FISH o hibridacin fluorescente in situ es una tcnica de marcado de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas especficos brillen
bajo el microscopio. Esta tcnica permite la rpida determinacin de aneuploida, la ausencia del cromosoma completo o la presencia de un cromosoma adicional, as como la adjudicacin de un marcador gentico a un cromosoma (cartografa gentica). Los cromosomas que son usualmente utilizados con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta tcnica. FISH usa segmentos de una nica hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma especfico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. El primer paso de la tcnica consiste en la desnaturalizacin del DNA para separar la doble hlice. A la muestra desnaturalizada se le aade entonces la sonda de inters (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a regiones especficas. Despus, se tien los ncleos con un color de contraste inespecfico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con molculas fluorescentes (mtodo directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (mtodo indirecto). La tcnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.
FISH interfsico en ratn. En metafase se utiliza para detectar microdeleciones especficas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son csmidos,satlites alfas y sondas completas (painting probes). Los csmidos son secuencias nicas que hibridan con fragmentos pequeos. Se emplean en estudios de microdeleciones. Las sondas satlites estn formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran
cerca de lo centrmeros. En la mayora de los casos son especficas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. No siempre es posible tener ncleos fijados en metafase para realizar el FISH. Normalmente, cuando se fija una clula sin tratar el ncleo se encuentra en interfase, con los cromosomas descondensados. A pesar de ello, es posible realizar el FISH aunque los resultados obtenidos no sean tan especficos. Se emplea sobre todo para la deteccin de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en clulas fetales o tumorales. Adems del FISH mltiple, est el FISH en hebra y el FISH inverso. El FISH en hebra es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar; permite distinguir pequeas reorganizaciones sin tener que clonar y secuenciar, esta tcnica se usa bastante para detectar deleciones en clones o para estimar huecos en los proyectos de genoma.Por su parte, el FISH inverso es una tcnica que consiste en recortar un fragmento de cromosoma teido con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda; se utiliza para detectar el origen de un ADN marcador o fabricar sondas inespecficas que hibriden con determinada regin. Esta tcnica ha resultado ser muy til en el campo de la Medicina Reproductiva, con aplicacin en el diagnstico gentico preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnstico que, apoyndose en las tcnicas de reproduccin asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al tero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantacin embrionaria. Para el anlisis de anomalas cromosmicas embrionarias, tanto numricas como estructurales, puede utilizarse la tcnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una clula del embrin en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el ncleo en interfase y se hibrida con sondas especficas para el estudio cromosmico de la patologa que se sospecha pueda estar presente en el embrin. Entre las anomalas cromosmicas que pueden ser analizadas, caben citarse:
Anomalas numricas.
Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que, en muchos casos, slo se den defectos leves en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos de sndrome de Klinefelter, trisoma X y monosoma X.
Edad materna avanzada, aborto de repeticin de causa desconocida y/o fallo de implantacin: Ms de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos, la seleccin de aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las probabilidades de conseguir una gestacin a trmino.
Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a la tcnica de microinyeccin intracitoplasmtica del espermatozoide (ICSI).
Anomalas estructurales.Surgen espontneamente, en la mayora de los casos, como consecuencia de un fallo de meiosis durante la oognesis o espermatognesis, en los casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algn miembro de la pareja puede ser portador de una anomala estructural equilibrada, que podra transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio gentico especfico de embriones de la pareja portadora, podran distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosmicamente de los equilibrados. Un vez hecha esta seleccin de embriones, podran transferirse con total tranquilidad al tero materno los embriones que no presentan la alteracin gnica.
[editar] Mltiple FISH
El FISH Multicolor, M-FISH o SKY (Spectral Karyotiping) es una adaptacin del FISH que permite la visualizacin de los 23 pares de cromosomas a la vez, teidos con diferentes sondas fluorescentes. Para colorear los cromosomas, dado que slo hay 5 colores distintos posibles, se puede usar la sonda de un color concreto, o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. Un programa informtico se encarga de analizar las imgenes y formar el cariotipo: organiza los cromosomas de acuerdo a la emisin de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones. Se utiliza con frecuencia en el estudio de clulas tumorales. El poder de dicho mtodo reside en su habilidad para:
determinar rpidamente si hay algn cromosoma extra en el cariotipo y de qu cromosoma se trata, determinar si est presente algn cromosoma translocado y qu cromosomas estn implicados en la translocacin, permite la rpida identificacin de material cromosmico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma, y
ayuda en gran manera a la identificacin de cromosomas pequeos o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar de qu cromosoma son originarios.
La hibridacin fluorescente in situ (FISH) utiliza molculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de DNA. Esta tcnica es especialmente til para mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas (*) La tcnica consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de DNA que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se "marcan" con molculas fluorescentes [p.ejemplo con biotina (*) o fluorescena]. Esta sondas se hibridan o unen al DNA complementario y, como estan marcadas con molculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se encuentran (*). A diferencia de otras pruebas utilizadas para estudiar los cromosomas que requieren que las clulas se encuentren en divisin activa, la hibridacin fluorescente in situ puede ser llevada a cabo en clulas no activas La FISH utiliza tres tipos de sonda:
Sondas especficas de un locus: estas sondas se hibridan a una regin particular de un gen. Esta sonda es til cuando se ha aislado una pequea parte de un gen y se quiere averiguar en que cromosoma se encuentra. Sondas alfoides o centromricas: son sondas que contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas librerias de sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta manera, se consiguen imgenes en color que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas ms o menos oscuras. Esta tcnica es particularmente til para examinar anormalidades cromosmicas
4.2.2
Hibridacin "in situ" fluorescente (FISH)
Es una tcnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias gnicas especficas. Se puede aplicar sobre ncleos interfsicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las tcnicas de FISH sobre clulas que no estn dividindose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de divisin celular, como en los sndromes linfoproliferativos crnicos. Para ello utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los ncleos. Las sondas son pequeas secuencias de cadena sencilla de ADN, complementarias a la secuencia de inters del cido nucleico. Podemos utilizar distintos tipos de sondas:
Centromricas o ADN satlite: estas sondas hibridan con las regiones o satlites u otras secuencias repetitivas de la regin centromrica del cromosoma. Son de utilidad para detectar alteraciones cromosmicas numricas. Como hemos dicho anteriormente, esta tcnica puede aplicarse sobre clulas en divisin o ncleos interfsicos, por tanto podemos detectar anomalas cromosmicas numricas sin necesidad de tener clulas en metafase. Las sondas de pintado cromosmico contienen una librera de secuencias genmicas que abarcan todo un cromosoma o una determinada regin. Con estas sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numricas de los cromosomas, pero slo en clulas en metafase. Es muy til cuando tenemos cromosomas de mala calidad. Las sondas de secuencia nica (locus especfico), hibridan con secuencias cromosmicas muy concretas, correspondiente a una banda cromosmica o a un gen. Con estas sondas podemos visualizar alteraciones estructurales o numricas tanto en ncleos en interfase como en metafase. Podemos detectar la presencia de clulas tumorales residuales con una anomala caracterstica de estirpe o subtipo, como la t(9;22) en la leucemia mieloide crnica, la t(15;17) que afecta al PML/RAR en la leucemia mieloide aguda. Su sensibilidad vara desde 10-2 a 10-5 (detecta una clula tumoral entre 100 a 100.000 clulas normales) dependiendo del tipo y la cantidad de la sonda utilizada (Kasprzy et al., 1997). Si aplicamos sondas centromricas para el estudio de trisomas tendremos una sensibilidad del 1%, cuando coexisten 2 3 trisomas se podra detectar una clula neoplsica de entre 104 a 106 clulas normales, porque se multiplican los puntos de seal en una misma clula. Cuando aplicamos las sondas para detectar translocaciones especficas, utilizamos sondas que comprenden los fragmentos del ADN de los genes implicados en la tranlocacin, por ejemplo BCR-ABL, PML-RAR, con este tipo de sondas obtenemos una sensibilidad de 10-1. Sin embargo, cuando utilizamos las translocaciones como marcadores para detectar clulas tumorales es ms sensible la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa. Para localizar las secuencias de inters, la sonda debe hibridar con la secuencia de ADN de la muestra. El primer paso consiste en desnaturalizar las molculas de ADN (separar las hebras complementarias de la estructura en doble hlice del ADN), tanto la de la sonda como la de la muestra de estudio. Para ello elevamos la temperatura hasta 70 C - 80 C, o variamos el pH, y de este modo se rompen los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN. Despus se hibrida la sonda con su regin complementraria del ADN de la muestra, se incuban a 37 C la sonda de inters con la muestra, y por complementariedad de las bases se une la sonda de inters con la regin complementaria del ADN de la muestra. Con un microscopio de fluorescencia se observan las seales de la sonda. Esta metodologa es til para cuantificar aberraciones numricas, tanto si se presentan o no en clones de baja expresin o baja capacidad proliferativa y para monitorizar clones hiperdoploides en leucemia linfoblstica aguda. Otra aplicacin de la FISH es en el seguimiento de pacientes con un transplante alognico de distinto sexo. As, si utilizamos
sondas centromricas para los cromosomas sexuales, tendremos una informacin rpida del porcentaje de clulas del donante y clulas residuales del receptor. La FISH, como complemento de la citogentica convencional, puede ser de utilidad diagnstica y pronstica en el estudio de las neoplasias hematolgicas. Ambas metodologas tienen limitaciones y ventajas. La citogentica requiere que las clulas del clon neoplsico se estn dividiendo. Cuando los cromosomas son de mala calidad su interpretacin es dudosa. Se analizan pocas clulas y tiene una baja sensibilidad. Por el contrario la FISH se puede utilizar sobre ncleos en interfase y sobre clulas en metafase, pudiendo analizarse ms clulas que con la citogentica, siendo adems una tcnica con mayor sensibilidad. La informacin que nos aporta la tcnica de FISH est limitada al reordenamiento buscado, es decir a la sonda utilizada. Sin embargo, con la citogentica tenemos informacin de todos los cromosomas. La tcnica de FISH tiene un mayor coste que la citogentica.
