Universidad de Antioquia
Laboratorio de Bioquímica
Espectrofotometría y curva de calibración
Andrea Estrada Ramirez
Sara Valentina Gómez Orozco
Docente: Jaime Andrés Pereañez Jimenez
Medellín
Química Farmacéutica
26 de mayo 2023
Introducción
Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado en química, bioquímica, física y
otras disciplinas científicas para medir la cantidad de luz absorbida o transmitida por
una muestra en función de la longitud de onda. El dispositivo permite cuantificar la
cantidad de luz absorbida por una sustancia y generar un espectro de absorción.[1]
El principio básico de funcionamiento de un espectrofotómetro se basa en la ley de
Beer-Lambert, que establece que la absorbancia de una muestra es proporcional a
la concentración de la sustancia y a la longitud de trayectoria de la luz a través de la
muestra. Este instrumento proporciona una lectura de absorbancia o transmitancia
para cada longitud de onda seleccionada, lo que permite construir un espectro de
absorción. [2]
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra. La
transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y
transmitida al pasar por la muestra. Por otro lado, la absorbancia (A) es un concepto
más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida
por la misma. La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa
la luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste. [1]
Resultados
Sustancia: Azul de Bromofenol
Longitud de onda: 591 nm
TUBO Blanco 1 2 3 4 5 6 7
Dilución 0 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Solución 0 4 0 0 0 0 0 0
patrón (ml)
Cantidad de 0 0 0 2 2 2 2 2
solución
anterior (ml)
Agua 4 0 0 2 2 2 2 2
destilada
concentració 4,01x10 2,005x10 1,003x10 5,013x10 2,506x10 1,253x10 6,266x10
-5 -5 -5 -6 -6 -6 -7
n (mol/L)
Absorbancia 1,291 0,647 0,324 0,166 0,069 0,035 0,002
obtenida
Tabla N°1. Datos obtenidos en los patrones para la curva de calibración.
Gráfica N°1. Curva de calibración de azúl de bromofenol
Absorbancia obtenida de la muestra problema: 0,643
Ecuación de la recta:
y = 32465 x - 0,0071
Concentración de la muestra problema:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 + 0,0071
[ ] muestra problema =
32465
0,643 + 0,0071
[ ] muestra problema =
32465
= 2,0024x10-5M
Análisis de resultados
El principio de la espectrofotometría se basa en que las moléculas pueden absorber
energía en forma de luz, esto le da una alta precisión en la detección de las
moléculas, por ende, en la respuesta del equipo por la concentración contenida en
la muestra analizada; la luz está compuesta de fotones, los cuales al chocar con las
moléculas le confieren energía, pasándolas de un estado basal o fundamental a uno
excitado, almacenando esta energía como interna. Una particularidad de cada
molécula es que absorbe sólo la cantidad de energía necesaria para pasar de un
estado a otro, con lo cual se puede explicar las diferentes longitudes de onda que se
diferencian entre moléculas [1].
Figura 1. ilustración paso de estado basal a excitado.
Para la expresión matemática del fenómeno de la absorción de las moléculas se usa
la ley de Beer-Lambert, en la cual se tienen tres consideraciones importantes. La
cantidad de moléculas que absorbe la luz en su trayectoria (concentración), la
distancia que debe atravesar la luz por la muestra (distancia) y finalmente, la
probabilidad del fotón a una longitud de onda proporcionada pueda absorberse (ε).
La ley de beer establece una relación directamente proporcional entre la
concentración y la absorción de la luz proporcionada (a mayor número de moléculas
mayor interacción, absorbancia) [1][3].
Figura 2. Ecuación de Beer.
Sin embargo, se deben tener en cuenta varios factores que intervienen en el
cumplimiento de esta ley; a concentraciones altas la distancia entre las moléculas es
muy pequeña afectando las cargas y por ende, la capacidad de absorción de las
mismas provocando cambios en la linealidad de la curva. Se debe tener en cuenta
que con la intensidad de la luz se pueden presentar fenómenos de dispersión,
reflexión, etc. y finalmente, la falta de uniformidad en la muestra puede afectar la
variable respuesta [4].
La ley anteriormente mencionada permite entender que la relación entre las dos
variables involucradas es una línea recta, lo cual propicia una curva de calibración;
para el desarrollo de la práctica se realizaron y se analizaron patrones de azul de
bromofenol con concentraciones conocidas para elaborar una curva apropiada a fin
de conocer la concentración de la muestra problema. la ecuación de la recta se
interpreta de la siguiente manera:
y (absorbancia) = m x (concentración) + b
Se puede observar que en la gráfica 1, la curva sigue la tendencia esperada de
proporcionalidad siguiendo la ley de beer, lo que da un buen indicio de la calidad de
los datos tomados y analizados, siendo el coeficiente de determinación (R2) de
0,9998; para calcular la concentración de la muestra problema en primera instancia
se evalúa que la absorbancia obtenida se encuentre dentro de los valores obtenidos
por los patrones, para de esta manera realizar una interpolación que permita hallar
con mayor precisión la concentración buscada. En este caso se cumple con esta
condición y finalmente se obtiene una concentración de 2,0024x10-5M.
Conclusiones
La práctica de espectrofotometría fue realizada de manera satisfactoria, se logró
construir una curva de calibración lineal de acuerdo a los datos obtenidos
experimentalmente, pudiendo determinar la concentración de la muestra problema.
Gracias a la práctica anteriormente expuesta se pudo adquirir experiencia, habilidad
y entendimiento de esta técnica tan importante y tan útil para la industria, ya que es
sencilla y sensible para la valoración de concentraciones en diferentes matrices.
Preguntas
1. ¿Qué es una curva de calibración?
Una curva de calibración es la representación gráfica que relaciona una señal
instrumental (en este caso el espectrofotómetro) en función de la concentración de
un analito. La solución patrón con concentración conocida, es usada para preparar
soluciones con distinta concentración y obtener una curva de calibración, lo que se
busca es una respuesta instrumental proporcional a la concentración del analito [5].
2. ¿Qué características debe cumplir?
La curva de calibración se realiza mediante un modelo que consiste en encontrar la
recta de calibrado que mejor se ajuste a la serie de puntos experimentales. Cada
punto se encuentra definido por la variable “x” (independiente) que es la
concentración del analito, y una variable “y” (dependiente) que es la respuesta
instrumental, en este caso la absorbancia obtenida del espectrofotómetro. La recta
de calibración está definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m),
mediante la ecuación y = mx + b. [5]
Las anteriores características de la curva de calibración, permiten obtener el
coeficiente de determinación (R2) que debe cumplir con ser mayor a 0,995.
3. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas?
Sí, es posible construir una curva de calibración utilizando sustancias no coloreadas
en espectrofotometría. Aunque a menudo se asocia con la medición de sustancias
coloreadas, también se puede utilizar para medir sustancias incoloras. Estas no
absorben la luz visible, pero pueden absorber la luz en otras regiones del espectro
electromagnético, como el ultravioleta.
4. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las
mediciones de la curva de absorción?
Debido a que 591 nm es la longitud de onda donde el azul de bromofenol alcanza la
mayor absorbancia. Es esta longitud de onda la que se usa para hacer
determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto, por ejemplo, para
determinar la concentración, como es el caso de esta práctica. [1]
5. ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?
La pendiente de la curva de calibración indica la tasa de cambio de la absorbancia
en función de la concentración de la sustancia de interés. Cuanto mayor sea la
pendiente, mayor será la variación en la respuesta instrumental para un cambio
dado en la concentración.
6. ¿Qué son las desviaciones de la ley de Beer y cuáles son sus principales
causas?
Las desviaciones de la ley de Lambert-Beer son variantes que pueden ser de factor
de orden físico, químico o instrumental.
La principal causa física de desviación es que la absortividad varía con el índice de
refracción de la solución, lo que se pone en evidencia a concentraciones elevadas.
Experimentalmente se comprueba que la ley de Lambert-Beer se cumple cuando la
solución es diluida. A concentraciones altas la gráfica se inclina hacia este eje,
dando lugar a desviaciones negativas, que son indeseables pues conducen a un
error relativo en concentración cada vez más grande.
En lo referente a desviaciones de índole instrumental debe mencionarse que cada
instrumento, según su calidad, hace llegar a la cubeta una banda de longitudes de
onda, conocida como banda instrumental. [2]
Referencias
1. Díaz NA, Antonio Bárcena Ruiz J, Reyes EF, Cejudo AG, Novo JJ, Peinado
JP, et al. 8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas [Internet]. [Link]. [citado el 25 de mayo de
2023]. Disponible en:
[Link]
[Link]
2. Espectrofotometría: Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer [Internet].
[Link]. 2022 [citado el 26 de mayo de 2023]. Disponible en:
[Link]
3. Khan Academy. Introducción a la espectrofotometría [Internet]. 2011 [cited
2023 May 26]. Available from:
[Link]
termolecular-forces-and-properties/x2eef969c74e0d802:beer-lambert-law/v/sp
ectrophotometry-introduction
4. Alva H, Perfil VT mi. Limitaciones de la ley de Lambert-Beer [Internet].
[Link]. [cited 2023 May 26]. Available from:
[Link]
[Link]
5. Análisis químico, medir es comparar [Internet]. [Link]. 2017 [citado el 26
de mayo de 2023]. Disponible en:
[Link]
