricación (18 %), rupturas o punciones no percibidas. Se
descartan en bolsa roja solo los que tienen sangre visible. No lavar los guantes para su
reutilización con diferentes pacientes.
c. Sin re loj ni pulse ras
d. Sin anillos : se asoció la contaminación de las manos con la presencia y cantidad, no con el
tipo de anillo
e. Sin corbatas : tres estudios coinciden que aproximadamente el 30% de las corbatas
estudiadas estaban colonizadas con microorganismos patógenos, siendo Staphylococcus
aureus el más prevalente. El 70% de los profesionales admitió que no la habían lavado nunca.
f. Uñas cortas, preferentemente sin esmalte o ≤ 2 días. Se recomienda no usar uñas postizas, en
pacientes de riesgo no se deben utilizar.
g. Sin celulares durante la práctica médica. Dejarlos en el office de trabajo o maletín, no llevarlos
en el bolsillo para que no entren en contacto directo con el paciente o el medio ambiente.

Vide os subidos al aula virtual que le s suge rimos:

Video 02: Normas de bioseguridad y equipos en el laboratorio de microbiología.

Video de lavado de manos

Residuos hospitalarios
La atención de la salud humana (o animal), así como también la investigación, son actividades que
generan residuos que deben manejarse en forma cuidadosa y, sobre todo, responsable.

Según la OMS, un re siduo infe ccioso es aquel capaz de provocar una enfermedad infecciosa, es
decir que contiene microorganismos patógenos en cantidades suficientes para que, como consecuencia
de su exposición, exista el riesgo de producir una infección.

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El principio básico es que todo el material infeccioso debe ser descontaminado, esterilizado en
autoclave o incinerado.

Clasificación y manejo de los residuos - Ley Nac. Nº 24051/92 (Decreto

Reglamentario 831/93 PEN. Resolución 349/94).

Residuos Hospitalarios Tipo A (comunes o domiciliarios)

- Sin pode r patológico ni patogé nico .
- No tienen actividad biológica
- Se desechan en recipientes con bolsa plástica de color ne gro , de 60 µm de espesor.

Pueden ser:
- Residuos no médicos: provenientes de tareas administrativas, limpieza general, restos de
alimentos provenientes de cocina central, comedores (público o del personal), salas de estar,
etc. Ejemplos: envases de gaseosas, embalajes, papeles, cartones, té, café, mate.
- Residuos médicos NO infectantes: pañal, tubuladuras, gasas, frascos, apósitos, guantes, etc.
SIN sangre visible.

Residuos Hospitalarios Tipo B (patológicos o biopatogénicos)

- Son residuos o elementos materiales orgánicos o inorgánicos, en estado sólido, semisólido,
líquido o gaseoso. Pre se ntan cualquie r caracte rística de actividad biológica re al o
pote ncial capaz de afe ctar dire cta o indire ctame nte a los se re s vivos y/o causar
contaminación de l sue lo, agua o atmósfe ra.
- Deben descartarse en recipientes con bolsa plástica de color rojo de 120 µm de espesor.

Ejemplos: sangre y derivados, aislamientos de agentes infecciosos (laboratorio de microbiología),

tejidos, órganos y piezas que se remueven durante autopsias, material de cirugía, muestras biológicas,
restos de animales productos de la investigación médica, materiales desechables o de curación que
contengan sangre, fluidos corporales, esputo, secreciones pulmonares; materiales cortopunzantes (se
debe descartar en envase plástico rígido, antes de introducirlos en la bolsa contenedora).

Residuos Hospitalarios Tipo C (especiales)

- Aquellos desechos o elementos materiales en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que
pre sumible me nte pre se nte n o pue dan pre se ntar caracte rísticas de toxicidad o
actividad biológica que pue dan afe ctar dire cta o indire ctame nte a los se re s vivos o
causar contaminación de l sue lo, de l agua o de la atmósfe ra.
- Se de scartan e n bolsas y e nvase s amarillos .

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- Requieren un manejo especial por sus características físico química

Ejemplos: agentes corrosivos, tóxicos, radioactivos, reactivos, carcinogénicos.

- C1: Radioactivos. Son controlados a través de la Comisión Nacional de Energía Atómica
(CNEA).
- C2: Químicos, residuos farmacéuticos, tóxicos, sustancias inflamables, diluyentes, corrosivos,
etc.
En los laboratorios de microbiología se generan residuos tóxicos con las coloraciones. Estos son
colocados en bidones plásticos con etiquetas según normas y contenido.

Almacenamiento y transporte

Una vez que el residuo fue generado y clasificado en su lugar de origen, se almacena
TEMPORALMENTE manteniéndolo en un Centro de acopio que necesariamente debe tener cada
institución, hasta su envío a empresas autorizadas para su destrucción. Este debe estar separado de las
áreas de atención, y ser de fácil acceso para la recolección y transporte.
El transporte debe realizarse en vehículos con caja cerrada hermética, con sistemas de enfriamiento,
con sistemas de captación de escurrimientos, y mecanismo de carga y balanza de peso. El conductor
que efectúa el traslado, de los residuos tipo B y C, debe contar con elementos de protección (traje
especial, guantes, barbijo, botas plásticas, etc.). Éste debe ser entrenado y presentar manual de
procedimiento.

Tratamiento de los residuos

Se re aliza por mé todos físicos o químicos que garantice n la e liminación de microorganismos

patóge nos . Una vez tratados e irreconocibles, se eliminarán como residuos NO PELIGROSOS en
rellenos sanitarios.

Métodos utilizados para el Tratamiento de los Residuos:

- Autoclave .
- Incine ración-compactación-trituración: apta para la mayoría de los residuos.
- Descontaminación química.
- Inactivación térmica (Microondas)
Se recurre a empresas que tienen habilitaciones y autorizaciones otorgadas por la Secretaría de
Ambiente y Desarrollo sustentable de la nación y el Organismo Provincial para Desarrollo.
Al finalizar el procedimiento se debe extender una constancia de la destrucción total del residuo y
entregarla a la institución que lo generó para su archivo foliado como documento.

Inmunizaciones obligatorias para el personal de salud

(Prevención primaria)

DOBLE VIRAL o TRIPLE VIRAL Iniciar o completar esquema de 2 dosis

DOBLE BACTERIANA 1 dosis de refuerzo cada 10 años

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HEPATITIS B Iniciar o completar esquema de 3 dosis. Dosar

anticuerpos HBsAg 1-2 meses luego de la última
dosis

FIEBRE HEMORRÁGICA Zonas de riesgo (única dosis)

ARGENTINA

INFLUENZA Una dosis anual en época pre-epidémica

VARICELA En ausencia de evidencia de inmunidad (medir

anticuerpos IgG virus Varicela zóster previo) se
aplica esquema con dos dosis

MENINGOCOCO SOLO en trabajador de LABORATORIO y

cualquier otro personal con riesgo de contacto con
N. meningitidis

HEPATITIS A Se aplican 2 dosis en ausencia de evidencia de

inmunidad (medir anticuerpo IgG anti virus hepatitis
A previamente) en áreas de neonatología, pediatría
y personal de laboratorio en contacto con el virus.

Nota: Se amplía este calendario obligatorio según sea la epidemiología del lugar y función laboral de
cada personal en particular donde desempeña su actividad.

Inmunización COVID-19

La vacunación contra COVID-19, representa una herramienta de prevención primaria fundamental

para limitar las consecuencias sanitarias y económicas devenidas de la pandemia.
Disponer de vacunas eficaces y seguras a corto plazo contribuye a reducir la incidencia de la
enfermedad, las hospitalizaciones y las muertes relacionadas a la COVID-19.
El desarrollo de vacunas con estas características, su adquisición, distribución y administración supone
un reto sin precedentes a nivel mundial.
Los trabajadores de la salud, población estratégica para sostener adecuadamente el funcionamiento y
la respuesta del sistema sanitario, representan una proporción significativa de las infecciones debido a
la alta exposición laboral.
La actual campaña de vacunación presenta, como objetivo, vacunar al 100% de la población objetivo
en forma escalonada y progresiva, de acuerdo con la disponibilidad gradual y creciente del recurso y a
la priorización de riesgo. En este contexto el personal sanitario presenta prioridad en la colocación de la
misma si bien hasta la actualidad constituye un acto voluntario.

Para más información sobre esquemas de vacunación y vacunas

aprobadas en nuestro país: https://www.argentina.gob.ar/coronavirus/vacuna

Prevención secundaria para el personal de salud

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El propósito de ésta es evitar la infección del personal una vez ocurrido el ACCIDENTES DE
TRABAJO. Se define como ACCIDENTE de trabajo a todo acontecimiento súbito y violento ocurrido
por el hecho o en ocasión del trabajo. Algunos de ellos pueden traer aparejado un RIESGO
BIOLÓGICO.

Se define a los accidentes biológicos y/o cortopunzantes como una exposición del personal de salud a
fluidos potencialmente infecciosos ya sea por lesión percutánea, punción, corte, o por contacto con
mucosa o piel no intacta. Pueden provocar infecciones graves al personal e incluso provocar la muerte
por contagio con patógenos contenidos en la sangre u otros líquidos biológicos del paciente (VHB,
VHC, VIH). Por lo tanto, cuando ocurre cada caso, se evalúa el potencial riesgo del personal de salud
según:
- El tipo de exposición
- La cantidad de fluido o secreción potencialmente infectante
- De quién proviene el fluido o secreción: FUENTE
- El patógeno implicado, según los datos aportados por LA FUENTE para alguno de los
microorganismos estudiados y la cantidad de virus que contenga (carga viral).

Todos los e fe ctore s sanitarios de be n dispone r de protocolos e scritos para sabe r cómo actuar
e n caso de e xposición (Plane s de continge ncia) y de profe sionale s e ncargados de la ate nción
urge nte de l trabajador e xpue sto .

Lo habitual es la contratación de una Aseguradora de Riesgos del Trabajo (ART). Éstas son empresas
privadas contratadas por los empleadores para asesorarlos en las medidas de prevención y para
reparar los daños en casos de accidentes de trabajo o enfermedades profesionales.

Actualmente está vigente el Seguro de Riesgos del Trabajo, sancionado mediante la Ley 24557, que
obliga a todo empleador a afiliarse a una aseguradora de riesgo (ART) o a garantizar la protección de
sus trabajadores. Se buscó un mecanismo que permitiera enfrentar las contingencias que generan
accidentes y enfermedades laborales. Se hizo hincapié en la prevención de riesgos. En los casos en
que el daño se genera, el trabajador está protegido en los aspectos económicos, en lo que se refiere a
la rehabilitación y a su reinserción laboral si perdura la incapacidad.

FICHA DE INVESTIGACIÓN DE CASO DE ACCIDENTE LABORAL POR PUNCIÓN,

CORTE U OTROS CONTACTOS CON SANGRE O SECRECIONES

¿Cómo actuar una vez ocurrido el accidente cortopunzante?

- Contacto con piel:

- Lavarse inme diatame nte con agua y jabón. En mucosas lavar con abundante agua
o solución salina por 10 minutos en forma de arrastre.
- No aplicar agentes cáusticos, no masajear ni presionar la herida ni inyectar
desinfectantes o antisépticos en su interior.
- Avisar inmediatamente a su superior.
- En caso de FUENTE CONOCIDA, retener en el sitio a la persona para realizar
interrogatorio dirigido y solicitar estudios serológicos previa realización de
consentimiento informado. Es imprescindible obtener los datos del paciente de origen
para la posterior intervención médica sobre el personal accidentado.
- Registro y notificación del accidente al empleador y a la ART correspondiente a su
efector. Esto tiene suma importancia le gal (por las complicaciones que pueden
devenir) y clínica (atención médica completa y gratuita).

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- Consulta con el profesional indicado por la ART para que lo aconseje respecto a la
conducta a seguir. Es importante constatar si el elemento punzante era hueco o sólido,
si tenía sangre visible, si provocó salida de sangre luego del accidente en la zona
afectada, si fue superficial o profunda, si había presencia o no de elementos de
barrera (los guantes disminuyen el 50% del volumen inyectado).
- También se realizará el estudio serológico del accidentado y del caso fuente. Para
poder realizar las determinaciones el paciente origen debe firmar un consentimiento
informado; si se niega, se considera como origen desconocido.
- Según los resultados se formulará la necesidad de recibir o no tratamiento profiláctico
(Profilaxis pos exposición), se informará también los riesgos potenciales de las drogas
y se planificará el seguimiento clínico y serológico.
- Supervisión de la evolución serológica del personal y del tratamiento adecuado si lo
hubo (sin costo alguno para el personal) hasta su finalización.

Algunos trabajos recopilados señalan que aproximadamente el 38% de los accidentes cortopunzantes
ocurren durante el uso del material y un 42% al desechar el material utilizado.

Para finalizar
1. Hasta tanto no se aclare la situación de cada caso en particular, al personal accidentado se le
recomienda: No donar sangre por lo menos por un lapso de 6 meses y utilizar preservativos en
sus relaciones sexuales.
2. El accidente biológico es una urgencia médica y hay que iniciar cuanto antes las acciones
médicas y administrativas para no producir la infección.

Lo que le corre sponde por le y al e mple ado:

- Trabajar en un ambiente sano y seguro.
- Conocer los riesgos asociados a su tarea.
- Recibir capacitación sobre métodos de prevención.
- Recibir los elementos de protección personal.
- Estar cubierto por una ART a través de la afiliación de su empleador.
- Saber cuál es su ART y recibir el carné correspondiente.

Lo que te corresponde como alumno de la Facultad de Ciencias Médicas

UNR: ¿Que hacemos si tenemos un accidente corto punzante?

EN EL LUGAR DEL ACCIDENTE

1. Lavar la herida y dejar escurrir sangre
2. Avisar al jefe directo (quien deberá buscar al paciente fuente)
3. Ubicar paciente fuente
4. El estudiante deberá Informar al Atención de Accidentes Ocupacionales con Material
Cortopunzante
5. Informar a Secretaría de Práctica Final, 4804558. Int. 326
6. Concurrir al Servicio de Atención de Accidentes Ocupacionales con Material Cortopunzante
(Presidente Roca 746). Allí se realizara un proceso individual por personal entrenado destinado
a informar a los involucrados las alternativas existentes para el manejo de la exposición,
apoyándola en la toma de decisiones farmacológicas y de prevención

Esto incluye:
- Asistencia psicológica.
- Explicación y firmas de consentimiento informado.
- Evaluación particular de la situación de riesgo vivida.
- Indicación de profilaxis post-exposición si correspondiera.

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- Controles seriados

El aviso inmediato ante un accidente corto punzante mejora la atención en tiempo y forma, la
contención y el tratamiento de los involucrados.

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Material complementario 1: Equipo de

Protección Personal (EPP)
Se define al equipo de protección personal (EPP) como el conjunto de diversos elementos que pueden
ser usados solos, o en forma combinada, para proteger al personal de salud, al paciente y/o a las visitas
del paciente.

Estos comprenden:
- Lavado de manos (lo utiliza el personal de salud, el paciente y las visitas): respetar los 5
momentos y la técnica apropiada de lavado antiséptico.
- Bata o camisolín: Debe ser de material impermeable, desechable, cubrir todo el torso desde
el cuello hasta las rodillas, los brazos hasta la muñeca y envolver la parte posterior. Se fija en
la parte trasera del cuello y la cintura
- Guante s : pueden ser estériles o de caja según la práctica a realizar. Se cambian si se han roto
o contaminado y después de cada paciente. No reemplazan el lavado de manos.
- Botas .
- Antiparras, gafas, ante ojos prote ctore s o máscaras faciale s : existen distintos modelos y
deben utilizarse siempre que exista riesgo de salpicaduras. Deben permitir ver bien con
claridad, ser antiempañamiento y adaptarse anatómicamente alrededor de los ojos. Los
anteojos terapéuticos no reemplazan las gafas.

Barbijos

Hay de dos tipos para uso en ámbito sanitario:

Respirador o N95 Tipo quirúrgico o mascarilla

Protegen contra e nfe rme dade s transmitidas Prote ge n fre nte a e nfe rme dade s de
por ae rosole s. transmisión por gotas.
Se coloca antes de ingresar a la habitación y se Está indicado en todo personal que asista de
retira luego de salir de la habitación. forma directa a pacientes con aislamiento de
Indicado en situaciones que pueden generar gota, pacientes con infección respiratoria con la
aerosoles como: toma de muestra respiratoria deambulación por el hospital y para

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(hisopados oro/nasofaríngeos), IOT, procedimientos invasivos que requieran técnica

broncoscopia, BAL, aspirado traqueal, RCP, estéril.
utilización de ambú, entre otros. Son descartables y de un solo uso.
El uso debe ser individual (no se comparten) y Realizar higiene de manos luego de retirarlo
pueden ser reutilizados hasta 15 días en jornadas debido a qué la superficie está contaminada.
de trabajo menores a 7 horas diarias o hasta 7
días en jornadas mayores a 7 horas diarias.
Se debe conservar dentro de bolsas de papel
identificadas con el nombre y la fecha de inicio
de uso.
No llevar al domicilio. Luego de guardar,
descartar o tocar el barbijo siempre lavarse las
manos.

Tipo N95. N: significa “No resistente a partículas Tipo quirúrgico. Tienen una parte celeste que siempre debe
aceitosas”; 95: porque elimina, al menos, el 95% de las mirar hacia afuera, 2 o 4 tiras y ajuste en la nariz )
partículas de tamaño mayor a 0,3 micrones

Precauciones o medidas de aislamiento

Según la patología del paciente, o la sospecha diagnóstica, se pueden implementar me didas de

pre caución o siste mas de aislamie ntos , que comprenden un conjunto de procedimientos y equipo
de protección personal (EPP) específicos.

Existen medidas para ser aplicadas a todos los pacientes independientemente del diagnóstico o
sospecha (pre caucione s e stándar o unive rsale s) y otras que dependen del mecanismo de
transmisión de la enfermedad sospechada o diagnosticada. Estas incluyen: precauciones re spiratorias
por gota, re spiratorias por ae rosol y pre caucione s de contacto . (Ver videos)

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Precauciones Precauciones por gota Precauciones de Precauciones

estándar o contacto respiratorias por
universales aerosol

Se Todos los En pacientes con En pacientes con En pacientes con

aplicarán pacientes sin sospecha o diagnóstico sospecha o sospecha o diagnóstico
con importar el confirmado de diagnóstico confirmado de enfermedades
diagnóstico enfermedades que se de enfermedades que transmitidas a través de
transmiten a través de se transmiten por aerosoles
gotas contacto directo con el
paciente o su entorno

Microorga Mycoplasma Microorganismos Tuberculosis pulmonar

nismos pneumoniae, Bordetella multirresistentes bacilífera (TBC)
pertussis, Adenovirus , (Enterococcus
Sarampión
Influenza (A; B) resistente a la
Parotiditis ( Paperas ), vancomicina (EVR), Varicela
Parvovirus B19, Rubéola Bacilos Gram negativos
productores de Herpes Zoster
Carbapenemasa (KPC), diseminado (en ésta
Staphylococcus última implementar junto
aureus resistente a la con Precauciones de
meticilina (SAMR), contacto)
Virus Sincitial
respiratorio (VSR),
Enterovirus, Fiebres
Hemorrágicas (Lassa,
Ébola, Marburg,
Crimea – Congo),
Clostridioides difficile,
Rotavirus,
Corynebacterium
diphteriae afección
cutánea (Difteria
cutánea)

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Incluye Lavado de Precauciones estándar Precauciones estándar Precauciones estándar

manos Tarjeta identificatoria en Tarjeta identificatoria Tarjeta identificatoria en
antiséptico. la puerta de la en la puerta de la la puerta de la habitación
Descartador para habitación habitación Puerta cerrada Barbijo
elementos Puerta cerrada Barbijo Puerta cerrada Barbijo quirúrgico de uso
cortopunzantes quirúrgico de uso quirúrgico de uso personal y descartable
(No personal y descartable personal y descartable entre cada uso.
reencapuchar las entre cada uso. entre cada uso. Camisolín, guantes y
agujas) Camisolín, guantes y Camisolín, guantes y antiparras (sólo como
SOLAMENTE antiparras (sólo como antiparras (sólo como precaución estándar)
ante sospecha precaución estándar) precaución estándar) Elementos individuales
de salpicaduras: Elementos individuales Elementos individuales para control de signos
Barbijo tipo para control de signos para control de signos vitales
quirúrgico, vitales vitales Desinfección de
camisolín, Desinfección de Desinfección de elementos y aparatos
guantes y elementos y aparatos elementos y aparatos antes de retirarlos de la
antiparras antes de retirarlos de la antes de retirarlos de la habitación
habitación habitación

ACTIVIDADES

Luego de leer este material, complete el siguiente cuadro, marcando con una cruz el casillero según
corresponda.

SITUACIÓN Higiene de Bata Mascarilla Respirador Gafas protectoras Guantes

las manos quirúrgica (N95 o (protección ocular) o
similar) protección facial

Triage /Atención
de pacientes sin
aislamiento

Obtención de
muestras
respiratorias
para diagnóstico
de laboratorio

Aislamiento de
contacto

Aislamiento
respiratorio de
enfermedades de
transmisión por
gotas

Aislamiento
respiratorio de
enfermedades
transmitidas a
través de
aerosoles

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Procedimientos
invasivos que
requieran
técnica estéril

Vide os suge ridos: https://codeinep.org/videos/

Eje mplo para mirar: WHO guidelines on hand hygiene in health care. WHO Press, World Health
Organization, 2009. Ilustraciones Originales de Pittet D et al. Evidence-based model for hand
transmission during patient care and the role of improved practices. Lancet Infectious Diseases,
2006, 6:641– 652.

Eje mplo para pe nsar: Los virus respiratorios sobreviven hasta una hora en las manos del profesional
que atendió un paciente con enfermedad respiratoria y no se lava las manos contaminadas. Lo más
seguro es que va a transmitir la enfermedad al próximo paciente. Nada más actual en tiempos de la
pandemia de Sars-CoV-2. ¿Por qué lavarse las manos? Es la medida más simple y efectiva para
evitar las Infecciones Asociadas al Cuidado de la Salud (IACS).

BIBLIOGRAFÍA
- Control de infecciones y epidemiología. CODEINEP.
- CDC . Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH)
- Ministerio de Salud República Argentina. Utilización de EPP en enfermedad por SARS-Cov-2

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Laboratorio 2: Ciclo diagnóstico. Toma de

muestras, conservación y transporte

Obje tivos: Al finalizar la tarea extramuro el alumno debe ser capaz de…
- Entender qué se debe tener en cuenta para realizar la solicitud de examen microbiológico
- Indicar condiciones generales previas a la toma de muestra.
- Comprender la conservación y traslado de muestras microbiológicas hasta su procesamiento
- Describir, desde el punto de vista macro y microscópico las distintas formas microbianas
capaces de injuriar al hombre.

Ciclo diagnòstico microbiològico

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Elección de métodos de laboratorio microbiológico clínico

Para realizar un diagnóstico desde el punto de vista microbiológico podemos utilizar varios tipos de
técnicas. Estas se agrupan de la siguiente manera:
- Mé todos de diagnóstico microbiológico dire cto: Lo que se intenta demostrar es la
presencia del microorganismo, sus metabolitos o componentes antigénicos en la muestra
examinada. El resultado está fuertemente condicionado por la elección del tipo de muestra, su
conservación y transporte.
- Mé todos de diagnóstico microbiológico indire cto: Lo que se intenta demostrar es la
huella que el agente infeccioso dejó en el sistema inmune. La muestra más utilizada es la
sangre, donde se evalúa la presencia de anticuerpos específicos.

Métodos directos Helmintos Protozoos Hongos Bacterias Virus

Ex. Microscópico ++ ++ ++ ++ -/+

Cultivo - +/ - ++ ++ +/ -

Detección de Ag. +/ - +/ - + +/ - ++

Detección de Ác. +/ - +/ - + + ++
Nucleicos

Métodos Indirectos +/- +/ - +/ - + +

Tabla Modificada de “Microbiología y Parasitología Mé dicas”. G. Prats 2012. Se lèe: (++) muy utilizada, (+) utilizada, (-/+)
utilizada indirectamente en células probablemente infectadas, (+/-) utilizada en algunos microorganismos, (-) no utilizada.

A tener en cuenta
El profesional que va a realizar la solicitud del examen
microbiológico y/o la toma de muestras se debe contactar con el
laboratorio de microbiología a fin de informarse acerca de cuál es
el procedimiento a seguir y qué técnicas de diagnóstico están
disponibles.

Recolección de muestras biológicas

La búsqueda del microorganismo patógeno causante de la enfermedad conlleva una serie de pasos,
siendo el primero de ellos la toma de mue stra. Esta debe ser realizada en forma responsable y
óptima ya que condiciona toda la secuencia de eventos para un correcto diagnóstico:
- Debe ser mate rial de l sitio re al de la infe cción y debe recogerse a partir de tejidos,
órganos y sectores adyacentes.
- Debe respetar la pre paración pre via y e l proce dimie nto para la toma de muestra.
- Debe establecerse el mome nto oportuno para la recolección de las muestras. Es importante
conocer la historia natural y la fisiopatología del proceso infeccioso, con el objeto de tener la

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mayor probabilidad de recuperar

microorganismos causales. Siempre que sea
posible, se deben obtener las muestras ante s de
la administración de antimicrobianos (de lo
contrario aclarar en la orden del pedido).
- Debe obtenerse, de ser posible, una cantidad
suficie nte para efectuar la/s técnica/s de
examen.
- Deben usarse ade cuados dispositivos para la
re cole cción, transporte y conse rvación, a fin
de asegurar una óptima recuperación de
microorganismos.
- El envase de la muestra debe rotularse en
forma correcta, legible y colocarlo donde está el
contenido.

Mue stra de orina

Frasco de he mocultivo Extracciòn de sangre

Conservación y transporte
Todo material para examen microbiológico de be e nviarse lo más rápido posible al laboratorio .
Lamentablemente, la mayoría de las veces es casi imposible que sean transportadas y procesadas
dentro de las dos primeras horas de recogida, con escasas excepciones (ej. LCR en meningitis
agudas). Por este motivo es necesario conse rvar e n mane ra ade cuada cada tipo de muestra según
el ensayo a realizar.

La mayoría de las bacterias resisten bien las bajas temperaturas por lo que
pueden mantenerse entre 4 y 8ºC durante unas horas. El LCR para
diagnóstico bacteriológico resulta una excepción, ya que el meningococo es
muy sensible al frío, así como las muestras en las que se buscan anaerobios.

Es importante saber que el material se debe enviar en contenedores

estériles, sin conse rvante s (ej. no enviar muestras en formol) y de manera
tal que se eviten pérdidas (o contaminación). Siempre tendrá que tener
escrito el tipo de muestra que se transporta, los datos identificativos del
paciente, y los servicios solicitante y receptor.

Cuando la posibilidad de desecación de la muestra es grande se deben usar

me dios de transporte . Estos son medios, tales como el Stuart o Amies,
que no son nutritivos, sino que preservan las bacterias existentes, sobre todo
si son escasas, a la vez que impiden el crecimiento exagerado de otras
bacterias no deseadas. Estos pueden ser para bacterias aerobias o

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anaerobias y pueden conseguir supervivencias de hasta 24 horas a temperatura ambiente pero deberán
enviarse también lo más rápidamente posible al laboratorio.

Para la búsqueda de microorganismos especiales o menos frecuentes se suele requerir una toma de
muestra, transporte y/o conservación específicos por lo que resulta imperativo consultar con el
laboratorio antes del procedimiento.

En el laboratorio de Microbiología Clínica

Métodos directos
Los métodos directos fueron definidos anteriormente, ahora veremos las técnicas disponibles en el
laboratorio de Microbiología clínica según el agente etiológico que estemos buscando.

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Observaciones macroscópicas

Solo se utiliza para visualizar parásitos macroscópicos (helmintos y artrópodos) dado que se pueden
observar a simple vista o utilizando una lupa.

En infe ccione s gastrointe stinale s , donde la muestra de elección son las he ce s , es posible
visualizar los helmintos responsables después de manipular la muestra. Brevemente, una vez en el
laboratorio, se vuelca el contenido del frasco recolector en un colador fino, se lo somete a un chorro de
agua para eliminar los residuos fecales y se observan los restos (con buena fuente de luz) que quedan
en el colador buscando visualizar los helmintos adultos (ej. Enterobius, Ascaris, proglótides de
cestodes, etc.).

Ascaris lumbricoides

En las e ctoparasitosis , como las pediculosis (Pthirus pubis o capitis) el personal de salud puede
realizar el diagnóstico visualizando la presencia del parásito adulto o de su formas inmaduras

En las e nfe rme dade s transmitidas por ve ctore s , como el Chagas (Triatoma infestans) o el
Dengue (Aedes aegypti) la identificación del vector es importante para el control de la transmisión.

Triatoma infestans

Observaciones microscópicas
Se utiliza para visualizar microorganismos demasiado pequeños para poder ser distinguidos por el ojo
humano. Esta se puede realizar mediante la utilización de diferentes sistemas de amplificación de
imagen:
- Microscopio e le ctrónico: Se restringe este estudio solo a los fines de investigación. En un
momento fue útil para el diagnóstico directo rápido de infecciones exantemáticas vesiculares
como el herpes, la varicela y otras, o las infecciones intestinales por Rotavirus y otros virus

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enteropatógenos, ya sea desde los materiales biológicos sin tratamiento previo o tratados con
anticuerpos específicos (inmunomicroscopía electrónica) porque facilita la agregación de
partículas víricas.
- Microscopio óptico (MO): Permite observar objetos invisibles a simple vista, pero superiores
a 0,2 µm. Los MO poseen un revólver en el que se hallan varios objetivos con lentes de
diferente capacidad de aumento que pueden intercambiarse. Los aumentos del MO obtenidos
son los siguientes:

Ocular Obje tivo Aume nto Nota

conse guido

X 10 X 10 100 Para utilizar los aumentos de 100X y 400X se realiza

directamente colocando el portaobjeto sobre la platina.
X 10 X 40 400 Si la muestra es líquida se coloca encima de un
cubreobjeto.

X 10 X 100 1000 Para observar a 1000 aumentos, debe ponerse una

gota de ace ite de inme rsión e ntre la pre paración
y e l obje tivo de 100X para unificar la refringencia del
sistema.

Ver video 03 Partes y manejo del microscopio

Observación en fresco

En el caso de que el preparado se observe directamente, sin ninguna coloración previa, se denomina
observación microscópica “e n fre sco ”. A su vez, puede ser:
- Con campo brillante : La luz pasa directamente y se aprecian los detalles distinguibles de
manera natural.
- Entre porta y cubre obje to : Se coloca el producto patológico o la suspensión bacteriana para
ser observada en un portaobjeto y sobre él un cubreobjeto.
- En gota pe ndie nte : Con esta técnica se obtiene menor distorsión por el peso del cubreobjeto.
Se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. Se coloca una pequeña cantidad de
suspensión bacteriana en el centro de un cubreobjeto y se coloca vaselina o agua alrededor del
pocillo de un portaobjeto excavado. Se invierte el portaobjeto y se presiona contra el
cubreobjeto, guiando la gota de suspensión bacteriana al centro del pocillo. El portaobjeto se
lleva cuidadosamente al microscopio y se observa a 40X.

Observación por campo oscuro

Se usa para visualizar ciertas bacterias muy finas, que no son visibles con campo brillante y que no se
tiñen (o lo hacen con dificultad). Por ejemplo: Treponema pallidum de un chancro sifilítico, Leptospira
de orina, Borrelia comensales en la boca.

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Treponema pallidum

Se prepara el material entre porta y cubre. Luego se examina directamente al microscopio con el
objetivo 40X o 100X equipado con un condensador especial de campo oscuro. Este condensador
impide que la luz ilumine la muestra en forma directa, la misma incide en forma oblicua con lo cual los
microorganismos se ven brillantes y móviles contra un fondo negro (efecto Tyndall).
- Ventaja : aumenta el poder resolutivo del microscopio.
- Desventaja : no permite la visualización de las estructuras internas de los microorganismos ya
que la luz no pasa a través de ellos.

Observación por coloración

Como casi todos los microorganismos son incoloros cuando se los observa a través del microscopio
óptico, a menudo es necesario prepararlos para facilitar la observación y una de las maneras es
realizando una tinción o coloración.

Primero hay que realizar un e xte ndido del material a colorear sobre un portaobjeto de vidrio de modo
que se obtenga una película muy delgada y homogénea. Se fija al calor de la llama del mechero o bien
con metanol para evitar que al lavar se desprenda el material.

Se colorea según la tinción elegida, luego se lava, se deja secar y por último se observa al MO con
objetivo de inmersión.

En el diagnóstico microbiológico se utilizan coloraciones simples, compuestas ó diferenciales y, también

pueden contribuir las tinciones histológicas las cuales son realizadas por los anatomopatólogos.

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Examen microscópico de infecciones bacterianas

- Obse rvación e n fre sco: Es de escaso valor para el diagnóstico bacteriológico, salvo casos
particulares como la observación por campo oscuro de Treponema pallidum a partir de
lesiones compatibles con sífilis ó la presencia de leucocitos en sedimento urinario.

- Obse rvación microscópica por coloracione s:

Simple s Azul de me tile no : Se observa al MO con 100X (acordarse de colocarle una gota
de aceite de inmersión entre el frotis coloreado y la lente). Se utiliza para observar
la morfología de los microorganismos así como la presencia de re acción
inflamatoria en la muestra. Ej.: leucocitos en materia fecal.

Compue stas o Gram-Nicolle : Se utiliza desde 1884 para visualizar morfología y también inferir
dife re nciale s sobre la naturaleza y composición química de la pare d en las bacterias, criterio
básico para separar dos grandes grupos bacterianos: Gram + y Gram -.
Ve r vide o 08

Zie hl-Ne e lse n (B.A.A.R.): Las micobacterias están recubiertas de un grueso

material céreo que resiste la tinción (es por lo que en la técnica se calienta la
fucsina 3 veces para que penetre más profundamente).Sin embargo, una vez
teñidas no se decoloran ante la presencia de mezclas decolorantes fuertes como
ácido-alcohol. Es por ello que a estos gérmenes se los llama bacilos ácido
alcohol re siste nte (BAAR). No se tiñen con la coloración de Gram Nicolle.
Ve r vide o 12

SECUENCIA FUNCIÓN GRAM (+) GRAM (-)

Violeta de Colorante básico Permanece violeta Permanece violeta

Genciana (1’)
● ●
Lugol Mordiente Permanece violeta Permanece violeta
(1’)
● ●
Alcohol-acetona Decolorante Permanece violeta No se ven
(30”)
●
Fucsinao Contraste Permanece violeta Se tiñe rosa-fucsia
Safranina
(1’) ● ●
Pasos de la tinciòn de Gram-Nicolle

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SECUENCIA FUNCIÓN BAAR OTROS

Fucsina, calentar Colorante Se tiñen de rojo Se tiñen de rojo

hasta vapores básico
blancos (3 veces)

Alcohol-ácido Decolorante Permanecen rojo No se ven

Azul de Metileno Contraste Permanece rojo Se tiñen azul

Pasos de la tinciòn de Zihel-Neelsen

Examen microscópico de infecciones fúngicas

La microscopía sigue siendo una de las herramientas más utilizadas en micología.

Los métodos usados para la visualización fúngica difieren en algunos aspectos de los de las bacterias
debido al mayor tamaño de los hongos. El e xame n microscópico dire cto de una mue stra clínica
corre ctame nte tomada e s e l me dio más simple y rápido de de te ctar una infe cción fúngica.

Cuando los elementos fúngicos están presentes en número suficiente se puede establecer una
orientación diagnóstica presuntiva, en ocasiones definitiva, y en pocos minutos informar al médico, lo
cual permitirá la instauración temprana de una terapia antifúngica.

Observación microscópica en fresco

El examen en fresco en micología constituye un método rápido y económico para una primera
aproximación al diagnóstico de las micosis. La mayoría de los hongos se pueden detectar sin tinción,
en la mayor parte de las muestras clínicas como esputos, orinas, exudados y LCR.
Para optimizar la observación se puede agregar en la muestra una gota de:
- Hidróxido de potasio (KOH) para muestras que contengan células queratinizadas, las
disgrega y las separa, facilitando la observación de elementos fúngicos en muestras de
escamas, piel, pelo o uñas.
- Azul de lactofe nol, Gue gue n u otros: se genera un fondo azulado que facilita la
visualización de elementos fúngicos por contraste.
- Tinta china: Se usan para visualizar las cápsulas de muchos microorganismos. Los finos
gránulos de la tinta china dan un fondo semiopaco, contra el cual pueden verse claramente las
cápsulas claras. Se utiliza, por ejemplo, para Cryptococcus neoformans en líquido
cefalorraquídeo, esputo y otras secreciones. En el caso de LCR se centrifugan las muestras,
una gota de sedimento se coloca en un portaobjeto con una gota de tinta china. Se cubre con
un cubreobjeto y se observa primero con objetivo de 10X para una visión general y luego con
40X para la confirmación de microorganismos capsulados.

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Observación microscópica por coloraciones

Las tinciones más utilizadas en micología son: Gram-Nicolle (solo para levaduras), Giemsa,
May-Grünwald-Giemsa y agentes quimiofluorescentes como blanco de calcoflúor. También son útiles
tinciones histológicas como ácido peryódico de Schiff (PAS), Gomori-Grocott que serán interpretadas
por el anatomopatólogo.

Examen microscópico de infecciones parasitarias

El diagnóstico etiológico de la mayoría de infecciones parasitarias se re aliza me diante e l e xame n
microscópico ya que el tamaño y morfología de los elementos parasitarios permiten la identificación a
nivel de género y, en muchos casos, de especie.

Observación microscópica en fresco

- Mue stras de sangre : Las parasitosis hemohísticas persistentes (ej.: tripanosomiasis, filariasis,
etc.) se pueden diagnosticar mediante el estudio de muestras de sangre tomadas en el
momento adecuado en función del ciclo biológico del parásito. Se deposita una gota en el
portaobjeto y se le coloca encima un cubreobjeto, permite observar formas móviles de
parásitos circulantes. Su sensibilidad depende de la carga parasitaria.
- Mue stra de mate ria fe cal: A veces la cantidad de parásitos no es suficiente para su
detección dando falsos resultados negativos, por lo que es necesario conce ntrar la muestra de
heces para aumentar la sensibilidad del método. Puede efectuarse por centrifugación o por

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flotación. Una vez realizados el sedimento o la película que flota, se observa directamente a
microscopio óptico una gota de ellos entre porta y cubre. Permite la visualización de las formas
vegetativas y quísticas de los protozoos, como así también huevos de helmintos.
- Mue stras de sondaje duode nal: Se realiza la prueba de la cuerda. Se hace deglutir una
cápsula de gelatina que contiene una cuerda de nylon enrollada. Un extremo de la cuerda se
fija a la cara del paciente. Por peristaltismo llega a duodeno en 4 o 5 horas luego de que se
extrae la cuerda y el moco teñido con bilis adherido al extremo distal. Esto se utiliza para
realizar preparados en fresco (entre porta y cubre) y frotis teñidos. Sirve para la investigación
de Giardia lamblia . No es un método de rutina.
- Mue stras de flujo vaginal: Se coloca una gota de flujo vaginal entre porta y cubre y se
observa o no, la presencia de trofozoitos móviles (formas vegetativas flageladas compatibles
morfológicamente con Trichomonas vaginalis).
- Mue stras de e sputo: Ocasionalmente pueden observarse estadios larvales de uncinarias,
áscaris y estrongiloides o huevos de algunos parásitos. En casos de hidatidosis pulmonar,
cuando se produce una vómica, se pueden observar restos parasitarios como ganchos ó
vesículas. Si la muestra de esputo no va a ser procesada de inmediato se agrega formol diluido
para conservar los huevos o larvas de los helmintos.
- Mue stras de músculo: Primeramente, se realiza una digestión enzimática de la biopsia de
músculo esquelético. Se centrifuga el líquido y se observa la presencia de larvas de Trichinella
spiralis. Se puede mejorar la visualización por coloración.
- Mue stras de te jidos, aspirados, raspados, biopsias, re corte cutáne o, e tc: Según cuáles
sean los preparados, pueden observarse entre porta y cubre, con una gota de solución
fisiológica, aunque es mejor realizar frotis y fijarlos para coloraciones específicas. Estos
últimos se preparan por compresión de una superficie recién cortada del tejido contra la
superficie de un portaobjeto y la colocación inmediata de éste en un fijador.

Mue stras para diagnóstico de e nte roparásitos: Ve r vide os 15 y 16

Observación microscópica por coloraciones

a. Mue stras de sangre :

La forma más sencilla de observación microscópica consiste en realizar un frotis o extensión
de sangre anticoagulada sobre un portaobjeto, semejante a los preparados de hematología. En
este caso, se deja secar y se tiñe mediante coloraciones como Giemsa, May

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Grünwald-Giemsa, entre otras. Su observación al microscopio permite la visualización de las

formas parasitarias en los casos en que la parasitemia sea elevada o moderada. Para otras
parasitosis hemohísticas sin fase hemática sostenida (toxoplasmosis, leishmaniosis, hidatidosis,
triquinosis, larva migrans (toxocariasis), etc.) se pueden realizar biopsias para estudios
histopatológicos, pero habitualmente se efectúan métodos de diagnóstico indirecto (se
abordarán en el Laboratorio de Habilidades N° 6).
- Gota grue sa: Consiste en colocar 1 o 2 gotas de sangre en un portaobjeto, se desfibrina con el
ángulo de otro portaobjetos para evitar la coagulación, durante 2 ó 3 minutos, se deja reposar
varias horas y se hemolizan los hematíes cubriendo el preparado con agua destilada, por último
se tiñe. La ventaja sobre el extendido es que se observa más cantidad de sangre lo que
aumenta la sensibilidad.
- Té cnicas de ce ntrifugación, Mé todo de Strout: consiste en la concentración previa de la
sangre entera o con anticoagulante, el sedimento final se observa en fresco, entre porta y
cubre al microscopio con 400 aumentos. Ej: Diagnòstico de Trypanosoma cruzi en infecciones
agudas.

b. Mate ria fe cal:

Se pueden utilizar distintas coloraciones para favorecer la visualización de los elementos
parasitarios como por ejemplo: tinciones permanentes previa fijación como hematoxilina
férrica, tricrómica y otras, que permiten observar detalles citológicos esenciales para la
identificación definitiva del agente, o la tinción de Ziehl-Neelsen modificada para la detección
del género Cryptosporidium.

Examen microscópico de infecciones virales

El diagnóstico por métodos tradicionales se ha considerado muy complejo debido a que el tamaño de
los virus está por debajo del poder resolutivo del microscopio óptico. La observación microscópica de
los virus se realiza por microscopía electrónica, la cual no se utiliza en los laboratorios de microbiología
clínica por su complejidad.
Las técnicas de inmunofluorescencia permiten la visualización de antígenos víricos en células
infectadas cuando se usan anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes. Esta técnica está
dentro de las pruebas llamadas inmunológicas (se abordarán en el Laboratorio de Habilidades N° 6).
Se pueden visualizar en algunos casos cé lulas compatible s con infe cción viral, mediante
coloraciones citológicas convencionales, tarea de los histopatólogos.

Actividades
1. ¿Qué datos se deben tener en cuenta para realizar la solicitud de examen microbiológico?
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2. ¿Qué condiciones generales debo tener en cuenta, para realizar la toma de muestra?
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___________________________________________________________________________
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___________________________________
3. ¿En qué grupo o grupos de microorganismos, tiene valor diagnóstico el mé todo dire cto de
obse rvación microscópica e n fre sco ?
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4. ¿Qué dato le brinda al médico, el informe de la observación directa por tinción de Gram? Que
características estructurales de la bacterias hacen que se vean Gram + o Gram –? Busca
ejemplos de cada grupo.
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5. ¿Qué significa la sigla BAAR? ¿Con qué mé todo dire cto de obse rvación microscópica
por coloración está relacionada?
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6. ¿Cómo puedo aumentar la sensibilidad del mé todo dire cto de obse rvación microscópica
e n fre sco , en un examen parasitológico para evitar falsos negativos? ¿Qué elementos
parasitarios puedo ver?
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Laboratorio 3: Métodos directos (Parte I)

Objetivos
Al finalizar el encuentro el alumno debe ser capaz de:
- Reconocer las técnicas disponibles en un laboratorio para incrementar la biomasa celular
microbiana a partir de las muestras biológicas.
- Comprender las distintas técnicas que posibilitan la identificación de agentes etiológicos
responsables de los procesos infecciosos.
- Seleccionar las técnicas adecuadas de diagnóstico directo disponibles en diferentes contextos
laborales.

Cultivo y aislamiento del agente etiológico

Para su desarrollo todo microorganismo necesita:

- Nutrie nte s (fuentes de carbono, nitrógeno e hidrógeno): Un medio de cultivo debe poseer los
nutrientes necesarios que permitan la multiplicación de bacterias u hongos. Una de las ventajas
del cultivo es que permite aislar las bacterias presentes en la muestra clínica y aumentar la
biomasa celular (incluso cuando por su escasez no pueden observarse por microscopía).
Además, permite comenzar a identificarlas y luego también hacer las pruebas de sensibilidad
antimicrobiana (PSA).
- Condicione s óptimas de cre cimie nto : Los microorganismos no sólo necesitan nutrientes
sino que deben estar a un pH, temperatura, atmósfera, humedad ambiente y tiempo óptimo
para la multiplicación de los microorganismos.

Medios de cultivo
En los servicios de Microbiologìa Clìnica, los medios de cultivo tienen un rol muy importante dado que
permiten aumentar la biomasa, están disponibles en el comercio en polvo para preparar, ya hidratados o
fraccionados en placas y tubos, listos para usar. Pueden clasificarse de diferentes maneras:
- Por su consiste ncia:

Líquidos Semejan un caldo casero, filtrado y esterilizado. Contiene agua, extracto de

carne, glucosa y sales. Se pueden adicionar factores de crecimiento,
oligoelementos y otras sustancias. Se fraccionan en tubos o frascos-botellas
estériles.

Sólidos Son medios líquidos a los que se le incorpora una sustancia gelificante como el
agar-agar (es un extracto de algas marinas azules). Tiene una consistencia
semejante a la gelatina. Una vez esterilizados y fraccionados en placas o tubos,
adquieren consistencia sólida al enfriarse y son almacenados hasta su uso.

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- Por su conte nido nutricional:

Simple s Contienen sustancias nutritivas para el crecimiento de bacterias no exigentes

metabólicamente.

Enrique cidos Son medios básicos con el agregado de nutrientes (ej. sangre humana, de
carnero, etc.) permitiendo el desarrollo de bacterias nutricionalmente
exigentes. Ej.: agar sangre, agar chocolate, caldo cerebro corazón.

- Me dios de cultivos e spe ciale s (que nos van orientando, desde su desarrollo, a la
identificación de la/s bacteria/s):

Dife re nciale s Son medios que distinguen entre distintos grupos bacterianos en función del
color de sus colonias. Llevan colorantes que a distintos pH varían su color. Por
ejemplo, el agar MacConkey es un medio sólido que permite el crecimiento de
bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Los
primeros adoptan una coloración rosada que los diferencia de los segundos.

Se le ctivos Permiten el crecimiento de un determinado tipo de bacterias, para lograr este

objetivo, se les añade alguna sustancia que inhibe el crecimiento de todas las
bacterias excepto la que queremos aislar.

Se le ctivos-Dife r Suman las propiedades de los dos anteriores. Ej.: agar manitol salado o
e nciale s Chapman, agar SS (Salmonella–Shigella), agar CLDE y agar cromogénico.

Los me dios cromogè nicos , resultan muy útiles para la visualización de

poblaciónes mixtas de bacterias o levaduras; contienen sustratos incoloros, que
al ser hidrolizado por una enzima microbiana, se libera un compuesto
cromogénico que otorga una tonalidad determinada a las colonias, Estas
enzimas son tan específicas que permiten identificación presuntiva género,
especie o de un grupo reducido de especies.

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Ve r e l vide o
06 - Pre paraciòn de me dios

Temperatura de crecimiento
La mayoría de las bacterias que nos injurian se desarrollan entre 20-40 °C. Por esta característica,
reciben el nombre de bacte rias me sófilas . Hay otras bacterias que se denominan termófilas (ej:
Campylobacter jejuni con temperatura óptima de crecimiento a 42 °C), o criófilas (crecen entre 0 y
10 °C). Los hongos patógenos se comportan como mesófilos, los oportunistas pueden comportarse
como criófilos o mesófilos criotolerantes.

Para lograr la temperatura constante durante la incubación se utilizan estufas de cultivo con
termostatos.

Potencial de hidrógeno (pH)

Por lo general, las bacterias son neutrófilas (pH óptimo de crecimiento 7) pero hay algunas que se
desarrollan mejor a pH 4 (bacterias acidófilas, ej. Lactobacillus spp.) y otras a pH mayor que 7
(bacterias basófilas, ej. Vibrio spp ). El crecimiento óptimo de la mayoría de los hongos está entre pH 5
y 7, pero como toleran la acidez, suelen utilizarse medios selectivos con pH ácido.

Es por ello que los medios de cultivo, ya sean sólidos o líquidos, deben tener su pH ajustado y óptimo
para la mayoría de las bacterias u hongos que se quieren recuperar.

Atmósfera
En función de su necesidad de oxígeno se clasifican en:
- Ae robias e strictas : se desarrollan exclusivamente en atmósfera con O2 .
- Anae robias facultativas : son aerobias, pero se adaptan para crecer en atmósfera escasa de
O2 o en ausencia de él.
- Anae robias e strictas : el O2 es letal.
- Microae rófilas : crecen en bajas concentraciones de O2 .

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Humedad
Para su desarrollo, los microorganismos requieren 90-99% de humedad en su ambiente.

Tiempo de incubación
La mayoría de las bacterias que injurian al ser humano crecen entre las 24-48 hs de incubación
(velocidad de generación entre 15 y 20 minutos). Algunas, como las micobacterias, tienen una
velocidad de generación muy lenta y se llega a visualizar las colonias a partir de los 20 hasta 60 días.
Los hongos recuperados de infecciones humanas tienen distintas velocidades de generación, por lo que,
en el caso de levaduras se verá el desarrollo de colonias visibles a partir de las 24-48 hs. hasta 5 días,
en el caso de los dermatofitos se deben incubar hasta 15 días y en los hongos productores de micosis
profundas o sistémicas hasta se dejan 30 días aproximadamente.

El diagnóstico pre suntivo que e l profe sional mé dico coloca e n la solicitud de e xame n e s
de suma importancia, ya que e sto e s de cisivo para la toma de mue stra e n e l mome nto
oportuno, la conse rvación y e l transporte e n forma ade cuada.
Para proce sar las mue stra, e l microbiólogo toma e n cue nta e l diagnóstico pre suntivo y
sitio de re cole cción de la mue stra, junto con otros datos incluidos e n la orde n, factore s
orie ntativos para re alizar las obse rvacione s microscópicas pe rtine nte s y utilizar los
me dios de cultivo, atmósfe ra, te mpe ratura, pH y tie mpo ade cuados, para obte ne r e l
de sarrollo de los microorganismos implicados e n la patología obse rvada, para continuar
lue go con los e studios de ide ntificación y se nsibilidad a los antimicrobianos.

Siembra y aislamiento
El asa de sie mbra constituye un elemento básico en microbiología. Consta de un mango (mango de
Kohler) de 20 cm, en cuyo extremo lleva adosado un filamento de platino o nicrom. Estos metales
tienen la propiedad de alcanzar rápidamente temperaturas altas cuando se lo expone a la llama de un
mechero y de enfriarse de nuevo rápidamente. También las hay en el comercio estériles descartables.

Las células bacterianas o fúngicas, tomadas con el asa del material a estudiar, se van depositando

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sobre la superficie del agar seleccionado, según la muestra, cubriendo toda la placa de Petri teniendo la
precaución de no pasar por encima del trazo ó estría anterior. También se siembran en medios líquidos
para incrementar el número de células bacterianas (aquí no se obtiene aislamiento) obteniendo mayor
biomasa celular que la existente en la muestra original (enriquecimiento).

Ve r vide o
04 - El me che ro Bunse n

Incubación
Una vez sembradas, las placas deben llevarse a la estufa cuya temperatura debe ser la adecuada para
el crecimiento óptimo de la mayoría de las bacterias (35-37 ºC durante 24-48 hs). Existen también
microorganismos que se desarrollan a 28 ºC (ej. hongos dimórficos termales) por lo que se debe tener
otra estufa de cultivo regulada a esa temperatura.

Para realizar los cultivos no sólo basta tener en cuenta la temperatura sino también la atmósfera de
incubación. Para ello, si requerimos hacerlo en aerobiosis, basta con poner las placas en el interior de la
estufa, cuya atmósfera es igual a la del medio ambiente. En estas condiciones crecen las bacterias
aerobias estrictas y las anaerobias facultativas.

Algunas bacterias, a pesar de ser aerobias, crecen mejor en una atmósfera de oxígeno reducida .
Existen en comercio estufas de cultivo que poseen en su interior una atmósfera de CO2 provista por
conexión externa. De forma casera, podemos lograrlo colocando las placas sembradas en el interior
reducida. Existen en el comercio estufas de cultivo que poseen en su interior una atmósfera de CO2
provista por conexión externa. De forma casera lo logramos colocando las placas sembradas en el
interior de una lata de metal con un tapón de algodón o gasa humedecido con agua corriente (humedad
99%) y una vela encendida. Al apagarse la vela se logra en su interior una atmósfera reducida en
oxígeno con un 5-10% de CO2. Así se lleva a la estufa de cultivo para que esté a la temperatura de 37
°C.

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Para incubar las siembras en anaerobiosis estricta , las placas se colocan en jarras o sobres (bolsas
plásticas) que cierran herméticamente. Por una reacción química, producen H2 para atrapar las
moléculas de O2 atmosférico que hay en el interior formándose H2 O, dejando así el ambiente donde
están las placas libres de O2 .

Desarrollo
Cada célula bacteriana o fúngica da lugar, durante el tiempo de incubación, a miles de bacterias
(unidad formadora de colonias, UFC) que dan origen a una colonia constituida cada una por un solo
tipo de células idénticas.
El tamaño de las colonias suele ser de distintos diámetros (0,1 a 3 mm aproximadamente), visible a
simple vista. Si el medio de cultivo sembrado es líquido, se observa enturbiamiento del medio en todo el
tubo o en un sector (fondo o superficie).

Cultivo micológico

El cultivo e n micología también se realiza en medios artificiales. Los cultivos pueden producir
esporas que se liberan al aire y pueden inhalarse, es por ello que los medios, salvo para casos
específicos, no se fraccionan en placas de Petri sino habitualmente en tubos de ensayo, en los que el
agar se solidifica inclinado y cuya boca estrecha dificulta la difusión de las esporas.

Los hongos son microorganismos heterótrofos y aerobios estrictos pudiendo ocasionalmente ser
microaerófilos, se desarrollan sobre una gran cantidad de sustratos merced a enzimas hidrolíticas

Los medios usuales de bacterias permiten el crecimiento de los hongos, sin embargo, en micología se
utilizan medios selectivos como el Sabouraud, muy rico en glucosa y cuyo pH bajo (5,6-7,2) dificulta el
crecimiento de diversas bacterias sin inhibir a los hongos. Para incrementar este carácter selectivo

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frente a las bacterias se puede añadir al medio de Sabouraud diversos antibióticos (cloranfenicol o
gentamicina) así como antifúngicos (cicloheximida) que inhiben hongos ambientales o no patógenos.

Como no se utilizan placas (para evitar la desecación del medio), se sie mbran varios tubos de cada
muestra por agotamiento.

Cuando se manipulan muestras probablemente contaminadas con hongos filamentosos o cultivos de los
mismos se debe manipular dentro de una cabina de se guridad (preferentemente Clase II – tema a
tratarse en Laboratorio de Habilidades N° 5) con todas las recomendaciones que ello implica.
Los hongos levaduriformes dan lugar a colonias semejantes a las bacterianas, cremosas, pero más
opacas de 2 a 5 mm de diámetro. Los hongos filamentosos dan lugar a colonias mayores (5-15 mm),
vellosas, algodonosas o pulverulentas, de vistosos y variados colores, que deben ser observadas en el
anverso y reverso, donde puede verse si el pigmento difunde al medio.

El cultivo en parasitología

En general, el cultivo e n parasitología se utiliza en el ámbito experimental. En la confirmación del

diagnóstico clínico de parasitosis, en nuestro medio se intenta realizarlo con algunos parásitos
(Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, Leishmania , amebas, etc.), pero el costo/beneficio y la
complejidad en su realización no aumentan ni la sensibilidad ni la especificidad del método, por lo que
las observaciones en fresco por campo brillante y las coloraciones siguen siendo muy eficaces.
Más adelante, en los laboratorios 5 y 6 veremos que en algunos casos se recurre a la detección
antigénica, a la detección de ácidos nucleicos (todavía no muy utilizados en la Parasitología clínica
diagnóstica) o a la detección de anticuerpos para el diagnóstico desde el laboratorio microbiológico.
Concluyendo, las técnicas de cultivo quedan restringidas en esta especialidad a laboratorios con alto
grado de especialización (fundamentalmente en investigación básica y aplicada).

El cultivo en virología

El diagnóstico por cultivo de virus tradicionalmente se ha considerado muy complejo, laborioso y

caro, debido a la imposibilidad de efectuar un examen directo por técnicas sencillas de microscopía
óptica (fresco o coloración) y el aislamiento por cultivo en medios sintéticos. El cultivo en esta
especialidad debe, necesariamente, efectuarse en líneas celulares.
Las células se multiplican in vitro si encuentran las condiciones similares a las que existen in vivo. Se
requiere para ello de medios ricos en sustancias nutritivas, pH, osmolaridad, iones inorgánicos, fuente

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de carbono, oxígeno y CO2. Se trabaja bajo cabina de seguridad biológica (clase II) para evitar
contaminaciones.
Las células se introducen en el frasco con todos los suplementos necesarios para su multiplicación
hasta formar una monocapa de células. Sobre ellas se inocula el material biológico a estudiar. Las
líneas celulares (HeLa, McCoy, etc.) utilizadas para la propagación de los virus se adquieren
comercialmente. Según sean los virus que se pretenden aislar se elige el tipo de células. El material
clínico a inocular debe ser tratado previamente con antimicrobianos para evitar contaminaciones con
bacterias u hongos que pudieran invalidar el cultivo celular.
Los cultivos celulares en los que existe replicación vírica sufren diversas alteraciones que permiten
detectarla (e fe cto citopático). Son fácilmente observables como zonas focales de necrosis y
desprendimiento de células del tubo o frasco que se ven a simple vista. Otras veces estas alteraciones
morfológicas celulares no son tan evidentes y tienen que realizarse observándose, en microscopio
invertido o por técnicas inmunológicas de inmunofluorescencia. Los cultivos celulares están en desuso
para microbiología clínica.
Una alternativa al cultivo es la inoculación e n animale s de e xpe rime ntación. Esta técnica ha sido
empleada para el aislamiento de virus que no se propagan bien en cultivos celulares. Se puede realizar
en embrión de pollo de un huevo fecundado de 10 días (gripe) o por inoculación intracerebral en el
ratón lactante (Coxsackie), como los cultivos celulares se reservan para investigación o laboratorios
muy especializados.
Las té cnicas de biología mole cular, como las de de te cción de antíge nos o las de de te cción de
ácidos nucle icos son las que se emplean hoy en la práctica diaria, debido a su sencillez, eficacia,
especificidad, menor riesgo en la manipulación, etc., superando así a las pruebas convencionales que
someramente acabamos de describir.
La laboriosidad y costo económico del diagnóstico virológico clásico ha hecho que ésta sea un área
donde las nuevas técnicas han encontrado un campo fértil para su aplicación.

Identificación de microorganismos

La práctica de la microbiología clínica, además de lo ya trabajado en los laboratorios anteriores,

contempla la ide ntificación de los age nte s e tiológicos responsables de los procesos infecciosos.
Esto consiste en asignar al aislamiento su gé ne ro y e spe cie con el mayor grado de certeza que le sea
posible así como la detección de la sensibilidad a los antimicrobianos (AMB).
La finalidad de este proceso es lograr la aplicación de una te rapia e ficaz, e l conocimie nto de las
implicancias patogé nicas/patológicas y la e volución microbiológica/clínica de l proce so
infe ccioso e n e studio .
Por lo tanto, para llevar a cabo todo esto, el laboratorio de microbiología cuenta con distintos métodos
que pueden ser:

Fe notípicos Mole culare s

Es decir basados en las características Se basan en la detección de antígenos

“observables” de los microorganismos (como su (inmunológica), proteínas (proteómica),
morfología, crecimiento, desarrollo y biomarcadores (metabolómica) ó genes
características bioquímicas/metabólicas) específicos (genómica).

Cualquiera sea el método de tipificación, este debe cumplir con tres requisitos esenciales:

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- Pode r de tipificación: ser capaz de catalogar cualquier aislamiento en un tipo determinado.

- Pode r discriminatorio: ser capaz de discriminar entre aislamientos no relacionados.
- Re producibilidad: ser capaz de brindar resultados reproducibles entre diferentes ensayos y
estables para un aislamiento obtenido de diferentes orígenes.
A la hora de evaluar un método de tipificación, además de considerar estos requisitos, se considera
también la posibilidad y sencillez de realización junto con la interpretación de resultados, ya que es
fundamental para la identificación de los microorganismos, que la metodología empleada sea “pre cisa
y posible ”.
Según cuál sea el microorganismo en cuestión (bacterias, hongos, parásitos o virus), la metodología y
necesidad de realización varían.

Métodos Fenotípicos
- Biotipo
La identificación de las bacterias y levaduras, se realiza basándose en las pruebas bioquímicas que
permiten determinar las características metabólicas de las mismas (capacidad de hidrolizar
determinados azúcares, desaminación y descarboxilación de aminoácidos, producción de catabolitos a
partir de sustratos determinados, etc).

Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada
y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su
lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo
pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que
determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de
identificación que contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de estas pruebas pueden
realizarse de forma rápida tras incubación de unas 2-6 hs; en general, se trata de reacciones
enzimáticas cromogénicas o pruebas convencionales modificadas, existen discos o tabletas
comercializados con sustratos cromogénicos para uso individualizado).
- Me dios de agar cromogé nicos: Estos medios están basados en reacciones enzimáticas

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frente a un sustrato cromogénico, que le otorga un determinado color a la colonia de

microorganismos sembrada en él, con lo que se puede predecir cuál es el microorganismo
crecido. Por ejemplo, en agar cromogénico, cuando las colonias adquieren un color morado
(según marca comercial), es posible que se trate de Escherichia coli. En agar Chromoagar
Candida (según marca comercial), el crecimiento de una colonia de color verde, hace pensar
en una probable Candida albicans.
- Por prue bas bioquímicas o me tabólicas conve ncionale s: Aquí se comparan las
características observables de bacterias desconocidas prove nie nte s de un cultivo puro con
aquellas de un cultivo tipo (cepas de referencia/cepas de colección). En el proceso de
identificación microbiana se deben lograr un conjunto de pruebas de forma secuencial, en
función del género o de la especie bacteriana que se pretende identificar, el origen del
aislamiento microbiano y de la factibilidad de las mismas. Sie mpre se de be n buscar
caracte rísticas fe notípicas e stable s .

Limitacione s de l proce so de biotipificación

- Resultados erróneos en las pruebas primarias (I nivel) pueden conducir a una identificación
equivocada.
- Es laborioso y más lento que otros métodos (24- 48 hs).
- En ningún caso estos métodos de identificación fenotípica pueden proporcionar una certeza
absoluta. Solamente indican cuál es el género y/o la especie y/o biotipo al que la bacteria
identificada tiene mayor probabilidad de pertenecer.

Sistemas comerciales: Paneles cromogénicos comerciales

Existen varias marcas comerciales y modelos. El panel contiene 20 microtubos con sustratos
deshidratados (cada uno correspondiente a un tubo de la macroescala) que permiten determinar la
presencia de distintos productos del metabolismo del microorganismo en cuestión, entre 20 o más
pruebas.
Se le asigna a cada tubo un número de acuerdo a la prueba bioquímica estudiada, y se llega a un
número de 7 dígitos que se vuelca en una base de datos que indica el/los microorganismos con la
probabilidad de certeza de su biotipificación.
Pueden ser utilizados para bacterias (aerobias, anaerobias, cocos Gram positivos, bacilos Gram
positivos y negativos, etc.) y hongos del género Candida.

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Sistemas comerciales: Por sistemas automatizados

Los sistemas automatizados de identificación y estudio de sensibilidad ofrecen como principal ventaja la
disminución del tiempo requerido en la obtención de los resultados; sin embargo, son de mayor costo
que los sistemas manuales convencionales que estuvimos viendo hasta ahora, y se han descrito
restricciones técnicas a su uso para determinados microorganismos y antimicrobianos.

S iste m a VITEK. Es un sistema automatizado de identificación bacteriana y estudio de sensibilidad antimicrobiana. Se basa en la
inoculación de una suspensión de microorganismos en tarjetas con determinados paneles de reacciones bioquímicas o de diluciones
estandarizadas de distintos antibióticos correspondientes a los puntos de corte de sensibilidad.

- Antibiotipo
El antibiotipo es un método que se basa en el comportamiento que poseen determinados
antimicrobianos contra una determinada bacteria específica, es decir, sirve para “che que ar” e l
biotipo que estamos estudiando, según el patrón de sensibilidad antimicrobiana (AMB) que este posea.
Esto significa que si, por ejemplo, sabemos que la bacteria es naturalmente resistente a un determinado
AMB, debemos encontrar este resultado en la prueba de sensibilidad que realicemos sino puede estar
equivocada la identificación (género y/o especie).
También se puede observar determinados mecanismos de resistencia que están presentes en algunas
bacterias y en otras no.
Este estudio se realiza con la misma metodología que las pruebas de sensibilidad antimicrobiana.

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Métodos moleculares
Estos métodos han aparecido como procedimientos alternativos complementarios a los fenotípicos. Se
pueden dividir en dos: mé todos inmunológicos (detección de Ag y/o Ac) y las “ómicas ” (proteínas,
biomarcadores, genes).

A. Se rotipo – Se rovarie dad – Se rogrupo (Mé todos mole culare s inmuno lógicos.
De te cción de antíge nos de supe rficie )
En las bacterias las estructuras antigénicas son muy numerosas adquiriendo relevancia las que se
encuentran en la parte más externa de ellas: antígeno K (cápsula), antígeno H (flagelos), LPS
(lipopolisacáridos), antígeno O, proteínas de la membrana externa, ácidos teicoicos, exopolímeros, etc.
Estas moléculas antigénicas han permitido subclasificar bacterias de un mismo género y/o especie .
Tienen importancia a nivel epidemiológico, por ejemplo, la recuperación de Vibrio cholerae de un
aislamiento de una muestra clínica serogrupo O1 u O139 implican patogenicidad y los restantes no.
Otro caso: Escherichia coli O157:H7 (serogrupo O157 y serotipo H7) asociada al síndrome urémico
hemolítico.
Así, un serotipo determinado es una subpoblación de un microorganismo infeccioso que se diferencia
de otras subpoblaciones de la misma especie por medio de un antígeno. Por ello, las respuestas
inmunitarias frente a un serotipo de un microorganismo pueden no proteger frente a otro serotipo del
mismo género y especie.
Los términos serotipo y serogrupo son usados en conjunto con números, letras o números romanos. Ej:
Escherichia coli O157 H7, Streptococcus agalactiae (beta hemolítico grupo B Ia).

B. “ÓMICAS”
Este es un neologismo proveniente del inglés que, en biología molecular, se utiliza como sufijo para
referirse al estudio de la totalidad o del conjunto de algo como, por ejemplo, genes, proteínas, lípidos,
metabolitos o incluso las relaciones entre ellos. Se valen para su desarrollo de otras especialidades muy
interrelacionadas como la bioinformática, tecnologías rápidas, ingeniería de micromatrices y
automatización.
En microbiología, el término “ómicas” hace referencia a un nuevo “lenguaje” de los genes, que da lugar
hoy por hoy a 4 distintas disciplinas divididas en ge nómica, transcriptómica, prote ómica y
me tabolómica.
En este momento se ha implementado la identificación de microorganismos por la técnica de detección
del perfil de proteínas, “huella peptídica” característica y específica de cada microorganismo
(proteómica) que se verá con más detalle en el Laboratorio Nro. 5.

Identificación de hongos filamentosos

Se identifican por las características macroscópicas de las colonias o macromorfología (color del
anverso y el reverso, textura, forma, etc.) y fundamentalmente por la morfología microscópica o
micromorfología de las hifas, esporas sexuales o asexuales y de las estructuras donde éstas se
generan. También se realizan en ciertos casos pruebas fenotípicas complementarias.

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Actividades
1. ¿Qué parámetros son importantes para el cultivo in vitro de hongos y bacterias?

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2. ¿Por qué son importantes, para el microbiólogo, los datos que el médico consigna en la solicitud
de análisis microbiológicos? ¿Cuáles consideras que incluirías en tu caso?

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3. ¿Cuánto tiempo tardan las bacterias en dar colonias visibles en los medios de cultivo? ¿Cómo
se identifican?

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4. ¿Cuánto tiempo tardan las levaduras en dar colonias visibles en los medios de cultivo? ¿Cómo
se identifican?

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5. ¿Cuánto tiempo tardan los hongos filamentosos en dar colonias visibles en los medios de
cultivo? ¿Cómo se identifican?

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Laboratorio de habilidades N° 4: Métodos

directos (Parte 2)
Obje tivos de e ste laboratorio:
- Concientizarse de la problemática actual de la resistencia a los antimicrobianos
- Distinguir las distintas técnicas que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana
de los microorganismos involucrados en procesos infecciosos
- Comprender las distintas pruebas in vitro para obtener el perfil de sensibilidad
- Interpretar los resultados y resolver situaciones prácticas
- Justificar la utilización de cada técnica en particular

Durante el ciclo diagnóstico estudiamos los distintos procesos de diagnóstico directos e indirectos del
examen microbiológico. Comenzamos con el diagnóstico directo y la investigación del microorganismo
causal del proceso infeccioso que incluye la toma de mue stra, el aume nto de la biomasa
microbiana por medio de distintos cultivos y conocimos los distintos mé todos de ide ntificarlos .

En la práctica médica, ¿qué hace mos una ve z ide ntificado e l microorganismo?

Sabemos que nuestro organismo está preparado con un complejo sistema inmunológico que nos protege
contra diversas noxas. ¿Pero qué sucede cuando esas defensas no son suficientes para frenar un
proceso infeccioso? Nos introducimos así al concepto de antimicrobianos (AMB)

Antimicrobianos: reseña histórica

Si bien la historia de los AMB comienza, formalmente, en el siglo XX existen registros de culturas
antiguas que utilizaban compuestos naturales para combatir enfermedades infecciosas (ej. extracto de
plantas o algunos mohos).
En 1910 se comienza a comercializar un producto derivado de compuestos orgánicos del arsénico
llamado arsfenamina (Salvarsan), conocido como “bala mágica” y que parecía tener cierta efectividad
en el tratamiento de la sífilis.
Llegado 1928 se produce un acontecimiento que revolucionaría la historia de la medicina: un científico
llamado Fleming descubre en su laboratorio que sus placas de cultivo bacteriano habían sido
contaminadas por unas colonias de un hongo llamado Penicillium y podía observarse que en la
periferia de esta colonia fúngica el crecimiento bacteriano estaba inhibido.
En 1935 aparece la primera sulfonamida, el prontosil. Funcionaba como una prodroga, ya que el
fármaco se metaboliza en el organismo para convertirse en sulfanilamida. Es por este motivo que se
considera a las sulfas dentro de los primeros AMB de amplio espectro que fueron utilizados.
Sin embargo, no fue sino hasta 1941 que dos científicos, Florey y Chain logran producir extractos
purificados para producir la Penicilina. Fue el primer AMB descubierto y a partir de ese momento se
comenzó a invertir recursos en el desarrollo de estas sustancias. Fleming, Florey y Chain ganaron el
Premio Nobel de Medicina en 1945.
De allí en más se sucedieron varios descubrimientos de AMB tanto de origen natural como sintéticos.

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Definición y clasificación de los fármacos antimicrobianos

Los AMB son sustancias de distinto origen (natural o sintéticas) utilizadas para dar muerte
(microbicida) a los microorganismos o inhibir su crecimiento (microstático).
Se intenta lograr que el ATM sea lo más selectivo posible con las células microbianas causando la
mínima expresión de toxicidad sobre las células del hospedero.
Según el orige n de su e structura química podemos hablar de 3 tipos de sustancias:
- Antibióticos (anti-vida): Son sustancias naturales desarrolladas por seres vivos que suprimen
o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Por ejemplo, la penicilina es una sustancia
producida por hongos del género Penicillium.
- Quimioantibióticos: Son antibióticos modificados en el laboratorio con la finalidad de
expandir su espectro. Por ejemplo, las aminopenicilinas.
- Quimiote rápicos : Son substancias completamente sintéticas elaboradas por el hombre. Por
ejemplo, las sulfamidas.

Según el grupo de microorganismos sobre los que actúan, los agentes microbianos pueden ser:

- Antibacte rianos
- Antivirale s
- Antifúngicos
- Antiparasitarios

Antibacterianos
Para entender cómo actúan los antibacte rianos es imprescindible conocer la estructura de los
microorganismos. Podemos resumirlo en el siguiente esquema:

Inhibición de la pare d Betalactámicos Pe nicilinas

bacte riana Ce falosporinas

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Carbape ne ms

Otros grupos Vancomicina

Daptomicina
Isoniacida
Etambutol

Inhibición de la sínte sis Unión a ribosoma 30S Aminoglucósidos

prote ica Te traciclinas

Unión a ribosoma 50S Macrólidos

Lincosamidas
Estreptograminas

Inhibición de la sínte sis Inhiben la replicación de ADN Quinolonas

de ácidos nucle icos Me tronidazol

Inhiben la síntesis de ARN Rifampicina

Antime tabolitos Inhiben la síntesis de ácido fólico Sulfonamidas

Trime toprima
Tabla. Clasificación según mecanismo de acción de los antibacterianos

Antifúngicos
Ahora para entender cómo actúan los antifúngicos es imprescindible conocer la estructura de los
mismos y el sitio de acción de cada uno de ellos.

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Inte racción con e l e rgoste rol Polienos Anfotericina B

(membrana celular) Nistatina

Inhibición de sínte sis de Nucleósidos 5- Fluorocitosina

ácidos nucle icos (núcleo)

Inhibición de la sínte sis de Imidazoles Clotrimazol

e rgoste rol por bloque o de Miconazol
14- de me tilasa (membrana Ketoconazol
celular)
Triazoles Fluconazol
Itraconazol
Voriconazol
Posaconazol

Inhibición de la sínte sis de Alilaminas Terbinafina

e rgoste rol por bloque o de Naftifina
e scuale no oxidasa (membrana
celular)

Inhibición de la sínte sis de Equinocandinas Caspofungina

glucanos (pared) Micafungina
Anidulafungina

Tabla. Clasificación según mecanismo de acción de los antifúngicos

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La elección de un AMB debe estar basada en las propiedades farmacocinéticas, toxicidad, enfermedad
clínica, enfermedad/es de base, vías de administración, etc.
Se recomienda utilizar combinaciones de AMB en el caso de ampliar empíricamente el tratamiento
polimicrobiano de una infección, prevenir emergencia de organismos multirresistentes durante la terapia
y producir un efecto bactericida sinérgico.

Mecanismos de resistencia antimicrobianos

La Resistencia (R) a los AMB es la capacidad natural o adquirida por parte de una bacteria de
permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de un AMB.
Esto obliga al profesional médico a utilizar otros AMB. Cuando se lanza al mercado un nuevo fármaco
se debe especificar el espectro de acción sobre el cual es eficaz. Este va cambiando a medida que la
droga es utilizada clínicamente (aparición de resistencias), llegando un momento que es inutilizada y
cae en desuso.
Miremos en la figura de abajo la línea de tiempo. En la parte superior el año en que el AMB comenzó
a utilizarse en los tratamientos infecciosos y abajo los años en que se detectaron las primeras
resistencias, que como podemos observar no fueron mucho tiempo después.

Esto pudo deberse a:

- Presencia de mecanismos de resistencia (R)
- Uso indiscriminado de ellos
- Uso de AMB de amplio espectro
- Tratamiento inútiles prolongados

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- Tratamientos incompletos o no adecuados para el aislamiento microbiano causante de la

infección.
- Falta de exámenes microbiológicos antes del tratamiento.

¿Qué es One Health?

One Health (“una sola salud”) es un enfoque de la salud que

considera que los seres humanos, los animales y el medio ambiente
son interdependientes, por lo que promueve la cooperación
interdisciplinaria, especialmente entre la medicina humana, la
medicina veterinaria y las ciencias ambientales, para trabajar de
forma local, nacional y global con el objetivo de una salud para
todos.

Tipos de resistencia
- Natural o intrínse ca (Son propias del microorganismo)

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Es la que presentan los microorganismos de un mismo género o especie en forma preestablecida a

alguna familia de AMB. Ej.: Las bacterias del género Proteus son TODAS resistentes naturales a los
nitrofuranos.
Se demostró en los aislamientos de bacterias, cuya existencia se estima hace 2000 años atrás,
(encontradas en las profundidades de los glaciares) la presencia de mecanismos de resistencia a AMB

- Adquirida se produce a través de:

- Mutacione s : Cambios en la secuencia de bases del cromosoma que codifica el modo
de acción del AMB y se transmite de generación en generación. Ejemplo:
Enterobacterias resistentes a las fluorquinolonas por modificación de la ADN-girasa.
- Transmisión horizontal de e le me ntos ge né ticos móvile s de otras bacte rias :
Plásmidos, Integrones, Transposones, por mecanismos como la conjugación,
transcripción o transformación.

Mecanismos de resistencia

Eflujo Un AMB penetra en la bacteria y es expulsado de la misma por un

transporte activo, una especie de bomba expulsora que utilizan las bacterias
para la excreción de productos residuales o tóxicos. Ejemplo:
Staphylococcus aureus resistentes a las tetraciclinas.

Disminución de la Puede realizarla la bacteria por pérdida o modificación de los canales de

pe rme abilidad de entrada (porinas) Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa resistente a imipenem
la pare d bacte riana (carbapenem).

Modificación de l Hay AMB que se unen a proteínas que son esenciales para la sobrevida de
sitio de acción la bacteria. La R de las bacterias al AMB radica en que se modifica la
proteína diana y cambia su función. Ejemplo: Staphylococcus aureus

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resistente a la meticilina por alteración de las PBP (Penicillin Binding

Proteins o Proteínas ligadoras de Penicilina).

Producción de Las bacterias producen enzimas que inactivan o destruyen los AMB. Es
e nzimas oportuno citar las enzimas cloranfenicol acetil transferasa sobre el
inactivante s de l cloranfenicol y las betalactamasas que tiene la función de destruir el anillo
AMB (*) beta-lactámico de los AMB de ese grupo.
No hace mucho tiempo fueron creadas en la industria farmacéutica
moléculas de “inhibidoras de la betalactamasa” (ácido clavulánico, sulbactam
y tazobactam) para proteger a los AMB del efecto destructor de la enzima.
(*) Citaremos ejemplos de estas enzimas:
- AmpC cromosómicas inducibles: Se producen a bajos niveles de manera natural y aumentan su síntesis
en presencia de inductores (betalactámicos). Como se mencionó anteriormente, pueden derreprimirse,
perdiendo así la característica de inducción. Ejemplos: Enterobacter spp., M. morganii, Providencia
spp. P. aeruginosa.
- AmpC cromosómicas no inducibles (constitutivas): Su expresión es a niveles muy bajos sin mostrar
resistencia. Cuando se encuentran hiperproducidas pueden conferir resistencia a todos los
betalactámicos a excepción de cefalosporinas de 4ta generación y carbapenémicos. Ejemplo:
Escherichia coli.
- AmpC plasmídicas inducibles y AmpC plasmídicas constitutivas : La evidencia molecular sugiere que los
genes que codifican a estas enzimas, derivan de los genes ampC cromosómicos que naturalmente
poseen las enterobacterias arriba mencionadas. Estos genes han sido integrados en elementos genéticos
transferibles facilitando la diseminación a diferentes microorganismos. Ejemplo: Los genes ampC
mediados por plásmidos han sido encontrados en bacterias como Salmonella spp., K. pneumoniae y
Proteus mirabilis que naturalmente no poseen estos genes.
Hasta el presente se han descrito más de 20 familias de AmpC plasmídicas. Al igual que las
betalactamasas AmpC cromosómicas hiperproductoras, las enzimas AmpC plasmídicas confieren
resistencia a un amplio espectro de betalactámicos incluyendo penicilinas, oximino cefalosporinas,
cefamicinas, etc.
- Betalactamasa de espectro extendido (BLEE)
- Carbapenemasa

Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (PSA)

¿Para qué se realizan?

Estas pruebas son de particular importancia para instaurar un correcto tratamiento antimicrobiano
individual, monitorear la evolución de la resistencia antimicrobiana (epidemiología local, nacional, etc.)
y/o actualizar estrategias para el tratamiento empírico de la infecciones.
Se realizan a fin de orientar al profesional médico a formular un adecuado y oportuno tratamiento
antimicrobiano (AMB).
Según cuál fuera el microorganismo en cuestión (bacterias, hongos, parásitos o virus), la metodología y
necesidad de realización varían.

¿En qué consisten?

Estas pruebas se basan en la falta, disminución o inhibición del crecimiento de un microorganismo en
un medio ante la presencia de cantidades conocidas de AMB. Se efectúan desafiando una suspensión
de microorganismos estandarizada con una o diferentes concentraciones o tipos de AMB,
comprobando si tiene lugar o no la inhibición del crecimiento bacteriano.
Todas son técnicas rigurosamente controladas y estandarizadas. Por ejemplo: en pureza y densidad del
inóculo, composición del medio, reactivos, condiciones de incubación, métodos de lectura, criterios

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clínicos e interpretación de resultados.

En nuestro país, los microbiólogos clínicos se ajustan a las recomendaciones emanadas por la Sección
antimicrobianos del Instituto de epidemiología Dr. Carlos Malbrán y el CLSI (Status Clinical and
Laboratory Standards Institute ) que llegan en forma de guías metodológicas y tablas de
interpretación revisadas y actualizadas anualmente.

¿Por qué son importantes?

La rápida evolución de la adquisición de los mecanismos de resistencia por las bacterias clínicamente
significativas justifica sobremanera la realización de estos exámenes de expresión fenotípica y nos
induce a la realización de otros adicionales en la mayoría de los casos.
La sensibilidad (S) in vitro es un prerrequisito para inferir la eficacia de un tratamiento AMB, o sea
que orienta para la decisión del AMB a utilizar en el tratamiento en cada paciente.
En algunas bacterias a veces su resistencia (R) a los AMB puede ser predicha porque tienen un
espectro natural de actividad o de R natural y la mayoría de las veces nos orientan en su tipificación.
Ejemplos: Proteus mirabilis R natural a colistin, Klebsiella pneumoniae a ampicilina, Pseudomonas
aeruginosa a nitrofuranos, cefalosporinas de 1a y 2a generación, etc.
También hay algunas que son naturalmente S pero adquieren R o sea que su antibiotipo ha sido
modificado por mutación o adquisición de genes. Esta evolución de la R está íntimamente ligada al uso
de AMB. Es por esto que la detección de la S por pruebas fenotípicas o genotípicas es esencial.

Técnicas para determinar la sensibilidad antimicrobiana in vitro

Bacte rias
Cabe aclarar que estas pruebas son para bacte rias de rápido cre cimie nto , que no son e xige nte s
e n cuanto a re que rimie ntos nutricionale s por cultivo, ae robias o anae robias facultativas , pH
óptimo alre de dor de 7 y te mpe ratura de cre cimie nto 35-37 ºC.
Es por esta razón que en el laboratorio de microbiología, no se realiza habitualmente la investigación de
la sensibilidad a los AMB de las bacterias anaerobias, (aparente patrón estable de sensibilidad) ni de
las bacterias fastidiosas o de difícil crecimiento, como así también de las espiroquetas, micoplasmas,
clamidias y rickettsias. En el caso de las micobacterias, las pruebas de sensibilidad AMB se realizan en
laboratorios especializados y por técnicas diferentes (feno y genotípicas).
Existen distintas técnicas para realizar las PSA, estas pueden ser por DILUCIÓN y/o DIFUSIÓN, o
bien técnicas que combinan ambos métodos. SIEMPRE de be n re alizarse con cultivo bacte riano
puro , y que no sea parte de la microbiota colonizante habitual en el sitio infeccioso o un contaminante.

¿Cuáles y cuántos AMB ensayamos?

En las PSA lo conveniente es probar varios AMB pero NO todos los existentes en el mercado:
- Uno de cada grupo y que su actividad se a e quivale nte al e nsayado . In vivo tendrá la
misma actividad que él. Ejemplo: Se ensaya solo cefazolina pero su actividad in vitro se hace
extensiva para todas las cefalosporinas de 1ra generación (cefadroxilo, cefalexina, cefalotina,
etc).
- Todo aque l AMB de inte ré s te rapé utico para utilización del profesional médico y además
que lle gue activo e n conce ntración ne ce saria e n e l sitio de la infe cción.
- Aque llos AMB que se constituye n e n “marcadore s te rapé uticos” . Son más amigables
para la detección de los mecanismos de R. Ejemplo: Se ensaya cefoxitina como marcador de
la meticilino resistencia en Staphylococcus aureus y predice la actividad a todos los

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betalactámicos.
- Espectro clínico de los AMB: Está integrado por la R natural del microorganismo, frecuencia
de adquisición de la R, farmacocinética y datos clínicos y es regularmente revisado. La
eficacia clínica no solo es suficiente con una correcta realización de las PSA sino de una
apropiada indicación clínica profesional.

Categorización de los microorganismos frente a la actividad de los AMB.

- Un microorganismo se categoriza como Se nsible , con dosificación estándar (S)
cuando hay una alta probabilidad de éxito terapéutico usando un régimen de
dosificación estándar de agente.
- Un microorganismo se categoriza como Se nsible , con e xposición aume ntada (I)
cuando hay una alta probabilidad de éxito terapéutico porque la exposición al agente
está aumentada por ajuste del régimen de dosificación o por su concentración en el
sitio de infección.
- Un microorganismo se categoriza como Re siste nte , (R) cuando hay una alta
probabilidad de fracaso terapéutico incluso cuando haya un incremento de la
exposición.

Técnicas de dilución
Se realiza la técnica en macrodilución con una serie de tubos que poseen la misma cantidad de un
caldo de cultivo adecuado para el crecimiento de la bacteria que estamos estudiando; en cada uno de
ellos se coloca una cantidad decreciente de un AMB (la mitad que en el tubo anterior), dejando
siempre un tubo control sin antibiótico. Finalmente se colocan en todos los tubos la misma cantidad de
una suspensión estandarizada de las bacterias en cuestión. Estos tubos se incuban por 18-24 hs. en
estufa a 35-37 oC.
Pasado el lapso de tiempo se observa en cuáles tubos hubo crecimiento bacteriano (turbidez) y en
cuáles no. El tubo con menor cantidad de AMB de los que no presentan crecimiento (el medio
permanece transparente como lo era originalmente) es el que indica la mínima concentración de
antimicrobiano o CIM, (expresada en microgramos por mililitro) que se requiere para inhibir el
crecimiento de la bacteria qué estamos estudiando.

De esto se deduce que cuanto menor es la cantidad que se necesita de un AMB para que este inhiba a

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un microorganismo, mayor es la actividad de él frente al microorganismo y viceversa. Esta técnica

también puede realizarse en pequeños pocillos contenidos en placas de poliestireno fondo en U, técnica
denominada MICRODILUCION, en la cual el crecimiento bacteriano se observa como un botón turbio
en el fondo del pocillo.

La desventaja de las técnicas de macrodilución, es que sólo permite probar un antibiótico por ve z, lo
cual resulta un tanto engorroso y costoso. Esta desventaja puede solucionarse en parte con las técnicas
de microdilución, ya que las placas (de 96 pocillos en U) permiten probar diferentes AMB en cada
columna y por los sistemas automatizados.

Técnica de difusión (Método de Kirby-Bauer)

Se basa en la utilización de una placa de Petri que posee un medio de cultivo sólido (Agar
Mueller-Hinton) en la cual se siembra una suspensión de la bacteria que estamos estudiando en
solución fisiológica (correspondiente a una concentración igual a la turbiedad del tubo 0.5 de la escala
de Mc Farland).
Esta siembra se realiza en tres direcciones diferentes con el fin de que se consiga una distribución lo
más homogénea posible de las bacterias sobre el medio de la placa.
Posteriormente se colocan sobre la misma una serie de monodiscos de papel o tabletas impregnados
con una cantidad determinada de AMB. Estos difunden radialmente desde el disco al agar sembrado
con bacterias, estableciéndose un gradiente de concentración a su alrededor (la mayor concentración
de antimicrobiano está alrededor del monodisco y va disminuyendo hacia la periferia).

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Estas placas se dejan incubando en la estufa por 18-24 hs. a 35-37 oC. Al cabo de este tiempo se
puede observar un crecimiento homogéneo en la superficie, con halos de inhibición alrededor de los
discos. El diámetro de estos halos expresados en mm se mide con un calibre o regla.

Los mm que resultan de la lectura de la ausencia de crecimiento se comparan con una tabla que
expresa, para cada AMB el diámetro que indica S, I ó R.

Ve r vide o
Antibiograma

Técnica mixta (método epsilométrico o por gradiente de

concentración AMB)

Años atrás se la conocía como E-Test y combina las técnicas de difusión y dilución. Se realiza de igual
forma que para la técnica de difusión pero en vez de colocar los monodiscos o tabletas se colocan tiras
plásticas que poseen a su largo una concentración decreciente de un determinado AMB.
Tras la incubación de la placa durante 18-24 hs. a 37 ºC, podemos observar un halo de inhibición
elipsoidal alrededor de la tira. El punto de la tira en la cual termina este halo, es decir, donde comienza
el crecimiento bacteriano, corresponde a la CIM de ese AMB.

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Detección de mecanismos de resistencia a los AMB

Tanto con el método de Kirby-Bauer o el epsilométrico, se pueden detectar mecanismos de resistencia

a determinados AMB. Citaremos algunos ejemplos:

Interacción antimicrobiana
El uso de AMB combinados en un mismo tratamiento infeccioso en la actualidad es habitual
empleándose con mayor frecuencia de lo que se justifica. La aparición de nuevos AMB,
conjuntamente con las especificidades del hospedero y la resistencia que desarrollan las bacterias, han
obligado a modificar la estrategia a seguir en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Es
importante reconocer que este proceder por parte de los profesionales médicos puede aumentar en
grado significativo la incidencia de efectos adversos, incrementar el costo del tratamiento y, en
ocasiones, disminuir la eficacia clínica por obstaculizar la actividad de un fármaco con la presencia de
un segundo.

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Cuando empleamos 2 AMB en un tratamiento podemos lograr entre ellos:

- Sine rgia: se refiere a la propiedad de ciertas combinaciones de AMB capaces de producir un
efecto bactericida superior al ejercido por cada uno de ellos por separado.
- Antagonismo : propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida
inferior al de cada uno de ellos por separado
- Indife re ncia: propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida
igual al de sólo uno de ellos.

Bacterias especiales: Micobacterias

La sensibilidad a los fármacos antituberculosos en Mycobacterium tuberculosis y otras de crecimiento

lento se realiza por:

Método de las proporciones

En un medio sólido (Lowenstein Jensen) sin antimicobacteriano se siembra un inóculo de micobacterias
determinado correspondiente al 100% del crecimiento y luego se siembran otros tubos conteniendo el
mismo medio con diferentes fármacos a ensayar.
Se incuba en aerobiosis a 37 oC y al cabo de 4 a 6 semanas se cuentan las colonias en todos los tubos
y se evalúa la proporción de desarrollo obtenida frente a la control (100%).
También se puede realizar en medio líquido (Middlebrook) incubándose en estufas que registran la
gráfica de la curva de crecimiento. Si las curvas del control con las de los frascos que tienen
antimicobacterianos son similares, implica que hay 1% o más de micobacterias resistentes. Es un
sistema automatizado cuyos resultados se pueden leer entre 4 a 14 días (media 6 días).

Diagnóstico molecular genómico

La resistencia a la rifampicina predice la resistencia a otros fármacos antituberculosos (80 % de las
cepas resistentes a Rifampicina son resistentes a Isoniacida). Se investiga simultáneamente por
técnicas genéticas directamente de muestras clínicas la presencia de micobacterias y mutaciones en el
gen rpoB (RNA polimerasa subunidad B) asociada a la resistencia a la rifampicina. Los re sultados
pue de n informarse a las 2 hs .
La presencia del gen de resistencia a la rifampicina implica la necesidad del estudio de sensibilidad a
todas las drogas de 1era. y 2da. línea de tratamiento.

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Hongos
No se realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de micología clínica. Se denomina
antifungigrama. El patrón de sensibilidad es estable en la mayoría de las infecciones fúngicas, sin
embargo, debido al aumento de las infecciones micóticas fundamentalmente en inmunodeprimidos y al
aumento de los tratamientos empíricos que se realizan, han aparecido aislamientos R que hacen que en
en determinadas situaciones, sea necesario el estudio de sensibilidad antifúngica.
Para las levaduras las técnicas son similares a las de bacterias: dilución, microdilución, difusión y por
gradiente de concentración.
Para los hongos filamentosos son muy complejas y difíciles de estandarizar. Se efectúan en centros
especializados de micología.

Parásitos
Las pruebas de sensibilidad antiparasitarias de protozoos y helmintos son muy complejas y NO se
realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de parasitología clínica humana. Pose e n patrón
de se nsibilidad constante fre nte a los antiparasitarios .
En ciertas ocasiones en los laboratorios de microbiología clínica veterinaria se emplean para los
enteroparásitos. Por ejemplo: el test de disminución de conteo de huevos (TRCH) o test de eficacia en
las heces de los animales.

Virus
No se realiza de rutina en el laboratorio de virología clínica humana. Los tratamie ntos se re alizan e n
forma e mpírica y pue de n ne ce sitarse e stas prue bas ante fallas e n los tratamie ntos
antirre trovirale s (ARV). Fundamentalmente estas pruebas de sensibilidad se practican a los fines de
investigación y epidemiológicos.
Los estudios de sensibilidad pueden efectuarse al virus herpes simple, varicela zoster, hepatitis B y C e
inmunodeficiencia humana (VIH).
En el VIH la resistencia aparece cuando este es capaz de cambiar lo suficiente en sus genes y así
evitar la acción de los ARV que llevaría al profesional médico a replantear el tratamiento.
Este virus muta fácilmente y se reproduce muy rápido, por tanto una persona puede tener circulando
varias cepas (cuasiespecies) en su organismo al cabo de un tiempo de la infección.
En los pacientes que tienen una adecuada adherencia al tratamiento, las mutaciones tardan algunos
años en aparecer.
Para la detección de resistencias del VIH al tratamiento antirretroviral se utilizan pruebas genotípicas.
Las pruebas de resistencia a los ARV se realizan con sangre entera del paciente como muestra
biológica, se basan en el análisis del genoma y por tanto detectan la presencia de mutaciones (número
y lugar donde se encuentran). Pueden realizarse por secuenciación directa del ARN retroviral o
hibridación. Son las más difundidas por su menor costo.

Para tener en cuenta…

Cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana correctamente realizada e interpretada indica en la

mayoría de los casos que ese microorganismo in vitro es sensible a un AMB y, si se lo administra habrá

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un 90% de respuesta clínica eficaz al tratamiento. Si por el contrario se lo informa como resistente
puede haber 50-60% de respuesta clínica.
Esta paradoja puede deberse a diversos factores propio del:
- Paciente: estado inmunitario, adherencia al tratamiento, localización de la infección, presencia
de catéteres, sonda vesical, respiradores, gravedad de la infección, etc.
- Microorganismo: CIM, mecanismos de resistencia, formación de biopelículas, concentración
microbiana en el sitio de infección, etc.
- Antimicrobiano: farmacocinética, farmacodinamia, dosis suministrada, actividad microbicida o
microstático, interacciones con otros fármacos, etc.

Los antimicrobianos por sí solos “no hacen milagros ni son mágicos”, simplemente son
COLABORADORES en el tratamiento de un proceso infeccioso.

¡PUEDEN DEJAR DE CURAR!

Actividades

1. ¿Qué e s un AMB?
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2. ¿A qué se llama y cuále s son los sitios de acción de un AMB e n bacte rias y
le vaduras?
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3. ¿Qué e s un me canismo de re siste ncia? ¿Por qué apare ce ?

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4. ¿Qué tipos de re siste ncia hay y por qué me canismos la re alizan? Busca que significa
e l acrónimo ESKAPE
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5. ¿Cómo se pue de pone r e n e vide ncia los me canismos de re siste ncia antimicrobiana?
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6. ¿En qué se basan?
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7. ¿Qué tipos de prue bas de se nsibilidad AMB se pue de re alizar e n bacte rias y
le vaduras?

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8. ¿Cuándo e s importante conoce r la CIM y que significan e stas siglas?

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El doce nte le e ntre gará una placa donde se re alizó una prue ba de se nsibilidad
antimicrobiana con monodiscos:
a) Efectúe la lectura de los halos de inhibición.
b) Interprete dichos halos.
c) Elabore el informe médico para el paciente según tabla de halos que se le entregará.

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Laboratorio de habilidades Nº5 -

Diagnóstico Clínico Molecular

Objetivos
Al finalizar el encuentro el alumno debe:
● Poder nombrar las técnicas básicas que permiten el estudio microbiológico molecular.
● Conocer las aplicaciones prácticas de las principales técnicas empleadas actualmente para el
diagnóstico molecular en microbiología.
● Saber qué técnicas son costo efectivas para el estudio de distintos procesos infecciosos
humanos.

La biología molecular es una rama de la biología que estudia los fenómenos biológicos en términos
moleculares. El principio básico del diagnóstico molecular microbiológico es la detección de molé culas
pe rte ne cie nte s a los microorganismos patóge nos (ADN o ARN, proteínas, metabolitos, etc.)
como así también molé culas de la re spue sta inmune de l hospe dador (anticuerpos).
La introducción de técnicas moleculares como sustitución, complemento o ampliación de las técnicas
tradicionales ha potenciado la capacidad diagnóstica del laboratorio microbiológico clínico al punto tal
que, para la detección de algunos microorganismos, estas pruebas son claramente las de elección
(sensibilidad y especificidad). Hoy en día, en los laboratorios de microbiologìa médica estas técnicas
son fundamentales para el diagnóstico de enfermedades como meningitis, encefalitis, infecciones
respiratorias, hepatitis virales, VIH, Infecciones en pacientes inmunodeprimidos (Virus JC, CMV,
Pneumocystis jirovecii, etc.) e infecciones de transmisión sexual (Chlamydia trachomatis, HPV,
etc).
La historia de la microbiología molecular comienza en 1928, con el bacteriólogo inglés F. Griffith quien
realizó experimentos de laboratorio con dos cepas de Streptococcus pneumoniae . Una de ellas, al
crecer en un medio sólido enriquecido, producía colonias rugosas (cepa R) mientras que la otra
formaba colonias lisas (cepa L). Observando la morfología de las dos cepas al microscopio, se vió que
la cepa L estaba rodeada por una cápsula gruesa y que cuando se inyectaba en animales de
experimentación producía bacteriemia, neumonía y muerte. Se dedujo que la cápsula le confería
protección contra la fagocitosis. Por el contrario, la cepa R no presentaba cápsula por lo que era
fagocitada rápidamente impidiendo su multiplicación.

En otros experimentos, Griffith observó que si inyectaba una cantidad pequeña del cultivo de la cepa R
junto con la cepa L, previamente inactivada por calor, los animales morían igualmente por la infección.
De este resultado concluyó que las bacterias muertas de la cepa L poseían una capacidad
transformadora gracias a la qué habían transmitido su virulencia a los descendientes de la cepa R
(Recuperar conocimientos del laboratorio 4 e Investigar: “Mecanismos de transmisión genética
horizontal”).

En 1944 Oswald T. Avery, uno de los primeros biólogos moleculares, junto a su colaborador M. Mc
Carty, establecieron que era el ADN el responsable de la transformación en el experimento de Griffith
y que este material es capaz de transmitir características especiales a organismos receptores que
carecían de dicha información.

Los estudios moleculares comenzaron a tomar importancia en varios campos científicos (hematología,
oncología, farmacogenética, etc) poniendo énfasis en la necesidad de desarrollar herramientas acordes
para simplificar los procedimientos. En la actualidad, el éxito de estas técnicas diagnósticas ha sido

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posible gracias a los progresos biotecnológicos que han llevado a la simplificación y automatización de
varios procesos. La incorporación de la bioingeniería (robótica) posibilita la manipulación automatizada
de cantidades muy pequeñas de reactivos, procesamiento de varias muestras a la vez y menor riesgo
biológico para el operador.
Las posibilidades de este nuevo recurso diagnóstico son infinitas y es posible que todavía ni nuestra
imaginación hoy haya podido llegar.
A los fines prácticos vamos a dividir al diagnóstico mole cular en: “las omicas” y “las
inmunológicas” . Las primeras las veremos en este laboratorio y las segundas en el Laboratorio de
Habilidades Nº 6.

Mapa conceptual

Para comprender mejor este material, se sugiere ver el siguiente video:

“Introducción al diagnóstico genómico en microbiología”
(Hacer click)

Las “Ómicas”
Es un neologismo proveniente del inglés y que en biología molecular se utiliza como sufijo para
referirse a la investigación de un gran conjunto de datos (por ejemplo genes, proteínas, lípidos,
metabolitos) y cuya integración permite el análisis funcional global de sistemas biológicos. Se valen
para su desarrollo de otras especialidades como por ejemplo la bioinformática, las tecnologías rápidas,
la ingeniería de micromatrices (o microarray ) y la automatización.

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La aparición de las “ómicas” revolucionó el diagnóstico microbiológico clínico pe rmitie ndo me jorar
marcadame nte la se nsibilidad de los procesos y trasladar las técnicas desde los laboratorios de
investigación a los de diagnóstico microbiológico clínico .
Hoy en día el término “ómicas” en microbiología hace referencia a 3 distintas disciplinas
complementarias:
1. Ge nómica e structural, cuyo objetivo es mapear y secuenciar el genoma;
2. Ge nómica funcional, que trata de asignar una función a las secuencias encontradas;
3. Ge nómica comparativa, que usa una variedad de herramientas, entre ellas los análisis
computarizados, para comparar secuencias del genoma de distintas especies.
La genómica funcional estudia productos de expresión de genes por lo cual permite múltiples
aproximaciones diagnósticas de especial aplicación en microbiología clínica. La genómica comparativa,
al comparar detenidamente las características que definen a distintos organismos (humanos,
chimpancés, levaduras, etc) puede localizar regiones de similitudes y diferencias. Esta información
puede ayudar a los científicos a entender mejor la estructura y la función de los genes humanos, y a
crear nuevas estrategias para combatir las enfermedades.

Transcriptómica
El transcriptoma es el conjunto de moléculas de ARN mensajero (ARNm) y de ARN no-codificante
presentes en una célula o tejido concreto. La transcriptómica es el estudio del transcriptoma de una
célula o de un tejido y que permite cuantificar e l nive l de e xpre sión de los ge ne s .
Inicialmente se empleaban técnicas de bajo rendimiento, como Northern-blot y la reacción en cadena
de la polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR), que sólo permitían el análisis cualitativo o
semicuantitativo de un gen candidato. Posteriormente, el rendimiento mejoró gracias al desarrollo de la
técnica cuantitativa RT-qPCR que permitió analizar varios transcriptos al mismo tiempo pero no fue
hasta la aparición de los microarrays que se logró analizar los niveles de expresión de miles de
transcriptos simultáneamente.
La mayoría de estudios donde se han analizado los perfiles de expresión en los últimos años ha sido en
el ámbito de la oncología, con el fin de identificar marcadores específicos de cada tipo de tumor.

¿Qué son los Microarrays?

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La tecnología de microarrays de ADN permite realizar análisis genéticos sobre miles de genes
simultáneamente. El funcionamiento se basa en
la capacidad de las moléculas complementarias
de ADN de hibridar entre sí.
De las células que queramos medir su
expresión obtendremos una muestra de ARN
que se convertirá en ADN complementario
(ADNc) y se marcará con una molécula
fluorescente. A esta muestra marcada la
denominaremos sonda.
Por otro lado, pequeñas cantidades de ADN,
correspondientes a diversos genes cuya
expresión se desea medir, son depositadas en
una base de cristal utilizando un robot de
precisión. A estas muestras de ADN
depositadas en el microarray las
denominaremos dianas.
Durante el proceso se enfrentará a las dianas
del microarray con las sondas. Cada molécula
de ADNc marcada de la sonda se moverá por
difusión hacia la diana que contenga su
molécula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada allí. Después de un tiempo el
microarray se lava y se procede a hacer una medición relativa de la cantidad de ADN de la sonda
que ha quedado fijada en cada diana.
A partir de estos datos se pueden realizar estudios de diagnóstico y caracterización de tumores así
como diagnóstico de enfermedades infecciosas a partir de la detección del genoma del germen en
muestras clínicas.

Metabolómica
Se ocupa del estudio de los metabolitos, que son el producto final de todos los procesos celulares.
Mediante el e studio de los pe rfile s me tabólicos e n mue stras biológicas (fluidos, tejidos, cultivos,
células, etc.) podemos conocer el impacto del ambiente en un organismo vivo. Se ha utilizado para
identificar biomarcadores de enfermedades, evaluación de tratamientos con drogas y en microbiología.
Se emplean varios métodos para su análisis basado en la necesidad de separar primero los metabolitos
(técnicas de cromatografía y electroforesis) y luego detectarlos (espectrometría de masa y resonancia
magnética nuclear).

Proteómica (huella peptídica)

El término proteómica se utiliza para indicar el estudio cualitativo y cuantitativo del conjunto de
proteínas expresadas por un genoma en un determinado momento (proteoma). El proteoma consta de
todas las proteínas presentes en una célula, organismo o líquido biológico e incluye no sólo las proteínas
traducidas, sino también todas las proteínas modificadas por el corte y empalme alternativo de los
tránscriptos primarios y el procesamiento posterior a la traducción.
El desarrollo de la tecnología MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of
flight, en español: desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo
de vuelo) ha permitido la utilización de la espectrometría de masas en la identificación de
microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a través de la creación
de un espectro de masas (huella digital de la masa de los péptidos) que es específico para cada género

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y especie. Es una herramienta de trabajo muy útil y resulta costo efectiva para laboratorios con gran
número de muestras en Microbiología Clínica, por su rapidez y fiabilidad en la identificación de
microorganismos.

¿En qué consiste la té cnica de MALDI-TOF?

En el método se emplean células intactas del microorganismo,

una pequeña porción de una colonia de bacterias, crecida en
medio sólido se deposita sobre una placa metálica conductora.
Posteriormente, a la placa con el microorganismo se adiciona una
solución saturada de un compuesto orgánico de baja masa,
denominada matriz, que se deja secar.
Una vez qué se haya secado la matriz con las células, la placa
metálica se introduce en el espectrómetro de masas, en donde la
mezcla es irradiada con pulsos cortos de un rayo láser UV. La
interacción entre el láser y de la matriz desencadena una
sublimación de la matriz en una fase gaseosa causada por la
absorción de la energía del haz, seguida por la ionización de la
muestra del microorganismo. Al ionizarse, las proteínas son
aceleradas a través de un campo electrostático y luego son
expulsadas en un tubo de vuelo al vacío donde se separan en
función de su tiempo de vuelo, llegando finalmente al detector de
masas, el cual genera información característica de la
composición del microorganismo mediante un espectro de picos
llamada también huella digital de la masa de los péptidos.

Se utiliza para bacterias anaerobias, Gram positivas, Gram negativas, micobacterias y levaduras. Se
piensa en un futuro estudiar con esta metodología determinación de resistencia antimicrobiana y
factores de patogenicidad. Esta metodología no está adaptada para la determinación de pruebas de
sensibilidad antimicrobiana (PSA).
Actualmente existen métodos para analizar, además de las proteínas, biomacromoléculas (ácidos
nucleicos, péptidos, lípidos, hidratos de carbono, etc.) apoyados en el desarrollo de otras especialidades
como por ejemplo bioinformática, tecnologías rápidas, ingeniería de micromatrices y automatización.

Genómica aplicada al diagnóstico clínico molecular

El constante desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico tiene su origen en la necesidad de un método
de diagnóstico rápido, económicamente accesible y con alta sensibilidad y especificidad.

Pero, ¿para qué podemos usar la genómica en microbiología?

- Detección de microorganismos en muestras clínicas, sobre todo microorganismos fastidiosos,
crecimiento lento, escasa cantidad, no cultivables (ej.: virus)
- Cuantificación de carga viral (pronóstico y seguimiento)
- Identificación de un microorganismo después de su aislamiento
- Detección de genes que codifican toxinas o factores de virulencia
- Detección de resistencia a los antimicrobianos
- Genotipificación

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- Estudios de epidemiología molecular

- Farmacogenética

Scre e ning Diagnóstico Monitore o

VPH VSR Carga viral para VIH y VHC

(Cáncer cervicouterino) (Panel respiratorio)

Además, considerando que las técnicas de biología molecular se basan en la detección de segmentos
de material genético, no es necesaria la presencia de un microorganismo viable en la muestra.

Técnicas de hibridación
Fueron las primeras técnicas utilizadas. Primero se desnaturaliza el ADN por calor, luego se añade
una sonda marcada complementaria de la secuencia específica buscada, se enfría la mezcla y se
produce la hibridación entre ambas. Al quedar unida a su blanco se puede detectar según el marcador
utilizado. Entre las técnicas de hibridación más comunes que escucharan nombrar se encuentran
Southern blot y Northern blot, entre otras.
El inconveniente de esta técnica es que necesita que en la muestra haya mucha cantidad de ADN, son
poco sensibles. Son muy utilizadas en la identificación de microorganismos aislados de cultivo, ya que
en esa muestra se puede obtener gran cantidad de ADN.

Técnicas de amplificación (PCR)

Son las técnicas genéticas más utilizadas en los laboratorios de microbiología clínica, existen
numerosas variantes pero la más usada para estos fines es la PCR (reacción en cadena de la
polimerasa).

- Reacciòn en cadena de la polimerasa (PCR)

En la década de los 80’, K. Mullis revolucionó la biología con la creación de la técnica de Re acción
e n Cade na de la Polime rasa (PCR), una de las técnicas centrales en biología molecular, y que le
valió el Premio Nobel de Química en 1993.
La técnica de PCR, y sus variantes, permiten fabricar cantidades ilimitadas de ADN a partir de una
molé cula molde . Este enfoque revolucionó las técnicas de detección (por su sensibilidad y
especificidad) permitiendo fabricar material genético específico, fácilmente y a bajo costo para uso en
investigación o aplicaciones biotecnológicas.

En la microbiología clínica la irrupción de la PCR significó una revolución ya que permite detectar
microorganismos de difícil cre cimie nto e n cultivos, de le nto de sarrollo e incluso no cultivable s.
Su sensibilidad brinda una alternativa a las técnicas de detección de antígenos mediante anticuerpos,
que requieren gran carga microbiana en la muestra.

¿Cómo funciona la PCR convencional?

La reacción en cadena de la polimerasa es en realidad un sistema que permite obtener, en pocas horas,
varios millones de copias de una se cue ncia blanco de ADN que se utiliza como molde y que se
obtiene a partir de una muestra.

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La extracción del ADN es el paso más crucial en todo el proceso por lo que suelen utilizar kits
standardizados y comercializados que incluyen el protocolo específico para la extracción. En síntesis,
los métodos de extracción de ADN se caracterizan por la lisis de la célula, la inactivación de las
enzimas nucleasas celulares y la separación de los ácidos nucleicos de los demás restos celulares.

La reacción se lleva a cabo dentro de un tubo de ensayo donde se mezclan varios componentes:

- Secuencia blanco de ADN (molde)

- Oligonucleótidos, que actúan como cebadores
(Primers)
- ADN polimerasa termoestable (Taq Polimerasa)
- Desoxirribonucleótidos, que se utilizan como
sustrato para copiar las cadenas nuevas a partir del
molde
- Amortiguador, que se encarga de estabilizar la
reacción

El primer ciclo de la reacción, conocido como

desnaturalización, consiste en separar las dos cadenas de la
molécula de ADN, a una temperatura entre 94 y 96°C,
aplicada durante pocos minutos.
A continuación se produce el anillamiento o hibridación de los cebadores con las secuencias
complementarias del ADN. Los cebadores son oligonucleótidos sintéticos que delimitan el sitio que se
busca amplificar, y se anillan a temperaturas que oscilan entre 50 y 65°C.
El último ciclo, o ciclo de extensión, toma entre uno y varios minutos a 72°C, lo que permite a la ADN
polimerasa sintetizar las nuevas hebras de ADN, que serán complementarias a las cadenas originales.
A medida que avanza el proceso se logra amplificar el segmento deseado unas 107 veces.

Vide o suge rido:

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Reacciòn en cadena de la Polimerasa

¿Cómo vemos el resultado?

Existe un variado número de técnicas para detectar las secuencias amplificadas (o amplicones). En la
PCR convencional, una vez finalizada la detección se hace a través de electroforesis en un gel de
agarosa con el uso de un intercalante inespecífico fluorescente (bromuro de etidio).
En la PCR en tiempo real (qPCR) se realiza la identificación inmediata de la amplificación,
principalmente a través de hibridación con sondas marcadas con un fluorocromo y posterior lectura de
la fluorescencia emitida por la sonda con un sensor.

Electroforesis en gel de agarosa

qPCR (o “Real-Time PCR”). A diferencia de las PCR convencionales, monitoriza la amplificación de la molécula de ADN
problema durante cada ciclo de amplificación y no al final.

¡Contaminaciòn, nuestro mayor enemigo!

En los laboratorios de microbiología molecular se utiliza mayormente la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR). Esta técnica es altamente sensible y específica por lo que el volumen de muestra
requerido para su realización es muy pequeño. Es por este motivo que la contaminación con cantidades
minúsculas de ADN o ARN es el principal problema de la PCR.
Estas moléculas de ADN o ARN pueden actuar como templados en las reacciones de amplificación
por lo que podría llevar a la necesidad de repetir varias veces los procedimientos (costo económico) así
como derivar en problemas diagnósticos como son los resultados falsos positivos.

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¿Qué necesitamos para la realización de estas técnicas?

De forma general, los laboratorios clínicos que ofrecen estos test diagnósticos se agrupan en espacios
con una infraestructura adecuada para dar un servicio de calidad.

1. Laboratorio
Debe constar de 3 o 4 áreas separadas y aisladas una de otras. Cada una tiene que tener sus
materiales para trabajar y no pueden intercambiarse entre ellas. Poca circulación del personal.
Equipamiento adecuado (algo más complejo que para diagnóstico convencional que hemos visto hasta
ahora), materiales calibrados, estandarizados y sistemas de bioseguridad. En cada área deben utilizarse
distintos guantes para evitar la difusión de la contaminación. El trabajo de be se r muy pulcro y
me ticuloso a fin de no contaminar con ningún ve stigio de ADN e xtraño a la mue stra.

2. Pe rsonal altame nte e ntre nado

Es de imperiosa necesidad contar con personal idóneo a fin de evitar o detectar los resultados falsos
positivos. Esto se minimiza con el correcto uso del espacio y de los materiales así como se los
protocolos de trabajo, conjuntamente con la interpretación adecuada de los resultados.

3. Mue stra clínica ade cuada

La elección de la muestra va a depender principalmente de la localización de la infección o
colonización y/o de la sospecha etiológica existente, en caso de que exista. La recogida de la muestra
debe realizarse en condiciones asépticas.
Las muestras a analizar deben recogerse, conservarse y trasladarse de acuerdo a la técnica que el
laboratorio que la recibe va a emplear. El re cipie nte de be se r nue vo y e sté ril (no se admite nada
re ciclado).

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Como regla general, y con el fin de preservar la integridad de los ácidos nucleicos, no deben
transcurrir más de dos horas entre la toma de la muestra y su recepción en el laboratorio,
manteniéndose refrigeradas durante el transporte (2-8ºC).
En el caso particular de requerirse la utilización de medios de transporte específicos, es necesario
asegurarse de que éstos no contienen sustancias que puedan interferir o inhibir la posterior extracción
de ácidos nucleicos.
Cada muestra debe ir acompañada de su correspondiente solicitud, ya sea en forma de orden médica o
mediante solicitud electrónica. Debe contener la información suficiente para que las muestras se
procesen e interpreten en manera adecuada.

Re cipie nte s y siste mas de re cogida y Come ntarios

transporte

MTV y UTM (con o sin torunda) Útil para virus

El universal también para PCR de Chlamydia spp.,
Ureaplasma spp. y Mycoplasma spp.

Torundas de alginato cálcico En Bordetella spp. se pueden emplear para cultivo,

pero no se recomiendan para PCR. Puede inhibir
técnicas de PCR y ser tóxicas para virus

Torundas de dacrón, rayón o nylon No interfieren con las técnicas de PCR, útiles para
virus

Torunda (flocada o no) con medio líquido de Muestras de exudados. Se puede emplear en
transporte (Amies) automatización. Para bacterias aerobias,
microorganismos exigentes, bacterias anaerobias y
PCR

Excepciones Las muestras líquidas tales como LCR, líquido de

lavado broncoalveolar u orina no deben ser diluidas
en medio de transporte para virus.
Abreviaturas: M TV (medio de transporte para virus), UTM (medio transporte de virus universal).

¿Qué contie ne e l me dio de transporte unive rsal de virus?

Consta de una solución salina equilibrada de Hanks modificada y enriquecida con seroalbúmina bovina,
cisteína, gelatina, sacarosa y ácido glutámico. El pH se amortigua con tampón HEPES. El rojo fenol se
utiliza como indicador de pH. Se ha añadido vancomicina, anfotericina B y colistina al medio para
inhibir la proliferación de bacterias y levaduras competidoras. El medio es isotónico y carece de
toxicidad para las células anfitrionas de mamífero. La presencia de sacarosa actúa como crioprotector
que facilita la conservación de los virus y las clamidias si las muestras se congelan (–70 °C) para
almacenarse durante mucho tiempo.

4. Emisiòn de informe s de re sultados

Es esencial que los resultados se comuniquen de forma clara, consistente y concisa, ya que los
informes pueden ser leídos por personal experto e inexperto. Para ello, estos informes sólo deben
incluir aquellos resultados que sean clínicamente relevantes.

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¿Qué otros tipos de PCR existen?

La técnica de PCR convencional se ha ido modificando a lo largo del tiempo con el fin de ampliar
enormemente sus posibilidades. De ahí que hay PCR de varios tipos:

• PCR anidada (Ne ste d PCR)

Es una variante de la PCR convencional que utiliza dos pares de cebadores. Esta involucra tomar
una alícuota del producto de la primera amplificación y usarla como molde para una segunda ronda
usando un juego diferente de cebadores. Estos cebadores “anidados” son internos a los cebadores
usados en la primera PCR, generando un amplicón más corto que el generado por la primera
amplificación. Se gana en sensibilidad y especificidad por lo que puede ser utilizada para secuencias
muy específicas.

• PCR múltiple (Multiple x PCR)

Se realiza una amplificación simultánea en un mismo tubo. Es una PCR convencional pero en vez
de colocar un solo tipo de cebadores se colocan varios tipos diferentes y cubrir todos los
microorganismos que con mayor frecuencia son causantes de una patología. Esto acorta el tiempo
para el inicio del tratamiento específico.
Ejemplo: Para detectar el agente etiológico de una meningitis se realiza una PCR múltiple en líquido
cefalorraquídeo del paciente. Existe n siste mas come rciale s capace s de de te ctar hasta 22
age nte s dife re nte s .

• PCR con transcriptasa inve rsa (RT-PCR)

Este tipo se utiliza para de te ctar y cuantificar se cue ncias de ARN. En primer lugar, una hebra
de ARN es retrotranscripta a ADN complementario (ADNc) usando una enzima de
retrotranscripción y el resultado se amplifica en una PCR convencional. Ejemplo: Carga viral para
VIH o VHC.

• PCR e n tie mpo re al (qPCR)

Es una PCR convencional cuya evolución se puede seguir en tiempo real en un monitor. Se
diferencia de la clásica porque se utilizan sondas marcadas con un fluoróforo que a medida que
se produce un ciclo va emitiendo una señal que es capturada por un luminómetro o fluorómetro
integrado al termociclador. Se gana en especificidad porque hay un doble control de unión (los
cebadores y la sonda marcada) y además se va cuantificando el ADN formado. Como ventaja
tiene el me nor tie mpo de e ntre ga de los re sultados y me nor contaminación al no te ne r e l
último paso de l re ve lado.

PCR conve ncional PCR e n tie mpo re al

Detecta un único segmento del ADN Detecta y cuantifica el ADN

Amplificación y cuantificación del producto en Amplificación y cuantificación en un solo paso

dos fases

Menor sensibilidad y especificidad Mayor sensibilidad Mayor especificidad

Equipos menos costosos Equipos y reactivos más costosos (sondas

fluorescentes más caras)

Entre los microorganismos que se pueden identificar encontramos:

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- Bacterias: Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Salmonella tiphy, Chlamydia

pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Bordetella pertussis, Chlamydia trachomatis,
Neisseria gonorrhoeae, Listeria monocitogenes, Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae y Streptococcus pneumoniae .
- Hongos: Aspergillus fumigatus, pan fungus, Pneumocystis jirovecii.
- Parásitos: Toxoplasma gondii, Plasmodium spp., Leishmania spp. y patógenos protozoos en
heces.
- Virus: Herpes virus tipo I y II, varicela zoster, virus de Epstein Barr, Citomegalovirus,
parvovirus B19, JC virus y BK virus.

¿Qué ve ntajas hay por e l uso de las té cnicas mole culare s de amplificación?
a. Capacidad de multiplicar la porción de ácido nucleico buscada (106-9 copias) y detectarlas
luego por técnicas de hibridación, fluorométricas, ELISA, etc. que le otorgan gran sensibilidad.
b. Técnicas rápidas comparadas con las técnicas convencionales.
c. Poder utilizar diversidad de muestras biológicas. Se detecta presencia de ácidos nucleicos
(AN) sin necesidad de la viabilidad de los microorganismos.
d. Capacidad de cuantificar la cantidad de AN (por ejemplo: carga viral)

¿Qué de sve ntajas hay por e l uso de las té cnicas mole culare s de amplificación?
a. No permite aislamiento de los microorganismos para estudios de resistencia
b. Falsos positivos : contaminación con productos amplificados anteriores
c. Falsos ne gativos : presencia de inhibidores o inconvenientes en los distintos
pasos de las técnicas. Necesidad de utilizar controles internos en todos los
procedimientos.

La nueva generación de pruebas moleculares comerciales se presentan en formatos automatizados o

cerrados tipo casette, sumamente simples para el operador, que minimizan los riesgos de
contaminaciones y no requieren laboratorios especiales.

GeneXpert (Cepheid) - PCR en tiempo real

Nota: Esta tecnología utiliza cartuchos de un único uso, específico para cada PCR. En el interior del cartucho se encuentran
los reactivos de PCR liofilizados, y en el momento del uso se añaden otros reactivos que acompañan el pack.

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Biofire FilmArray - PCR multiplex para diagnóstico sindrómico

Este sistema combina los procesos de preparación de la muestra, la amplificación y detección y el posterior análisis
de los resultados. Trabaja mediante paneles, en función de la clínica que presente el paciente (panel de meningitis,
infecciones respiratorias, digestivas y panel sanguíneo). Permite obtener resultados preliminares en una hora.

Ver el video
Reacciòn en cadena de la polimerasa

Detecciòn de mecanismos de resistencia a los

antimicrobianos
La resistencia a los antibióticos está, en general, codificada en el genoma bacteriano, por lo que la
aplicación de tècnicas moléculares tiene la capacidad teòrica de identìficar el fenotipo de resistencia en
un microorganismo dado. La predicción del fenotipo en base al genotipo es una aplicación
especialmente interesante para el estudio de resistencia a los antibióticos en microorganismos de
crecimiento lento como Mycobacterium tuberculosis o microorganismos no cultivables.

Se han explorado diferentes estrategias para predecir la resistencia en base al genotipo. La más
sencilla es la basada en reglas, en las que la predicción se basa en la detección de genes y de ciertas
mutaciones cromosómicas bien caracterizadas.

Técnicas de secuenciación
La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas automatizadas rápidas que combinan
procesos químicos y bioinformática cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A,
G, C y T) de un fragmento de material genètico, esto permite conocer y descifrar el código genético.
Actualmente se han secuenciado genomas completos de varios organismos incluso el humano, por
ejemplo la secuenciación genómica, permite obtener la lectura del genoma viral del SARS-CoV-2 y
detectar mutaciones que determinan nuevas variantes, esta información se comparte a través de bases
de datos de acceso público.
Existen bancos de datos donde se guardan las secuencias de numerosos genes como Genbank,
EMBL-Bank, GISAID, etc.)

Epidemiología molecular

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La epidemiología molecular engloba un conjunto de técnicas mediante las cuales se persigue discernir
si dos o más aislados están genéticamente relacionados, siendo por lo tanto una herramienta
fundamental para la realización de estudios filogenéticos, vigilancia epidemiológica global e
investigación de brotes. Las primeras técnicas consistían en la realización de ensayos de
caracterización fenotípica, como por ejemplo el estudio de la sensibilidad a los antibióticos, de
sensibilidad a fagos o la determinación de los antígenos de superficie presentes. El desarrollo de la
biología molecular dio paso a técnicas de tipificación basadas en la restricción del ADN, más
reproducibles y resolutivas, y, en general, más rápidas y menos laboriosas. Durante muchos años, la
electroforesis de campo pulsado (PFGE) ha sido considerada como el gold-standard al analizar todo
el genoma bacteriano y ofrecer, por tanto, un gran poder de resolución. Sin embargo, la complejidad de
la técnica y la difícil comparación de los resultados entre laboratorios promovió el desarrollo de
numerosas técnicas de tipificación basadas en la PCR, habiéndose posicionado el Multi Locus
Sequence Typing (MLST) como la principal técnica de tipificación para la realización de estudios de
vigilancia epidemiológica a nivel global. Además de utilizarse con fines epidemiológicos, y dado que
ciertos genotipos se asocian con fenotipos de mayor resistencia a los antibióticos y/o virulencia, la
tipificación bacteriana también ha sido ampliamente utilizada como herramienta para la predicción de
dichos fenotipos.

Glosario
- Sonda: es una secuencia de nucleótidos específica de AN (5 a 30 bases- oligonucleótido). Se
puede sintetizar artificialmente en un laboratorio siendo complementaria de una secuencia de
ADN específica.
- Ce badore s o primers : son sondas que se utilizan para iniciar una reacción. Son específicos
de una región complementaria de una cadena de ADN. En las reacciones se utilizan 2
cebadores para que se unan a los 2 extremos del ADN que se quiere estudiar.
- Ce badore s, primers ó sondas marcadas : Un oligonucleótido puede marcarse con
sustancias fluorescentes o lumínicas. Son utilizadas para detectar, localizar e identificar un
determinado fragmento de ADN.
- De snaturalización: separación de 2 cadenas de ADN por medio de calor (90ºC). Se rompen
los puentes hidrógenos que las unen. También se lo llama templado ómelting.
- Hibridación: Técnica utilizada para unir 2 moléculas de polinucleótido complementarias.
- Polime rasa: es una enzima que interviene en el proceso de replicación del ADN. No se
inactiva con el calor puesto que proviene de un microorganismo termorresistente (por ej: Taq
polimerasade Thermusaquaticus).
- Ele ctrofore sis e n ge l de agarosa: distanciar moléculas a través de una matriz sólida
sometida a un campo eléctrico que funciona como un filtro para separarlas de acuerdo a su
tamaño y carga eléctrica.

Actividades
a) De fina diagnóstico mole cular. ¿Cuál e s su importancia clínica?
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b) ¿Qué son las “ómicas”? Clasifíque las.

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c) Se ñale ve ntajas y de sve ntajas de las té cnicas mole culare s.

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d) ¿Cuále s son las aplicacione s de la ge nómica e n e l diagnóstico microbiológico?

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e ) ¿Cómo de fine PCR? ¿Qué tipos conoce ?

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f) Busque e je mplos de diagnósticos microbiológicos e n los cuale s se aplican las

distintas té cnicas de PCR.
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Laboratorio de Habilidades Nº 6: Métodos

Inmunológicos (Directos e Indirectos)

Objetivos:
● Aproximarse a los fundamentos y aplicaciones de los principales recursos técnicos,
metodológicos y estrategias empleadas en los campos de la microbiología.
● Familiarizarse con las técnicas básicas moleculares inmunológicas que permiten el análisis del
estudio microbiológico.
● Comprender las aplicaciones de métodos y técnicas en el estudio de distintos procesos
infecciosos humanos e interpretar sus resultados.
● Distinguir la sensibilidad y especificidad de las diferentes técnicas empleadas.

En microbiología podemos utilizar para el diagnóstico técnicas inmunológicas. El método directo

detecta el agente etiológico o parte de su estructura en una muestra; en tanto el método indirecto
detecta la respuesta inmune generada por un microorganismo en el hospedero.
Aplicamos el método directo cuando la infección es reciente con el objetivo de hallar al
microorganismo injuriante detectando la presencia de algún determinante antigénico; en cambio, el
método indirecto nos sirve cuando la infección tiene más de 15 días, momento en el cual comienzan a
circular los anticuerpos como consecuencia de la activación del sistema inmune en presencia de un
agente extraño al organismo.
Para llevar a cabo estos métodos, las técnicas utilizadas precisan de la obtención de antígenos y/o
anticuerpos comerciales marcados para que al interactuar con los antígenos o anticuerpos presentes
en la muestra del paciente se genere un fenómeno visible.
En función de la marca que se aplica sobre los reactivos comerciales, las técnicas son: Aglutinación
(Látex), Hemaglutinación (Glóbulos rojos), Inmunofluorescencia (Fluorocromo), Enzimoinmunoanálisis
(Enzima), Inmunocromatografía (oro coloidal) o Radioinmunoanálisis (Moléculas radiactivas).

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Inmunidad
Antígeno
Los antígenos son moléculas no reconocidas como propias por el organismo que inducen una respuesta
inmune humoral y/o celular (reconocidas por el BCR en el LB y el TCR en el LT). La capacidad de
activar los linfocitos es una característica de los antígenos denominada Inmunogenicidad. Pueden
actuar como antígenos proteínas, glúcidos, lípidos o ADN.

Ejemplos de antígenos bacterianos:

● Cápsula del Streptococcus pneumoniae (Neumococo), Neisseria meningitidis
(Meningococo){se pueden diferenciar según la estructura antigénica de los polisacáridos de su
cápsula en serogrupos denominados: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z}, Bordetella
pertussis
● Pared celular de bacterias gram negativas con lipopolisacáridos (LPS) (constituyen el
Antígeno O, con función de endotoxina)
● Flagelos y fimbrias de enterobacterias; Ej: antígeno H(flagelar).
● Toxinas: exotoxina eritrogénica del Streptococcus pyogenes, tetanospasmina del Clostridium
tetani, toxina del cólera (Vibrio cholerae ), verocitotoxina de Escherichia coli
enterohemorrágica

Ejemplos de antígenos virales:

● HBsAg, HBeAg, HBcAg del Virus de la Hepatitis B (HVB)

Anticuerpo
El LB luego de ser estimulado por un antígeno (Ag) se diferencia en una célula secretora de
anticuerpos (Ac). Esta célula denominada plasmocito secretará un Ac específico para el Ag que lo
generó. Se encuentran principalmente solubles en el plasma y presentes en las secreciones mucosas.

Los anticuerpos son proteínas, están constituidos por 4 cadenas peptídicas:

● Dos cadenas pesadas(H)
● Dos cadenas livianas(L)

Estructuralmente, además de las cadenas peptídicas, los anticuerpos poseen hidratos de carbono
localizados principalmente en las cadenas H; por esta razón podemos concluir en que son
glucoproteínas.
Todas unidas mediante puentes disulfuro intracatenarios adoptando una forma final de letra “Y”:

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Los anticuerpos tienen dos funciones, una para reconocimiento del antígeno (Fab, zona hipervariable) y
otra efectora (Fc , zona constante), que puede unirse a diversas poblaciones de leucocitos a través de
receptores y activar el sistema del complemento.
El análisis de la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes de las cadenas H (CH) permitió
definir cinco clases de anticuerpos: IgM; IgG; IgA; IgE; IgD.

Re sumie ndo: la capacidad fijadora de antígeno se relaciona con las regiones variables mientras que
los efectos biológicos o funciones efectoras se relacionan con las regiones constantes.

La interacción in vitro Ag - Ac

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La unión del antígeno con el anticuerpo tiene alta se nsibilidad y e spe cificidad, estas propiedades son
relevantes y tienen un uso diagnóstico.
La zona donde el Ag se une al Ac recibe el nombre de e pítope o de te rminante antigé nico , mientras
que el área correspondiente de la molécula del Ac es el parátope .

Epítope Parátope

Producción de anticuerpos monoclonales

La producción de anticuerpos monoclonales utiliza una tecnología creada en 1975 por Georges Köhlery
César Milstein, que consistía en la generación de una línea celular estable, secretora de un isotipo
determinado de inmunoglobulina contra un antígeno específico, fruto de la fusión de dos células
diferentes. El linfocito B extraído de un animal inmunizado con el antígeno de interés, una célula
tumoral de mie loma múltiple (inmortal). Los hibridomas pueden multiplicarse rápida e
indefinidamente y producir gran cantidad de anticuerpos.

Produ cción de an ticu e rpos m on oclon ale s por m e dio de la té cn ica de h ibridación .
Fuente: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v10n3/v10n3a06.pdf

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La detección de antígenos en una muestra biológica,

es prueba indudable de una infección activa o reciente.
La presencia de anticuerpos específicos en el suero del
paciente, generalmente, demuestra que el agente
infeccioso está (IgM) o estuvo (IgG) presente en ese
hospedero.

Son té cnicas rápidas, simple s y altame nte e spe cíficas . Se realizan las determinaciones tanto de
Ag como de Ac.

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Titulación
Para la titulación, se realiza la interacción de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades
constantes de Ag o diluciones seriadas del material biológico del paciente (Ag) con cantidades
constantes de Ac.

Sue ro de l pacie nte : deben extraerse entre 5 y 10 ml de sangre, dejar que coagule a temperatura
ambiente (20 minutos) y separar el suero por centrifugación (1000-1200 g durante 10 minutos). Una
vez separado el suero, puede mantenerse a 4-6ºC durante una semana, pero es preferible congelarlo a
-20 ºC (se conserva años si se evita la descongelación y congelación repetidas).

Microdilución

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/512 1/ 1/ 1/

1024 2048 4096

Microdilución

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Se elige arbitrariamente como título a la inversa de la máxima

dilución de suero (Ac) o material biológico (Ag) que
produce interacción visible .

Por e je mplo:
Una muestra de líquido cefalorraquídeo la diluimos a la mitad 10 veces consecutivas, luego a cada
dilución le aplicamos la técnica elegida para que reaccione con anticuerpos específicos conocidos.
Observamos hasta qué dilución dio positiva la interacción Ag-Ac: Título de Ag XX. (Ej.: cuantificación
del antígeno de C. neoformans)

Paciente 1
Dilución 1/2 1/8 1/16 1/32 1/64 1/ 1/ 1/ 1/ Reactiva
1/4 128 256 512 1024 a:

Técnica + + + + - - - 128 dil

+ + +

Concluimos que la reacción en LCR investigando la presencia de un Ag XX fue reactiva hasta 128 dil.
Por lo que el agente etiológico de la patología que cursa es el que posee el Ag XX.

Paciente 2:

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Diluci 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/
ón 1024

Técnic - - - - - - - - - - No
a reactiv
a

El age nte e tiológico de la patología que cursa e l pacie nte 2 no pose e e l Ag XX e nsayado.

Los métodos directos son reactivos o no son reactivos según la sensibilidad que tenga la técnica
empleada.

En cambio, en los mé todos indire ctos podemos trabajar con 2 muestras de suero de un mismo
paciente tomadas a diferentes tiempos (día 1 y a los 15 días) para comparar mediante alguna técnica el
título de Ac en ambas muestras e interpretar los resultados

Ejemplos:

Paciente 3: Seroconversión
Día 1

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/ 1/ 1/ 1/ React

128 256 512 1024 ivo a:

Técnica + - - - - - - - - - 2 dil

Día 15
Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/ 1/ 1/ 1/ React
128 256 512 1024 ivo a:

Técnica + + + + + + + - - - 128
dil

Re sultado: Infección activa, el titulo de Ac aumentó más de 4 veces el título.

Paciente 4
Día 1

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactivo
a:

Técnica + + + - - - - - - - 8 dil

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Día 15

Dilución ½ ¼ 1/8 1/ 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactivo

16 a:

Técnica + + + + - - - - - - 16 dil

Resultado: la patología que cursa en este momento no se debe al agente etiológico, cuyo Ag XX
específico no induce la formación del Ac ensayado.

Tuvo la infección a ese Ag en el pasado: los Ac detectado muestra una concentración de IgG de
memoria.

Paciente 5: Seroconversión
Día 1

Dilució 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/
n 1024

Técnica - - - - - - - - - - No
reactiva

Día 15

1/2 1/4 1/8 1/ 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/ Reactiva

Diluci 16 1024 a:
ón

Técnica + + + + - - - - - - 16 dil

Re sultado: Infección activa del agente etiológico cuyo Ag XX es específico del Ac ensayado.

1ra mue stra 2da mue stra Significado

(-) (-) Paciente susceptible

(+) (ej. 1:8) (+) (ej. 1:8; 1:16) Paciente Inmune

(+) (ej. 1:4) (+) (ej. 1:2) Paciente Inmune

(-) (+) (1:64) Infección actual

(+) (1:8) (+) (> 1:128) Infección actual

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¿Qué necesitamos para la realización de estas técnicas?

Las técnicas más utilizadas en estos momentos son:

- Aglutinación
Son útiles tanto para detectar Ag (aglutinación directa) como Ac
(aglutinación indirecta). Se basan en que tanto sea el Ag como el Ac
conocido debe estar adherido a un soporte a una partícula (ej. partícula
de látex, glóbulo rojo, oro coloidal, gelatina u otro material) y se debe
enfrentar con una gota de la muestra biológica o del suero del paciente.

Se forma una aglutinación visible macroscópicamente de partículas que nos indican la presencia de la
interacción Ag-Ac. Aquellos complejos son sólo visibles cuando está presente una concentración
óptima de antígeno y anticuerpo, denominada frecuentemente zona de e quivale ncia.

Fuente:
http://www.aulavirtualexactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?url=L1RFQ05JQ0FT X0lOT VVOT 0zT R0lDQVNfRE
VfSU5URVJBQ

Las pruebas de aglutinación son técnicas rápidas, pero pueden resultar menos sensibles y a veces
menos específicas en comparación con otros métodos. Permiten determinar los serotipos de algunas
bacterias previamente cultivadas e identificar género y especie. Pueden usarse en muestras clínicas
para detección de Ag: ej Ag capsulares bacterianos en LCR, rotavirus y adenovirus en materia fecal,
etc. También se utilizan como método indirecto, generalmente como screening, para detección de Ac,
detectan preferentemente IgM: ej Rosa de bengala en Brucelosis, monotest (Ac heterófilos).
Se pueden realizar sobre un portaobjetos. Si la aglutinación visible se observa grupos.

Si el glóbulo rojo es el soporte del anticuerpo (método directo) o del antígeno (método indirecto) la
técnica recibe el nombre de hemoaglutinación.

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Inmunofluorescencia - Directa (IFD) o Indirecta (IFI)

La fluorescencia es la propiedad que tiene una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a
radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV, RX). Las radiaciones absorbidas (invisibles al
ojo) son transformadas en luz visible o sea de una luz de mayor longitud de onda que la incidente. La
absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo (sustancias que emiten un fotón cuando son
excitados por un fotón incidente) la eleva a un estado de excitación en el cual contiene mayor energía.
La molécula permanece en estado de excitación por un período de tiempo muy corto. El retorno a un
nivel de energía menor es acompañado por emisión de luz (fluorescencia).

- IFD
Se realiza en 1 solo paso. Se coloca la muestra sobre un portaobjeto (impronta) y se le cubre con un
Ac específico hacia el Ag buscado marcado con fluoresceína. Se deja interaccionar y se enjuaga. La
observación de una fluorescencia (con microscopio de fluorescencia) es una reacción positiva. La
ausencia de fluorescencia verde manzana es ausencia de Ag o sea reacción negativa.
Ej.: Los virus se pueden detectar por la presencia de las proteínas víricas cuando se están
multiplicando en una célula mediante Ac marcados con fluoresceína específicos para esas proteínas.

- IFI
Esta técnica se realiza en 2 pasos:

1. Interacción del Ag conocido con el suero del paciente (¿Ac?)

2. Revelado: colocar un anticuerpo específico para la Fc del Ac conocido marcado con
fluoresceína.

Observación de fluorescencia verde manzana nos dice que es una reacción positiva, que en la muestra
había Ac específicos para el Ag que estaba en el soporte.

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Con un solo Ac marcado puedo realizar todas las IFI porque es específico con respecto a la fracción
constante de las Ig.

Ventajas:
- Se pueden obtener resultados rápidos
- No es necesario realizar cultivos
- Se pueden identificar microorganismo en un grupo mixto
Desventajas:
- Costos en reactivo y equipo
- Debe ser realizado por personal muy especializado.
- Los resultados no son 100% específicos.

EIA (Enzimoinmunoanálisis)
Se realizan en microplacas de 96 pocillos fondo en U de plástico o un soporte de nitrocelulosa al
que se le ha fijado un Ag o un Ac conocido según lo que desee estudiar. El anticuerpo está
marcado con una enzima y la reacción se revela por el cambio de color de un sustrato que se
observa a simple vista y se puede cuantificar mediante un espectrofotómetro.

La técnica más utilizada es ELISA o ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (siglas en
inglés Enzyme-linked immunosorbent assay) Existen distintas variantes de esta técnica como
ELISA indirecta, ELISA sándwich, ELISA de captura etc.

A lo largo de estos últimos años se ha ido optimizando esta técnica ganando sensibilidad y
especificidad. Observemos por ejemplo lo que ocurrió con la detección de la infección por HIV.

● ELISA 1ra. Generación. No tan sensible y específico. Por ejemplo, para HIV se usaban como
Ag, lisado de virus proveniente de un cultivo. Detecta IgG
● ELISA 2da. Generación. Ag usaban proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Ya se
podía detectar HIV1 y HIV2. Detecta Ac IgG
● ELISA 3ra. generación. Gran sensibilidad. Ag Péptido recombinante/ sintético de VIH-1 y
VHI-2 y Ag VIH-1. Capacidad de detección Ac IgM– IgG –Ig A
● ELISA 4ta. generación. Gran sensibilidad. Ag Péptido recombinante/ sintético de VIH-1 y
VHI-2 y y Ac para detectar Ag p24. Capacidad de detección IgM, IgG, IgA y Ag p24

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Quimioluminiscencia (CLIA: ChemiLuminescent Immunoassay)

Es un método automatizado basado en el principio de emisión luminosa a través de una reacción
enzima-sustrato. Es más sensible que el ELISA, por eso un resultado negativo es más confiable, y más
específico. Utilizan como sustrato moléculas que producen luz generalmente y puede ser medida por un
lector de luz.

Electroquimioluminiscencia (ECLIA: Electro Chemi Luminescent

ImmunoAssay)
Se trata de un inmunoanalisis tipo sándwich que usa reacciones electroquímicas, que conducen al
desarrollo de señales lumínicas, usa anticuerpos monoclonales de captura biotinilados, que se unen a
microparticulas magnéticas recubierta con estreptoavidina, el complejo emite radiaciones luminiscentes
que son detectadas por un aparato (fotomultiplicador). CLIA y ECLIA son técnicas que juegan un
papel importante en el diagnóstico de enfermedades. Son métodos avanzados de inmunodiagnóstico
basados en el concepto de unión anticuerpo-antígeno. La diferencia clave entre CLIA y ECLIA es el
método de generación de quimioluminiscencia. Mientras que CLIA usa reacciones químicas para
generar quimioluminiscencia después de la unión anticuerpo-antígeno, ECLIA usa reacciones
electroquímicas para el mismo propósito. Sin embargo, ambas técnicas son rápidas, muy sensibles y
específicas.

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HRP: Peroxidasa de rábano

Inmunocromatografía

La inmunocromatografía se basa en el desplazamiento de una muestra a través de una membrana de

nitrocelulosa o nylon donde se encuentran absorbidos en la línea de reacción anticuerpos contra el
antígeno que buscamos y sobre la línea control anticuerpos anti-conjugado. La muestra es añadida en
un extremo de la tira en la zona del conjugado, el cual está formado por un Ac específico (marcado
con oro coloidal u otro marcador) contra el Ag a detectar. Si la muestra contiene el Ag problema, éste
se unirá al conjugado formando un complejo inmune (Ag-Ac) que se desplazará a través de la
membrana de nitrocelulosa y quedará atrapado en la zona de captura en la que se hallan fijados Ac
anticonjugado que se unirán a este complejo haciéndose visible dicho fenómeno como una línea de
color, en caso contrario el conjugado y la muestra migrarán sin unirse y el conjugado es retenido
únicamente en la zona control que tiene fijado un Ac que reconoce al reactivo de detección (Ac
marcado).

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La línea de control debe aparecer siempre, es un indicativo de que el ensayo ha funcionado bien, tanto
en muestras positivas y negativas.

Son técnicas muy sensibles, simples y rápidas. No es necesario de reactivos adicionales ni

instrumental.
Se presenta en varios formatos pero generalmente en tira, en el cual la muestra problema fluye a lo
largo de un sustrato sólido por medio de una acción capilar. Ejemplo de utilización: Detección de HIV
en campañas masivas - Test rápido del Streptococcus pyogenes.

Western blot
Es una técnica analítica de alto costo. Usada para identificar los Ac presentes en el suero del
paciente.
La técnica se basa en tres etapas.
- Ele ctrofore sis : en gel es la más frecuente, hace uso de gel de poliacrilamida y duodecilsufato
(SDS). En esta técnica las proteínas se desnaturalizan, sufren la pérdida de las estructuras
secundaria y terciaria y mantiene los polipéptidos. De este modo, la estructura tridimensional
de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del
tamaño.
- Transfe re ncia: desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa.
- De te cción: se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína.
Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a una enzima que, en presencia de su
sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color).

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Inmunidad Celular
Pruebas cutáneas de hipersensibilidad IV. Inmunidad mediada por células

● Ag (desencadena respuesta de inmunidad celular)

● Pápula indurada: paciente sensibilizado
● Inoculación: intradérmica
● Me canismo : reacción mediada por macrófagos activados por el interferón y producido
por los linfocitos T CD4 de memoria.
● Microorganismos: micobacterias, Brucella , Histoplasma , Leishmania , Paracoccidioides,
etc.
● Le ctura 48-72 hs. (precoces de hs. No corresponde a una respuesta celular)
● Inte rpre tación: mm de induración. Si se considera positiva, solo indica que ha habido
contacto previo con el agente etiológico, cercano o lejano, pero no se correlaciona con
enfermedad actual.

Actividade s

1. ¿Cuándo un mé todo microbiológico e s dire cto o indire cto?

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2. ¿En qué se basan las té cnicas e mple adas e n los mé todos inmunológicos tanto
dire ctos como indire ctos?
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3. ¿Qué significa un re sultado no de te ctable ?

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4. ¿Qué e s un título? ¿Qué nos informa?

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5. ¿Qué e s la se roconve rsión inmunológica?

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6. Explique se nsibilidad y e spe cificad.

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Situaciones problemáticas de integración a resolver (respuestas en el power point)

Un jove n e x convicto de 22 años concurre a una consulta mé dica por de caimie nto, vómitos y
fie bre de hace casi 1 se mana de e volución. Pe nsaba que se le pasaría e n unos días. Ante e l
diagnóstico pre suntivo de he patitis viral se le solicita la re alización e n e l laboratorio de
distintos marcadore s he páticos.

El laboratorio le remite el siguiente informe:

Muestra : suero sanguíneo

Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos

Se realizaron las siguientes determinaciones por la técnica de enzimoinmunoensayo indirecta (ELISA)

con anticuerpos monoclonales específicos para cada determinación

○ Detección de IgM HDV: reactivo

○ Detección de Ag HBsV: reactivo
○ Detección de IgM HAV: no reactivo
○ Detección de IgG HAV: reactivo hasta 1/16 dil
○ Detección de Ig totales HCV: no reactivo
○ Detección de IgG HBsV: no reactivo
○ Detección de IgG CMV: reactivo hasta 1/256 dil
○ Detección de IgM Epstein Barr: no reactivo

Una jove n de 18 años, oriunda de l Chaco, se pre se nta e n la guardia de un hospital e n

Rosario. En e l inte rrogatorio no re fie re se guimie nto obsté trico alguno. A pronto de su
lle gada, da a luz un niño de bajo pe so con alte racione s psicomotoras y síntomas
ne urológicos a quie n se le indica la re alización de e xáme ne s de laboratorio que lue go de
re alizados, Ud. re cibe e l siguie nte informe :

Muestra : sangre entera/EDTA

● Observación directa en fresco (Método de Strout)

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No se observan formas vegetativas flageladas de protozoarios.

● Investigación molecular genómica: Técnica de amplificación por reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN del kinetoplasto del Trypanosoma cruzi

Resultado: No detectable

Muestra : suero sanguíneo

● Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos:

● VDRL (anticardiolipina -Técnica de floculación no treponémica)

Resultado: No reactiva

● FTA-Abs (Absorción de ac. fluorescentes anti T. pallidum – Técnica inmunofluorescencia

indirecta IFI)
Resultado: no reactivo

● Toxoplasma gondii (Técnica por inmunofluorescencia indirecta)

Resultados: Ig totales: reactiva hasta 1/ 512dil
IgM: reactiva hasta 1/ 256 dil

● Virus Rubéola : (Técnica ELISA)

Resultado:
- IgM: no reactiva
- IgM (por captura): no reactiva
- IgG: reactiva hasta 1/32 dil

Mue stra: cordón umbilical y líquido amniótico

Examen bacteriológico

● Observación directa en fresco por campo oscuro: No se observan morfología bacteriana

compatible con espirilos

● Investigación molecular inmunológica : Detección de antígenos Treponema pallidum (Técnica

con anticuerpos fluorescentes-IFD)
Resultado: Negativo

Un pacie nte convivie nte con VIH diagnosticado de sde hace 1 año no adhirió a tratamie nto
alguno, re torna a la consulta lue go de e se pe ríodo por dolor y dificultad e n la de glución de
alime ntos y fue rte dolor e n e l pe cho a la altura de l e ste rnón. De caído y e n mal e stado
ge ne ral.

Se le solicita la realización de distintas determinaciones que se presentan en el informe:

Examen micológico de biopsia esofágica

Observación microscópica directa en fresco: Se observan elementos levaduriformes

Cultivo e identificación: Se obtuvo desarrollo de Cándida albicans

Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos (Método de difusión):

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Sensible a: fluconazol – itraconazol – ketoconazol – voriconazol – caspofungina – anfotericina B

Parasitológico de materia fecal

Observación directa en fresco: Se observan ooquistes compatibles morfológicamente con
Cystoisospora belli

Coloración de Ziehl-Neelsen modificado (previa concentración por método de flotación): Se observan

ooquistes ácido-alcohol resistente

Investigación de Cryptosporidium parvum (Técnica de amplificación por reacción en cadena de

la polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN específico del C. parvum.

Resultado: detectable

Investigación molecular inmunológica: Detección de antígenos

- Ag HBsV (Método por ELISA): negativo

- HIV (Método por ELISA - proteína del core): positivo
- Western Blot para detección proteína core HIV: positivo

Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos

Frente a HBc (Método por ELISA):

IgG: reactivo hasta 1/16 dil

Frente a Toxoplasma gondii:

IgG: detectable hasta 1/64 dil IgM por captura: negativo

Frente a Citomegalovirus (Método IFI):

IgG detectable hasta 1/32 dil IgM: negativo

Frente a HCV (Método ELISA):

IgG: no detectable

Frente a HDV (Método ELISA):

IgG: no reactivo

Lavado bronco alveolar:

Investigación de Pneumocystis jirovecii (técnica por IFD): detectable

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Para te rminar…
Come nzamos e ste caminar por e l laboratorio de diagnóstico microbiológico clínico
proponie ndole s de scubrir e l fascinante mundo microbiano capaz de injuriar al hombre y
cómo de te ctarlo.
Espe ramos habe r contribuido e n algo.
Los e sfue rzos, re alme nte , no fue ron pocos. Hicimos todo lo que e stuvo a nue stro alcance
y un poquito más.
Que damos a disposición de Uds. Hasta pronto.

Cue rpo doce nte

Cáte dra Microbiología, Parasitología y Virología
Facultad de Cie ncias Mé dicas UNR

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