LINFOCITOS B
ONTOGENIA
Los linfocitos B y T se originan en la médula ósea a partir de un precursor común denominado stem cell o
célula madre pluripotente hematopoyética (CMPH). Estas células pueden autorrenovarse y, como su
nombre lo indica, pueden dar lugar a distintos tipos celulares. En el hombre, las CMPH aparecen en el
saco vitelino embrionario alrededor de la tercera semana de vida y, a medida que el feto se desarrolla,
algunas de ellas migran al hígado. Recién al cuarto mes de
vida fetal, la hematopoyesis comenzará a transcurrir en la
médula ósea, lugar que concentrará toda la actividad
hematopoyética al momento del nacimiento.
La mayoría de las CMPH se hallan cerca del endostio. Las
células del endostio y las células estromales de la
perivasculatura secretan números factores importantes para
la supervivencia, retención y proliferación de las CMPH,
entre los que cabe mencionar a CXCL12 o SDF-1 (stromal
cell derived factor-l). A partir de las CMPH se generan
distintos progenitores con un potencial pluripotente
denominados progenitor mieloide y progenitor linfoide común
(PLC), a partir del cual se generarán los linfocitos B y T.
Los LB generados son vírgenes y tienen especificidad aleatoria. Se distribuyen a los órganos linfoides
secundarios, donde se pueden encontrar con el Ag para el que son específicos y así proliferar y
diferenciarse a células plasmocitoides y células de memoria. Los LB que generaron receptores que
reconocen Ag propios son eliminados durante la ontogenia.
Progenitor común LB virgen encuentro con Ag proliferación y diferenciación Cel plasmocitoide
Cel de memoria
Ciclo de vida de un LB2
El desarrollo de las células B ocurre en la médula ósea y depende de la presencia de las células
estromales. Estas células no sólo actúan como una red de sostén necesaria para que los linfocitos B
continúen su desarrollo, sino que sintetizan actores de crecimiento que cumplen un papel crítico, al
estimular la diferenciación y proliferación.
La célula progenitora pluripotencial se une estrechamente a las células estromales mediante receptores
que unen ligandos de estas células. Las células estromales producen CXCL12 (SDF-1), una quimiocina
que es importante para el anclaje de la CMPH. También producen IL7, la cual hace que la CMPH se
diferencie a un progenitor linfoide común. Luego este se diferencia a células proB tempranas y tardías y a
célula pre-B. Las células pre-B incrementan receptores para IL7, expresan receptores para su Ag (pre-
BCR) y comienzan a desprenderse del estroma para que el LB inmaduro (que expresa BCR) pueda ir a
circulación. Este se dirige al bazo, donde se convierte en LB maduro.
LB Ontogenia - 1
GENERACIÓN DE LA DIVERSIDAD
Previo contacto con el antígeno extraño: RECOMBINACIÓN SOMÁTICA
- Existencia de varios segmentos V-D-J para las cadenas H, y V-J para las cadenas L (región variable)
- Unión combinatoria de los segmentos VDJ
- Unión imprecisa de segmentos
- Adición de nuceótidos (P y N)
- Asociación de cadenas H con L
Después del contacto con el antígeno extraño: HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA
Loci génicos de las Ig
Tres loci separados codifican, respectivamente, todas las cadenas pesadas de Ig, la cadena ligera k de Ig
y la cadena ligera de Ig. Cada locus está en un cromosoma diferente.
Localizado en sentido 5' hay un exón que codifica el péptido líder (o señal). Las secuencias señal se
encuentran en todas las proteínas transmembranarias y secretadas recién sintetizadas, y participan en la
guía de los polipéptidos nacientes que están siendo traducidos en los ribosomas unidos a la membrana
hacia la luz del retículo endoplásmico. Aquí, las secuencias señal son rápidamente escindidas y no están
presentes en las proteínas maduras.
En el extremo 5' de cada locus de Ig también hay un grupo genes V (variable). El número de genes V
varía considerablemente entre los diferentes loci de Ig. A distancias variables en sentido 3' de los genes V
hay varios segmentos J que están muy estrechamente ligados a exones de la región constante C. Los
segmentos J suelen estar separados por secuencias no codificadoras. Entre los segmentos V y J en el
locus IgH hay segmentos adicionales conocidos como segmentos D (diversity, diversidad). En los loci de
la cadena ligera de Ig no se encuentran segmentos D. Como en los genes V, el número de genes J y D
varía en diferentes loci de Ig y en diferentes especies.
En una cadena ligera de Ig (k o X), el dominio V está codificado por los segmentos génicos V y J; en la
cadena pesada de Ig, el dominio V está codificado por los segmentos génicos V, D y J.
Locus cadena
Locus cadena liviana k Locus cadena pesada H
liviana
N° de genes V 30 40 65
Cadena
N° de genes D 0 0 27
liviana
N° de genes J 4 5 6
9 codifican las regiones C
Cadena
N° de genes C 4 1 de nueve isotipos y
cte
subtipos diferentes de Ig
Esta configuración está en la línea germinal y en todas las células de nuestro organismo. Estos genes no
pueden transcribirse en ARNm que codifiquen receptores para el antígeno funcionales. Los genes del
receptor funcional para el antígeno se crean solo después del reordenamiento del ADN que pone en
continuidad segmentos génicos V, (D) y J escogidos. Esto ocurre durante la ontogenia en la médula ósea.
LB Ontogenia - 2
Recombinación somática
El proceso de recombinación V(D)J en cualquier locus de Ig implica la selección de un gen V, un
segmento J y un segmento D (cuando está presente)
en cada linfocito, y el reordenamiento de estos
segmentos génicos para formar un solo exón V(D)J
que codificará la región variable de un receptor para el
antígeno.
En los loci de cadena ligera de Ig que carece de
segmentos D, un solo reordenamiento une un gen V
seleccionado de forma aleatoria con un segmento J
seleccionado igualmente de forma aleatoria. Los loci
IgH contienen segmentos D y en estos loci deben
iniciarse por separado dos reordenamientos distintos,
primero uniendo un segmento D a uno J y después un
segmento V al segmento DJ fusionado.
SSR
Las proteínas específicas del linfocito que median la recombinación V(D)J reconocen ciertas secuencias
del ADN, llamadas secuencias señal de la recombinación (RSS), localizadas en sentido 3' a cada
segmento génico V, en sentido 5' a cada segmento J
y flanqueando a cada segmento D por ambos lados.
Las RSS consisten en secuencias muy conservadas
de siete nucleótidos, llamadas heptámero,
habitualmente CACAGTG, localizadas en la
secuencia codificadora, seguidas de un espaciador
de exactamente 12 o 23 nucleótidos no
conservados, al que sigue una secuencia rica en AT
muy conservada de nueve nucleótidos, llamada
nonámero.
Mecanismo de recombinación
Reordenamiento por eliminación: es el reordenamiento que ocurre con más frecuencia.
Durante la recombinación V(D)J, recombinasas RAG1 y RAG2 reconocen al azar SSR y producen una
alineación de lo que se va a unir. Generan roturas de la doble cadena entre el heptámero de la RSS y la
secuencia codificadora adyacente V, D o J. El ADN intermedio de doble cadena, que contiene extremos
señal (los extremos que contienen el heptámero y el resto del RSS), se elimina en forma de círculo y los
extremos codificadores de V y J se unen.
La recombinación se produce entre dos segmentos solo si
uno de ellos está flanqueado por un espaciador de 12
nucleótidos y el otro por un espaciador de 23 nucleótidos; a
esta se la llama la regla de 12/23.
El tipo de RSS en el flanco asegura que se recombinen los
segmentos génicos apropiados. Por ejemplo, en el locus de
la cadena pesada de la Ig, los RSS que flanquean a los
segmentos V y J tienen espaciadores de 23 nucleótidos y,
por tanto, no pueden unirse directamente; la recombinación D
a J se produce primero, seguida de la recombinación V a DJ,
y esto es posible porque los segmentos D están flanqueados
en ambos lados por espaciadores de 12 nucleótidos, lo que
permite la unión D-J y después la unión V-DJ.
LB Ontogenia - 3
Recombinación en cadenas livianas:
1. Sinapsis: RAG1/2 y las proteínas HGM se unen a la RSS y catalizan la sinapsis entre un segmento
de gen V y uno J, es decir, estas porciones del cromosoma se hacen accesibles a la maquinaria de
recombinación y forman asa cromosómica (loop).
2. RAG1/2 hace una muesca monocatenaria en el borde 5’ en la unión entre el RSS heptámero que
limita con V y el RSS heptámero que limita con J.
3. El OH 3' liberado del extremo codificador ataca un enlace fosfodiéster en la otra cadena de ADN,
formando un extremo codificador horquilla covalente sellado. El extremo de la RSS queda romo.
4. Se ligan los extremo señal y se pierde como ADN circular.
5. Artemisa es una endonucleasa que abre las horquillas codificadoras en los extremos codificadores.
Se pueden generar aberturas saliente 5’, con extremos romos o saliente en 3’.
6. Esta abertura genera sitios para la adición de nucleótidos P. Esto es llevado a cabo por enzimas de
reparación de ADN.
7. Los segmentos V y J se ligan gracias a la DNA ligasa IV.
Recombinación de cadenas pesadas:
Ocurre primero la recombinación entre D y J, y luego entre V y DJ.
Los pasos son similares a los expuestos para las cadenas livianas,
con la diferencia de que hay una enzima llamada TdT que incorpora
nucleótidos N (3-20) luego de que se incorporaron los nucleótidos
P. Esto aumenta la diversidad y solo ocurre en las cadenas
pesadas.
Reordenamiento por inversión: no se elimina el ADN intermedio,
ocurre con menos frecuencia.
Diversidad en los LB
La diversidad del repertorio de linfocitos B se crea mediante:
- Diversidad combinatoria: el reordenamiento V(D)J acerca múltiples segmentos génicos en línea
germinal que pueden combinarse de forma aleatoria, y diferentes combinaciones producen diferentes
LB Ontogenia - 4
receptores para el antígeno. Después de la síntesis de las proteínas del
receptor para el antígeno, la diversidad combinatoria aumenta aún más
porque cualquier cadena H se puede unir a cualquier cadena liviana (VH y VL
en moléculas de Ig).
- Diversidad en la unión: la mayor contribución a la diversidad de receptores
para el antígeno la realiza la eliminación o adición de nucleótidos en las
uniones de los segmentos en el momento en que estos segmentos se unen
(nucleótidos P y N).
- Mutación somática
Debido a la diversidad en la unión, la zona de hipervariabilidad CDR3 es la que más
variabilidad presenta en comparación con CDR1 y CDR2. CDR1 y 2 está ubicados
en la región de V, mientras que CDR3 se ubica en la unión VJ de la cadena L y VDJ en la cadena H.
Además, CDR3 de la cadena H es aún más variable que el CDR3 de la cadena L ya que en la cadena H
se agregan además de los nucleótidos P, los nucleótidos N.
Exclusión alélica
Es un proceso que asegura que cada linfocito B exprese un solo receptor, lo que mantiene la
especificidad clonal.
En la célula pro-B temprana, la asociación DJ se produce en ambos cromosomas. Esto es así porque se
quiere tener muchas chances de que los LB expresen la cadena pesada. Si este proceso es exitoso, la
unión del fragmento V al DJ se intentará primeramente en un cromosoma y, en caso de no ser exitoso, se
intentará reordenar el segundo cromosoma. La ausencia de reordenamientos exitosos de la cadena H
conduce a la apoptosis del linfocito B.
El reordenamiento productivo de la porción V permite la expresión en la membrana de una cadena
pesada μ (es la primera que se reordena) asociada con una cadena liviana sustituta formada por 5
(sería constante liviana) y VpreB (sería como la cadena variable liviana). Los complejos formados por u, el
sustituto de las cadenas ligeras y las proteínas transductoras de señal llamadas Igɑ e Ig, forman el
prerreceptor para el antígeno de la línea B, conocido como receptor del prelinfocito B (pre-BCR).
El receptor pre-BCR estimula:
Inhibición de recombinación de cadena H (exclusión alélica)
Proliferación de prelinfocitos B.
Estimulación para recombinación de cadena ligera k.
Desactivación de transcripción de sustituto de cadena ligera
Los reordenamientos de la porción variable de la cadena L también están gobernados por el fenómeno de
exclusión alélica. La recombinasa primeramente intentará un reordenamiento productivo de la cadena Lk
en uno de los cromosomas y, en el caso de que no lo consiga, intentará reordenar esa misma cadena en
el alelo presente en el otro cromosoma. Si estos intentos fracasan, comenzarán los reordenamientos de la
cadena L, primero en un cromosoma y luego en el otro. Normalmente, un 65% de los linfocitos B logran
un reordenamiento exitoso de la cadena Lk, mientras que el restante 35% presenta reordenamientos
productivos de la cadena L. No existen linfocitos con reordenamientos no productivos de la cadena L, ya
que estos no son viables y mueren por apoptosis.
LB Ontogenia - 5
RESUMEN
En el linfocito pro-B es cuando se empiezan a expresar RAG1 y RAG2 y la enzima TdT. Aca es cuando
ocurre el reordenamiento de los genes de la cadena pesada. La cadena pesada μ es la primera que se
reordena y por eso los LB vírgenes tienen a IgG como BCR. Cuando este reordenamiento termina, la
cadena pesada se expresa en la membrana con una cadena liviana sustituta ya que los genes de las
cadenas livianas aún no se han reordenado. Los complejos formados por u, el sustituto de las cadenas
ligeras y las proteínas transductoras de señal llamadas Igɑ e Ig, forman el prerreceptor para el antígeno
de la línea B, conocido como receptor del prelinfocito B (pre-BCR). En este punto se avanza hacia pre-B.
Luego el linfocito preB prolifera. Se expresa de nuevo RAG1 y 2 pero NO se expresa TdT. Se reordenan
las cadenas livianas. Primero se reordena k y después (por eso la mayoría de los LB tienen a k por
cadena liviana). Ahora el LB tiene un
BCR completo y alcanza el estado de LB
inmaduro. El BCR está formado por la
molécula IgM y el heterodímero Igɑ e Ig.
En el estadio B inmaduro las células son
evaluadas en función de su capacidad de
reconocer antígenos presentes en el
ambiente medular, proceso conocido
como inducción de tolerancia central B.
Los LB inmaduros que no reconocen Ag
propios van al bazo para terminar de
madurar. Luego se generan LB
transicionales de tipo 1 y 2. Los LB
maduros van a los órganos linfáticos
secundarios en un proceso denominado
tráfico linfocitario. El BCR de un LB
maduro tiene IgG e IgD como BCRs.
PUNTOS DE CONTROL DE LA ONTOGENIA
Expresión de pre-BCR y BCR
La expresión del pre-BCR es el primer punto de control en la maduración del linfocito B. Si los dos alelos
sufren reordenamientos génicos de Ig H no productivos, la célula en desarrollo no puede producir
cadenas pesadas de Ig, no puede generar una señal de supervivencia dependiente del pre-BCR, y con
ello sufre una muerte celular programada.
LB Ontogenia - 6
El segundo punto de verificación es la expresión del BCR. Como en las cadenas pesadas, si ninguno de
los dos alelos de las dos cadenas k y es funcional en un linfocito B en desarrollo, ese linfocito no recibe
las señales de supervivencia que genera normalmente el BCR y muere.
Tolerancia central
Los linfocitos B inmaduros que no recitan ninguna señal en la médula ósea a través de sus BCR emigran
para continuar su desarrollo. La ausencia de señales a través del BCR del linfocito B inmaduro induce la
disminución de las proteínas RAG y el cese de los reordenamientos. Las proteínas RAG continúan
disminuyendo hasta desaparecer en el momento que el linfocito alcanza el estadio B maduro en el bazo.
Los linfocitos B inmaduros cuyos BCR reciben señales en el entorno medular son LB que reconocen Ag
propios. Pueden recibir señales fuertes a través de su BCR si reconocen moléculas unidas a las células
(ej mCMH) o señales débiles di reconocen Ag propios solubles. A este linfocito se le puede:
Modificar las porciones VH a través de un proceso que se denomina "reemplazo del fragmento VH"
Variar la cadena L por un mecanismo llamado "edición del BCR".
Si tras intentar modificar la especificidad de la inmunoglobulina, el linfocito B inmaduro continúa
recibiendo señales a través de su BCR, se inducirá:
Anergia clonal, cuando la señal es de baja intensidad. El leve entrecruzamiento de su receptor
conduce a su inactivación y a un estado permanente de no respuesta. Estos linfocitos
autorreactivos, si bien salen de la médula ósea, no podrán activarse en la periferia y morirán
relativamente pronto.
Apoptosis, si la señal que recibe el BCR es de alta intensidad, como consecuencia de un
entrelazamiento extensivo del BCR (p. ej., por reconocimiento de moléculas multivalentes).
Edición del BCR
Las células B inmaduras que reciban señales a través del BCR interrumpen su desarrollo y mantienen
cierta expresión de las recombinasas RAG1/2. Estas recombinasas pueden reconocer las SSR que
flanquean a los fragmentos y que no fueron reordenados antes, por más que ya exista un reordenamiento
productivo. Los nuevos reordenamientos de la cadena L se transcriben y traducen a proteínas,
reemplazando a la cadena L anterior.
Si el nuevo BCR generado no es autorreactivo, el linfocito B inmaduro logra evitar su muerte o anergia.
Emigrará posteriormente al bazo a fin de continuar su proceso de maduración. Si genera un receptor
autorreactivo, puede editar nuevamente el BCR (lo puede hacer hasta que se le agoten los fragmentos
para poder recombinar). Si los intentos de editar el BCR continúan generando un receptor autorreactivo,
la célula morirá por apoptosis en la medula ósea o emigrará como linfocito B anérgico.
LB Ontogenia - 7
Reemplazo del fragmento V H
La mayoría de los fragmentos VH funcionales presentan, cerca de su extremo 3', motivos compatibles con
SSR crípticas, capaces de mediar la recombinación a través de las enzimas RAG con el fragmento que se
encuentra inmediatamente en dirección 5' del fragmento recombinado. Una vez producido el reemplazo
del gen la mayor parte del fragmento reemplazado se pierde como círculo de DNA, mientras que una
pequeña porción del extremo 3' de ese
fragmento queda en el nuevo reordenamiento
y puede ser reconocido como una "huella" del
proceso de reemplazo de fragmentos VH.
Debido a esto, los sucesivos reemplazos de
genes incrementan la longitud de las regiones
CDR3 de la cadena H porque siempre se
mantiene el pequeño fragmento de la región 3'
del fragmento VH anterior.
La célula puede hacer esto tantos fragmentos
tenga disponibles y mientras viva.
MADURACIÓN PERIFÉRICA DE LB
Sólo los linfocitos B inmaduros que sobrevivan a la inducción de tolerancia central podrán migrar desde la
médula ósea hacia el bazo, donde culmina su maduración.
Los linfocitos B que se encuentran en la periferia en un estado de transición entre el estadio B inmaduro y
el maduro reciben el nombre de linfocitos B transicionales (BTr). Dentro de esta población de linfocitos,
pueden diferenciarse dos subpoblaciones: BTr de tipo 1 y de tipo 2.
LB inmaduro LB transicional 1 LB transicional 2 LB maduro: LB foliculares o LB ZM
Durante este estadio, los BCR de dichos sufren un proceso de selección negativa si reciben señales a
través de su BCR por reconocer moléculas propias en el bazo. Mediante este mecanismo de inducción de
tolerancia periférica nos aseguramos de que los linfocitos B autorreactivos que hayan sobrevivido a la
inducción de tolerancia central en la medula ósea no continúen su desarrollo y mueran por apoptosis en el
bazo.
Los sobrevivientes darán lugar a los LB transicionales 2, que se ubican de preferencia en los folículos
esplénicos. Para que dicha subpoblación alcance el estadio de B maduro, son necesarias señales de
supervivencia dadas a través del BCR. Estas señales de supervivencia las expresan las CD foliculares. Si
el LB transicional 2 no reconoce estas señales, muere por apoptosis.
Una vez que los linfocitos alcanzaron su madurez, se pueden diferenciar en LB ZM y en LB foliculares.
Los LB foliculares coexpresan en su membrana los BCR de tipos IgM e IgD por splicing alternativo. La
coexpresión de IgM e IgD se acompaña de la capacidad de recircular y de la adquisición de competencia
funcional.
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Ubicación en el bazo
Lo región que rodea a la arteriola central se denomina vaina
linfoide periarteriolar (PALS) y está poblada mayoritariamente
por linfocitos T y linfocitos B transcionales 1. Los transicionales
2 se ubican en los folículos, mientras que las distintas
poblaciones de LB maduros pueden encontrarse tanto en los
folículos como en la zona marginal.
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