Una vez formado el complejo de pre-replicación y abierta la horquilla de replicación, se

comienza la INICIACION del proceso de replicación de ADN. Este se caracteriza por la

formación de los primers.
Cuando se abre la horquilla, la ADN primasa se asocia al ADN y sintetiza una pequeña
cadena de ARN primer o ARN cebador y será la raíz necesaria para que la ADN
polimerasa pueda realizar la ELONGACION.
Durante la replicación hay 2 cadenas que van a ser replicadas al mismo tiempo. Debido
a que la enzima polimerasa solamente replica de 5’-3’ y que las cadenas del ADN son
antiparalelas, el proceso va a ser bidireccional.
También es asimétrico:
 Cadena conductora o continua: Esto es porque una de las cadenas va a ser
replicada de manera continua y posee un único primer al inicio. Entonces, en la
elongación, la ADN polimerasa toma los primers y los comienza a elongar.
 Cadena retrasada o discontinua: va a necesitar de otras enzimas ADN
polimerasas distintas a la anterior. Esto es porque la ADN primasa en la otra
cadena no va a producir un único primer sino distintos. Estos son producidos en
determinadas distancias unos de otros. A cada uno de estos primers se le asocia
una ADN polimerasa distinta y los va a empezar a elongar. Una vez elongados,
se van a formar varios fragmentos sueltos que son los fragmentos de Okazaki.
Luego de elongadas las cadenas, se eliminan los primers de las cadenas con la enzima
ARNasa H. luego, una ADN polimerasa con capacidad reparadora va a unirse a los
huecos donde estaban los primers anteriormente, y los rellena con un fragmento de
ADN.
Por último, se asocian los fragmentos y se unen por medio de una enzima ADN ligasa.

Las helicasas separan las hélices del ADN. Van rompiendo los puentes de hidrogeno
entre bases nitrogenadas complementarias. Entonces, a medida que se extiende el
proceso de replicación en los extremos de la horquilla de replicación, las helicasas
continúan rompiendo los puentes de hidrogeno y van aumentando el largo de la
horquilla de replicación, exponiendo a las cadenas molde al proceso de replicación.
Entonces, al principio vemos una horquilla, pero luego se extiende por sus extremos
porque allí se encuentran adheridas las helicasas que rompen los puentes y la amplían a
la horquilla, permitiendo el proceso de replicación de ADN continuo.
Al mismo tiempo que las helicasas separan a las hebras de ADN, los puentes de
hidrogeno, que son interacciones intermoleculares que a temperatura optima se forman
de manera espontánea, tienden a asociarse nuevamente por la temperatura celular. Para
que no ocurra, entran las SSB que son las proteínas de unión al ADN monocatenario.
Entonces, a medida que la helicasa separa las hebras, las SSB se asocian a ellas para
mantenerlas separadas y facilitar el proceso de replicación.
También las cadenas de ADN tienden a establecer puentes de hidrogeno intracatenarios,
entre bases de la misma cadena de ADN. También actúan las SSB para mantener la
cadena extendida.
La proteína de enganche de carga permite el acoplamiento de la proteína de enganche
deslizante al ADN y a la ADN polimerasa.
Hay 2 tipos de topoisomerasas: la 1 o girasa, y la 2. Cortan un fragmento o dos de ADN,
permitiendo que el ADN bicatenario en los extremos de la horquilla gire alrededor de si
mismo, disminuyendo la tensión generada por el superenrollamiento y luego, volviendo
a sellar la cadena.
Existen una serie de enzimas y proteínas accesorias importantes:
 Helicasas: (separan las hélices del ADN) se encargan de seguir extendiendo la
horquilla de replicación para que los fragmentos de ADN neosintetizado puedan
elongar hasta la horquilla de replicación vecina. Su función se debe a su
capacidad de romper las interacciones puentes de hidrogeno entre bases
nitrogenadas complementarias.
 SSB: son las encargadas de unirse a las hembras de la horquilla para impedir que
estas vuelvan a reasociarse a través del restablecimiento espontáneo de las
interacciones puentes de hidrogeno.
 La RFC (proteína de enganche de carga) y PCNA o antígeno nuclear de células
proliferativas (abrazadera o proteína de enganche deslizante) son 2 proteínas
accesorias que auxilian a la ADN polimerasa en su función. Debido a la baja
afinidad de la ADN polimerasa por su sustrato, ésta tiende a disociarse de la
molécula de ADN. La proteína de enganche de carga cataliza la unión de la
proteína abrazadera deslizante, la cual ayuda a la ADN polimerasa a mantenerse
fija en la hebra de ADN mientras esta está siendo sintetizada.
 Topoisomerasas: se encargan de disminuir la tensión en los extremos de la
horquilla del ADN. El ADN, al tener sus cadenas separadas en la formación y
extensión de la horquilla, gira en los extremos de ésta generando un
superenrollamiento de la molécula, lo que podría detener la replicación por la
generación de deformaciones en el ADN. Las topoisomerasas se encargan de
disminuir la torsión de la molécula generando cortes reversibles en una sola
hebra (topoisomerasa I) o en ambas (topoisomerasa II)
La TERMINACION es la fase menos comprendida del proceso de replicación y
concluimos que ocurre cuando el ADN fue correctamente replicado. Cada origen de
replicación nos permite obtener un segmento denominado replicón, al final de la
replicación del ADN, los replicones deber ser ensamblados, constituyendo de esta forma
una molécula idéntica a la original en toda su extensión.
Al final se obtienen dos moléculas de ADN bicatenarias idénticas las cuales van a
mantenerse asociadas entre si a través de la acción de proteínas conocidas como
cohesinas. Este ADN también comienza a asociarse a las histonas que constituyen la
cromatina.
Notas:
  La cadena continua es replicada por la ADN polimerasa delta.
 Los fragmentos de Okazaki van a ser elaborados por la ADN polimerasa alfa.
 La ADN polimerasa beta se encarga de rellenar los espacios que quedan luego
de la eliminación de los primers.
Los telómeros (extremos de los cromosomas) están constituidos por secuencias de ADN
repetitivo dispuestos en tandas de alrededor de 10 kb de longitud y suelen presentar un
segmento de ADN de mayor longitud que el otro, con lo cual, tienen un segmento de
ADN no complementario en su extremo, de alrededor de 150-250 bases. El segmento de
mayor longitud tiene un extremo 3’ libre, con lo cual no puede ser replicado por las
ADN polimerasas debido a que estas se encargan de la replicación exclusivamente en
sentido 5’ 3’, con lo cual la replicación de los telómeros requiere de la actividad de otra
enzima: las telomerasas.
Debido a la estructura particular del telómero, es muy sensible a la acción de enzimas
nucleasas. Entonces, los extremos de los cromosomas tienen una cierta facilidad para la
interacción con las nucleasas y ser fácilmente digeridos si es que no hay algún otro
mecanismo de protección para impedir la digestión enzimática de los extremos de ADN.
Durante toda la interfase, excepto la fase S, G1, G2 y M, el telómero va a estar
protegido. Adquiere una forma de bucle por la asociación de una serie de proteínas al
extremo telomérico, entre ellas, la shelterina.
En el proceso de replicación, la shelterina tiene que salir del telómero. Durante el
tiempo en que dura la replicación, el telómero queda abierto a la acción de nucleasas
que lo reconocen y lo empiezan a degradar, eliminando ambas cadenas y recortando el
telómero. Si el recorte del telómero es continuo, como consecuencia, habrá menor
protección de las secuencias de ADN que contienen material codificante. Si bien, el
telómero está compuesto por secuencias de ADN repetitivo, el recorte constante genera
perdida de genes funcionales. Este problema si podría llegar a suceder, pero, en lo
normal, no sucede. Esto es porque los telómeros pueden ser replicados a través de la
actividad de la telomerasa, una nucleoproteína que tiene una parte proteica con
actividad de transcriptasa inversa y, una parte nucleica TERC (ARN primer) o
componente de ARN de la telomerasa, que permite a la parte de la transcriptasa inversa
asociarse al extremo telomérico y luego elongarlo.
La telomerasa es una enzima que contiene una estructura……asociada a un fragmento
de ARN complementario a las secuencias repetitivas presentes en los telómeros. La
telomerasa presenta la actividad de transcriptasa inversa, es decir, puede sintetizar ADN
a partir de moldes de ARN, lo que explica su función.
La elongación de los telómeros se da a partir de la unión del extremo libre del ADN al
fragmento de ARN presente en la telomerasa, sucedido el acoplamiento entre ambos
elementos, la telomerasa elonga la hebra de ADN en sentido 3’. Luego de elongado el
fragmento libre, la ADN primasa y la ADN polimerasa se asocian para duplicar todo el
segmento, proceso que finaliza con la eliminación del primer, restableciendo el extremo
3’ libre.
La digestión de los telómeros no llega a suceder a tal punto en que se afecten las
secuencias codificantes porque, al llegar a un determinado tamaño o después de una
serie de acortamientos, la celula pone en marcha mecanismos que detienen la
proliferación celular (senescencia celular o vejez celular). Entonces, la celula ya tiene
los telómeros tan desgastados que pone en marcha mecanismos que le impiden
proliferar, porque ya sabe que, si sigue proliferando, en algún momento, las secuencias
codificantes se van a ver comprometidas. ¿Por qué no suele haber acortamiento
telomérico a tal punto? Porque hay 2 mecanismo: elongación del telómero o senescencia
celular.

Recordemos que la ADN polimerasa solo replica de 5’-3’. El extremo telomérico que la
polimerasa debería elongar va de 5’, por lo que debería presentar la capacidad de
replicar en sentido inverso, cosa que no tiene. Entonces, debido a la estructura del
extremo telomérico, la ADN polimerasas no logran elongarlo. Lo que la telomerasa hace
es asociarse al extremo telomérico a través del componente TERC (componente de
ARN de la telomerasa) que tiene secuencias complementarias a las secuencias
repetitivas del telómero. Entonces, la telomerasa se une al extremo telomérico no
complementario, a través de este ARN, y lo utiliza como molde para elongar a la cadena
no complementaria (transcripción inversa: proceso de producción de ADN a partir de un
molde de ARN). Una vez elongado, a través de la acción de primasas y polimerasas
especiales, se realiza la biosíntesis de un fragmento de la cadena no complementaria
formando un telómero completamente bicatenario.
¿Cómo se restablece el extremo telomérico monocatenario? A través de la eliminación
del primer. Entonces, una vez que llega la ARNasa a eliminar el primer, vuelve a estar
presente un pequeño segmento monocatenario que es importante porque, con la
asociación de las shelterinas, se forme nuevamente el bucle y se protejan los extremos
durante la interfase y la fase M, excepto la fase S.
Ahora, la telomerasa, en la mayor parte de las células, se encuentra en cantidades tan
pequeñas que no logra mantener el largo de todos los telómeros equilibrados. Entonces,
a lo largo de los años, nuestras células y, principalmente las que tienen un alto índice
mitotico, van a ir experimentando senescencia celular, en especial las células madre que
son las que están proliferando todo el tiempo.

Por último, durante la fase S, ocurre la replicación de las histonas. Son necesarias para
la compactación del ADN en forma de cromatina. Entonces, a medida que la horquilla
de replicación avanza, el ADN se libera de las histonas y permite que la replicación
avance. El ADN previamente replicado se va asociando a nuevas histonas
restableciendo la forma de la cromatina.
Las histonas presentan una asociación muy lábil con el ADN, lo que permite
desplazarlas para que la maquinaria de la replicación pueda cumplir con su función. Las
histonas también se replican en la fase S, permitiendo que el ADN recién replicado
también se asocie a histonas y constituya la cromatina.
Que se replica en fase S: ADN, histonas y centríolos. Estos centríolos duplicados, en la
profase de la fase M, empiezan a organizar el huso mitótico.
Orígenes de replicación: son secuencias del ADN donde hay secuencias de nucleótidos
que reclutan un complejo de proteínas que luego de un proceso de activación ponen en
marcha la replicación.
La helicasa rompe los puentes de hidrogeno y permite formar las horquillas de
replicación. Luego, la primasa coloca un primer en la cadena que corre 5’-3’ y coloca
varios primers en la cadena que va 3’-5’. La ADN primasa es una ARN polimerasa.
Luego, la ADN polimerasa forma las cadenas continua y discontinua.
Luego, para unir los fragmentos, actúa una enzima que puede borrar los ribonucleótidos
(RNAasa H) dejando huecos que luego son rellenados por la acción de una ADN
polimerasa.
Luego, la ADN ligasa cataliza la formación de los puentes fosfodiéster haciendo que los
fragmentos vecinos experimenten el sellado y así se obtienen 2 cadenas continuas.
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN.
Cuando hay daños en el ADN y no se repara, puede ocasionar la perdida de genes que
compromete la funcionalidad celular. Daños en el ADN pueden comprometer a todo el
organismo, como el cáncer.
Los daños en el ADN producen, en un principio, el arresto del ciclo celular. Esto es
porque se producen cascadas de señalización ocasionadas por proteínas que reconocen
el punto de daño del ADN y estas ponen en marcha múltiples mecanismos en
simultaneo (reparación del ADN, arresto del ciclo, apoptosis)
¿Porque se quiere frenar la progresión del ciclo celular? Para poder darle al ADN la
posibilidad de reparar el daño en cuestión. Si el daño es irreparable, el arresto del ciclo
se establece y, mientras ocurre esto, se produce la expresión de proteínas pro
apoptóticas que van a intentar matar a la celula, evitando que el ADN dañado se
replique y de dos células hijas con el mismo error.
Ahora, si el daño es corregido, se continua con la proliferación celular normal. Si no lo
es, ocurre apoptosis y, si falla la apoptosis, se da lugar a una proliferación anormal,
principalmente en aquellos casos donde se producen daños en el ADN que afecten la
actividad de protooncogenes y genes supresores de tumores.
Los daños en el ADN pueden ser espontáneos o inducidos.
 Los espontáneos son desaminación (perdida de grupos amino) y depurinacion
(perdida de bases nitrogenadas puricas). Afectan las bases nitrogenadas, por
ende, afectan la complementariedad de bases.
 Los inducidos pueden ser por factores químicos (alquitrán del cigarrillo, plomo,
mercurio, etc), factores físicos (radiación UV), factores biológicos (HPV: virus
del papiloma humano)
Desaminación: perdida de un grupo amino. Produce la modificación de bases
nitrogenadas, afectando la complementariedad de bases.
Depurinación: ruptura de una base nitrogenada púrica.
Dímeros de pirimidinas: unión de 2 pirimidinas iguales. Los procesos que se ven
afectados por un dimero de pirimidina son la replicación, transcripción,
empaquetamiento de la cromatina, asociación del ADN a las histonas, etc.
Los mecanismos de reparación del ADN pueden dividirse en:
 Inversión directa de la alteración o reacción química que desencadenó la
mutación.
 Eliminación de las bases dañadas seguida de su reposición con ADN recién
sintetizado.
Adentro de los mecanismos de “inversión directa de la alteración o reacción química
que desencadeno la mutación” tenemos:
 La doble lectura de la ADN polimerasa: la capacidad de la ADN polimerasa de
corregir el agregado de bases incorrectas durante la replicación del ADN por su
actividad correctora 3’ exonucleasa.
 La fotorreactivacion en este proceso se utiliza la energía de la luz visible para
romper el anillo de ciclobutano formado entre pirimidinas adyacentes (foto-
liasa).
  Trasferencia de grupos metilo o etilo: en los procesos de alquilación del ADN,
donde ciertos agentes alquilantes transfieren a bases como la guanina, grupos
metilo o etilo, algunas enzimas como las que tienen actividades metiltransferasas
pueden retirar el metilo o transferirlo a otra molécula, restableciendo la base
original.
Adentro de los mecanismos de eliminación de las bases dañadas, seguida de su
reposición con ADN recién sintetizado tenemos;
 Reparación por escisión de bases nitrogenadas.
 Reparación por escisión de nucleótidos.
 Reparación acoplada a la transcripción
 Reparación no complementaria
 Reparación por síntesis de ADN de translesión
 Reparación de roturas de doble hebra.
La reparación por escision de bases consiste en la eliminación de la base alterada del
esqueleto del ADN (azúcar+fosfato). Un ejemplo de esta es la retirada de residuos
uracilo que se forman en el ADN. Para su retirada se requiere la acción de una enzima
ADN Glicosidasa, la cual rompe la unión del uracilo con la desoxirribosa, para formar
un sitio AP (sitio apurínico o apirimidínico). Luego, por acción de las enzimas AP
endonucleasa y desoxirribosafosfodiesterasa se retira el azúcar y el fosfato presentes en
el sitio AP y se rellena el espacio por la ADN polimerasa reparadora y la ligasa sella.
La reparación por escisión de nucleótidos se requiere cuando el daño es más extenso
que una base nitrogenada, como un dimero de purinas o pirimidinas, que afecta al
menos dos bases adyacentes. Consiste en la retirada de un oligonucleótido que tiene
como objetivo eliminar un daño como un dimero de timina. En estos casos, el ADN
dañado es reconocido y después se abre la doble hebra por acción de la helicasa. A
continuación, se escinde un segmento de la cadena con el daño, por nucleasas 3’ y 5’,
produciendo la retirada del segmento dañado y sus porciones aledañas. Posteriormente,
el espacio desocupado es rellenado por la ADN polimerasa y fijado por la ligasa.
También puede ocurrir acoplado a la transcripción. Cuando se produce la pausa de la
transcripción por la presencia de un dimero, se produce un reclutamiento de proteínas a
la horquilla de transcripción.
La reparación por síntesis de ADN de translesion se trata de un mecanismo de
reparación que se pone en marcha cuando los mecanismos de inversión directa del daño
al ADN no lograron eliminar alguna alteración, como podría ser un dimero de
pirimidinas, y como consecuencia este daño interrumpió el proceso de replicación
normal del ADN. En este caso, una ADN polimerasa especializada como la ADN pol V,
incorpora desoxirribonucleótidos a través de la lesión y luego, las ADN replicativas
normales continúan el proceso replicativo. Por último, el dimero de pirimidinas se
elimina por escisión de nucleótidos. (Debemos aclarar que la ADN pol V tiene una baja
fidelidad de replicación, o sea, tiende a la incorporación de nucleótidos no
correspondientes al sitio. La enzima sigue incorporando desoxirribonucleótidos en la
cadena en síntesis, a pesar del daño del ADN para no frenar el proceso de replicación.)
La reparación no complementaria ocurre por acción de 2 proteínas, la MSH y la MLH,
las cuales tienen la propiedad de unirse a la base no apareada y dirigir la escisión del
fragmento dañado o incorrecto (parecido a la escisión de nucleótidos, luego de la
replicación, donde un error puede ser reparado por las proteínas mencionadas que
eliminan todo un segmento del ADN para permitir que se produzca una reparación
donde se incorpora un nuevo segmento) . Luego, las enzimas ADN polimerasa y ligasa
cumplen con el relleno y unión del nuevo segmento. (ocurre luego de la replicación,
pero sigue en fase S. Un error en el apareamiento de bases puede ser reparado por las
proteínas que eliminan un segmento del ADN y permitir la reparación en donde se
incorpora un nuevo segmento correcto)
La reparación de roturas de doble hebra es un problema que puede corregirse con la
reparación recombinatoria, la cual sintetiza los segmentos que sufrieron rotura, pero
con nucleótidos al azar. Otra forma de corregir roturas de doble hebra es con la
recombinacion homologa (reparación más adecuada), donde se sintetiza la porción
degradada utilizando como molde la misma región de un cromosoma homologo, de esta
forma, la secuencia pierde su información.
Consta de 2 mecanismos: unión de los extremos propenso al error en donde los
extremos dañados se pegan nuevamente y pierde el segmento de información afectado.
Esta forma de reparación introduce errores y hay perdida de bases en el punto de unión.
Variabilidad genética.
Consiste en la alteración de las secuencias del genoma preexistentes. Los mecanismos
de generación de variabilidad genética son múltiples y entre ellos están:
Mecanismos:
 Mutaciones: alteración de genes.
 Recombinacion: homologa, de sitio especifico, transposición, amplificación
génica.
 Sexo.

PCR
La PCR, también conocida como reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de
amplificación de ácidos nucleicos in vitro.
Se caracteriza por ser una técnica molecular:
 Versátil
 Rápida
 Sensible
 Especifica.
Componentes necesarios:
Se requiere de un recipiente donde este presente el ADN que se quiere replicar,
cebadores, la ADN polimerasa termoestable, sus sustratos (dNTPs/A, G, T, C/) y
cofactores (Mg2+).
El cebador o primer son secuencias de ARN de entre 18-25 pares de bases
(oligorribonucleótidos). Deben presentar complementariedad de bases con alguna
secuencia de la molécula que se quiere amplificar. Determina la región a la cual se va a
amplificar. (los segmentos de ADN que pueden ser clonados eficientemente tienen un
tamaño de 50-5000 pares de bases)
Los cebadores se unen a secuencias complementarias de las cadenas molde o templado,
una vez que estas se separan, marcando donde empieza el sitio de replicación.
Pasos de PCR:
 Desnaturalización: proceso que se produce in vitro para poder separar la doble
hebra del ADN. Proceso que in vivo se da por las MCM helicasas. Se eleva la
temperatura entre 93 y 95 grados, bajo la cual los puentes de hidrogeno entre
bases complementarias se rompen.
 Hibridación: se reduce la temperatura entre 50-70 grados permitiendo la
formación de puentes de hidrogeno con la consecuente asociación (annealing) de
los cebadores a las cadenas molde o templado.
 Elongación: se eleva la temperatura nuevamente, pero ahora alrededor de 70-75
grados, temperatura óptima para la ADN polimerasa termoestable, facilitando la
biosíntesis de ADN.
Al final del proceso se obtiene el doble material genético. Y repitiendo los mismos
pasos se puede realizar de manera cíclica. PCR son ciclos de amplificación.
Detalles.
 Las variaciones de temperatura son generadas por un termociclador.
 La enzima polimerasa (Taq polimerasa) se obtuvo inicialmente de bacterias
termófilas del género Thermus aquaticus. Se trata de una enzima polimerasa
termoestable. Las Taq polimerasa no tiene actividad 3’ exonucleasa (lectura de
prueba)
 La amplificación es exponencial. Se obtiene el doble de lo que se tiene al
principio.
¿Cómo se visualizan los productos o resultados?
Se realiza la electroforesis (en agarosa: gel poroso) de los amplicones, separándolos,
como consecuencia, según su peso molecular.
Los amplicones, o fragmentos amplificados, son sometidos a un proceso de migración
que los hace migrar a distinta velocidad según su peso molecular.
En el gel, se aplican 2 electrodos, un cátodo y un ánodo. Lo positivo va hacia el cátodo
y lo negativo hacia el ánodo. Los ácidos nucleicos van hacia el ánodo. La velocidad a la
que llegan al ánodo va a depender de su peso molecular.
Luego de la electroforesis van a haber partículas que van a estar mas cerca del cátodo,
del ánodo o en el medio.
 Se colorea el ADN con bromuro de etidio (el bromuro de etidio permite una
fluorescencia)
 Se realizan fotografías del gel mientras este es iluminado por luz uv.
 Un procesador de imágenes se encarga del análisis de las bandas observadas.
M: marcador de peso molecular. Compuesto por fragmentos de ADN de tamaño
conocido.
El grosor de las bandas marca la cantidad de fragmentos que están presentes en cada
banda.
La PCR tiene variantes
 PCR convencional o punto final.
 PCR cuantitativa
La PCR cuantitativa se realiza de una manera más especifica que permite identificar en
tiempo real la cantidad de productos que se obtienen en cada ciclo y permite inferir en la
cantidad de muestra inicial.
Los controles son para chequear que los resultados de la técnica se hayan realizado
correctamente.
Ventajas de la PCR:
 Rapidez: El clonado por PCR puede realizarse en unas pocas horas, con equipos
relativamente no sofisticados.
 Sensibilidad: la amplificación puede llevarse a cabo partiendo de cantidades
muy pequeñas de ADN, incluso de una única celula.
Limitaciones:
 Se necesita información previa de la secuencia que se quiere amplificar, para
poder sintetizar los primers.
 La secuencia para amplificar no puede ser muy larga.
RT – qPCR.
Es una variación de la PCR, conocida como PCR cuantitativa (tiempo real) precedida
por retro transcripción. Se trata de una técnica molecular que sigue los mismos
principios que la PCR, pero que difiere de esta en 2 puntos principales:
 Puede analizar muestras de ARN. (PCR: solo ADN)
 La observación de los resultados se hace a través de gráficos en una pantalla.
Pasos: son los mismos que la técnica de PCR, pero antes se requiere de un paso
adicional, una vez aislada la muestra.
 Retrotranscripcion: producción de ADN a través de un molde de ARN.
 Desnaturalización
  Hibridación
 Elongación
Retrotranscripcion funciona de la siguiente manera:
A través de un molde de ARN se produce un ADN complementario por una enzima que
produce este proceso y es la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.
Realizada la Retrotranscripcion, se sigue con la PCR.
En la hibridación se utilizan primers que están acoplados a proteínas fluorescentes las
cuales, al ser sometidas a luz especial, se activan y producen la fluorescencia. Mientras
más cadenas se produzcan, mas primers van a haber y más fluorescente se verá el
resultado.
Además de los fluoroforos, existen sondas que se acoplan en la hibridación y, luego de
la elongación, estas se rompen y liberan un fragmento que libera la fluorescencia.
¿Cómo analizo los productos?
Los termocicladores, en este caso, tienen un aparato de detección de fluorescencia
emitida por la reacción química ocurrida en el recipiente. Según el grado de
fluorescencia se produce patrones que se grafican y aparecen en pantalla.
CLASE 2: REGULACION DEL CICLO CELULAR.
Modelos experimentales:
 Ovocitos.
 Fusión de células en cultivos.
 Hongos unicelulares (estudios genéticos)
 Estudios bioquímicos libres de células.
Técnicas:
 Cuantificación de células en mitosis.
 Detección de células que duplican su ADN (radioautografía con timidina
tritiada, bromodeoxiuridina)
 Cuantificación de células con distinta cantidad de ADN (citometría de flujo)
Conceptos iniciales.
-Ploidía: el número de cromosomas característico de las células de una determinada
especie.
N: representa la ploidía de una celula. Dentro de la n están el número de cromosomas.
1n: 23 cromosomas = haploides (células germinales)
2n: 46 cromosomas = diploides (células somáticas)
3n: 69 cromosomas =triploides
4n: 92 cromosomas = tetraploides
-Cantidad de ADN: C: número de cromátides)
Cada celula tiene 46 cromosomas, que es igual a 46 cromátides. (2n=2c)

En G1, nuestras células somáticas son células que tienen 2 juegos de 23 cromosomas,
cada cromosoma está constituido por una única cromátide. (celula está en reposo)
La madre da 22 autosomas y un cromosoma sexual (X) y el padre da 22 autosomas y un
cromosoma sexual (X / Y).
En fase S se produce la replicación del material genético. Cada cromosoma va a tener 2
cromátides luego de fase S. luego, estas cromátides serán redistribuidas a las células
hijas equitativamente o igualitariamente. (2n=4c o 46 cromosomas= 92 cromátides)
En G2, comienzan los preparativos para la fase M.
En fase M, la fase mitótica, la célula se divide y reparte las cromátides. (2n=2c)
Y vuelve a comenzar el ciclo.
CICLO CELULAR.
 En G0= estado de reposo. La celula no se está preparando activamente para la
división, solo está llevando a cabo su función. Pueden reiniciar la división si
reciben las señales correctas.
 En G1= la celula crece físicamente: copia las organelas y hace componentes
moleculares que necesitará en etapas posteriores.
 En S= la celula sintetiza una copia completa del ADN en su núcleo, duplica el
centrosoma. (ayudan a separar el ADN durante la fase M)
 En G2= la celula crece más, hace proteínas y organelas, y comienza a
reorganizar su contenido en preparación para la mitosis.
 En M= profase, metafase, anafase y telofase.
G0 es un estado de quiescencia. Metabólicamente esa celula se encuentra activa.
Datos del ciclo:
 Secuencia temporal univoca de procesos asociados.
 Adaptable a condiciones ambientales
 Mantiene fidelidad del proceso en condiciones variables.
 En cada etapa ocurren eventos moleculares que facilitan el progreso a la
siguiente.
Mecanismos que operan en todas las etapas del ciclo celular: CDKs y ciclinas.
CDK: quinasa dependiente de ciclina. La quinasa es una enzima que fosforila.
Ciclinas: son proteínas reguladoras de las CDK. Presentan una expresión cíclica.
 La CDK no unida a ciclina tiene una ultraestructura que bloquean el acceso del
substrato al sitio activo unido al ATP. La unión de la ciclina a la CDK induce
cambios conformacionales que exponen el sitio activo.
El ciclo se regula a través de la acción de los complejos CDK – ciclinas. Este complejo
adquiere actividad dado que se abre el sitio de unión al sustrato de la enzima y puede
realizar sus funciones.
Las ciclinas tienen una concentración que cambia constantemente a lo largo de las fases
del ciclo. En cambio, las CDKs tienen su concentración constante durante todo el ciclo
celular.
Las ciclinas son proteínas que varían su cantidad a lo largo del ciclo (aumentan y
disminuyen= ciclan). Al unirse a las kinasas dependientes de ciclinas CDK, las activan
para cumplir funciones específicas en los puntos de control del ciclo celular. Entonces,
las ciclinas aumentan sus niveles por síntesis de novo y disminuyen sus niveles por
degradación.
Hay grandes grupos de complejos ciclina-quinasa. Podemos dividir las familias de
ciclinas en:
 Ciclinas de fase G1
 Ciclinas de fase S
 Ciclinas de fase M
Una vez que se asocia la ciclina con la CDK, ocurren otros eventos como la
fosforilación activadora de la treonina próxima a la posición 160. También ocurre la
fosforilación inhibidora de la treonina 14 y de la treonina 15 y la asociación con
inhibidores de CDK (CKI)
Entonces, el acoplamiento de la ciclina a la CDK es uno de los factores iniciales que
permite que se produzcan fosforilaciones subsecuentes que originan o tornan a la CDK
más susceptible a fosforilaciones mediadas por otras enzimas.
 La ciclina determina la actividad de la CDK. No es el único componente.
Entonces, las ciclinas tienen concentración variable mientras que las CDK tienen
concentración estable. La activación de las CDK requiere presencia de ciclinas. Estos se
asocian formando complejos que generan una cascada de eventos de fosforilación que
ponen en marcha mecanismos que permiten que se produzcan eventos específicos de
cada etapa del ciclo celular y eventos de progresión de una etapa para la otra. Sin
embargo, no es lo único que se requiere para la activación de estos complejos. También
es necesario eventos como fosforilaciones activadoras, la desfosforilación de sitios
fosforilados inhibitorios, la disociación de inhibidores de las CDKs, etc.
EVENTOS CLAVES EN EL CICLO CELULAR.
Puntos de control o checkpoint: son los puntos en donde se hace un análisis del material
genético para ver si no tiene roturas, mutaciones, etc. Son mecanismos de vigilancia. Se
distribuyen a lo largo de todo el ciclo.
El punto de control va a revisar si el ADN se encuentra completamente replicado, si la
celula tiene todos los cromosomas asociados al huso mitotico, si el ADN tiene roturas o
se encuentra en su estado integro, etc.
Punto de restricción: punto de regulación del ciclo especial, en G1, en donde se produce
un análisis del entorno celular. Busca chequear si la celula recibe estímulos del entorno
del microambiente celular que favorezcan la proliferación celular (factores de
crecimiento).
Si en los puntos de control se detectan algunos fenómenos, se detiene o arresta el ciclo
celular.
Entrada a G1.
Factor de crecimiento: son moléculas reconocidas por receptores que activan cascadas
de señalización intracelular controlando la transcripción de ciclinas que favorecen el
pasaje de los puntos de control en el ciclo celular. Es un estimulante de crecimiento.
Dado que su función es estimular la proliferación celular es codificado por un gen
especial, protooncogenes.
Como son ligandos, actúan sobre receptores, y estos también van a ser codificados por
protooncogenes. En conjunto, desencadenan una cascada de señalizaciones que van a
activar un conjunto de enzimas, reguladas por fosforilación, que llamamos quinasas
activadas por mitógenos (MAP quinasas). Estas desencadenan otra cascada de
señalizaciones que produce la activación de factores de transcripción, los cuales, a nivel
genético, producen la expresión de genes que codifican para ciclinas, para factores
antiapoptoticos, para componentes que estimulan la proliferación celular.
Para producir el pasaje del punto de restricción de G1, se requiere estímulos
extracelulares mediados por factores de crecimiento. Estos estímulos conducen la
producción de ciclina D, que desencadena los eventos necesarios para sobrepasar el
punto de restricción de G1.
Eventos claves de G1:
 Se unirán complejos de reconocimiento de los sitios de origen de replicación del
ADN
 Se recluta la helicasa y se forma el complejo de pre-replicación
 Se expresan ciclinas de la etapa G1.
Transición G1-S
La ciclina D va a activar una serie de CDK4/6. Estos factores constituidos por esa
combinación de ciclinas y CDKs, al encontrarse en pleno estado de actividad,
comienzan a fosforilar una serie de sustratos. Uno de ellos es una proteína llamada Rb
(retinoblastoma= cáncer que afectan la retina). La proteína Rb es una proteína de
producción o expresión constitutiva, que actúa secuestrando algunos factores de
transcripción específicos. Al secuestrarlo, impide su acción sobre un gen preciso que es
regulado por dicho factor. Ese gen coincide con el gen que codifica para la ciclina E,
que es necesaria para la transición G1-S.
¿Cómo se suprime la acción de la proteína Rb? Bajo estímulos mediados por factores de
crecimiento, se produce expresión de ciclina D. esta en conjunto con la CDK4/6 forman
complejos que fosforilan la proteína Rb. Al fosforilarla, experimenta un cambio
conformacional donde se libera del factor de transcripción y deja de secuestrarlo o
inhibirlo y, por ende, este factor suelto puede actuar sobre genes como, por ejemplo,
sobre el gen que codifica para la ciclina E.
Como consecuencia, se produce la expresión de ciclina E que, junto con la CDK2,
forman el factor promotor de la transición G1-S. Dicho factor, además de retroalimentar
la vía inhibitoria de la proteína Rb, produce una cascada de eventos de fosforilación de
componentes como las proteínas que se unen al sitio de iniciación de replicación de
ADN, fosforila proteínas que tienen que ser reclutadas a los sitios de origen de
replicación del ADN y formando los complejos de pre-replicación que, posteriormente,
se activan iniciando la fase S.
Acción de retinoblastoma: gen supresor de tumor.
Eventos claves de la transición G1-S:
 La activación de CDK4/6 permitirá la fosforilación de la proteína Rb
 Una vez fosforilada, esta proteína dejara de inhibir (=estimulara) la transcripción
de la siguiente ciclina en juego: ciclina E.
Fase S:
 La activación de CDK correspondientes a esta etapa conllevaran la fosforilación
de complejo de pre-replicación.
 Cesa la actividad del complejo promotor de la anafase.
 Se reclutan proteínas a la burbuja de replicación: topoisomerasas, RPA,
primasas, ligasas.
 La fosforilación de proteínas del complejo de pre-replicación (libres y unidas al
ADN) impiden que puedan volver a unirse evitando que factores de iniciación se
unan en etapas tardías.
 Replicación del ADN.
En esta fase, todos los componentes acoplados a los orígenes de replicación van a ser
fosforilados y activados. Ponen en marcha su acción, como la apertura de la horquilla de
replicación y la replicación del ADN propiamente dicha.
El ADN no se duplica 2 veces en el mismo ciclo celular debido a que durante la
replicación del ADN se separan del sitio de inicio de la replicación las proteínas MCM
que no pueden volver a unirse a dicho sitio hasta la interfase siguiente.
Inicio de mitosis.
Mecanismo iniciador de la mitosis: FPM o MPF
El factor promotor de la mitosis (FPM) está compuesto por CDK1 y ciclina B. cuando
se activa, desencadena una cascada de fosforilaciones que activan un grupo secundario
de quinasas que intervienen en la fosforilación de los factores y otros componentes para
que se ponga en marcha los eventos típicos de las primeras 3 fases de la mitosis:
profase, prometafase y metafase. Estos factores secundarios son las quinasas aurora y
polo.
La acción que se produce a través del factor es que, sea a través de quinasas aurora y
polo o de manera directa, produce:
  Fosforilación de proteínas condensinas: condensan cromatina.
 Fosforilación de lamininas: de la lámina nuclear.
 Fosforilación de proteínas especificas: producen la disgregación de las cisternas.
Fragmentar las organelas constituidas por membranas y que pertenezcan al
sistema de endomembranas: Golgi y RE
 Formación del huso mitotico. Por fosforilación de proteínas MAP, proteínas
asociadas a microtúbulos, regulan la actividad microtubular haciendo que
adopten un comportamiento especial y formando el huso mitotico.
Eventos claves de la transición G2-M
 Eventos nucleares: fosforilación de láminas (desensamble de lámina nuclear),
fosforilación de nucleoporinas (desensamble de complejo de poro nuclear),
fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana,
fosforilación de condensinas.
 Eventos citoplasmáticos: fosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos,
fosforilación de proteínas del REG y Golgi (inhibición de tráfico vesicular,
fragmentación de Golgi y REG).
Las cohesinas son proteínas que van a mantener las cromátides hermanas adheridas.
La cromatina, al principio, es una cromatina laxa. Para que se puedan producir los
cromosomas metafásicos, necesita modificar su perfil de condensación. Las condensinas
se activan que se asocian a la cromatina y la compactan en nivel metafásico, cuando el
cromosoma se encuentre en la placa ecuatorial o metafásica.
A nivel del centrómero, van a presentar proteínas, las cinetocoro, sobre las cuales se van
a asociar los microtúbulos cinetocoricos del huso mitotico, los cuales van a traccionar y
transportar posteriormente los cromosomas y las cromátides hermanas hacia las células
hijas respectivamente.
Etapas de la mitosis:
 Profase: condensación de los cromosomas. Ensamblado del huso mitotico.
Formación del huso mitotico: en fase S se produce la duplicación del centrosoma, donde
los centriolos se separan y empiezan a formar otro miembro del par de centriolos para
cada uno de los que se han separado inicialmente. Estos, posteriormente, experimentan
una reorganización de los microtúbulos citoplasmáticos y, en la profase, dan inicio a la
formación del huso mitotico.
El huso mitotico se va reorganizando gradualmente a medida que la envoltura nuclear
también va experimentando disgregación. Se reorganizan de tal manera que los
microtúbulos se asocian de manera antiparalela y, a través de una serie de proteínas de
adhesión, las mantiene unidas.
 Prometafase: ruptura de la envoltura nuclear (cariocinesis). Asociación de los
microtúbulos del huso mitotico a los cromosomas.
La cariocinesis solo es posible por la fosforilación de láminas nucleares y de las
nucleoporinas. Esta fosforilación produce su desensamble.
  Metafase: agrupamiento de los cromosomas en el ecuador.
Huso mitotico propiamente dicho: tiene 3 fibras principales:
Las fibras cinetocoricos, asociadas al centrómero, y son las que fijan los cromosomas en
la placa metafásica.
Las fibras de los microtúbulos interpolares, son antiparalelos que se organizan entre si
para mantener la estabilidad del huso mitotico y permitir su elongación.
Y los microtúbulos astrales, que son los que cierran hacia los polos, por afuera del huso
mitotico propiamente dicho pero que son parte de este.
En el ensamblado del huso, las fibras interpolares o polares que son antiparalelas, a
través de proteínas motoras como las kinesinas 5 y 14, se ensamblan y a través de la
acción de éstas se produce el remodelado y los movimientos dinámicos del huso.
Los cromosomas también tienen una relación estrecha con las kinesinas.
Las dineínas van hacia los polos negativos de los microtúbulos, aunque la dineína
parece tener un papel mas de fijador del microtúbulo a la membrana.
Eventos claves de la transición metafase-anafase:
 La unión de los microtúbulos del huso al cinetocoro permitirá la liberación de
proteínas reguladoras (cdc20) y su unión al complejo promotor de la anafase
(APC)
 APC actúa como ubiquitin ligasa: permitirá la degradación de la ciclina B y de
las cohesinas. Finalizan los eventos que iniciaron durante la mitosis.
 APC también libera de su inhibición a las proteínas del complejo de pre-
replicación, cuya actividad volverá a observarse en la siguiente fase G1.
¡Este evento es un checkpoint!
 Anafase: separación de las cromátides hermanas y trasportándose hacia los polos
de la celula para permitir que, a nivel del ecuador, se produzca el evento final
(citocinesis)
Para que se produzca esta segregación de las cromátides hermanas se necesita que todos
los cromosomas estén asociados al huso mitotico. Si hay un cromosoma que no este
asociado al huso mitotico, se observa que proteínas reguladoras (bub, mad) se activen y
produzcan un efecto inhibitorio sobre otra proteína de importancia, cdc20, y que es la
responsable de activar el complejo promotor de la anafase.
Una vez producido el acoplamiento, los cromosomas que estaban activando las
proteínas activadoras del complejo, dejan de hacerlo. Las proteínas bub y mad se
inactivan y, como consecuencia, se elimina la inhibición sobre la cdc20 y esta puede
actuar sobre el complejo promotor de la anafase.
El complejo induce la degradación de ciclinas B y el cese de la actividad del factor
promotor de maduración. Por otro lado, dicho complejo induce la degradación de la
proteína securina, que inhibía otra proteína llamada separasa. La separasa actúa sobre
las cohesinas produciendo su liberación y permitiendo que las cromátides hermanas se
separen.
¿Cómo se produce la regulación de las concentraciones de ciclinas mitóticas?
Se degradan por la acción de enzimas o de complejos que tengan actividad enzimática
que llamamos ubiquitin ligasas. Uno de estos complejos es el complejo promotor de la
maduración. Este tiene la capacidad de ubiquitinar proteínas, o sea de incorporar
secuencias de aminoácidos hidrófobos (ubiquitinas), y que indican que dicha proteína
debe ser posteriormente degradada. Esta proteína, luego, interactúa con el proteasoma, y
este produce su degradación y eliminación.
 Telofase: polimerización de la envoltura nuclear. Descondensacion de la
cromatina. Citocinesis.
Se ve que las cromátides hermanas segregadas comienzan a descondensarse. Se
comienzan a revertir todos los fenómenos ya vistos. Se comienza a reformular el
sistema de endomembranas y la envoltura nuclear, formando nuevamente los núcleos de
las células hijas.
En el sector medio de la celula se comienza a formar un anillo contráctil de actina y
miosina que va a participar del fenómeno de citocinesis, en donde se produce la
separación de los citoplasmas de las células hijas de manera completa por lo general.
MEIOSIS.
Se produce en células germinativas. Es un proceso que requiere una replicación de
material genético y, como consecuencia de esta replicación, se producen 2 divisiones
secuenciales que producen a la formación de células haploides.
Meiosis produce reducción del número total de cromosomas en las células hijas, las
cuales pasan a ser haploides.
También produce mecanismos de variabilidad genética:
 Crossing over: en profase 1.
 Segregación azarosa de los cromosomas.
La gonia tiene 2n 2c.
La cito primario tiene 2n 4c.
Cito secundario: cada uno va a tener 1n 2c (son dos). Los espermatocitos secundarios se
dividen nuevamente (división ecuacional) y originan 4 espermátides (2 por cada cito
primario) y su información en las células hijas queda 1n 1c.
La primera división meiótica ( M1) es la división reduccional.
 Cuando se habla de la ovogénesis, se produce un arresto en metafase 2. Los
ovocitos pasan por detenimientos en la división celular y el ciclo. Un
detenimiento de relevancia es cuando el ovocito primario queda detenido en el
dictiotene en profase 1. Luego de que este, por estímulos hormonales, logra
finalizar la primera división meiótica, este queda detenido en metafase 2. Este
 detenimiento es el resultado de una cascada de señalizaciones inhibitorias que
inhiben la acción del complejo promotor de anafase, por ejemplo.
Durante la activación del ovocito, la generación de ondas de calcio permitirá la
activación de proteínas que liberaran a APC.
Otros mecanismos de regulación del ciclo celular.
 Otros mecanismos de regulación.
Daños en el ADN que activan mecanismos de reparación o detención del ciclo celular:
 Rotura de doble hebra
 Problemas en la horquilla
 Falta de no complementariedad de bases
 Daños en los nucleótidos
Cualquiera de estos daños es reconocido por proteínas de vigilancia del genoma y van a
enviar cascadas de señales que, en un principio, van a buscar frenar la progresión del
ciclo, poner en marcha mecanismos de reparación y, en caso de que fallen estos
mecanismos, se ponen en marcha la activación de proteínas pro apoptóticas o de
proteínas que produzcan un arresto definitivo del ciclo.
TP53: gen supresor de tumores. Es una proteína que tiene una inestabilidad
pronunciada. Esto quiere decir que es una proteína que se expresa y que luego se
degrada. Como se degrada constantemente, se expresa de manera constitutiva (todo el
tiempo se expresa P53). Si se produce algún tipo de daño celular (estrés oxidativo o
alguna cosa que ponga en riesgo la organización de la celula normal), la P53, a través de
cascadas de señalizaciones celular, termina experimentando un fenómeno de
fosforilación que produce el aumento de su estabilidad y esta deja de ser degradada.
Además, esta fosforilación permite que esta, a través de un cambio conformacional,
adquiera funcionalidad.
La P53 actúa como factor de transcripción facilitando la transcripción de ciertos genes
que van a estar involucrados con la apoptosis, con vías de reparación, con arresto de
ciclo.
 La proteína P53, en condiciones normales, será ubiquitinizada y degradada.
 De existir eventos de daño, esta proteína será fosforilada, lo que conllevará a que
actúe como factor de transcripción.
Detención del ciclo celular en los puntos de control de lesión del ADN y rol de la
proteína P53 en la detención del ciclo en G1.
A través de la proteína P21 y de la acción de cdc25 se produce la inhibición de ciertos
complejos que permiten la progresión celular de G1 a S.
 La P21 actúa como inhibidora de quinasas dependientes de ciclinas.
 La cdc25 favorece la fosforilación en residuos de aminoácidos que produce la
inhibición de las CDKs.
 Caracterización clásica de ciertas regiones génicas en virtud de su rol en el desarrollo
tumoral.

Genes supresores de tumores Protooncogenes. Notas

Codifican proteínas cuyo rol, en Codifican proteínas, que cuando Todo lo que tiene que ver con
general, es el de impedir el aumentan su numero o actividad proliferación celular en sentido
desarrollo tumoral. favorecen el desarrollo tumoral (si positivo o de facilitar la
ya existieron mutaciones que proliferación, tiene que ver con
facilitaron este fenómeno: se protooncogenes.
denominan oncogenes)

En algunos casos codifican En algunos casos codifican

proteínas que detienen el ciclo proteínas que estimulan la
celular: actúan en checkpoints progresión del ciclo celular. (ciclina
mecanismos de reparación (p53, D, EGFR, Ras, Raf, Erk)
p21, BRCA, ATM)

Se requiere que ambos alelos Se requiere que uno de los alelos

estén mutados para favorecer el esté mutado para favorecer el
desarrollo tumoral. Se observa desarrollo tumoral. Se observa
perdida de función. ganancia de función.

Otros ejemplos: Otros ejemplos:

 Proteínas proapoptoticas:  Proteínas antiapoptóticas:
Bax. Bad. bcl2.
 Inhibidores de vias de  Mas actividad telomerasa:
crecimiento: PTEN c-myc
 Inhibidores de  Adquisición fenotipo
angiogénesis: VHI invasivo: Wnt1

Recuerden que las mutaciones pueden ser en células germinales y somáticas.

En pacientes que presentan mutaciones en células germinales, sobre todo vinculadas a genes supresores de
tumores, existirá riesgo de síndrome de cáncer hereditario.

Suele observarse en algunos de estos casos, que luego de que uno de los alelos ha sido heredado con una
variante patogénica, a lo largo del desarrollo del individuo ocurrirá una mutación somática en el otro alelo.
Este fenómeno suele ser conocido bajo el concepto de “teoría de los dos golpes” o hipótesis de Knudson.

*para la mayor parte de los genes tenemos 2 copias o alelos. Estas 2 copias se expresan
por lo general, y la función de la proteína está determinada en parte por la cantidad de
proteína que se produce. Entonces, si hay 2 copias funcionales, hay una cantidad de
proteína x. si hay 1 copia funcional, hay una cantidad reducida, por lo general, la mitad.
CLASE 3: REGULACION DE LA EXPRESION GENICA.
Cuando se habla de trascripción, se habla de un proceso bioquímico de biosíntesis
donde a través de la acción de enzimas, se produce una lectura de una secuencia de
ADN y a través de la información contenida en esta secuencia, se produce una molécula
de ARN que tiene una secuencia complementaria a la secuencia previa que sirvió de
molde. Producto de la transcripción es un ARN: si se habla de un gen que codifica una
proteína es un ARNm.
Ejemplo: el molde de ADN que codifica para el gen de la proteína X produce una
molécula de ARNm transcripto primario o inmaduro. Este ARN experimenta
procesamiento, exportación y así se obtiene el ARNm transcripto secundario. Este es
transportado hacia el citoplasma donde, por traducción, se vuelve polipéptido.
El procesamiento de los ARN es capping (5’), splicing (eliminación de intrones y
empalme de exones) y poliadenilación (3’). Estos 3 eventos son importantes para
obtener un transcripto secundario.
Diferenciación celular.
En la diferenciación celular se observa que células con el mismo genoma, previo a la
determinación celular, selecciona diferencialmente los genes (determinación celular: se
produce de manera irreversible y epigenético)
Luego de la selección, la celula va a expresar diferencialmente los genes (diferenciación
celular).
Entonces, la celula se determina de manera irreversible a nivel epigenético. Posee
eucromatina y heterocromatina. En la eucromatina incorpora los genes que son útiles
para la celula y los que no, van a la heterocromatina que los compacta.
Entonces, luego de la determinación, las células precursoras son iguales
fenotípicamente. Luego de una inducción permisiva, estos genes seleccionados se
comienzan a expresar (expresión diferencial de genes) y las células precursoras van a
comenzar a diferenciarse.
Luego de la diferenciación, las células serán idénticas genotípicamente.
Fenotípicamente es distinta.
¡EL GENOTIPO NUNCA CAMBIA!
Se puede definir la diferenciación como el proceso en el cual, como resultado de una
expresión diferencial de genes, la celula experimenta modificaciones morfológicas,
bioquímicas y funcionales. No hay cambios genotípicos, pero si con cambios
fenotípicos.
Otro evento en el cual se produce una expresión diferencial de genes es en la respuesta
celular a estímulos agudos o momentáneos. Puede ser a corto plazo.
Posibles niveles de regulación de la expresión génica.
Estos niveles toman como base el flujo de la información genética, que parten del ADN
y que finaliza en la obtención de la proteína madura y funcional.
Desde el punto inicial pasa por la transcripción, el procesamiento, la exportación, la
traducción, el plegamiento y modificaciones de los polipéptidos producidos durante la
traducción. Los posibles niveles de regulación son 1) a nivel pre transcripcional, 2) a
nivel transcripcional, 3) a nivel pos transcripcional, 4) a nivel traduccional y 5) a nivel
pos traduccional.
1- Regulación pre-transcripcional.
Definimos a la epigenetica como los cambios que ocurren a nivel del ADN, sin
modificar su secuencia, pero que van a generar una modificación en la expresión de ese
gen. La base de este nivel de regulación viene dada por la famosa “epigenética”. Son
modificaciones que no involucran a la secuencia de bases nitrogenadas en sí. Son
modificaciones que pueden darse a nivel de las proteínas asociadas al ADN, como las
histonas, e incluso pueden darse a nivel del propio ADN.
Estas modificaciones no alteran la secuencia de bases nitrogenadas. Al no afectar la
secuencia génica, se considera epigenético.
Epi: por sobre
Genética: genes
Se trata de todo aquello que está en relación con el ADN, siempre y cuando no se altere
la secuencia de bases nitrogenadas o la información del segmento de ADN en cuestión.
La cromatina es el resultado del ADN asociado a histonas.
Acetilación de histonas.
Puede ser realizada por enzimas como las histonas acetilasas o acetil-transferasa (HAT).
Son enzimas que actúan como coactivadores de la expresión génica: al ser reclutadas de
determinados sitios de donde se quiere producir la expresión génica, estos coactivadores
acetilan las histonas en asociación con el ADN. La acetilación de histonas produce una
disminución en la afinidad de la histona con el ADN, haciendo que esta quede unida
más débilmente y que el ADN pueda exponer mayormente sus secuencias, favoreciendo
el fenómeno de transcripción.
De manera contraria trabajan las histonas desacetilasas. Son enzimas que van a
desacetilar a las histonas. Actúan como correpresores de la expresión génica,
eliminando los residuos acetilo que se incorporan en las histonas, haciendo que estas
pierdan esta modificación que favorecía a la transcripción.
*¡los nombres de las enzimas son tomadas!
Metilación de histonas
La metilación permite que las histonas se adhieran mas fuertemente al ADN, produzcan
una cromatina mas compactada. Se encuentra mas frecuentemente en heterocromatina.
Se produce este tipo de modificación cuando se quiere producir el silenciado de la
expresión génica. También existen histonas desmetilasas que invierten la metilación de
histonas, convirtiendo la cromatina mas laxa.
Existen metiltransferasas de secuencias nucleotídicas específicas, principalmente en C-
G (islas CPG: citosina- fosfato- guanina).
*¡la acetilación y metilación son procesos mutuamente EXCLUYENTES! Donde se
incorpora un grupo acetilo no se puede incorporar un metilo sin desacetilar para luego
metilar.
Complejos remodeladores de la cromatina.
Estos se pueden dividir en 3 grupos principales:
 Escritores: aquellas proteínas que “agregan” algo, como, la acetil transferasa.
 Borradores: se consideran aquellas proteínas que “sacan” algo, como las
desacetil transferasas.
 Lectores: son aquellos modificadores de histonas que se unen y afectan los
programas epigenéticos en respuesta a determinadas modificaciones
epigenéticas.
Metilación del ADN.
Enzima: metil transferasa de ADN.
En este caso se metila el ADN directamente sobre una región específica del mismo, las
islas CGP. Estas islas son regiones específicas del promotor de un gen, donde abundan
nucleótidos de citocina y guanina. La metilación del ADN de un gen se asocia a la NO
expresión del mismo.
¿Por qué la metilación del ADN impide el inicio de la transcripción? La metilación del
ADN induce la compactación de la cromatina porque favorece la unión de enzimas que
desacetilan histonas (HDACs), impidiendo la unión del complejo de transcripción basal
al ADN.
2- Regulación transcripcional.
Por un lado, para la transcripción vamos a requerir de la presencia de una ARN
polimerasa, que se una a la región promotora de ese gen.
Además, es indispensable la presencia de los factores de trascripción basales. Estos son
proteínas que se van a unir a una región especifica, las secuencias TATA del promotor.
Quienes van a modular la velocidad de la misma van a ser los factores de transcripción
específicos. Estas son proteínas que se van a unir a secuencias regulatorias
(potenciadores/enhancers o silenciadores/silencers). A su vez, van a recibir a las
proteínas correguladoras que se van a unir a los factores de transcripción específicos.
Todo esto se une a la región promotora por medio de una proteína mediadora que
permite la proximidad espacial entre ambas regiones del genoma.
Entre los coactivadores tenemos:
 Complejos remodeladores de la cromatina
 Acetil transferasa de histonas: permite transcripción
Control combinatorio de la transcripción.
En general, no hay una única proteína reguladora que funcione para un gen particular,
sino que cada gen esta regulado por una “combinación” especifica de proteínas
reguladoras.
El control combinatorio permite generar un sistema de regulación complejo y sensible
utilizando un numero relativamente bajo de proteínas regulatorias.
Activación de los factores de transcripción específicos: pueden activarse ante señales
extracelulares (por ejemplo, estrógenos), lo que permite a las células modificar su
expresión genética ante la variación de estímulos del entorno.
Estos factores se asocian a reguladores como potenciadores, reclutan una cascada de
componentes que tornan accesible las secuencias promotoras del gen y secuencias
codificantes a la maquinaria transcripcional, que está constituido por factores de
transcripción basales y el ARN pol2
*importante saber a donde se une cada factor.
 Los factores específicos se unen a secuencias regulatorias, potenciadores o
silenciadores.
 Los factores basales se unen a secuencias promotoras, junto con la ARN
polimerasa. Especialmente a través de reconocimiento de secuencias como la
TATA box.

3- Regulación post transcripcional.

Luego de la transcripción obtenemos un transcripto primario y este tiene que procesarse,
adquirir un capuchón en el extremo 5’, una cola Poli A en el extremo 3’, tiene que
experimentar la remoción de los intrones y el empalme de los exones para obtener,
finalmente, un ARN trascripto maduro. (sin todo esto, no puedo transferirlo al
citoplasma, no se puede traducir y no se obtiene la proteína).
Capping (modificación: extremo 5’)
Se trata de una modificación que se produce al mismo tiempo que la transcripción. A
medida que el ARN mensajero trascripto maduro abandona la horquilla de transcripción,
este queda expuesto a la actividad de enzimas exonucleasas. Entonces, para evitar su
degradación al mismo tiempo que esta siendo transcripto, se incorpora a través de una
reacción enzimática un nucleótido especial en el extremo 5’ llamada 7-metilguanosina y
que actúa como una especie de capuchón. Esto ocurre por acción del complejo de unión
al capuchón (Cap Binding Complex). Es un enlace especial, 5’-5’
Si el extremo está desnudo va a ser degradado y el transcripto primario va a tener una
vida media muy corta, ni siquiera va a llegar a expresarse.
Clivaje y poliadenilación (extremo 3)’
Durante la trascripción, vemos que se produjo el agregado de capuchón en 5’, pero
también vemos que sigue produciéndose una cadena de ARN y esta va a seguir
produciéndose hasta que, en determinado momento, aparezca la secuencia señal de
poliadenilación y clivaje (AAUAA). Esta secuencia va a interactuar con proteínas que
van a estar acopladas a la cola CTD del ARN pol. Estas proteínas son 2 factores
importante como el factor estimulador de clivaje y el factor estimulador de clivaje y
poliadenilación.
Estos factores van a producir un corte que conduce a la liberación del transcripto
primario. La ARN pol sigue unida al gen y sigue transcribiendo un fragmento de ARN.
El segmento clivado con el extremo 3’ expuesto necesita ser modificado químicamente
y, una enzima llamada Poli A polimerasa, va a producir la incorporación de una cola de
entre 150-200 adeninas. La cola poli A posteriormente será reconocida por proteínas de
unión a la cola poli A, que van a producir un plegado de la cola y van a proteger el
extremo de las exonucleasas 3’.
Splicing.
Recordemos que un gen contiene intrones y exones. Durante la transcripción, el
transcripto primario también los contiene.
Para que el trascripto primario pueda obtener su carácter de transcripto secundario
maduro se necesita eliminar los intrones.
 Los genes eucariotas son discontinuos, ya que posee intrones, sectores del ADN
que no son codificantes.
 Para un reconocimiento de los intrones hay secuencias consenso que delimitan a
los intrones.
 Estas secuencias son reconocidas por proteínas y ribonucleoproteinas, más
conocidas como spliceosoma,
 El spliceosoma es el conjunto de proteínas encargadas del corte de intrones y
empalme de exones.
Un ARNm inmaduro contiene intrones y exones. Un ARNm maduro contiene solamente
exones.
Splicing alternativo.
En este caso, en vez de empalmar todos los exones en orden, se los desordena. También
puede ocurrir que se eliminen exones.
Este proceso permite que, a partir de un mismo ARNm inmaduro (transcripto primario)
se obtengan distintos ARNm maduro (transcripto maduro) y, por lo tanto, diferentes
proteínas.
El splicing alternativo permite obtener distintos ARNm maduros, con lo cual puedo
obtener distintas proteínas.
Una vez que se obtiene el ARNm maduro, se trasporta al citosol, este se traduce por los
ribosomas, se obtiene una cadena polipeptídica y, de ahí, pasan más cosas.
Micro ARNs
Es transcripto por la ARN pol 2. Son ARN pequeños de 18-25 nucleótidos. Son
procesados inicialmente en el núcleo por una enzima y después son transportados por
una exportina especifica hacia el citoplasma y allí son nuevamente procesados por otra
enzima llamada dicer.
En el citoplasma, estos micro ARN se acoplan a una maquinaria de regulación de la
expresión génica llamada complejo RISC, complejo de silenciamiento inducido por
ARNs. Este complejo a través del micro ARN y de sus bases nitrogenadas, se acopla a
ARNs mensajeros que tengan secuencias complementarias al micro ARN y, a través de
este acoplamiento, estimulan la degradación de los ARNm reconocidos por el complejo.
Estos son fragmentos de ARN que siempre actúan como reguladores negativos de los
ARNm.
Son producidos por genes específicos que, al ser traducidos, producen un ARN capaz de
salir del núcleo y, por complementariedad de bases, unirse a un ARNm del citoplasma.
Si la complementariedad es completa, el ARNm se degradará. Si es parcial, se evitará la
traducción del mismo.
Puede ser tomado los micro ARNs como parte de la regulación a nivel traduccional
4- regulación traduccional.
Consideramos que a nivel traduccional, se hace referencia a la regulación que se da a
través del reclutamiento de la propia maquinaria traduccional.
Para que se produzca la traducción necesitamos que se recluten las unidades
ribosomales, que se reclute al ARNm maduro, que se recluten a los ARN de
transferencia, etc. Entonces, para que todo esto se acople se necesita de factores de
iniciación, elongación y terminación de la traducción. Y estos factores pueden
experimentar una intervención en su función, incluso se puede dar desde un punto de
vista farmacológico.
Traduccional: factores que intervienen en el reclutamiento de los componentes que
constituyen la maquinaria traduccional.
5- Regulación post traduccional.
Una vez obtenido el polipéptido, tenemos que
 regular el plegamiento de la cadena polipeptídica
 las modificaciones químicas que esta requiere si se trata de una proteína
conjugada
 el acoplamiento de distintas cadenas polipeptídicas si estas pertenecen a una
proteína de estructura cuaternaria
Sistema ubiquitin-proteasoma
Es un mecanismo de reconocimiento complejo, encargado de la degradación especifica
de proteínas.
Van a participar diferentes proteínas, por un lado, la ubiquitina, que va a reconocer a
proteínas específicas. A su vez, esta proteína se va a ligar gracias a la ubiquitin ligasa,
formando la cola de ubiquitinas.
Con gasto de ATP, el proteasoma va a reconocer la cola de ubiquitinas y recicla los
péptidos de la misma para ser nuevamente utilizados.
(la ubiquitina señala el destino de la ubiquitina. El proteasoma es el destino de la
proteína).
CLASE 4: TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR.
Diferentes tipos de técnicas:
 Técnicas in vivo: animales sometidos a condiciones experimentales.
 Técnicas in vitro: cultivos celulares sometidos a condiciones experimentales.
Para realizar las distintas técnicas, primero se debe tomar una muestra.
 Extracción de sangre periférica
 Biopsias.
 Punciones.
Para analizar las muestras, muchas veces se usan microscopios. Principalmente hay 2
tipos:
 Microscopios ópticos.
 Microscopios electrónicos.
Reacción antígeno-anticuerpo. (forman los complejos inmunes)
La unión antígeno-anticuerpo es especifica, cada anticuerpo reconoce y se une a un
determinado antígeno.
En ella participa, en primer lugar, un anticuerpo. Estas son proteínas elaboradas por las
células plasmáticas (tipo de glóbulo blanco) en respuesta a un antígeno.
Anticuerpo: son glucoproteínas. Conocidas como inmunoglobulinas, porque son
glucoproteínas de estructura globular y con funciones inmunitarias. Se encuentran en la
sangre (plasma) y el espacio extracelular. También en las superficies de revestimiento,
tanto interno como externo (mucosa de la cavidad oral, por ejemplo). Nos protegen de
microorganismos y virus a través de la capacidad que tienen de reconocer regiones
específicas de proteínas bacterianas virales o antígenos. Cuando el anticuerpo reconoce
el antígeno, se le une y lo neutraliza. ¡Son muy específicos!
Antígeno: cualquier sustancia que haga que el cuerpo produzca una respuesta
inmunitaria contra ella. Ejemplo: proteínas Spike del virus SARS-CoV-2.
Fabricación de anticuerpos para investigación:
Se toma una proteína que se quiere identificar en una muestra, ejemplo: histona h2a.
 Se inocula un conejo con la histona humana.
 Las celulas inmunitarias del conejo detectan esta proteína como un cuerpo
extraño.
 Se activan linfocitos B a través de reconocimiento de dicha proteína por
receptores antigénicos presentes en la celula.
  Las celulas se activan y experimentan una expansión clonal y forman 2 grupos
de celulas: un grupo que se diferencia a plasmocitos productores de anticuerpos,
y otro grupo que son celulas B de memoria inmunitaria.
El resultado del proceso que queremos es la secreción de anticuerpos anti-histona h2a.
luego de 15 días aproximadamente, se extrae sangre del conejo que contendrá estos
anticuerpos.
Cuando 2 o mas linfocitos reconocen el mismo antígeno, estos se activan y forman 2
poblaciones que van a experimentar expansión clonal y van a producir anticuerpos
contra la misma proteína pero que tendrán la capacidad de reconocer distintas regiones
de esta.
Los anticuerpos monoclonales derivan de un único clon de celula o linfocito, entonces
todos serán idénticos y van a producir el mismo anticuerpo. Todos estos anticuerpos se
van a unir a la misma región antigénica en cuestión.
Inmunofluorescencia / Inmunohistoquímica.
En esta técnica se utilizan anticuerpos para detectar la localización de proteínas
específicas.
La IHQ es una técnica donde se señalan anticuerpos con marcadores específicos o
agregando una enzima al anticuerpo, para luego agregarle un sustrato y que esa reacción
de un producto que se pueda colorear.
La IF es una variedad de la técnica anterior, donde se reconoce una molécula a través de
la reacción antígeno-anticuerpo, pero agregándole fluoroforos para facilitar su
reconocimiento.
Inmunofluorescencia.
 Detección de celulas en una muestra de tejido.
 Detección de proteínas y su distribución subcelular.
 La IF directa es más rápida.
 La IF indirecta es más costosa por consumir mas insumos. Pero es la que mas se
usa por tener resultados mas fiables.
Directa:
Se tiene un anticuerpo primario. Este es un anticuerpo conjugado, o sea que se le asocia
algo extra, en este caso, un fluoróforo. El fluoróforo tiene la capacidad de emitir
fluorescencia cuando es excitado por luz UV, por ejemplo, en la observación de la
muestra con el microscopio de luz UV.
Este anticuerpo primario va a unirse a un antígeno especifico que se quiere identificar.
Luego de incubar la muestra con los anticuerpos conjugados, se somete la muestra a
observación para ver en donde se encuentran los complejos inmunes formados según la
fluorescencia emitida.
Indirecta:
 Requiere de métodos indirectos para detectar el antígeno y su distribución.
Un anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno. Posteriormente, se incorporan
anticuerpos secundarios conjugados con un fluoróforo que se unen a los anticuerpos
primarios.
Inmunohistoquímica.
En este caso, no se conjuga al anticuerpo con un fluoróforo sino con una enzima.
Entonces, se toma este anticuerpo con una enzima y se incuba con una muestra
histológica y, posteriormente, se incorpora un segundo componente que es el sustrato de
dicha enzima. Esta toma el sustrato y hace visible las reacciones antígeno-anticuerpo.
 Detección de celulas y su distribución en una muestra.
 Se puede observar en microscopio óptico.
 Es menos costosa que la inmunofluorescencia.
Fraccionamiento celular.
Es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo tener fracciones puras o
enriquecidas de un determinado componente celular. Se busca poder estudiar la
presencia o función de proteínas en ese compartimiento especifico.
Se empieza por una ruptura mecánica, homogeneizando y obteniendo un homogenato.
Se toma una muestra y se la licua provocando una homogeneidad, rompiendo las celulas
y liberando los componentes subcelulares. Luego, se coloca la muestra en un aparato de
ultracentrífuga para hacer una centrifugación diferencial, produciendo que la fuerza de
gravedad generada por el movimiento genere la sedimentación de los distintos
componentes que se encuentran adentro del homogenato.
Los componentes que se condensan o sedimentan antes son aquellos con mayor peso
molecular (núcleos, mitocondrias, microsomas, ribosomas al final). Forman un
sedimento en el fondo del recipiente llamado pellet, y que, posteriormente, puede ser
recogido y estudiado mediante análisis bioquímico.
Western blot.
Es una técnica que permite detectar la presencia de determinadas proteínas, además de
poder inferir la cantidad de las mismas en función de la comparación con las otras
muestras.
El 1° paso es la corrida electroforética de las proteínas, seguido del bloteo de las
mismas en una superficie sólida (membrana de nitrocelulosa).
Termina con la realización de una técnica similar a la IHQ, donde se agrega un antígeno
primario y secundario para la detección de proteínas específicas.
*Siempre va a haber una electroforesis, una transferencia de los fragmentos y un
método de detección que permita la visualización.
**la electroforesis depende del campo eléctrico, del gel, y del peso molecular, formando
distintas bandas distribuidas a lo largo del gel.
Las bandas tienen proteínas chiquitas. Se transfiere a una membrana y posteriormente se
incuba con anticuerpos para su visualización a través de algún tipo de reacción que
produzca color o la utilización de anticuerpos conjugados con componentes que emiten
radiación y permite la visualización de las bandas en tonos oscuros en una especie de
placa.
En la placa se observan:
 Del lado izquierdo, marcadores de peso molecular, que son proteínas ya
conocidas y su patrón de migración en el gel.
 Arriba, columnas con distintas muestras que se quieren comparar. (biopsias de 4
tumores de mama, por ejemplo)
 Las bandas oscuras indican la presencia de, ejemplo, E-cadherina.
Ahora, ¿Cómo se pueden combinar el western blot y el fraccionamiento celular?
Se usa para buscar una proteína o enzima y para saber en qué compartimiento celular
puede encontrarse.
A través de los distintos pellets, se pueden obtener muestras de distintos
compartimientos celulares y, posteriormente, sembrarlos en distintos canales y
columnas del gel.
 Si las bandas son más pálidas, indican menor concentración.
 Si las bandas son mas oscuras, indican mayor concentración.
PCR punto final.
En esta versión de la PCR, el producto de amplificación se observa a posteriori, una vez
que la reacción de ´PCR ya finalizo. Se utiliza la técnica de electroforesis en gel de
agarosa y una tinción con bromuro de etidio para la visualización de los resultados.
Resultado dice si hay presencia o no.
PCR cuantitativa o qPCR.
En esta variante de la PCR, buscamos una detección en TIEMPO REAL de la técnica.
Se utiliza un agente fluorescente muy sensible, el SYBR green. Esta sustancia tiene una
fluorescencia baja en solución acuosa estando como monómero, pero estando
concentrado como intercalante de base que es, en las bases del ADN producido en la
PCR, aumenta su fluorescencia.
Para esto, las muestras se introducen a una especie de termociclador, pero con un
módulo óptico acoplado, que monitorea cada una de las muestras a lo largo de los ciclos
de amplificación.
RT-qPCR o Retrotranscripcion -PCR
Esta variante de PCR permite amplificar indirectamente moléculas de AR. Para esto es
necesario convertir ARN en ADN utilizando una enzima, una transcriptasa inversa. A las
copias de ADN surgidas de ARN se les llama ADNc.
PCR alelo específico.
Variante utilizada para detectar mutaciones puntuales de sustitución.
Esta técnica implica usar un par de primers en donde el extremo 3’ OH-, en uno de los
casos este posicionado justo en aquel nucleótido que pretendemos explorar y
discriminar si esta presente una variante alélica u otra.
Por lo tanto, al realizar la PCR en una variante alélica, se producirá un mal
apareamiento, siendo este no elongado, mientras que aquel que tenga el primer
apareable con la variante alélica se elongará.
Si se diseña cuidadosamente el primer, podrá hacer que este discrimine entre una
variante alélica y otra. Esta técnica se realiza en simultaneo con otra reacción diseñada
de modo tal que solo amplifica la otra variante alélica que estemos explorando.
Esta segunda PCR mostraría si es que alguno de los alelos se expresa de manera
homocigota o heterocigota.
Enzimas de restricción.
Son endonucleasas que cortan el ADN en secuencias específicas.
Los dos fragmentos restantes pueden tener extremos romos o con segmentos de ADN
monocatenarios. Estos extremos monocatenarios pueden volver a unirse por
complementariedad de bases, por lo que también se los llama “bordes pegajosos”
por medio de una ligasa, se pueden unir por complementariedad de bases 2 moléculas
de ADN de distinto origen, cortadas por una enzima de restricción. De esta forma
podemos obtener una molécula de ADN híbrida.
Vectores de expresión.
Se le dice vector a algo que transporta alguna cosa.
Un elemento de ADN de interés puede insertarse, cercano a una secuencia promotora,
en un elemento de ADN con capacidad de autorreplicarse (vector) formando una
molécula de ADN híbrida. Esto permite, entre otras cosas, identificar la funcionalidad
de mutaciones.
¿Cómo se replican? La molécula hibridada se introduce dentro de una bacteria. La
proliferación de la bacteria a la vez permite obtener millones de copias de moléculas del
ADN recombinante. De esta forma, amplificamos in vivo el ADN hibrido,
permitiéndonos observar el funcionamiento fisiológico de estas moléculas.
Posibles modificaciones del genoma.
La alteración de la secuencia de ADN de un gen especifico, puede ocasionar que su
producto (ARAN y/o proteína) no presente cambios funcionales o, por el contrario,
puede ocasionar una ganancia o pérdida de función de su producto.
Hay 3 variaciones principales:
 Gen knock-out: se elimina del genoma el gen especifico, provocando una
perdida total de su función.
 Gen knock-in: se agrega un gen al genoma, provocando la expresión del mismo.
  Gen knock-down: no se elimina el gen, sino que se reduce la expresión del
mismo.
Metodologías para entender las funciones de los genes.
*un método es producir su inhibición incorporando micro ARNs con secuencias
complementarias a los transcriptos de interés y que, por medio de estos micro ARNs y
del complejo RISC, se produzca la inhibición de la traducción.
Modificación del genoma in vivo: Crispr-Cas9
Técnica cuyo fundamento proviene de un sistema inmune detectado en bacterias.
Se usa una endonucleasa llamada Cas9, que posee la propiedad de reconocer ciertos
segmentos del genoma y producir sitios de clivaje o rupturas de doble hebra donde,
posteriormente, se estimula la acción de los mecanismos de recombinacion de roturas de
doble hebra que pueden ser mecanismos de reparación de unión de los extremos rotos o
de recombinacion homologa.
Esta técnica produce estos daños en el ADN y que, posteriormente van a ser reparados.
Esta técnica utiliza un segmento de ARN guía que dirige a Crisper-Cas9 a sitios
específicos del genoma donde se quiere producir la eliminación de variantes génicas
mutadas, por ejemplo. Y por mecanismos de reparación por recombinacion homologa,
se pueda producir la reparación del daño con la incorporación de una secuencia génica
sana.
Se usa en la terapia génica, que se basa en la eliminación y reemplazo de genes
mutados.
Palabras claves
 Terapia génica, recombinacion homologa, edición génica.
 Técnica que daña el ADN en sitios específicos
CLASE 5: DISTRIBUCION DE MACROMOLECULAS.
Sistema de endomembranas: carioteca, RER, REL, Golgi, vesículas, endosomas y
lisosomas.
No pertenecen las mitocondrias y peroxisomas.
Complejo sistema membranoso formado por:
 Vesículas
 Cisternas (sacos aplanados)
 Túbulos.
Con interconexión funcional.
Determinante de 2 compartimientos:
 Intramembranosos
 Citosólico.
CLASE 9: MIGRACION CELULAR, CELULA TUMORAL Y MUERTE CELULAR.
Migración celular:
 Citoesqueleto
 Membrana plasmática
 Uniones celulares
Estos se encuentran involucrados en esta migración.
¿Cuáles son los determinantes de la migración celular? La membrana, las moléculas de
adhesión celular presentes en la membrana, la interacción de estas con el citoesqueleto.
Del citoesqueleto, principalmente, los filamentos de actina.
Los filamentos de actina se podían dividir en 2 grupos
 Transcelulares: que formaban una maya o red tridimensional.
 Corticales: forman haces paralelos que se encuentran por debajo de la membrana
plasmática formando un córtex.
También hay distintos ordenamientos de los filamentos de actina que forman haces
estrechos, fibras de estrés que participan en la formación de adhesiones o contactos
focales, redes dendríticas, etc. Estos van a tener distintas funciones y van a estar
organizados por diferentes proteínas relacionadas con los filamentos de actina.
¿Qué molécula es de relevancia a nivel de los contactos focales? Las integrinas, que van
a participar de la interacción de las fibras de estrés que son filamentos con la capacidad
de generar tracción.
¿Cómo migra la celula en general?
La celula establece adhesiones focales que van a permitir que esta genere puntos de
tracción inicial. Luego de generadas las primeras adhesiones focales, la celula va a
seguir emitiendo prolongaciones que van a buscar la formación de nuevos contactos
focales ¿Qué tipo de prolongaciones? Prolongaciones laminares o filosas, que son
lamelipodios o filopodios. Estas prolongaciones, cuando logran contactar con otros
sitios y establecer nuevos contactos focales, producen señalizaciones intracelulares que
reorganizan el citoesqueleto y que promueven la liberación de las adhesiones focales
que se encontraban en un principio.
*La migración es un desplazamiento celular. La celula se desplaza de un punto a otro,
tomando fijación en una región y extendiéndose en un sentido determinado por: la
generación de nuevas adhesiones focales o por la generación de estímulos mediados por
gradientes extracelulares de quimioatractantes, como quimioquinas.
Quimiotaxis: migración celular dirigida.
Aptotaxis: migración dirigida por moléculas insolubles en la matriz extracelular.
Cuando se hablan de ciertos receptores, se hablan de receptores acoplados a la proteína
G. es un receptor que va a participar en la migración celular. Los receptores pueden
enviar señales proliferativas, señales de muerte celular, señales migratorias, etc.
Un receptor puede desencadenar cascadas de señalización que pueden modificar la
capacidad migratoria de la celula. Por ejemplo, a través de ciertas proteínas como Rho y
Rac, que pueden mediar modificaciones citoesqueléticas que, posteriormente, van a
modificar la morfología de la celula y facilitar el proceso de migración.
La activación de los receptores que participan en la quimiotaxis permite que se
produzca una cascada de señalizaciones que activa ciertas proteínas, como la Rac y
Rho. Estas son proteínas que están reguladas por su asociación a nucleótidos de guanina
(GTP-GDP). Las proteínas Rac van a participar de fenómenos de polimerización de
filamentos de actina, que son importantes para la formación de prolongaciones en el
sentido migratorio. En sentido opuesto participan otros tipos de proteínas, como la Rho,
que participa de la regulación de la actividad contráctil de los filamentos de actina en
conjunto con la miosina.
Estos fenómenos mediados por estas proteínas se producen en polos opuestos de una
celula en migración. Por eso, cuando se analiza una celula que esta en proceso de
migración, se puede identificar 2 regiones notables, con distinta morfología que son:
 Frente de avance o polo anterior
 Frente de retracción o polo posterior
Este fenómeno se produce por acción de la señalización y por la acción de
modificaciones citoesqueléticas que involucran los microfilamentos y los microtúbulos,
dado que el fenómeno de señalización que se produce por las quimioatractantes no solo
producen la alteración de la actividad de polimerización o despolimerización o de
contracción de los microfilamentos, sino que también produce el desplazamiento del
centrosoma haciendo que este se oriente en sentido del polo anterior y produciendo una
serie de microtúbulos que van a respaldar o impulsionar la masa citoplasmática hacia el
polo anterior y, posteriormente, por debajo de la membrana los filamentos de actina, a
través de la polimerización, experimentan los desplazamientos de membrana que dan
origen a lamelipodios y filopodios, los cuales van a buscar los contactos focales a nivel
matricial.
No solamente los microfilamentos de actina participan de la migración. También hay
una reorganización microtubular que permite que se produzca el desplazamiento de la
masa citoplasmática en el sentido de frente de avance, que se estabilice y,
posteriormente, las prolongaciones menores (lamelipodios y filopodios) van a formarse
a expensas de movimientos de los filamentos de actina.
En resumen, la celula recibió un estímulo. Este estimulo actuó sobre un receptor
desencadenando una cascada de señalizaciones en la cual intervinieron algunas
proteínas asociadas a microtúbulos y algunas asociadas a microfilamentos. Los
microtúbulos experimentaron desplazamiento dado que el centrosoma se desplazo en el
sentido del frente de avance. Del centrosoma irradian microtúbulos que permitieron el
desplazamiento y la generación del frente de avance.
Por debajo de la membrana plasmática que se encuentra en la superficie del frente de
avance, tenemos una maya de componentes de filamentos de actina, los cuales tienen
capacidad de movilizarse constantemente y dando origen a pequeñas prolongaciones
como lamelipodios y filopodios, los cuales van a estar buscando nuevos sitios de
adhesión. A medida que estos sitios se producen, se produce una retracción del polo
posterior como consecuencia de fenómenos de contracción mediados por
microfilamentos de actina en asociación con la miosina (miosina tipo 2).
Contacto focal: punto de adhesión entre la membrana celular y su citoesqueleto, y la
matriz extracelular. Intervienen proteínas de la familia de las integrinas,
microfilamentos de actina y componentes extracelulares. Los componentes
citoesqueléticos que participan son los microfilamentos de actina. Estos están unidos a
la integrina a través de una interacción complejas de moléculas (involucra vinculina,
talina, etc). Desde el punto de vista extracelular, la integrina va a mediar la interacción
de la membrana con componentes extracelulares, como el colágeno extracelular, pero no
de manera directa sino por medio de proteínas intermediarias como, la fibronectina.
El frente de avance posee una superficie mayor que el frente de retracción. Esto implica
que nuevos fosfolípidos tengan que ser incorporados constantemente en el frente de
avance.
En el frente de retracción, lo que se quiere es retraerlo. Por eso se eliminan
constantemente los componentes a través de la contracción del citoplasma e ir
eliminando las porciones de membrana que se encuentran en esta región.
Dado que se requiere este fenómeno dinámico de membrana, se produce endocitosis y
exocitosis en paralelo a la migración.
Palabras claves:
 Endocitosis: frente de retracción
 Exocitosis: frente de avance
 Componentes citoesqueléticos que participan: microfilamentos, microtúbulos.
 Tipos de migración: quimiotaxis y aptotaxis
 Contacto focal.
Biología de la celula tumoral.
Neoplasia: formación que se produce por una alteración en la capacidad de control de la
proliferación celular, donde se evidencia un aumento de esta proliferación y una masa
de celulas donde no debería estar (tumor)
El tumor es una masa anormal que, según su patrón de organización, puede ser benigno
o maligno. Cuando es maligna, ahí si es un cáncer.
Cuando una celula pierde su capacidad de controlar su % celular por la sumatoria de
mutaciones que haya experimentado que hayan afectado genes de relevancia y del
control del ciclo celular. Entonces, esta celula comienza a proliferar desmesuradamente.
Forma un grupo de celulas en el mismo sitio, pero, a medida que prolifera y origina una
población de clones de la celula inicial, van a comenzar mutaciones adicionales en estos
clones y, en un momento, se formaran subclones que sigue proliferando y así,
sucesivamente.
Los subclones comienzan a no respetar las características del fenotipo epitelial y
comienzan a amontonarse. Posteriormente, celulas con fenotipo más invasivo empiezan
a promover la invasión de los tejidos adyacentes. Luego comienza la diseminación por
vía hemática o linfática (metástasis)
 Proliferación.
 Sobrecrecimiento.
 Invasión y metástasis.
Tumor benigno: crece hacia la luz. Si bien no posee la capacidad de invadir tejidos
adyacentes, si puede ser que traiga complicaciones. Incluso, puede convertirse en un
tumor maligno, generando el cáncer. (finalizan en “oma”)
Carcinogénesis.
Cáncer: formación tumoral maligna que tiene la capacidad de invadir. (finalizan en
“carcinoma” de origen epitelial, “sarcoma” de origen conectivo)
Fenómenos necesarios para la promoción de la formación tumoral.
Multifactorial: son muchos los factores que generan un cáncer (biológicos, físicos,
químicos)
Las celulas tumorales se caracterizan por:
 Capacidad aumentada de producir o responder señales mitógenas.
 Inmortalidad replicativa: la celula cancerígena se considera inmortal porque
tiene aumentada la expresión de enzimas telomerasas. El acortamiento
telomérico no es impedimento y la celula puede proliferar constantemente.
 Incapaz de responder estímulos que llevan a la muerte celular.
 Evade la respuesta inmunitaria antitumoral
 Promueve un entorno proinflamatorio por medio de secreciones de distintos
componentes que favorecen modificaciones en la celula y su entorno como:
modificaciones metabólicas (para favorecer la producción de energía y
sobrevida de la celula tumoral) y la llegada de nutrientes por estimular, por
ejemplo, la angiogénesis.
 Inestabilidad del genoma: permite que subclones adquieran nuevos fenotipos
que vayan teniendo la capacidad de invadir y realizar metástasis.
Protooncogenes.
Es un gen sano que codifica para una proteína que estimula o favorece la proliferación
celular.
Puede codificar para
 un factor de crecimiento,
 un receptor de factor de crecimiento,
 una proteína que interviene en la cascada de señalizaciones mediada por un
factor y su receptor, cuando ambos se tratan de factores de crecimiento
Ras, quinasas (Raf, MEK, ERK), factores de transcripción (fos), EGF, ErbB
*cuando los protooncogenes pierden la capacidad normal que tienen y se alteran,
promoviendo un desarrollo tumoral, pasan a llamarse oncogenes.
Genes supresores de tumores.
Son genes que producen productos que intervienen en la regulación de la proliferación,
pero en sentido negativo.
Proteína Rb: codificada por un gen supresor de tumores, Se expresa en fase G1 y
secuestra e inhibe un factor de transcripción especifico que favorece la expresión de
ciclinas E, que son necesarias para inicia la fase S. Por medio de una cascada de
señalización que ocasiona la fosforilación de la proteína Rb, esta pierde la afinidad por
el factor de transcripción E2F y este se une a secuencias de ADN específicas,
promoviendo la transcripción de la ciclina E.
P53: guardián del genoma por excelencia. Se trata de una proteína que se expresa
constitutivamente pero que se degrada también constantemente dado que tiene una baja
estabilidad. Constantemente se poliubiquitina la p53 y se la degrada en el proteasoma.
Pero, cuando se produce una mutación en el ADN (proteínas de vigilancia del genoma),
produce una cascada de activación enzimática que activa la quinasa ATM y CHK2.
Estas fosforilan a la p53, aumentando su estabilidad (y puede realizar la función que
presenta) y dejando de ser degradada.
La p53 es un factor de transcripción especifico que se une a secuencias específicas del
genoma, potenciadores de ciertos genes, promoviendo la expresión de genes. Por
ejemplo, la proteína p21 que inhibe la proliferación celular al inhibir el complejo
CDK2-ciclina E, produciendo un arresto de ciclo en G1.
También promueve, indirectamente, la expresión de proteínas proapoptoticas que van a
favorecer la apoptosis.
Aspectos moleculares.
 Mutaciones.
Para protooncogenes: ganancia funcional. Si la mutación es mono alélico, es suficiente
para producir un desarrollo tumoral.
Para genes supresores de tumores: perdida funcional. La mutación debe ser bialélico.
 Modificaciones epigenéticas que contribuyen al desarrollo tumoral.
Metilación de histonas: favorece la compactación de la cromatina y esto favorece, a su
vez, al silenciado transcripcional.
Para genes supresores de tumores: los promotores van a estar hipermetilados
Para protooncogenes: los promotores van a estar hipometilados.
 microARNs.
Puede favorecer el desarrollo tumoral actuando, por ejemplo, sobre ARNm transcriptos
con base en genes supresores de tumores.
Ejemplo: si se inhibe la p53 por medio de microARN, se favorece el desarrollo tumoral.
Alteraciones del ciclo celular.
Pueden darse por:
 incremento en la cantidad de receptores de factor de crecimiento
 incremento en la expresión de ligando del factor de crecimiento propiamente
dicho.
 Incremento y actividad de proteínas que intervienen en la cascada de
señalización mediada por mitógenos.
También se pierden mecanismos inhibitorios de la proliferación. En condiciones
normales, la celula experimenta inhibición por contacto (cuando forman una monocapa,
esta inhibición deja a las celulas en un estado de quiescencia). Las celulas tumorales
pierden estos mecanismos inhibitorios, provocando que esta proliferación genere masas
celulares o tumores.
 Evolución tumoral.
La evolución tumoral es gradual. En relación al crecimiento tumoral, hay cambios a
medida que crece y se desarrolla, incluso antes de que comience a invadir.
El tumor tendrá que evolucionar, de cierta manera, desde el punto de vista metabólico,
porque si las celulas proliferan aceleradamente, estas están demandando gran cantidad
de sustratos energéticos. Esto significa que, se necesita un aumento de la
vascularización porque el tumor crece con el paso del tiempo.
Una adaptación de la masa tumoral es una metabólica. Por ejemplo, las celulas
cancerígenas modifican su metabolismo de tal manera de que no dependan en gran
cantidad de oxígeno. Entonces, al verse con nutrientes limitados en el entorno,
modifican su expresión génica para que se produzcan enzimas que puedan metabolizar
de una manera anaerobia. Estas celulas cambian su metabolismo par adaptarse a una
llegada menor de oxígeno y, aun así, mantener la producción de energía para seguir
produciendo el crecimiento de la masa tumoral.
A medida que la celula experimenta estos cambios adaptativos, pone en marcha vías de
señalización que estimulen la angiogénesis. Estos fenómenos de modificaciones
metabólicas son consecuencia de la hipoxia.
Las celulas que se encuentran en el centro del tumor son las que reciben menos oxigeno
y nutrientes, por lo que experimentan hipoxia (baja concentración de oxígeno). Esto
activa factores de transcripción, como HIF1, que produce la expresión de ciertos genes,
entre ellos, genes que codifican para factores de crecimiento vascular endotelial (VEGF)
estimulando a que los vasos sanguíneos que estén alrededor del tumor comiencen a dar
ramificaciones vasculares (angiogénesis) que favorecerán la irrigación de la masa
tumoral.
 Adquisición del fenotipo invasivo.
Cuando ya tenemos un tumor que se vascularizó y creció, va a experimentar con el
tiempo modificaciones fenotípicas que confieren a subclones un fenotipo invasivo.
Transición epitelio-mesenquimática: se produce como resultado de una combinatoria de
factores, por ejemplo:
 Mutaciones adicionales que experimentan algunas subpoblaciones celulares.
 Estímulos que reciben estas celulas del microambiente y modifican su patrón de
expresión génica, ocasionando la perdida de las características fenotípicas
epiteliales y la adquisición de características fenotípicas mesenquimáticas, que
son celulas con capacidad migratoria importante.
 Se pierden las E-cadherinas, las zónulas ocludens, adherens, hemidesmosomas,
desmosomas, polaridad de la celula epitelial.
 Se producen metaloproteinasas (MMPs) de la matriz que van a degradar la
membrana basal, permitiendo que la celula se convierta en una celula
mesenquimática y se introduzca en el TC subyacente o adyacente
 La celula puede invadir TC y, cuando lo hace, puede tomar contacto con
componentes vasculares, linfáticos o hemáticos, y producir metástasis.
Cuando las celulas llegan a la circulación, terminan en distintos sitios.
 Tropismo metastásico.
Afinidad de ciertos tumores por ciertos sitios. ¿Por qué se da esto?
Los órganos tienen expresiones moleculares específicas que son características de cada
uno. Según la capacidad de las celulas tumorales que hicieron metástasis de responder a
uno u otro estimulo, estas terminan ubicándose en sitios específicos o con una cierta
afinidad. Van a tener una mayor afinidad por sitios específicos que expresan las
moléculas que logren interactuar con los receptores de la celula tumoral.
La irrigación también tiene que ver. (hipoxia y angiogénesis).
Por más que allá un tropismo y, hoy en día se conozca en que lugares puede ocurrir la
metástasis de un cáncer, las celulas pueden terminar en cualquier región.