FBCB-UNL Bioquímica Básica de Macromoléculas Guía de coloquios 2020
Electroforesis
1. Respecto al fenómeno electroforético: a) describa el fenómeno y b) analice la dependencia
funcional de la velocidad y la movilidad electroforética libre en base a una ecuación
representativa.
2. ¿Que fenómenos están presentes en la electroforesis sobre soporte y cómo influyen en el
desplazamiento de las partículas?
3. ¿Cómo se puede representar la distribución de iones alrededor de un ión o de una
superficie cargada? ¿Qué ecuación representa el potencial eléctrico φ, de un ión y su nube, en
función de la distancia desde el centro del ión al seno de la solución? ¿De qué depende ese potencial?
¿A que se denomina potencial zeta y de qué depende?
4. Respecto a la velocidad electrosmótica: a) describa el fenómeno, explicando por qué se
origina; b) analice la dependencia funcional en base a una expresión matemática que lo
describa; c) explique cómo puede influir en una corrida electroforética.
5. Un capilar de sílica es el medio soporte para una electroforesis, en la que se trabaja a pH 8,
por lo que los grupos silicato se encuentran desprotonados. Cuando se siembra una molécula
de carga neutra a ese pH se observa un desplazamiento de la misma hacia el polo negativo.
¿A qué se debe este desplazamiento?
6. ¿Qué ecuación semi-empírica representa la movilidad de una proteína en gel en función de
la concentración del gel? Analice cada uno de sus términos y su dependencia funcional.
7. En la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) existen distintas variantes de trabajo
para la separación: a) continua o discontinua; b) condiciones nativas; c) condiciones
desnaturalizantes con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en medio reductor o no
reductor; c) condiciones desnaturalizantes con urea. Describa los fundamentos de la
separación en cada una de las variantes, indicando qué efectos producen el SDS, el reductor,
la urea y sus aplicaciones.
8. Para dos proteínas monoméricas A y B, cuyas características responden alternativamente a
las descriptas a continuación en I y II, complete la tabla:
Propiedad y relación de igualdad Responder Seleccione los métodos por
/ desigualdad conocida los que se pueden separar
en cada caso
I QA / 6 rstokesA = QB / 6 rstokesB ¿Cómo resultan Electroforesis nativa libre,
r Stokes A > r Stokes B QA y QB PAGE-nativo,
MA > MB entre sí? PAGE-SDS
II QA / 6 rstokesA > QB / 6 rstokesB ¿Cómo resultan Electroforesis nativa libre,
r Stokes A = r Stokes B QA y QB entre PAGE-nativo,
MA = MB sí? PAGE-SDS
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9. Si se tienen dos proteínas de distinto pI, ¿por qué método electroforético las podría
separar?
10. ¿Qué método electroforético le permite determinar masa molecular? Para una proteína
pura que es alternativamente: a) monomérica; b) un homotetramérica; c) heterotetramérica
constituida por dos subunidades α y dos subunidades β. ¿Qué imagen observaría en un gel
nativo y cuál en un gel desnaturalizante con SDS y reductor? ¿Qué masa podría determinar
en cada caso y cómo?
11. La electroforesis cruzada o bidimensional se lleva a cabo en dos pasos. ¿Cuáles son en la
mayoría de los casos y que objetivos se persigue con cada uno y en su conjunto?
12. ¿Qué métodos combinados de análisis electroforético con reacciones inmunoquímicas
conoce? Describa brevemente.
13. Teniendo en cuenta la estructura molecular y conformación que normalmente adoptan los
ácidos nucleicos y los polisacáridos. ¿Siempre es posible separarlos por electroforesis? ¿Qué
medio soporte y condiciones se utilizan generalmente? Desde el punto de vista del ácido
nucleico, ¿de qué depende la distancia migrada? ¿Cómo se pueden visualizar en el gel?
14. En una electroforesis de alto voltaje en papel a pH 4,0 ¿qué aminoácidos, de los veinte
proteicos migrarán hacia el cátodo y cuáles hacia el ánodo?
Los valores de pKa de los aminoácidos puede encontrarlos en el sitio web:
[Link]
15. Se tiene una mezcla del compuesto M, que es el pentapéptido Pro-Gly-Phe-Ser-Cys y del
compuesto Q, que es la forma oxidada de M donde los grupos –SH de la Cys forman un
puente disulfuro. a) ¿Cómo podría separar M de Q? b) ¿Es el compuesto Q un decapéptido?
c) ¿Podría utilizar el mismo principio separativo para una mezcla de glutatión en su estado
reducido (GSH) y oxidado (GSSG)?
La estructura del GSH puede encontrarla en el sitio web:
[Link]
&sa=X&ved=0ahUKEwj_loj3yOPLAhXDTJAKHewlCAAQsAQIPg&biw=979&bih=916#i
mgrc=aLqUi35fgNQDuM%3A
El artículo de MC Gennaro y C Abrigo (1992) Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis 10: 61-5, al que puede accederse por la biblioteca virtual del Mincyt, describe un
procedimiento cromatográfico para realizar tal separación.
16. Calcúlese el punto isoeléctrico de la glicina a partir de los datos siguientes obtenidos
mediante una electroforesis de alto voltaje en papel.
pH 2 3 4 5 7 8 9 10
distancia (cm) 3,3 2,5 1,7 0,8 -0,7 -1,8 -3,3 -3,4
17. En una electroforesis sobre soporte capilar de sílica, un compuesto neutro se desplaza 45
cm hacia el cátodo en 10 min. El campo eléctrico aplicado es de 300 V/cm. Sabiendo que la
movilidad libre de una proteína, en iguales condiciones de pH y fuerza iónica es de 0,01
(cm/min)/(V/cm) hacia el ánodo, cuánto tiempo tardará la proteína en desplazarse los 45 cm,
si se la siembra en ese capilar?
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18. ¿Cómo podría separar una mezcla de glucosa (Glc), glucosa-1-fosfato (Glc-1P) y UDP-
glucosa (UDP-Glc)? Busque las estructuras de estos compuestos en Internet. Estos
compuestos fueron separados en estudios pionero realizados por el grupo de LF Leloir, como
el trabajo de la publicación de AC Paladini y LF Leloir (1952) Biochemical Journal 51: 26-
30.
19. La enzima glicerol-3P deshidrogenasa de Ceratitis capitata da un valor de movilidad
relativa de 0,45 en SDS-PAGE. Las proteínas patrones de pesos moleculares conocidos dan
las movilidades siguientes, cuando fueron analizadas en las mismas condiciones:
Proteína Citocromo c Mioglobina Tripsina Aldolasa Albúmina
Peso molecular 12.350 17.800 23.600 38.000 43.500
Movilidad 0,87 0,75 0,60 0,36 0,15
Calcúlese el peso molecular de la glicerol-3P deshidrogenasa.
Métodos hidrodinámicos y parámetros de forma y tamaño: difusión, fricción y radio de
Stokes
1. ¿Qué modelos conformacionales pueden utilizarse para representar las macromoléculas,
considerándolas como partículas? ¿Cuál de esos modelos se asemeja más respectivamente, a
una proteína alternativamente en estado nativo o desnaturalizado, un ácido nucleico, o un
polisacárido?
2. Exprese la masa y el volumen de la macromolécula, en función de su masa molar y
teniendo en cuenta el coeficiente de solvatación.
3. Defina coeficiente de difusión y coeficiente de fricción y explique de qué dependen.
4. Defina radio equivalente de Stokes y explique cómo se calcula.
5. ¿Qué parámetros macromoleculares y qué métodos de separación y caracterización
dependen del radio de Stokes?
6. ¿Cómo se supone que varían el radio de Stokes, el coeficiente de sedimentación, la
movilidad elecrotroforética en gel y el volumen de elusión en cromatografía de filtración por
gel, cuando una proteína se desnaturaliza?
7. Una macromolécula tiene una masa molecular de 60.000 Da, un volumen específico
parcial de 0,73 cm3/g y un coeficiente de hidratación de 0,1. a) Calcule el volumen de la
molécula hidratada. b) Explique si con estos únicos datos puede calcular el coeficiente de
fricción real y el radio equivalente de Stokes de la proteína c) Calcule los valores mínimos
que podrían tener el coeficiente de fricción y el radio para esa proteína.
8. La ubiquitina es una proteína pequeña de peso molecular 8.500. El volumen específico
parcial es v2 = 0.72 cm3/g y presenta un 10 % de hidratación (δ= 0.1). Para esta proteína se
determinaron los coeficientes de fricción en estado nativo, y desnaturalizado por urea, siendo:
fN = 2.96 10-8 g/s y fD = 4.86 10-8 g/s. Calcule: a) El radio de la proteína, suponiendo que es
una esfera, de la que solo conoce la masa molecular, el volumen específico parcial y la
hidratación. b) El radio de Stokes para la proteína en su estado nativo y desnaturalizado, en
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un medio cuya viscosidad es η = 1.10-2 poise (dyn . seg/cm2). c) ¿Qué conclusión obtiene
respecto de las formas de la proteína nativa y desnaturalizada y respecto de los radios
calculados en los puntos 1 y 2 respectivamente?
Sedimentación
1. ¿Qué utilidad tienen los métodos de sedimentación?
2. ¿Que diferencias hay entre una centrífuga común, una súper-centrífuga y una
ultracentrífuga?
3. ¿Que fuerzas intervienen sobre las moléculas en una experiencia de centrifugación?
4. ¿Cuáles son las ecuaciones de la velocidad de sedimentación y el coeficiente de
sedimentación? ¿De qué dependen?
5. Respecto a la velocidad de sedimentación, ¿cómo depende la distancia migrada hacia el
fondo de la celda con el tiempo de sedimentación?
6. a) Defina fuerza centrífuga relativa (FCR) o g.
b) Demuestre que la FCR = 11,19 10-6 cm-1. rpm2. r (cm).
7. Dado el siguiente rotor de ángulo fijo, en el que las distancias mínimas y máximas al rotor
son respectivamente 4.8 cm y 8 cm (media = 6,4 cm).
a) Calcular las rpm necesarias para centrifugar alternativamente a 50.000 g y a 100.000 g. b)
A cuántas rpm debería centrifugar para sedimentar una proteína cuyo S = 2 o una cuyo S =
10, en 2 h. c) Si las máximas rpm que puede alcanzar son 20.000, con un rotor de r (menisco)
= 4.8 cm y r (máximo) = 8 cm, calcule el valor mínimo de coeficiente de sedimentación
deben tener las partículas para sedimentarlas en 1 h. Esas partículas ¿serán proteínas?
8. Sobre los métodos de velocidad de sedimentación: a) ¿Qué diferencia hay entre velocidad
de sedimentación de frente y de zona, y que utilidad tiene cada uno? b) Explique cómo se
produce el proceso de separación en una experiencia de velocidad de sedimentación de zona
y frente. Para un sistema de tres componentes (solvente y dos solutos macromoleculares),
trace un diagrama aproximado de la variación de concentración en función del radio, a
tiempo cero y a un tiempo en el que se ha producido la separación.
9. El método de centrifugación en gradiente de densidad, generado con una sal de alta
densidad, tal que en un punto del mismo la densidad es mayor que la de las moléculas que
sedimentan, es un método de equilibrio de sedimentación. Explique qué diferencia presenta
respecto de los de velocidad de sedimentación, cómo se produce el proceso de separación, y
en función de que propiedad se separan los componentes en cada caso.
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10. Se ha estudiado por medio de la centrífuga el efecto de la pepsina (enzima) sobre una
pseudoglobina diftérica antitóxica obtenida del cobayo. Los coeficientes de sedimentación
antes y después del tratamiento con pepsina fueron 7,2 y 5,7 Sbedverg, respectivamente, y los
correspondientes coeficientes de difusión fueron 3,9 10-7 y 5,8 10-7 cm2/seg. Se supone que el
volumen específico parcial de la proteína es el mismo antes y después del tratamiento y tiene
un valor de: v2 = 0.745 cm3/g. Considerar = 1 g/cm3 la densidad del agua a 20 ˚C. Determinar
el efecto del tratamiento con pepsina sobre la toxina diftérica.
11. En un experimento de velocidad de sedimentación de frente, se centrifuga una proteína
durante 2 h a 52.000 rpm. A distintos tiempos, se obtienen fotografías del frente,
determinados por óptica de Schlieren, obteniéndose los siguientes datos:
Tiempo (min) 20 40 60 80 100
Distancia al eje de giro (cm) 6,38 6,51 6,63 6,77 6,9
Calcule el coeficiente de sedimentación de la proteína.
12. La DNA ligasa de E. coli tiene un peso molecular de 74.000 y un v2 = 0.737 cm3/g. Se
somete a una experiencia de velocidad de sedimentación de frente en una ultracentrífuga
analítica y se obtienen los valores de radios a los que se observa el frente a distintos tiempos
que se muestran en la tabla.
Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 120 140
R (cm) 5.991 6.0217 6.1141 6.2068 6.3040 6.4047 6.5133 6.6141
Calcular el coeficiente de sedimentación y el de fricción (dens solv = 1 g/cm3)
13. El ADN de un virus polyoma posee un coeficiente de sedimentación S = 20. La digestión
con una DNasaI produce un cambio del coeficiente que adopta un valor S = 16. Esta
disminución del coeficiente podría ser debida a una disminución de la masa molecular, o a un
cambio conformacional. Explique qué experimentos podría realizar para decidir entre ambas
posibilidades. Analice tanto en base a otras metodologías como en base a otro método de
sedimentación.
14. Efectúe un diagrama de los distintos procesos de centrifugación que se podrían emplear
para efectuar un fraccionamiento subcelular, a partir de un homogenado.
