Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Sistemas de Control de Calidad

(SCC) en el laboratorio clínico

Profesores responsables:
Carreño Duran Luis Ramón
Colin Tovar María del Carmen Mercedes
Hernández Olicón Aura Patricia
Quiroz González Héctor Javier

Práctica 2. Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de

los espectrofotómetros empleados en el laboratorio clínico.
Determinación del volumen mínimo de lectura, observación del efecto
menisco.
Morales Luna Diego Antonio
AQM2
Fecha de entrega: 18 de marzo de 2024
Introducción.
Los espectrofotómetros son instrumentos analíticos fundamentales en el laboratorio
clínico, empleados para determinar la concentración de sustancias en una muestra
a través de la medición de la absorbancia de luz. La precisión y exactitud de las
mediciones espectrofotométricas son esenciales para garantizar la calidad de los
resultados y la confiabilidad de los diagnósticos.
Para que los resultados sean de confianza y de buen valor médico, es necesario
que se realicen verificaciones de la calibración, sensibilidad y linealidad del mismo,
asi como es necesario evaluar y conocer el volumen mínimo del lectura para una
correcta determinación.
La calibración es el proceso de ajustar un espectrofotómetro para que sus lecturas
coincidan con un patrón conocido. Es fundamental realizar la calibración de forma
regular, utilizando patrones trazables a estándares nacionales o internacionales. La
descalibración puede afectar la precisión de las medidas, provocando resultados
erróneos. (Martínez Osorio, 2009)
Por otra parte, la sensibilidad se refiere a la capacidad del espectrofotómetro para
detectar pequeñas diferencias en la absorbancia de luz. Una alta sensibilidad es
importante para detectar pequeñas cantidades de analito en la muestra. La baja
sensibilidad puede afectar la capacidad de detectar analitos en concentraciones
bajas, lo que puede llevar a falsos resultados. (Martínez Osorio, 2009)
Mientras que la linealidad se refiere a la proporcionalidad entre la absorbancia de
luz y la concentración del analito. Un espectrofotómetro lineal tendrá una respuesta
constante a diferentes concentraciones de analito. La no linealidad puede afectar la
precisión de las medidas, especialmente a concentraciones bajas o altas del analito.
(Carreño, 2021)
Por último, el volumen mínimo de lectura es el volumen de muestra más pequeño
que puede ser medido con precisión por el espectrofotómetro. Es importante
determinar el volumen mínimo de lectura para asegurar que se utilice la cantidad
adecuada de muestra y se obtengan resultados precisos. El uso de un volumen
inferior al mínimo puede afectar la precisión de las medidas, mientras que el uso de
un volumen superior al necesario puede generar un desperdicio de recursos.
La verificación de la calibración, la sensibilidad, la linealidad y el volumen mínimo
de lectura son aspectos críticos para asegurar la precisión y exactitud de las
determinaciones espectrofotométricas en el laboratorio clínico. La implementación
de protocolos adecuados para la verificación de estos parámetros, junto con el uso
de técnicas correctas de medición, permite obtener resultados confiables que
impactan positivamente en la calidad de la atención al paciente.
Objetivos.
• Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros,
utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio.
• Interpretar los resultados obtenidos de acuerdo con la ley de Lambert – Beer
• Determinar el volumen mínimo que un espectrofotómetro puede utilizar, para
obtener lecturas confiables.
• Evaluar la magnitud del efecto con que el menisco afecta las mediciones,
cuando se utilizan volúmenes inferiores al mínimo.
Fundamento.
Los espectrofotómetros son dispositivos utilizados para medir la cantidad de luz
absorbida por una muestra en función de la longitud de onda de la luz incidente. El
fundamento de su funcionamiento se basa en la ley de Lambert-Beer, que establece
que la absorbancia de una muestra es directamente proporcional a la concentración
de la sustancia absorbente y al espesor de la muestra, y de manera exponencial al
coeficiente de absorción molar a esa longitud de onda específica
Los espectrofotómetros operan enviando luz de una longitud de onda específica a
través de una muestra y midiendo la cantidad de luz que se absorbe. Esto se logra
mediante un sistema de fuentes de luz, filtros y monocromadores que permiten
seleccionar la longitud de onda deseada. La luz transmitida a través de la muestra
se compara con la luz de referencia que no ha pasado a través de la muestra, y la
diferencia de intensidad entre ambas se utiliza para calcular la absorbancia. (García
Martínez, 2012).
Efecto menisco
El menisco adopta forma convexa o cóncava. La formación de dicha forma depende
de la relación entre la fuerza de cohesión y adherencia del líquido. El volumen de la
muestra debe ser adecuado para asegurar que no haya fenómenos de difracción de
la luz que hace incidir y que pasa por el menisco formado por el líquido, dando como
resultado lecturas erróneas.
Verificación de la linealidad utilizando Dicromato de Potasio
Se evalúa la capacidad de respuesta lineal de un espectrofotómetro a diferentes
concentraciones de una sustancia que cumpla con la ley de Lambert- Beer. El
estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancias en
el que el espectrofotómetro arroja lecturas proporcionales a los cambios de
concentración.
 Metodología (diagrama de flujo).

1. Ajustar 4. Repetir pasos 2 y 3

2. Añadir 50uL de
Efecto menisco espectrofotometro al 3. Leer absorbancia hatsa tener tres 5. Graficar Vol VS Abs
dicromato de potasio
aire a 500nm lecturas constante

3. Ajustar 5. Repetir las

1. Ajustar
2. Leer una celda con espectrofotometro a lecturas de 460.a 550
Calibración y espectrofotometro 4. Tomar lectura de
CoCl2 y reportar 460 nms a cero con nm, incrementando
sensibilidad con agua destilada a CoCl2
Absorbancia ayuda de agua absorbancias de 10
450 nm
destilada en 10

1. Realizar una serie de

diluciones de K2Cr2O7 Y H2O
(mL), respectivamente.
- 0.25 + 4.75
- 0.5 + 4.5
-1+4
- 1.5 + 3.5 4. Calcular factor de
2. Leer absorbancia a calibracion y ajustar 5. Calcular %Error y
Linealidad -2+3 3. Construir curva tipo
500 nm de cada una concentracion de cada graficarlo
- 2.5 + 2.5 tubo
-3+2
- 3.5 + 1.5
-4+1
- 4.5 + 0.5
-1

Resultados.
Tabla 1. Resultados obtenidos en la determinación de calibración y sensibilidad en
la sección I y II
Secc Equip
CALIBRACION SENSIBILIDAD
1 #espectro  (max) Dictamen A max % Error Dictamen
1 DLAB #32 510 Calibrado 0.452 -9.6% No sensible
2 Jenway 7305 510 Calibrado 0.484 -3.2 Sensible
#13
3 Genesys 20 510 Calibrado 0.435 -13 % No sensible
#31
4 Jenway 7305 510 Calibrado 0.376 -24.8% No sensible
#3
1 Jenway 7305 510 Calibrado 0.520 -4% Sensible
#1
2 11 510 Calibrado 0.457 -8.6% No sensible
3 Jenway 7305 510 Calibrado 0.493 -1.4% Sensible
#10
4 Dynamica Halo 500 No calibrado 1.740 248% No sensible
Vis-20
Tabla 2. Resultados obtenidos en la sección I y II para la determinación de
linealidad en los espectrofotómetros
Sección Equipo
1 Concentración concentración Pendiente (m) Intervalo lineal
esperada (r) corregida (r) A
1 0.9996 1 1.0138 0.540-1.795
2 0.9987 1 1.1834 0.159-0.299
3 0.997 1 0.9528 0.338-1.473
4 0.997 1 1.0827 0.174-0.352
2 1 0.998128 1 1.0108 0.565 – 1.388
2 0.9968 1 0.9917 0.797 - 2.003
3 0.9989 1 0.998 0.501-1.612
4 0.95 1 1.1674 0.438-0.563
Tabla 3. Resultados obtenidos en la sección I y II e para la evaluación del efecto
menisco en los espectrofotómetros.
Sección Equipo Tipo de celda Vol del Vol. A menisco A mínima %Error
efecto Minimo
menisco
1 1 Vol. completo 1400 L 1600 L 0.387 0.032 16.91
2 Vol. completo 1800 L 1900 L 0.301 0.276 9.05%
3 Vol. completo 900 / 1000 1100 L 0.582 / 0.316 84% /
L 0.385 22%
4 Vol. completo 1900 L 2100 L 0.351 0.313 12.1%
2 1 Semi-reducida 800 uL 900 uL 0.405 0.445 -8.9%
2 Semi-reducida 700uL 900 uL 0.412 0.380 12.5%
3 Semi-reducida 700 uL 900 uL 0.393 0.340 15%
4 Semi-reducida 250 L 400 L 0.147 0.157 -37.5%

Linealidad

Imagen 1. Tabla y grafica de la concentración esperada vs las absorbancias obtenidas a 500 nm

*Para realizar la corrección de las concentraciones, se tomó el punto 6 ( [265 mg/dL] ; Abs: 0.863)
debido a su gran cercanía a la línea de tendencia*
Imagen 2. Tabla y gráfica obtenida después de la corrección de las concentraciones tomando como
base el punto más cercano a la línea de tendencia (punto 6)

Imagen 3. Tabla y gráfica correspondiente a los valores de concentración esperada y concentración

corregida, en donde al interior del rectángulo verde se señala la ecuación de la recta y la pendiente
obtenida (m= 0.9521)

Imagen 4. Resultados del %Error graficados. Las lineas moradas delimitan aquellos
resultados que se encuentran dentro de la linealidad
Imagen 5. Tabla de absorbancias y gráfica de las mismas donde se puede observar la
absorbancia máxima a 510nm

Imagen 6. Tabla y gráfica de la relación Volumen VS Absorbancia donde se visualiza el

efecto menisco en una celda semirreducida
BITACORA DE RESULTADOS FECHA: 11 DE MARZO 2024
“Verificación de la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros utilizados en el
laboratorio clinico”
Resultados y observaciones
Espectrofotometro: Jenway 7305 Codificación del usuario: 10
Marca: Jenway No. de serie: 72970
Unidades: nanómetros
Condiciones físicas de la micropipeta: Normales

Tipo de celda utilizada: volumen semireducido

Reactivo utilizado: CoCl2 al 2.2% Vol. Seleccionado: N/A

Solucion con la que se hizo diluciones: HCl al 1%
Intervalo de λ: 460-550 nm
Ajuste del espectrofotómetro con: HCl al 1%

Longitud de onda A Longitud de onda A

(nm) (nm)
460 0.298 510 0.493
470 0.347 520 0.476
480 0.388 530 0.423
490 0.420 540 0.324
500 0.462 550 0.242

Λ minima seleccionada: 460 nm λ máxima seleccionada: 510

Anotar observaciones
Al haber encontrar la mayor absorbancia en 510 nm podemos dictaminar que el
espectrofotómetro se encuentra calibrado
Para el análisis, de la sensibilidad se determinó el porcentaje de error:
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 0.493 − 0.500
% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = = = −1.4 %
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 0.500
Al obtener un valor de -1.4% es posible dictaminar que el espectrofotómetro es sensible.
Efecto del menisco
Resultados y observaciones
Efecto menisco

Vol (μL) Absorbancia Vol (μL) Absorbancia

(500 nm) (500 nm)
50 0.000 500 0.203
100 0.000 550 0.258
150 0.005 600 0.339
200 0.005 650 0.378
250 0.012 700 0.393
300 0.011 750 0.357
350 0.043 800 0.340
400 0.216 850 0.340
450 0.169 900 0.340
950 -------

Espectrofotometro utilizado: Jenway

Reactivo utilizado: K2Cr2O7
Tipo de celda: semireducida
Longitud de onda a la que se hicieron las lecturas: 500 nm
Volumen seleccionado: 900 microlitros
Absorbancia a la que se observa el efecto menisco: 0.393
Volumen a la que se observa el efecto menisco: 700 microlitros

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 0.393 − 0.340

% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑥 100 = 𝑥 100 = 15 %
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 0.340
Discusión.
En la tabla 1, podemos observar los resultados que cada uno de los equipos de la
sección I y II reportó según la calibración y sensibilidad del espectrofotómetro
utilizado. Para el caso de la calibración, es posible apreciar que todos los equipos
(a excepción del equipo 4 de la sección II) reportaron dispositivos calibrados, esto
último tomando como calibrados a aquellos equipos donde se observara un registro
de máxima absorbancia a los 510 nm; En particular para el equipo 4 de la sección
II, es posible que el espectrofotómetro que utilizaron se encuentre dañado por
cambios bruscos en la temperatura ambiental de donde se ubica el equipo (es
importante recordar que estos equipos son demasiados sensibles a factores
ambientales que pueden alterar su optimo funcionamiento), (Montes, 2018)
también, el uso prolongado y frecuente del equipo sin un buen mantenimiento
preventivo, puede ir acortando la vida media de los componentes del
espectrofotómetro, disminuyendo asi su calibración. Factores como suciedad,
desalineación óptica, desgaste del sistema luminoso o un nulo o mal mantenimiento,
son los principales tópicos que se muestran involucrados cuando un equipo como
este está descalibrado.
Además, en la tabla 1, es muy importante mencionar que la gran mayoría de los
equipos de ambas secciones, reportaron espectrofotómetros NO sensibles, siendo
una falla en la fuente luminosa del equipo, daños en el detector o daños en el
selector de la longitud de onda, las fallas mas comunes que afectan de manera
negativa a la sensibilidad del espectrofotómetro. (Montes, 2018)
Para el caso de la determinación de la linealidad, es relevante mencionar que este
fenómeno debe de seguir la ley de Beer al momento de trazar una curva tipo. Es
decir, para el caso de la determinación de linealidad por el método del dicromato de
potasio, debe de haber una relación lineal en la que, si se aumenta la concentración
de dicromato de potasio, debe de aumentar la absorbancia al momento de realizar
lecturas en el espectrofotómetro (Benites, 2016). En la imagen 4 podemos observar
el porcentaje de error que se obtuvo al momento de realizar la determinación de la
linealidad, siendo los primeros tres puntos y el ultimo, aquellos que se encuentran
por afuera de los intervalos de linealidad (+/- 5%); En nuestro caso, las variaciones
que se encuentran por encima del intervalo de linealidad, pueden deberse a errores
del analista al momento de realizar la serie de diluciones: Es probable que el mismo
analista haya añadido volumen demás en los tubos, ya sea por un mal enfoque del
menisco al momento de despachar el volumen de la pipeta serológica o bien, por
una distracción que haya perjudicado todo el proceso.
Finalmente, en la prueba del efecto menisco, se observó que a los 800uL, la
absorbancia se mantuvo constante en 0.340nm, siendo los 700uL, el volumen
donde llevó a cabo el fenómeno de difracción de la luz, dando asi resultado al efecto
menisco en la celda de volumen semirreducido que utilizó el equipo. Aquellos
equipos donde se presentó un mayor porcentaje de error en sus determinaciones,
pudieron deberse al depósito de la gota de 50uL muy por encima, muy por debajo o
justo en la zona donde se lleva el efecto menisco, alterando completamente los
valores de volumen mínimo.
Conclusiones.
• La falta de sensibilidad en los equipos espectrofotométricos puede deberse
al daño del detector o en el selector de la longitud de onda, asi como también
de un posible desgaste de la fuente de luz
• La mayoría de los equipos se encuentran calibrados, mostrando una máxima
absorbancia a los 510 nm
• Los valores obtenidos fuera de linealidad pueden deberse a errores por parte
del analista al momento de añadir erróneamente mas volumen del dicromato
de potasio
• El efecto menisco puede darse erróneamente por un mal despacho de
volumen en la celda donde una gota sea la causante de la difracción de la
luz
Pregunta extra
1.-Volúmenes mínimos en equipos automatizados.
Química clínica → COBAS 8000: 2uL
Citometría → Sysmex XN10: 40uL
Coagulación → Roches COBAS t 711: 90Ul
2.- ¿Qué es el volumen muerto de una determinación?
El volumen muerto en una determinación se refiere al volumen de líquido que no se
utiliza para la medición o análisis y que queda atrapado en el sistema de medición
o análisis. Por ejemplo: Tubos, conexiones, burbujas, líquidos viscosos, etc. (Skoog,
2023)

Referencias.
Martínez Osorio, F. S., & Pérez Espinoza, I. D. L. A. (2009). Calibración de un espectrofotómetro UV-
Visible y Evaluación de la incertidumbre (Doctoral dissertation).

Carreño Cisneros, E. O., Mejia Domínguez, C. M., & Andrade Girón, D. C. (2021). Evaluación de la
linealidad del método espectrofotométrico VIS para determinar nitratos en hortalizas: Curva de
calibración con estándares externos.

García Martínez, E. M. (2012). Aplicación de la ley de Lambert-Beer en espectroscopía UV-visible.

Montes, H. (2018). Valoraciones Fotométricas. Universidad de Sevilla. Pp. 7-12.

Benites Melquiades, J. I. (2016). Validación del método analítico por espectrofotometría uv-vis para
la cuantificación de tabletas recubiertas de nifuroxazida 200 mg.
Skoog, DA, West, DM, Holler, FJ y Crouch, SR (2023). Fundamentos de química analítica
(10a ed.). Aprendizaje Cengage.