PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

Departamento de Genética y Microbiología

Universidad de Murcia
Curso 2012/2013

Alumno/a:……………………………………………………
 Normas del laboratorio

NORMAS GENERALES DE TRABAJO

EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde

se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a
cabo con toda escrupulosidad, una buena técnica aséptica, un ambiente limpio y
ordenado y trabajando siempre en condiciones de esterilidad (en la proximidad de la
llama de un mechero).
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos,
todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución
por su potencial patógeno.

Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:

1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y

medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa,
etc.) contaminen nuestras muestras.

Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de BUENAS

PRÁCTICAS DE LABORATORIO:

1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.

2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y
jabón.
3. Es imprescindible que las personas que tengan el pelo largo se lo recojan lo máximo
posible para tener la cara despejada y que no ocurran accidentes durante el trabajo
en las mediaciones del mechero.
4. El orden y la limpieza deben presidir todas las prácticas de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a colocar donde lo ha
encontrado todo el material o eliminar convenientemente el que sea de desecho.
Asimismo, los libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en
la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
5. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben
evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
6. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
7. Trabajar con calma y concentración.
8. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados,
que serán esterilizados posteriormente. Existen unos botes convenientemente
rotulados donde se depositan los portas sucios. Asimismo, todo material
contaminado (puntas de pipetas, torundas de algodón…) se depositará en unos
contenedores de color amarillo que se encuentran en el puesto de trabajo. Las
placas Petri contaminadas son recogidas por el servicio de residuos de la
Universidad de Murcia en un contenedor de color negro que se encuentra al lado
de la puerta del laboratorio.
9. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
10. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que
es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.

1
 Normas del laboratorio

11. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de
las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho
cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
12. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios,
deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
13. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se
depositen en ellos la grasa de las manos.
14. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea
clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre
anotados cuidadosamente apenas se conozcan.
15. No tocar con las manos y menos con la boca los cultivos o productos químicos.
En consecuencia, no se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre
pipeteadores manuales.
16. Mientras que se trabaja en el laboratorio cada alumno debe ser autosuficiente, de
forma que dejaremos preparado todo lo que necesitamos antes de comenzar una
inoculación o siembra. De igual modo, aunque ello implique que tardamos un poco
más, nos debemos acostumbrar a manipular los tapones de los tubos, tapaderas de
placas Petri, etc, sin necesitar la ayuda del compañero de grupo.
17. Evitar hablar, toser, estornudar, etc., durante las etapas de toma de muestras,
siembras… siempre que no sea estrictamente inevitable y, en ese caso, nunca sobre
el trabajo que se esté realizando, sino fuera de su área.
18. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos,
etc.) se comunicará inmediatamente al profesor de prácticas.

Fig. 1.- Uso del agitador vórtex para

homogeneizar las diferentes
diluciones. Observe que el dedo
índice se mantiene siempre sobre
el tapón mientras que el resto
sujetan firmemente el tubo de
ensayo.

Fig. 2.- Durante el manejo de tubos

de ensayo, para tomar una
muestra o para inocular dichos
tubos, se debe flamear la boca
del tubo tras abrirlo y justo antes
de cerrarlo. Observe en el dibujo
cómo se puede sujetar el tapón
del tubo mientras se está
manipulando.

2
PRÁCTICA 1: AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Día 1)
- Normas de trabajo en el laboratorio de Microbiología.
- Material y Medios de cultivo usados en microbiología. Utilización de medios
selectivos y diferenciales.
- Manipulación del material estéril.
- Técnicas básicas de aislamiento, siembra y recuento de microorganismos. Siembra
por estría en placa y agotamiento del asa.
- Aislamiento en medio sólido: Agar nutritivo y Agar MacConkey.

Fig. 3.- Protocolo a seguir para la siembra en estría o por agotamiento del asa.

3
Agar nutritivo.
Medio económico para cultivar microorganismos que no sean muy exigentes en sus requerimientos
nutritivos.

Composición: g/l
Peptona de gelatina 5
Extracto de levadura 3
Agar 15
pH: 6.8 ± 0.2.

Agar MacConkey.
Medio diferencial para la detección, aislamiento y recuento de bacterias coliformes y patógenos
intestinales en aguas, productos lácteos y muestras biológicas. Es un medio selectivo por contener sales
biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. Es también un medio
diferencial, porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azúcar
producirán un cambio en el pH del medio por la liberación de productos ácidos. Como consecuencia sus
colonias aparecerán de color rojo, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias de bacterias
incapaces de fermentar la lactosa.

Composición: g/l
Peptona de gelatina 7
Mezcla de peptonas 3
Cloruro sódico 5
Sales biliares 1.5
Cristal violeta 0.001
Lactosa 10
Agar 13.5
Rojo neutro 0.05
pH: 7.1 ± 0.2.

Día 2)
- Análisis de las características macroscópicas del crecimiento bacteriano en medios
sólidos. Lectura y discusión de los aislamientos del día anterior.

1. Redonda 2. Redonda con 3. Redonda con 4. Arrugada

márgenes sinuosos márgenes elevados

5. Concéntrica 6. Irregular y 7. Filamentosa 8. Forma de L

extendida

9. Redonda con 10. Filiforme 11. Rizoide 12. Compleja 13. Fusiforme
márgenes radiales

Fig. 4.- Algunos tipos de morfología colonial.

4
PRÁCTICA 2: TINCIONES MICROBIOLÓGICAS
Día 1)
- Uso del microscopio para la observación de preparaciones teñidas.
- Tipos de tinciones.
- Tinción simple.
- Tinción de Gram: fundamento y técnica.
Día 2)
- Tinción de Ziehl-Neelsen: fundamento y técnica.
- Tinción de Wirtz de endosporas.

TIPOS DE TINCIONES:

1. Tinciones simples: utilizan un solo colorante.

2. Tinciones negativas: no tiñen la muestra sino el medio externo. Ejemplo: tinta
china.
3. Tinciones diferenciales: usan más de un colorante. Tienen carácter taxonómico.

3.a) Tinción de Gram.

3.b) Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-alcohol resistencia).

4. Tinciones específicas o estructurales: permiten contrastar estructuras celulares.

4.a) Tinción de esporas (de Wirtz).

4.b) Tinción de cápsulas.
4.c) Tinción de flagelos.

TINCIÓN SIMPLE

1. Realizar el frotis: La realización del frotis consta de 3 pasos. A) Extensión: poner

una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de
siembra. B) Secado: Generalmente se hace al mismo tiempo que la fijación. C)
Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero, sin
calentar en exceso (comprobar temperatura sobre la mano), hasta que se seque.
2. Añadir un colorante de estos: Azul de Metileno, Safranina o Cristal Violeta (5 min).
3. Lavar la muestra con abundante agua destilada.
4. Secar la preparación sobre papel de filtro.
5. Observar con objetivo de 100 x y aceite de inmersión. Movimiento del objetivo
siempre alejándose de la preparación.

Bacillu s subtilis

5
TINCIÓN DE GRAM

1. Realizar el frotis: La realización del frotis consta de 3 pasos. A) Extensión: poner

una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de
siembra. B) Secado: Generalmente se hace al mismo tiempo que la fijación. C)
Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero, sin
calentar en exceso (comprobar temperatura sobre la mano), hasta que se seque.
2. Cubrir la muestra con Cristal Violeta (3 min) = colorante principal.
3. Tirar el exceso de colorante (no lavar con agua).
4. Cubrir la muestra con Lugol (I2 + IK) (1 min) = mordiente
5. Lavar con agua destilada.
6. Decolorar con alcohol de 96% (gota a gota hasta que deje de desprenderse color violeta).
7. Lavar con agua destilada.
8. Cubrir la muestra con Safranina (5 min) = colorante de contraste.
9. Lavar con agua destilada.
10. Secar la preparación sobre papel de filtro.
11. Observar con objetivo de 100 x y aceite de inmersión. Movimiento del objetivo
siempre alejándose de la preparación.

Staphylococcus aureus en azul (Gram+) y Escherichia coli en rosa (Gram-)

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (Ácido-Alcohol Resistencia)

1. Realizar el frotis: La realización del frotis consta de 3 pasos. A) Extensión: poner

una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de
siembra. B) Secado: Generalmente se hace al mismo tiempo que la fijación. C)
Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero, sin
calentar en exceso (comprobar temperatura sobre la mano), hasta que se seque.
2. Cubrir la muestra con Fucsina fenicada y aplicar calor (5 min): el colorante no
debe agotarse ni hervir.
3. Lavar con agua destilada.
4. Aplicar alcohol ácido (10 min, cambiando el alcohol ácido cada 30 seg).
5. Lavar con agua destilada.
6. Cubrir la muestra con Azul de Metileno (5 min).
7. Lavar la muestra con agua destilada.
8. Secar la preparación sobre papel de filtro.
9. Observar con objetivo de 100 x y aceite de inmersión. Movimiento del objetivo
siempre alejándose de la preparación.

6
TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ)

1. Realizar el frotis: La realización del frotis consta de 3 pasos. A) Extensión: poner

una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el asa de
siembra. B) Secado: Generalmente se hace al mismo tiempo que la fijación. C)
Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero, sin
calentar en exceso (comprobar temperatura sobre la mano), hasta que se seque.
2. Cubrir la muestra con Verde de Malaquita y aplicar calor (10 min): el colorante
no debe agotarse ni hervir.
3. Lavar con agua destilada.
4. Cubrir la muestra con Safranina (10 min).
5. Lavar la muestra con agua destilada.
6. Secar la preparación sobre papel de filtro.
7. Observar con objetivo de 100 x y aceite de inmersión. Movimiento del objetivo
siempre alejándose de la preparación.

Bacillus subtilis

PRÁCTICA 3: RECUENTO DE
MICROORGANISMOS VIABLES
Día 1)
- Aislamiento y recuento de microorganismos viables mediante la técnica de siembra
en superficie o por extensión en una muestra de suelo. Técnica de las diluciones
seriadas.
- Análisis de microorganismos presentes en derivados lácteos: yogurt y kéfir.

Día 2)
- Lectura y discusión de resultados de las siembras del día anterior. Recuento del
número de viables presentes en la muestra de suelo.
- Observación al microscopio y tinción de microorganismos presentes en algunas de
las colonias aisladas del suelo.

7
 9 ml SS estéril

10-3 g/ml 10-4 g/ml

10-2 g/ml asa Drigalski

10-4 g 10-5 g de suelo

Fig. 5.- Recuento de microorganismos viables mediante siembra por extensión (o en superficie)
para la muestra de suelo. Modificado a partir de Gamazo et al. (2005), Manual práctico de Microbiología, Ed. Masson.

PRÁCTICA 4
Día 1)
- Caracterización bioquímica de microorganismos y aplicación para su identificación.
Siembra de pruebas: Hugh-Leifson (O/F), Kligler y Catalasa.
Día 2)
- Lectura y discusión de los resultados obtenidos en las pruebas anteriores.

1. PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (O/F) DE AZÚCARES

(HUGH-LEIFSON).

Objetivo:
Determinar la capacidad de producción de ácidos a partir de azúcares por los
microorganismos. Estos ácidos pueden originarse bien por metabolismo fermentativo
(p. ej. miembros de la familia Enterobacteriaceae) u oxidativo (miembros de la familia
Pseudomonadaceae).
En base al tipo de metabolismo y modo de crecimiento en los tubos empleados
en la prueba, se podrá determinar cuál es la dependencia del oxígeno por parte del
microorganismo.
También se podrá determinar la movilidad del microorganismo mediante la
observación del crecimiento del microorganismo en la siembra en picadura.

8
Técnica:
1) Inocular el microorganismo problema por picadura en dos tubos con medio Hugh-
Leifson que incluye como indicador de pH azul de bromotimol (verde a pH 7,
amarillo a pH < 7 y azul intenso a pH > 7).
2) Cubrir uno de los tubos con aceite de vaselina estéril para asegurar anaerobiosis, el
cuál se denominará (F) y mantener el otro tubo sin cubrir (O). Para coger el aceite
de vaselina usar pipetas Pasteur estériles y poner 10-12 gotas de aceite.
3) Incubar a 37ºC durante 24 h.

Resultado:
Los microorganismos anaeobios facultativos y los aerotolerantes podrán crecer en
los dos tubos (O y F), lo que quedará de manifiesto por el color amarillo del medio
debido al descenso del pH originado por la liberación de ácidos.

Los microorganismos oxidativos solamente crecerán en la superficie del medio del

tubo (O) que aparecerá de color amarillo. Estos microorganismos son aerobios estrictos.

Además, si la siembra en picadura se ha hecho correctamente se puede determinar la

movilidad del microorganismo: si crece localizado en la picadura será inmovil y si
además de en la picadura se observa turbidez en el medio circundante será móvil (la
baja concentración de agar del medio empleado permite que las bacterias lo invadan si
son móviles).

2. PRUEBA DE LA CATALASA

Objetivo:
Comprobar la presencia del enzima catalasa que desdobla el peróxido de
hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.
Junto con la superóxido dismutasa y la peroxidasa, la catalasa protege a las
células de la presencia de radicales tóxicos libres derivados del metabolismo del
oxígeno (O2-, H2O2, OH-).

Se encuentra presente en microorganismos aerobios y anaerobios facultativos.

Los anaerobios aerotolerantes en vez de catalasa tienen peroxidasa que cumple la misma
función de desdoblamiento del peróxido de hidrógeno, pero sin liberar oxígeno. Los
microorganismos anaerobios estrictos no tienen ninguno de los enzimas antes
mencionados, por lo que no pueden vivir en presencia de oxígeno.
Permite diferenciar facilmente los géneros Streptococcus (-) de Micrococcus (+)
y Staphylococcus (+), así como Bacillus (+) de Clostridium (-).

Técnica:
1) Colocar una gota de H2O2 al 30% en un porta limpio.
2) Con el asa de siembra, previamente flameada, coger una colonia (o masa microbiana
de un cultivo puro) procedente del aislamiento en placa de la bacteria problema.
3) Depositar dicha colonia sobre la gota de H2O2.

Resultado:
Si se observa desprendimiento inmediato de burbujas (como consecuencia de la
liberación de O2) el microorganismo es catalasa positivo.

9
Reacción catalizada por la catalasa: 2 H2O2 2 H2O + O2

3. PRUEBA DE LA OXIDASA.

Objetivo:
Determinar la presencia de Citocromo C en la Cadena de Transporte de
Electrones. Los microorganismos oxidasa (+) poseen Citocromo c y pueden crecer en
presencia de oxígeno. Son oxidasa (+) algunos microorganismos aerobios y algunos
anaerobios facultativos.
Esta prueba permite distinguir facilmente los miembros de la familia
Pseudomonadaceae (generalamente oxidasa +) o de la familia Vibrionaceae (oxidasa +)
de los de la familia Enterobacteriaceae (oxidasa -) muy relacionada con la familia
Vibrionaceae.

Técnica: Se basa en sustituir los aceptores de electrones naturales presentes en los

microorganismos por sustratos artificiales activables por el sistema citocromo c oxidasa.
Para ello se utiliza el reactivo Kovacs para la oxidasa (diclorhidrato de tetrametil para-
fenilen diamina al 1% en H2O). Este compuesto actúa como dador artificial de
electrones para el citocromo c. Tras ceder electrones se oxida transformándose en
Indofenol (compuesto de color azul-violeta).
1) Depositar unas gotas de reactivo Kovacs sobre un papel de filtro.
2) Con un palillo de madera estéril coger una colonia (o masa microbiana de un cultivo
puro) procedente del aislamiento en placa de la bacteria problema.
3) Extender la colonia sobre el reactivo depositado en el papel de filtro.

Resultado:
Una reacción positiva implica la aparición de color azul-violeta intenso a los 10-
15 segundos (la lectura a largos tiempos puede dar falsos positivos).

Esquematicamente:
5

½ O2

Cit b Cit c Citaa3

H2O

CH3 CH3
N

O= = N- -O

N
CH3 CH3

Tetrametil p-fenilen diamina Indofenol (azul-violeta)

10
4. PRUEBA DE KLIGLER (AGAR DE HIERRO DE KLIGLER).

Objetivo:
El agar de hierro de Kligler es un medio diferencial preparado en tubo (tubo de
agar inclinado) que, sembrado adecuadamente, puede ofrecernos mucha información
acerca de la bacteria que se está analizando.
Está especialmente indicado para la caracterización de Enterobacterias
(microorganismos anaerobios facultativos).

Permite determinar:
Requerimiento de O2
Uso de diferentes fuentes de carbono:
Utilización de la glucosa
Utilización de la lactosa
Uso de las peptonas como fuente de carbono
Producción de SH2
Producción de gas (CO2 + H2)

Técnica:
1) Inocular la bacteria problema por picadura en “el taco” de agar del fondo de un tubo
con medio Kligler.
2) Inocular la bacteria problema por extensión en la superficie inclinada del mismo
tubo anterior con medio Kligler.
3) Incubar a 37ºC entre 18 y 24 h (importante no sobrepasar este tiempo).

Antes de leer los resultados hay que tener en cuenta que el indicador de pH que lleva
el medio Kligler es rojo de fenol y sus condiciones de viraje son: rojo a pH alcalino,
anaranjado a pH neutro y amarillo a pH ácido.

Resultado:
Requerimiento de O2: si la bacteria sólo crece en la superficie inclinada será
aerobia estricta. Si crece tanto en la superficie como en el fondo podrá ser anaerobia
facultativa o ser aerotoleante. Esto y el tipo de metabolismo, oxidativo y/o fermentativo,
de estos microorganismos se debe tener en cuenta a la hora de interpretar el resto de
resultados.

Utilización de la glucosa y no de la lactosa: la superficie inclinada se observa

alcalina (roja) por utilización de la peptona tras haber agotado la glucosa, mientras que
el fondo del tubo presenta reacción ácida (amarillo) por la fermentación de la glucosa.

Utilización de la lactosa: una bacteria que metaboliza la lactosa es capaz de

utilizar la glucosa previamente. Como consecuencia del uso de ambos azúcares se
observa reacción ácida (amarillo) tanto en el fondo del tubo como en la superficie.
No utilización de glucosa ni de lactosa: se observa reacción alcalina en la
superficie y en el fondo del tubo. Aquí el microorganismo crece a expensas de la
peptona alcalinizando el medio (rojo). Ej. Alcaligenes faecalis.

Producción de SH2: se detecta en forma de sulfuro de hierro mediante un

precipitado negro en el fondo del tubo (en anaerobiosis, ya que el H 2S se forma como

11
consecuencia de la utilización del tiosulfato del medio como aceptor de electrones
durante una respiración anaerobia).

Producción de gas (CO2 + H2): la fermentación de los azúcares del medio puede
realizarse con producción o no de gas. Este gas se observa mediante la aparición de
burbujas o rotura del agar.

MEDIOS DE CULTIVO USADOS EN LAS PRUEBAS

BIOQUÍMICAS

Medio Hugh-Leifson Agar de Hierro de Kligler (KIA)

Peptona 2g Peptona 20g

MgSO4 0,2 g Lactosa 10g
NaCl 5g Glucosa 1g
Agar 3g Citrato sódico 2g
Azul de Bromotimol 0,03 g NaCl 5g
Un azúcar (p.ej. glucosa) 10 g Citrato férrico 0,5g
Agua destilada 1l Na2S2O3 0,5g
pH= 7,10,2 Agar 15g
Rojo de Fenol 0,025g
Agua destilada 1l
pH= 7,40,2

Agar LB (Luria-Bertani)

Triptona 10 g
Extracto de Levadura 5g
NaCl 10 g
Agar 15 g
Agua destilada 1l
pH= 7,00,2

PRÁCTICA 5

Objetivo:

12
- Técnica de la doble capa de agar para la visualización y el recuento de
bacteriófagos en agua contaminada (UFP/ml).

Día 1)
Los virus, como la mayoría de los parásitos, son muy específicos en relación con
los hospedadores que parasitan. Algunos virus son específicos de bacterias y se
denominan virus bacterianos, bacteriófagos o fagos. La mayoría de las bacterias son
susceptibles a ataque por bacteriófagos. Un fago está constituido por un cromosoma de
ácido nucleico (DNA o RNA) rodeado por una cubierta de moléculas de proteína.
Durante la infección el fago se adsorbe a una bacteria e inyecta su material genético
dentro del citoplasma. La información genética del fago pasa entonces a controlar la
maquinaria de la célula bacteriana, utilizándola para la síntesis de los componentes del
fago y su posterior ensamblaje (multiplicación).
Finalmente, se liberan nuevos fagos cuando la pared de la célula bacteriana se
rompe. Este proceso de rotura se denomina lisis. Tras la lisis, los fagos descendientes
infectan a las células vecinas. Este fenómeno produce un incremento exponencial en el
número de células lisadas. Quince horas después del comienzo de un experimento del
tipo doble placa de agar, pueden verse los efectos a simple vista: se observa un área
clara, calva o halo, en el césped opaco de bacterias sobre la superficie de una placa de
medio sólido.
Dependiendo del fago, estos halos pueden ser grandes o pequeños, claros o
turbios, etc. Por tanto, la morfología del halo es un carácter del fago que pueden ser
objeto de análisis.
Otro carácter fenotípico de los fagos que puede analizarse fenotípicamente es el
rango de hospedadores. Ciertas estirpes bacterianas son inmunes a la adsorción o
inyección de material genético por fagos. Los fagos, a su vez, pueden diferir en el
espectro de estirpes bacterianas a las que infectan y lisan.

Técnica:

1) Realizar diluciones de la muestra, previamente diluida ( ). Tomamos con la ayuda de una

pipeta 1 ml de la muestra y realizamos sucesivamente las diluciones 10 −2 y 10−3.
2) Añadimos a cada tubo con LB agar blando (0,7%), 0,5ml de cada dilución y 0,5ml
de cultivo (E. coli).
3) Agitamos (evitando que se formen burbujas) y vertemos el contenido sobre una
placa con agar base, procurando una distribución uniforme.
4) Una vez solidificada la doble capa, incubamos las placas a 37ºC entre 18 y 24 h.

Día 2)
- Recuento de calvas de virus y estimación de Unidades Formadoras de Placas
(UFP/ml) en la muestra original.

13
Debéis entregar únicamente el cuestionario cumplimentado y con vuestro nombre.

ALUMNO/A:

CUESTIONARIO.

1. ¿Cuáles son los tres tipos principales de cultivo atendiendo a su estado físico?

2. ¿Qué asa de siembra utilizarías para inocular a partir de un cultivo en medio líquido?

3. ¿Qué componentes son característicos de los medios de cultivo complejos?

4. ¿Cómo esterilizarías un medio de cultivo líquido?

5. ¿Por qué deben incubarse invertidas las placas Petri?

6. ¿Cuál es la fuente de carbono en el medio agar nutritivo?

7. ¿Qué se pretende conseguir con la técnica de siembra en estrías o por agotamiento de

masa?

8. ¿Por qué se define el medio agar MacConkey como un medio selectivo y diferencial?

9. ¿Por qué se dan los resultados de los recuentos en placa en UFC/ml?

14
10. De los siguientes tipos de morfología colonial señale aquellos que ha observado en
las placas de recuento.

1. Redonda 2. Redonda con 3. Redonda con 4. Arrugada

márgenes sinuosos márgenes elevados

5. Concéntrica 6. Irregular y 7. Filamentosa 8. Forma de L

extendida

9. Redonda con 10. Filiforme 11. Rizoide 12. Compleja 13. Fusiforme
márgenes radiales

MÁRGENES ELEVACIÓN

1. Entera 2. Ondulada 3. Lobulada 1. Plana 2. Elevada 3. Convexa

4. Dentada 5. Ciliada 6. Ramificada 4. Pulvinada 5. Umbilicada 6. Montuosa

7. Lanuda 8. En hebras 9. Como bucles 7. Se adentra en el medio 8. Crateiforme

de pelo

11. ¿Qué indica esta heterogeneidad?

12. Supongamos que obtenemos 78 colonias y 82 en dos placas de la misma dilución,

habiendo sembrado 0,2 ml de la dilución 10 -5 de la muestra original. ¿Cuál es el número
de UFC/ml de la muestra original?

13. Escriba los resultados que ha obtenido en los recuentos realizados mediante la
técnica de siembra de diluciones seriadas, indicando:
tipo de muestra:
dilución sembrada:
colonias contadas en cada placa:
resultado de UFC/ml:

15
14. ¿Cuál es el propósito de la fijación de la muestra?

15. ¿Qué información obtenemos de una tinción simple?

16. ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una tinción diferencial?

17. Indica, atendiendo a su función, los reactivos que has utilizado en la tinción de
Gram:

a. mordiente:
b. colorante primario:
c. decolorante:
d. colorante de contraste:

18. ¿Qué fase es crítica durante el desarrollo de la tinción de Gram? ¿Por qué?

19. ¿Por qué debemos utilizar cultivos jóvenes para realizar la tinción de Gram?

20. ¿Que parte de la célula está implicada en la tinción de Gram? ¿Por qué?

21. ¿Donde localizan las endosporas en células de un cultivo en crecimiento?

22. Indica, atendiendo a su función, los reactivos que has utilizado en la tinción de
esporas:

a. mordiente:
b. colorante primario:
c. decolorante:
d. colorante de contraste:

16
23. Nombra dos enfermedades causadas por bacterias esporulantes.

a.
b.

24. ¿Que tienen en común la tinción de esporas con la tinción de Ziehl–Neelsen?

25. ¿Cuál es el propósito del tiosulfato en el medio agar Kligler?

26. ¿Cómo se refleja la utilización de peptona por parte de las bacterias en el medio agar
Kligler?

27. ¿Que importancia tiene para la célula la actividad catalasa?

28. Agrupa en esta tabla los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas (+/-):

KLIGLER

Nombre O/F Mov. CAT. Gluc. Lac. SH2 Gas

29. Indique el resultado obtenido en el recuento de bacteriófagos de la muestra

problema. ¿Qué indica la presencia de bacteriófagos en la muestra de agua?

17