Manual de Prácticas
de Laboratorio
Técnicas básicas de Biología
Molecular y Celular
2024
Cátedra de Biología Molecular
& Celular
Bioingeniería - Licenciatura en
Bioinformática
BM&C - FIUNER
Contenido
Normas Mínimas de Seguridad ....................................................................................................................... 2
Materiales y Equipamientos de Laboratorio ................................................................................................... 3
1. Preparación de muestras biológicas para MO............................................................................................. 4
1.1 Preparados frescos ................................................................................................................................ 4
1.1.1. Observación de células en suspensión .......................................................................................... 4
1.1.2. Observación de hongos filamentosos. Impresión en cinta engomada transparente ............... 4
1.1.3. Observación de células de la epidermis de vegetales. .................................................................. 4
1.3. Preparados semipermanentes. Extendidos o frotis ............................................................................. 5
1.3.1. Observación de células epiteliales de mucosa bucal humana ...................................................... 5
1.3.2. Observación de bacterias. Coloración de Gram ............................................................................ 5
1.3.3. Observación de células meristemáticas de raíces. Técnicas de macerado, aplastamiento o
squash y tinción. ...................................................................................................................................... 6
1.4. Cortes histológicos ............................................................................................................................... 7
2. Obtención de extractos biológicos .............................................................................................................. 8
2.1. Obtención de componentes celulares solubles en agua. ..................................................................... 8
2.1.1. Obtención de extracto crudo de endospermo de gramíneas ....................................................... 9
2.2. Fraccionamiento subcelular ................................................................................................................. 9
3. Determinaciones bioquímicas ................................................................................................................... 12
3.1. Determinación de la actividad enzimática ......................................................................................... 12
3.1.1. Determinación de la actividad de enzimas hidrolíticas del endospermo de gramíneas. ............ 13
4. Técnicas analíticas ..................................................................................................................................... 15
4. 1. Espectrofotometría............................................................................................................................ 15
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Normas Mínimas de Seguridad
Normas generales para la seguridad en el laboratorio
• Usar guardapolvo.
• Usar el cabello largo recogido.
• Usar guantes cuando así se requiera.
• Mantener cubiertas las heridas.
• Mantener despejadas las áreas de trabajo.
• Colocar las pertenencias en un área designada a tal efecto.
• No comer o beber en el laboratorio.
• No usar la boca para pipetear líquidos, usar propipetas o peras de goma.
• Seguir en todo momento las indicaciones del docente
• No llevar a cabo experiencias no autorizadas.
• Consultar al docente a cargo ante cualquier duda, antes de proceder.
• Ante una eventualidad, dar aviso al docente en primera instancia.
Normas sobre sustancias peligrosas, reactivos y equipamiento
Productos químicos:
• Rotular adecuadamente todas las soluciones que se preparen.
• Leer el rótulo del envase antes de utilizar un compuesto, asegurarse que es el indicado.
• No devolver al recipiente de origen los sobrantes de los reactivos.
• No adicionar agua al ácido (dilución), sino que debe agregarse el ácido al agua, lentamente y
homogeneizando constantemente.
• No colocar productos inflamables cerca del fuego o de otra fuente de calor. Si deben calentarse
se hará a baño maría y bajo supervisión del docente.
• Lavarse inmediatamente con abundante agua en caso que la piel tome contacto con un reactivo.
Avisar inmediatamente al docente a cargo.
• Cuando destape un producto químico, coloque siempre la tapa hacia arriba para evitar que
queden restos del producto en la mesada.
• Al destapar un producto, siempre dirija el envase con inclinación hacia adelante, apuntando
opuestamente a su cuerpo.
• Emplear campana de extracción, sí es necesario.
Material de vidrio:
• Tener precaución con los bordes y puntas cortantes de los tubos u otros materiales de vidrio.
• No usar equipo de vidrio agrietado o roto.
• El descarte del material de vidrio NO se realiza en un tacho común de residuos.
Eliminación de residuos
• Materiales cortopunzantes: desecharlos sólo en los contenedores destinados a tal fin.
• Material biológico: desecharlos sólo en los contenedores destinados a tal fin.
• No verter productos químicos por el desagüe como norma general.
• Ante un derrame accidental, consultar inmediatamente al docente a cargo.
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Materiales y Equipamientos de Laboratorio
Pipeta
Embudo
Probeta Placa de Petri
Vaso de precipitado Matraz
Pipeta
Pasteur
Propipeta
Erlenmeyer Tubo Falcon Tubos de Pizeta
Tubo de centrifuga
ensayo
Ansa ojal
Mortero Cubreobjetos
Portaobjetos
Estufa de cultivo Centrifuga Microscopio óptico Microscopio electrónico
Cuba Fuente de poder
electroforétic Transiluminador
Termociclador a
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1 Preparación de muestras biológicas para MO
Los materiales biológicos deben ser sometidos a distintos procedimientos y técnicas, hasta obtener las
condiciones para ser observados al microscopio. Para la formación de la imagen a través del sistema de
lentes de un microscopio, la muestra debe ser atravesada por los rayos luminosos de la fuente de
iluminación. En un microscopio óptico el espesor de la muestra no debe superar los 10 um, ya que, si esto
ocurre, se dificultará el paso de la luz tornando difusas las imágenes.
Por otro lado, en algunos casos y debido a que la composición de los tejidos, generalmente, no tiene
contraste ni colores que permitan diferenciar sus estructuras mediante la observación directa en el
microscopio, las muestras se deben procesar para evitar el deterioro, resaltar las estructuras y permitir
mayor tiempo de conservación.
1.1 Preparados frescos
Para estos preparados se coloca una porción o una gota de la muestra sobre un portaobjetos, se agrega una
gota de agua destilada o solución fisiológica y se cubre con un cubreobjetos. De esta manera se puede
visualizar el material prácticamente en condiciones naturales, manteniendo las estructuras celulares su
normal funcionamiento.
1.1.1. Observación de células en suspensión
a. Agitar la suspensión.
b. Tomar una gota con un ansa o pipeta pasteur, depositarla sobre un portaobjetos.
c. Colocar un cubreobjetos y observar.
1.1.2. Observación de hongos filamentosos. Impresión en cinta engomada transparente
a. Colocar una gota de agua en un portaobjeto.
b. Tomar un fragmento de cinta engomada, adherir el hongo a la misma por simple contacto, apoyando
la cinta sobre el hongo.
c. Pegar la cinta en el portaobjeto sobre la gota de líquido.
d. Colocar sobre la cinta otra gota de agua y sobre ésta un cubreobjetos y observar.
1.1.3. Observación de células de la epidermis de vegetales.
a. Realizar un corte con un bisturí u hoja de afeitar de la epidermis del vegetal a estudiar y levantar una
fina capa, si es la epidermis de una hoja fina puede colocar un fragmento completo.
b. Colocar sobre una gota de agua en un portaobjetos, evitando la formación de pliegues.
c. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio.
1.2. Preparados frescos coloreados
Se preparan de la misma manera que los anteriores, pero con agregado de una gota de colorante antes de
colocar el cubreobjetos. Esto tiene el propósito de aumentar el contraste entre la célula y el medio o el de
algún componente celular. El uso de colorante interviene en la función normal de las células del tejido
usado.
1.2.1. Observación de leucoplastos.
a. Realizar un corte en una papa y con un bisturí raspar la parte blanca. También puede realizar la
observación utilizando un grano de arroz aplastado o en el raspado de un garbanzo hidratado, entre
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otros.
b. Depositar la muestra sobre una gota de agua en un portaobjetos.
c. Agregar una gota de lugol.
d. Colocar un cubreobjetos y observar.
1.3. Preparados semipermanentes. Extendidos o frotis
Si la muestra es líquida se coloca una gota del material sobre un portaobjetos y se la extiende con la ayuda
de otro colocado a 45 grados, de esta manera se forma una delgada capa, o se puede tomar la muestra con
un hisopo y distribuirla con este sobre el portaobjetos. Es útil para algunas muestras líquidas o semilíquidas.
El preparado debe luego fijarse, proceso que consiste en provocar la muerte rápida de las células, tratando
de mantener intacta su morfología y su composición química, antes de que comiencen los procesos de
autofagia. La fijación puede hacerse por calor, pasando el portaobjeto sobre la llama del mechero o dejando
secar a temperatura ambiente. Estos preparados pueden colorearse. La coloración puede ser simple (con
un solo colorante) o diferencial (utilizando varios colorantes diferentes para resaltar distintas estructuras).
Estos preparados, una vez secos, pueden observarse con objetivos secos o de inmersión.
Figura 1. Procedimiento para realizar un extendido o frotis, dese una muestra liquida con dos portaobjetos o de una muestra
tomado con un hisopo.
1.3.1. Observación de células epiteliales de mucosa bucal humana
1. Desinfectar con alcohol un portaobjetos.
2. Pasar cuidadosamente un extremo del portaobjetos por la cara interna de la mejilla.
3. Desechar con un algodón el material que recolectó y obtener una nueva muestra del mismo lugar.
4. Apoyar el extremo del portaobjetos con muestra sobre otro portaobjetos y realizar un extendido.
5. Dejar secar y agregar una gota de azul de metileno, colocar un cubreobjetos y observar al
microscopio.
1.3.2. Observación de bacterias. Coloración de Gram
Esta tinción se realiza sobre un extendido bacteriano y se basa en la naturaleza química de las paredes
celulares de estos microorganismos y su coloración final permite clasificarlos en Gram (+) si resultan violetas
o Gram (-) si resultan rosados. El colorante cristal violeta empleado penetra en las células bacterianas Gram
(+) y Gram (-). Posteriormente se adiciona lugol, el cual forma un complejo estable con el cristal violeta. Se
agrega una solución decolorante (alcohol/acetona), la cual sólo destiñe las células Gram (-). Estas últimas
serán luego teñidas con un segundo colorante, la safranina. Sobre un extendido de una suspensión
bacteriana fijado por calor se coloca:
1. Realizar un extendido (Ver sección 1.3 y Figura 1) de una gota de suspensión bacteriana.
2. Fijar por calor, pasando el portaobjetos unos 2 o 3 cm sobre la llama del mechero.
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3. Agregar cristal violeta, dejar por 1 minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Agregar lugol, dejar por 1 minuto (mordiente)
6. Agregar alcohol 96º/ Acetona (50%) (decolorante) por 10 segundos
7. Lavar con agua corriente
8. Agregar safranina por 1 minuto (colorante contraste)
9. Lavar con agua corriente
10. Dejar secar a temperatura ambiente
1.3.3. Observación de células meristemáticas de raíces. Técnicas de macerado, aplastamiento o
squash y tinción.
Cuando se desea trabajar con un tejido más grueso, pero se quieren observar pocas capas celulares, como
lo es el ápice de una raíz, se puede realizar un preparado semipermanente a partir de raíces previamente
fijadas. La idea es realizar un tratamiento químico para separar las células unas de otras mediante el
“macerado o disociación” de la pared celular entre ellas, seguidas de un aplastamiento o squash mecánico.
El objetivo es obtener una sola capa de células con sus membranas y componentes intactos, lo cual facilita
el pasaje de la luz y por lo tanto su visualización al MO.
Figura 2. Toma de muestra, meristemas radiculares de cebolla. A la derecha se muestra ampliada la zona proliferatirva.
1. Para el macerado de la pared celular, tomar 2 o 3 ápices radiculares fijados (con 3:1 de etanol/Ac.
acético) y sumergirlos 15 minutos en una solución de maceración (1:1 de etanol/HCl). Transferir las
raicillas a una solución de ácido acético al 45 % y dejarlas 15 minutos. Estas soluciones ayudan a
disolver el cemento de pectina de la pared celular vegetal y facilita la separación celular posterior.
2. Lavar varias veces las raicillas con agua destilada (H2Od).
3. Colocar las raicillas sobre un portaobjetos. Utilizar pinza y aguja de punta fina para disecar el extremo
apical de la raicilla (aproximadamente 1 mm, ver forma roma del esquema) y descartar la porción
restante de la raíz. Cortar el extremo apical en trozos pequeños y colocar un cubreobjetos y colorear
durante 5 minutos, depositando una gota de colorante aceto-carmín al 2 % sobre las muestras.
4. Realizar squash o aplastamiento del tejido. Colocar un cubreobjeto y realizar un squash o
aplastamiento del preparado, presionando con el dedo pulgar, pero sin romper ni deslizar el
cubreobjetos sobre el portaobjetos para distribuir las células.
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1.4. Cortes histológicos
Son cortes muy finos de tejidos animales o vegetales a los que se les realiza un tratamiento especial de
manera que puedan conservarse por largo tiempo sin sufrir alteraciones.
Las técnicas histológicas convencionales requieren de una serie de etapas:
i. Fijación: Las muestras biológicas normalmente requieren un proceso de fijación que arreste los
procesos fisiológicos en el momento que se desea estudiar. Normalmente las fijaciones se
clasifican en métodos químicos y métodos físicos. Los primeros se subdividen en métodos no
coagulantes y coagulantes. Los incluyen no coagulantes más comunes se basan
fundamentalmente en fijadores aldehídicos principalmente formaldehído y glutaraldehído. Los
coagulantes están representados fundamentalmente por alcoholes tales como el metanol o el
etanol. La fijación física normalmente se realiza a temperaturas muy bajas y a muy alta presión para
evitar la formación de cristales de agua que dañan la estructura celular/tisular.
ii. Deshidratación: una vez que las células/tejidos/órganos han sido fijados se requiere reemplazar el
medio acuoso que constituye el medio fundamental de los seres vivos, por un agente que permita
la realización del paso de inclusión.
iii. Inclusión: para poder realizar cortes muy finos de un tejido, de manera que los rayos de luz del
microscopio óptico puedan atravesarlo, se requiere que la muestra tenga cierta dureza. Para
lograrlo se embebe la muestra en una sustancia que al solidificar convierte la misma en un bloque
fácil de cortar. Por lo general se utiliza parafina para observaciones al MO y resinas plásticas de
mayor dureza y que permiten cortes más finos para el MET.
iv. Seccionamiento: se realiza con un instrumento llamado micrótomo, que puede lograr cortes de
grosor de 3 a 10 micrómetros. Estos se adhieren luego a un portaobjetos con gelatina o albúmina.
Para cortes más finos se utilizan ultramicrotomos.
v. Coloración: para esto se debe eliminar la parafina de la muestra (usualmente usando xilol o
tolueno) e hidratarla con una serie alcohólica de concentraciones decrecientes y agua en
concentraciones crecientes. Luego los cortes serán teñidos con los colorantes elegidos según lo
que se desee observar.
vi. Montaje: para proceder al montaje, el preparado deberá deshidratarse con una serie alcohólica de
concentración creciente. Los especímenes se clarean con xilol y posteriormente se agrega el medio
de montaje y el cubreobjetos. Estos preparados pueden observarse tanto con lentes secas como
de inmersión.
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2 Obtención de extractos biológicos
Para estudiar la estructura y/o función de un componente celular determinado, sea una macromolécula en
particular o un orgánulo completo, es necesario liberarlo del contexto celular y si es necesario purificarlo, es
decir, separarlo del resto de los componentes celulares. Para ello en primer lugar es necesario disgregar
el/los tejidos y romper la membrana plasmática. Este proceso se denomina disrupción u homogeneización y
la disolución resultante es un homogenado celular o extracto crudo. A partir del extracto crudo,
combinando diversas técnicas de separación como la centrifugación y la cromatografía, se puede purificar
el orgánulo o la macromolécula deseada.
Las técnicas de laboratorio son muy diversas y la selección dependerá del tipo de material de partida, que se
quiere obtener y con qué grado de pureza.
2.1. Obtención de componentes celulares solubles en agua.
Para obtener todos los componentes celulares solubles se debe romper tanto la membrana plasmática y
la pared celular, si ésta está presente; como las membranas de las organelas. Las células son suspendidas
en una solución de pH y de concentración salina adecuados, similar en composición a la del interior celular.
Existen varios métodos para romper las membranas y su eficacia relativa depende del tipo de célula que se
está estudiando. Los métodos físicos más utilizados son el choque osmótico, los ultrasonidos y la trituración
mecánica. En el primer caso, debido a que la membrana plasmática es altamente permeable al agua, pero
pobremente permeable a las sales y a otras moléculas pequeñas (solutos), puede utilizarse el flujo osmótico
para facilitar la ruptura celular. Consecuentemente, cuando las células son colocadas en una solución
hipotónica, el agua fluye a su interior, provocando el hinchamiento de la célula y consecuentemente su
ruptura. Las membranas plasmáticas pueden romperse también en homogeneizadores especialmente
presurizados, en los cuales las células son forzadas a pasar a través de un estrecho espacio entre el émbolo
y la pared del tubo. El proceso de homogenización debe hacerse a baja temperatura, utilizando medios que
mantengan constante el pH intracelular (soluciones amortiguadoras o buffers) para tener una mejor
preservación de las enzimas y de otros constituyentes.
Los pasos generales son:
1. Colocar el tejido en un mortero.
2. Morterear en seco por unos minutos, intentando disgregar lo máximo posible el tejido.
3. Agregar buffer y continuar mortereando unos minutos hasta que se obtenga una solución lo más
homogénea posible. Si es necesario filtrar con una gasa para separar el material insoluble de mayor
tamaño.
4. Traspasar el homogenado a un tubo y centrifugar a unas 3000 rpm por unos minutos, se formarán 2
fases bien diferenciadas y separables por simple decantación.
5. Separar el sobrenadante, en el cual estarán los componentes solubles de a muestra, los restos no
solubles (denominado pellet) quedarán en el fondo del tubo.
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Figura 3. Secuencia de pasos generales para obtener el extracto crudo de un tejido. A la derecha se muestra como funciona la
centrifugación, donde al finalizar se obtienen dos fases bien diferenciadas, el sobrenadante (amarillo) y en el fondo del tubo el
pellet
2.1.1. Obtención de extracto crudo de endospermo de gramíneas
Procedimiento:
1. Tomar 5 semillas previamente germinadas y/o tratadas según corresponda. Separar, bajo la lupa, el
coleóptilo y el eje embrionario para continuar trabajando con el endospermo y sus cubiertas.
2. Pesar juntas las 5 semillas desgerminadas y tomar nota de su masa.
3. Triturar el tejido en el mortero “en seco”, luego agregar 10 mL de buffer acetato 50 mM y
homogeneizar.
4. Filtrar en un tubo Falcon a través de una gasa con la ayuda de un embudo, llevando a un volumen
final de 25 mL con el buffer acetato.
5. Transferir a tubos de centrífuga el extracto obtenido y centrifugar a 3.000 rpm durante 5 minutos.
6. Decantar el sobrenadante (extracto crudo) en un tubo de ensayo limpio, el pellet se descarta.
2.2. Fraccionamiento subcelular
Los métodos de microscopía permiten analizar en gran medida la anatomía y localización de las organelas
celulares, pero si se quiere profundizar en su funcionamiento deben realizarse ensayos bioquímicos, para lo
cual el primer paso es obtener fracciones enriquecidas en las distintas organelas. La obtención de esta
fracción puede dividirse en dos partes, homogeneización y fraccionamiento, y se realiza típicamente
mediante centrifugación, aplicando métodos de separación diferencial basados en las diferentes densidades
de cada una de ellas.
Ruptura celular y liberación de organelas y otros contenidos
A diferencia de la homogeneización para obtener todos los componentes solubles, en este caso solo se debe
romper la membrana plasmática, no las internas ya que se desea obtener las organelas completas
funcionales. De este modo, los orgánulos celulares (núcleo, mitocondria, aparato de Golgi, lisosomas,
peroxisomas, etc.) permanecen intactas y mantienen la mayoría de sus propiedades bioquímicas originales.
Los métodos son los mismos que fueron descriptos en la sección 2.1, pero en condiciones más controladas.
La ruptura celular produce una mezcla de componentes celulares en suspensión, “el producto de lisis”, a
partir del cual las organelas deseadas pueden ser recuperadas.
Obtención de fracciones subcelulares
La mayoría de los procedimientos de fraccionamiento comienzan con centrifugación diferencial a
velocidades crecientes, también llamada centrifugación a velocidad diferencial (Figura 4).
Las diferentes velocidades de sedimentación de varios componentes celulares permiten separarlos
parcialmente por centrifugación, debido a sus diferentes tamaños. Los núcleos y partículas virales pueden
algunas veces ser purificados completamente. Después de cada centrifugación a una velocidad y tiempo
apropiados (ver Figura 4), el sobrenadante obtenido es centrifugado a mayor velocidad y tiempo. Cada
fracción que queda depositada en el fondo del tubo (pellet) puede ser resuspendida y mejor separada por
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centrifugación por gradiente de densidad en equilibrio. Como puede observarse en la figura, la centrifugación
diferencial no genera fracciones de organelas totalmente puras.
Figura 4. Fraccionamiento subcelular, primer paso: centrifugación por velocidad diferencial.
La centrifugación por gradiente de densidad en equilibrio (Figura 5) separa los componentes celulares
acorde a su densidad. La fracción impura de organelas se deposita en la superficie de una solución que
contiene un gradiente de una sustancia densa no iónica como la sacarosa o el glicerol. El tubo es centrifugado
a elevada velocidad (cerca de 40.000 rpm) por varias horas, permitiendo que cada partícula migre hasta su
posición de equilibrio, donde la densidad del líquido circundante es igual a la densidad de la partícula. En
preparaciones típicas de células animales, el retículo endoplasmático rugoso (densidad = 1,20 g/cm3) se
separa bien de las vesículas del Aparato de Golgi (densidad = 1,14 g/cm3) y de la membrana plasmática
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(densidad = 1,12 g/cm3). La mayor densidad del RER se debe a los ribosomas unidos. Este método también
resulta efectivo para resolver lisosomas, mitocondrias y peroxisomas en mezclas iniciales obtenidas por
centrifugación diferencial.
Debido a que cada organela posee una morfología única, la pureza de las fracciones de organelas puede
testearse por microscopía electrónica. Alternativamente, pueden cuantificarse marcadores moleculares
específicos. Por ejemplo, la proteína citocromo c sólo está presente en las mitocondrias, así su presencia en
una fracción de lisosomas indicaría su contaminación por mitocondrias. Similarmente, la catalasa está
presente sólo en los peroxisomas; la fosfatasa ácida sólo en los lisosomas y los ribosomas, sólo en el RER o
en el citosol. Los anticuerpos específicos de organelas son útiles en la preparación de organelas altamente
purificada.
Las fracciones celulares frecuentemente contienen más de un tipo de organela, aún después de la
centrifugación diferencial de gradiente de densidad en equilibrio. Por ello, estas fracciones pueden
purificarse por técnicas inmunológicas, empleando anticuerpos monoclonales para proteínas de membrana
específicas para cada organela. Un ejemplo es la purificación de vesículas celulares cubiertas por la proteína
clatrina. Un anticuerpo para clatrina se une a un transportador bacteriano o a pequeñas esferas metálicas y
estos anticuerpos unirán selectivamente las vesículas de interés en una preparación de membranas.
Finalmente, el complejo formado puede aislarse por centrifugación a baja velocidad o por unión a un imán,
respectivamente.
Figura 5. Fraccionamiento subcelular, segundo paso: centrifugación por gradiente de densidad.
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3 Determinaciones bioquímicas
Las determinaciones bioquímicas son análisis de laboratorio que se realizan para medir diversas sustancias
y parámetros presentes en muestras biológicas.. Estos análisis proporcionan información sobre el estado y
el funcionamiento del material analizado del organismo de donde se sacó, así como también sobre la
presencia de enfermedades o desequilibrios metabólicos. Algunas de las determinaciones bioquímicas más
comunes incluyen, perfil lipídico (colesterol, triglicéridos, etc), metabólico (glucosa, urea, ácido úrico, etc),
presencia de enzimas y su actividad.
3.1. Determinación de la actividad enzimática
Las técnicas para determinar actividades enzimáticas han sido, y continúan siendo, una pieza fundamental
en los avances en la comprensión del funcionamiento celular y de los organismos. El objetivo de estas
técnicas es medir la velocidad a la cual una enzima cataliza una reacción biológica específica, lo cual
proporciona información crucial sobre la función y el comportamiento de dicha enzima en diferentes
condiciones experimentales.
La determinación cuantitativa se realiza observando el efecto catalítico que produce la enzima sobre la
velocidad de reacción y, como cualquier estudio cinético, se puede realizar registrando en el tiempo la
desaparición de alguno de los reactivos o la aparición de alguno de sus productos.
Para llevar a cabo un estudio cinético es necesario conocer la ecuación global de la reacción catalítica,
contar con una técnica analítica sencilla para determinar la desaparición del sustrato o la aparición de los
productos de reacción, saber si la enzima necesita de cofactores y conocer las condiciones óptimas de la
reacción (pH y la zona de temperatura en la que muestra actividad elevada y estable)
El método general para determinar la actividad enzimática involucra los siguientes pasos:
1. Obtener un extracto celular que contenga la enzima a estudiar, no es necesario que esté pura. El
método utilizado para obtenerlo dependerá del tejido y el lugar o compartimento subcelular donde
se encuentra la enzima naturalmente.
2. Armar la reacción enzimática en un tubo, la cual debe incluir el extracto celular (contiene la enzima),
el sustrato de la enzima y cofactores, si fueran necesarios. La reacción enzimática también debe
llevarse a cabo en condiciones controladas, como temperatura y pH óptimos, este último regulado
por un buffer que se agrega al tubo de reacción.
3. Llevar a cabo la reacción enzimática controlando el tiempo y las condiciones, las cuales deben ser
lo más estandarizadas posible para obtener resultados precisos y reproducibles.
4. Detener la reacción utilizando un agente de detención adecuado que inactiva la enzima. Luego, se
mide la cantidad de producto formado o la cantidad de sustrato consumido en cada punto de tiempo,
con el método seleccionado.
5. Análisis de los datos y cálculo de la actividad enzimática, se analizan los datos obtenidos a lo largo
del tiempo para calcular la velocidad de la reacción enzimática en cada punto de tiempo. La actividad
enzimática se expresa típicamente en unidades específicas para cada enzima y se puede calcular
como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo o la cantidad de sustrato consumido
por unidad de tiempo.
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Es importante tener en cuenta que la determinación de la actividad enzimática puede requerir optimización
experimental y el uso de controles adecuados para asegurar la precisión y reproducibilidad de los resultados.
Además, diferentes enzimas pueden requerir métodos de análisis específicos según sus propiedades
bioquímicas únicas.
3.1.1. Determinación de la actividad de enzimas hidrolíticas del endospermo de gramíneas.
En la mayoría de las gramíneas, el endospermo es amiláceo, es decir, que el almidón es el principal hidrato
de carbono de reserva. Las enzimas hidrolíticas que son liberadas para catalizar la hidrólisis de este
polisacárido de reserva incluyen -glucanasa,- y - amilasa y-glucosidasa (Figura 6). La actividad de
estas enzimas se puede determinar indirectamente mediante la medición de la absorbancia del complejo
almidón-lugol remanente, luego de enfrentar a este polisacárido con un extracto crudo de las semillas (para
su obtención Ver sección 2.1.1), es decir se mide la desaparición del sustrato utilizando un reactivo
colorimétrico específico para su reconocimiento. La medición se realiza mediante la técnica analítica de
espectrofotometría (Ver sección 4.1). Para dicha reacción in vitro, se puede proceder de la siguiente manera:
1. Por cada determinación, preparar dos tubos de ensayo, uno destinado a la reacción enzimática
propiamente dicha y otro a su correspondiente blanco.
2. Agregar los siguientes reactivos en el orden indicado:
Reactivo Tubo Reacción Tubo Blanco
Volumen (mL) Volumen (mL)
Buffer acetato 50mM 1 1
Solución de almidón 0.1%* 1 1
Extracto crudo 1 -
Agitar. Incubar a temperatura ambiente 10 minutos
Solución de lugol 1 1
Extracto crudo - 1
Agitar
Agua destilada 10 10
Reposar 10 minutos
*Homogenizar la solución de almidón antes de agregar a cada tubo
3. Medir la absorbancia a 620 nm de cada tubo de reacción, homogenizando por inversión el contenido
antes de cada medición.
4. Calcular la actividad enzimática de cada extracto crudo como descenso en absorbancia por gramo
de semilla y por minuto, utilizando la siguiente fórmula:
(𝑨𝒃𝒔𝑩 − 𝑨𝒃𝒔𝑬 ) ∗ 𝑽 (𝒎𝑳)
∆ 𝑨𝒃𝒔 =
𝒎∗𝒕
Siendo: AbsB, absorbancia de los productos de la reacción enzimática “blanco”
AbsE, absorbancia de los productos de la reacción enzimática realizada con el extracto crudo
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V, volumen de aforo del extracto crudo
m, peso en gramos de las 5 semillas trituradas por muestra
t, tiempo de la reacción enzimática
Maltosa
Glucosa
Figura 6. Estructura de un gránulo de almidón y actividad -amilasa.
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4 Técnicas analíticas
Las técnicas analíticas en biología son fundamentales para comprender los procesos biológicos a nivel
molecular, celular y sistémico. En particular se utilizan para medir y cuantificar diferentes aspectos de los
sistemas biológicos. Estas técnicas son fundamentales para obtener datos precisos y reproducibles que
permitan entender los procesos biológicos en términos cuantitativos. Algunas de las técnicas cuantitativas
analíticas comúnmente utilizadas en biología incluyen:
Espectrofotometría: Se utiliza para medir la absorbancia o emisión de luz por una muestra biológica. Esto
se puede aplicar en la cuantificación de biomoléculas como proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos, así
como para estudiar la cinética de reacciones enzimáticas.
Cromatografía: Técnicas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de
gases (GC) se utilizan para separar y cuantificar componentes químicos en muestras biológicas, como
metabolitos, aminoácidos, lípidos y otros compuestos.
Microscopía cuantitativa: Técnicas como la microscopía de fluorescencia cuantitativa y la microscopía
confocal se utilizan para cuantificar procesos celulares y subcelulares, como la expresión génica, la
dinámica de proteínas, la migración celular y la morfología celular.
Estas son solo algunas de las técnicas cuantitativas analíticas utilizadas en biología. Cada una tiene sus
propias ventajas y limitaciones, y la elección de la técnica adecuada depende del tipo de muestra y la
información que se desea obtener. En conjunto, estas técnicas proporcionan herramientas poderosas para
estudiar y comprender los sistemas biológicos a nivel molecular, celular y sistémico.
4. 1. Espectrofotometría
La espectrofotometría es una técnica analítica ampliamente utilizada en biología para cuantificar la
concentración de compuestos específicos en muestras biológicas y para caracterizar biomoléculas como
proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos. Aquí hay una descripción básica de cómo funciona y por qué es
importante:
Principio de funcionamiento: La espectrofotometría se basa en la capacidad de ciertos compuestos para
absorber luz a una longitud de onda específica. Cuando una muestra se expone a la luz de una longitud de
onda particular, los compuestos absorbentes presentes en la muestra absorben parte de la luz. La cantidad
de luz absorbida está relacionada con la concentración de los compuestos en la muestra. La ley de Lambert-
Beer establece que, a mayor concentración de una sustancia en una solución, mayor será la absorbancia de
la luz incidente, por un cuerpo dado y por ello menor será la transmisión o transmitancia de luz al salir de él.
La solución por medir se ubica en una cubeta de vidrio (para visible) o cuarzo (para UV). Esta ley establece
que al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiación por una sustancia, hay una pérdida que se expresa
con la ecuación:
It/Io= T –dc
dónde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada
radiación o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que incide en la cubeta donde está la muestra
(radiación intensidad incidente) y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.
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BM&C - FIUNER
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el recorrido
aumenta. El superíndice indica la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo
electromagnético, d es la distancia recorrida por la luz en la cubeta de espectrofotometría y c es la
concentración del soluto en la muestra ubicada en la cubeta. La ecuación simplificada de la ley de Lambert-
Beer es:
A = ε.d.c
comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), el
espesor recorrido por la radiación o ancho de la cubeta (d) y el factor de calibración (ε). El factor de
calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares o patrones de medida.
La transmitancia y absorbancia son fácilmente interconvertibles según:
A= log 1/T
Medición de absorbancia: Se requiere de un equipo especial, denominado espectrofotómetro. Las
mediciones se realizan generalmente en el rango ultravioleta-visible (UV-Vis) o en el infrarrojo (IR),
dependiendo qué tipo de molécula o complejo de moléculas se quiere analizar es la longitud de onda a la
cual se irradia la muestra, ya que por ejemplo los ácidos nucleicos absorben a 260 nm y las proteínas a 280
nm. El funcionamiento básico de equipo implica que la luz de una fuente luminosa, usualmente una lámpara
de xenón o de deuterio-halógeno, pasa a través de una muestra y es detectada por un detector del otro lado.
El espectrofotómetro mide la cantidad de luz absorbida por la muestra en cada longitud de onda específica.
Las aplicaciones en biología son muchas, incluyendo: Cuantificación de ácidos nucleicos, de proteínas;
Análisis de cinética enzimática; Determinación de concentraciones de metabolitos entre otras. Es una
técnica relativamente simple y rápida que proporciona resultados precisos y sensibles, lo que la hace
ampliamente utilizada en laboratorios de investigación y clínicos.
Figura 7. Espectrofotómetro y sus componentes básicos.
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