UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

“Análisis de las alteraciones en células sanguíneas del pez

bagre (Ariopsis felis) de Tecolutla, Veracruz para
establecer un diagnóstico de salud”

TESIS
Que para obtener el grado de
MAESTRO EN BIOLOGÍA

P R E S E N T A:
Hidrobiólogo Misael Hernández Díaz

Comité Tutoral:

Director

Dra. Xochitl Guzmán García

Asesoras:

Dra. Edith Cortés Barberena

Dra. Marcela Galar Martínez

Ciudad de México, 13 de diciembre del 2018 .

i
 La Maestría en Biología de la Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Iztapalapa, pertenece al Padrón Nacional de Posgrados de

Calidad del CONACyT y cuenta con el apoyo del mismo convenio PFP-

20-93.

Con el número de beca: 789349

i
Esta Tesis forma parte del proyecto: “Indicadores de Integridad Ecológica y Salud

Ambiental”, aprobado por el departamento de Hidrobiología, Área de Manejo

Integral de Recursos Acuáticos (MIRA) en el laboratorio de Ecotoxicología de la

UAM-I.

Agradezco de manera especial el apoyo del personal del laboratorio de

Ecotoxicología, así como la asesoría en el montaje y análisis de técnicas tisulares a

la Biol. e H. T. Irma Hernández Calderas.

Agradecemos el apoyo del Dr. Juan Carlos Segoviano Ramírez encargado de la

Unidad de Bioimagen del Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias de la

Salud (CIDICS) de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL), por la asesoría

técnica y académica en la edición y análisis de fotomicrografías.

Asimismo, agradecemos el apoyo y asesoría del cDr. Felipe de Jesús Muñoz

González por su contribución y elaboración del programa de análisis histopatológico

titulado: IINDEX-PH: índice de impacto de contaminación y salud, utilizado en este

proyecto.

ii
Comité Tutoral

Directora.

Dra. Xochitl Guzmán García.

Laboratorio de Ecotoxicología. Departamento de Hidrobiología. División
de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma
Metropolitana, Iztapalapa.
Asesoras:

Dra. Edith Cortés Barberena.

Laboratorio de Biología Celular y Citometría de Flujo. Departamento de
Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa.

Dra. Marcela Galar Martínez.

Laboratorio de Toxicología Acuática. Departamento de Farmacia.
Instituto Politécnico Nacional, Zacatenco.

iii
iv
 Dedicatoria.

EL MAR… En tu orilla paz puedo sentir,

alguien me dijo que en ti
Donde hay historias de amor
encontró una razón para vivir.
que nunca se escribieron,
donde las olas vienen y van
¿A quién le importan los
siempre trayendo dulces
problemas
recuerdos.
si a tu lado, la vida
se transforma en un poema?
Escucho en una caracola el
susurro de tu voz,
En mis penas
te siento a mi lado, es la magia
tu brisa me acuna
del mar,
y en mis alegrías
me acerca a ti, me arrastran las
sólo mirarte me emociona.
olas…
Me pierdo en tu inmensidad
El mar.
y entre tus olas me dejo llevar.
Lugar infinito, lejano horizonte
No puedo sentir la soledad
donde tú estás…
porque siempre me queda el
mar.
Arena fría que no me dice nada
pues las olas borraron
aquellas cosas que escribías Jéssica Arias Mingorance
que terminaban en “te quiero”

El mar
Donde yo escribo estos versos
para ti, sin poderte olvidar.
Tú eres mi recuerdo, mi vida…

El mar…

A ti que, para hablar de amor

eres mi mayor inspiración.
v
Agradecimientos.
A mi abuelita, Bernardina Ramírez Miranda, el ser más maravilloso que he

conocido, una confidente que jamás me ha abandonado, la compañera con la que

reía y lloraba de mis éxitos y fracasos, un ángel que dejó este plano solamente para

seguir cuidándome en esta carrera llamada vida. Te amaré siempre y te llevo en mi

corazón Abue.

A mi madre, la Sra. Rita Díaz Ramírez quien gracias a su amor incondicional,

fortaleza, apoyo en momentos de confusión y comprensión así como regaños de

amor; me convirtieron en el hombre que soy. Gracias por sacarme adelante y

siempre creer en mí. Te amo mami.

A mi familia hermosa, Sarahí Hernández Díaz quien, además de ser mi mejor amiga

y compañera de videojuegos, me enseñó a creer en mí y a seguir mis sueños

cuando dudaba. Gracias hermana. Hobeth Hernández Díaz por su apoyo en la

transición de mi vida y consejos de crecimiento personal y profesional; y por darme

uno de los regalos más grandes en mi vida junto a Irma Rocío Espinosa Escobar,

mis sobrinos hermosos: Sofía Yaretzi y Elían Itzae con los que juego y cuido como

mis más grandes tesoros. Finalmente a mi Padre José Asunción Hernández

Hernández cuyas enseñanzas de vida me motivaron a seguir el camino del éxito.

A mis amigos, el M. en B. José Roberto Jerónimo Juárez por sus sabios consejos,

abrazos, regaños y días de alegría, te quiero mucho amiguito. Al Biol. José Ángel

Vázquez Castro por los momentos de felicidad y estrés que compartimos y que

6
reíamos cuando nos distraíamos bailando. A la Biol. Alejandra Reyes Márquez por

esos días de tomar té e infinitas pláticas de superación personal y risas. A mis

amigos de la licenciatura por acompañarme en esta travesía: David I. Acosta, Karla

García (Lechi) e Ivonne Pineda, Los quiero mucho amigos. Finalmente a Josué

Sánchez Fuentes por ser una persona maravillosa en mi vida quién impulsó y

enseñó lo que la felicidad significa y resumo en una oración: Today, Tomorrow and

Forever.

A la Dra. Xochitl Guzmán García, por su apoyo durante mi formación como

hidrobiólogo, consejos en mi proyecto de servicio social y maestría, oportunidades,

regaños y enseñanzas tanto académicas como de vida que, en su conjunto, me

hicieron crecer como profesional y ver la pasión que hay en la investigación y en la

vida acuática. Gracias por todo doctora Xochitl.

A la Dra. Edith Cortés Barberena por aceptar asesorarme en el proyecto de

maestría siempre mostrando entusiasmo en sus enseñanzas, recomendaciones y

consejos. Gracias por abrirme las puertas de su laboratorio para continuar con mi

desarrollo profesional.

A la Dra. Marcela Galar Martínez por su asesoría, revisiones y enseñanzas siempre

mostrando amabilidad y empatía que hacían que la investigación fuera un arte.

Gracias doctora Marce por hacerme sentir parte de su equipo de investigación.

Al Dr. Juan Carlos Segoviano Ramírez por aceparme en su laboratorio dentro de

una breve estancia de investigación para el aprendizaje y reconstrucción

tridimensional de microfotografías del ensayo cometa.

vii
A la Dra. Mayra Pamela Becerra Amezcua por su apoyo incodicional y consejos

sobre ensayos hemolíticos y estandarización de técnicas celulares. A la Biol. e H. T.

Irma Hernández Calderas por sus amables y entusiastas enseñanzas en la

caracterización morfológica de células. Al pasante de Doctorado Felipe de Jesús

Muñoz González por el apoyo en la base de datos EtMIRA y software IHB para este

proyecto. Al T.L.C. y pasante en Hidrobiología Brian Real Huescas por su apoyo

en la identificación celular y de alteraciones sanguíneas. Al M. en C. Fernando

Alberto Mares Guzmán por su asesoría en los análisis estadísticos.

A la M. en B. E. Ana María González Gutiérrez por su asesoría y enseñanzas en la

elaboración del ensayo cometa. Al pasante en Medicina Daniel Fernando López

Altamirano por su apoyo en el uso del microscopio confocal y toma de

microfotografías. Al Dr. Eloy Gasca Pérez por sus enseñanzas y consejos en el

aprendizaje de técnicas de estrés oxidativo. A los jóvenes de protección civil por el

apoyo incondicional en las prácticas de salvamento. Al H. Ayuntamiento por las

facilidades otorgadas en el municipio de Tecolutla, Veracruz.

Al CONACyT por el apoyo económico para la elaboración de este proyecto. A la

comisión de la Maestría en Biología de la Universidad Autónoma Metropolitana

por aceptarme como alumno en la generación 16-O y el apoyo en este proyecto.

viii
Índice General
Resumen .................................................................................................................1
Abstract ..................................................................................................................2
Introducción ...........................................................................................................3
Antecedentes .........................................................................................................6
Justificación .........................................................................................................10
Área de estudio ....................................................................................................11
Pregunta de Investigación ..................................................................................13
Hipótesis ...............................................................................................................13
Objetivo general ...................................................................................................14
Objetivos particulares .........................................................................................14
Materiales y Métodos ...........................................................................................15
Colecta de muestras ..................................................................................................15
Parámetros fisicoquímicos, biológicos y morfométricos ........................................ 15
Conteo de eritrocitos ..................................................................................................16
Caracterización Histológica....................................................................................... 16
Análisis de alteraciones (Histopatología) .................................................................17
Categorización de alteraciones ................................................................................ 17
Factor de Importancia (FI) ..............................................................................17
Intensidad de Reacción (IR) ...........................................................................18
Índice de diagnóstico de salud (Índice de Reacción) ............................................. 19
Daño del material genético (Ensayo cometa) ......................................................... 20
Diagnóstico de salud de los peces bagre (Ariopsis felis) ....................................... 21
Resultados ............................................................................................................22
Parámetros fisicoquímicos ........................................................................................ 22
Parámetros biológicos ............................................................................................... 23
Parámetros morfométricos ........................................................................................ 24
Conteo de eritrocitos ..................................................................................................25
Caracterización Histológica....................................................................................... 26
Análisis de alteraciones (Histopatología) .................................................................28
Categorización de alteraciones ................................................................................ 30
Factor de Importancia (FI) ..............................................................................31
Intensidad de Reacción (IR) ...........................................................................32
Índice de Reacción Patrón (Irp) ................................................................................ 35
Daño del material genético (Ensayo Cometa) ........................................................ 36
Diagnóstico de salud de los peces bagre (Ariopsis felis) ....................................... 39
Discusión ..............................................................................................................41
Conclusiones .......................................................................................................46
Bibliografía ...........................................................................................................48

ix
Índice de Figuras

Figura 1. Pez bagre Ariopsis felis de Tecolutla Veracruz. ..........................................4

Figura 2. Mapa del municipio y estuario de Tecolutla, Veracruz. ............................ 12
Figura 3. Aspecto del pez bagre (A. felis) colectado en Tecolutla, Ver. .................. 23
Figura 4. Caracterización morfológica de células sanguíneas del pez bagre A. felis.
......................................................................................................................................... 27
Figura 5. Microfotografías de alteraciones en eritrocitos de peces bagre Ariopsis felis
de Tecolutla, Veracruz...................................................................................................29
Figura 6. Porcentaje de la prevalencia de las alteraciones observadas en los peces
bagre A. felis de Tecolutla, Veracruz. .......................................................................... 33
Figura 7. Microfotografías que evidencian la presencia de cauda de cometas en
eritrocitos. ....................................................................................................................... 36
Figura 8. Grafica de la frecuencia de los niveles de daño genético en eritrocitos de
peces bagres (Ariopsis felis). ........................................................................................ 37
Figura 9. Grado de daño en la serie roja de 10 peces bagre Ariopsis felis de
Tecolutla, Veracruz. ....................................................................................................... 39
Figura 10. Nivel y porcentaje de daño en eritrocitos de bagres de Tecolutla,
Veracruz.......................................................................................................................... 40

x
Índice de Tablas
Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos obtenidos en la colecta. ................................... 22
Tabla 2. Parámetros morfométricos de los peces bagre A. felis colectados en
Tecolutla, Veracruz. ....................................................................................................... 24
Tabla 3. Concentración promedio de eritrocitos y desviación estándar en bagres A.
felis de Tecolutla Veracruz. ........................................................................................... 25
Tabla 4. Categorías de las alteraciones y Factor de Importancia (FI) en eritrocitos de
bagre. .............................................................................................................................. 31
Tabla 5. Porcentaje de la prevalencia de las alteraciones observadas en los peces
bagre A. felis de Tecolutla, Veracruz. .......................................................................... 32
Tabla 6. Intensidad de Reacción (IR) de acuerdo al porcentaje de prevalencia de las
alteraciones los preces bagre Ariopsis felis de Tecolutla, Veracruz......................... 34
Tabla 7. Índice de reacción patrón (Irp) de 10 peces bagre a partir del cálculo del
factor de importancia (FI) e intensidad de reacción (IR) de las 5 alteraciones
categorizadas. ................................................................................................................ 35
Tabla 8. Evaluación de la magnitud de daño genético y desviación estándar a partir
de los niveles de daño en eritrocitos de bagres de Tecolutla, Veracruz. ................. 38

xi
Resumen

Las alteraciones en eritrocitos aportan información sobre el estado de salud de los

peces así como del medio en el que se desarrollan. Sin embargo, estas alteraciones
no han sido bien categorizadas de forma semicuantitativa. Es importante conocer la
importancia patológica de las alteraciones en eritrocitos para generar protocolos de
evaluación que puedan ser utilizados en programas de monitoreo ambiental. Por
esta razón, el objetivo del trabajo fue categorizar alteraciones en eritrocitos del bagre
Ariopsis felis con valores de referencia para establecer un diagnóstico de salud.

Se colectaron peces bagre en Tecolutla, Veracruz. Los organismos fueron

anestesiados con benzocaína (5%) y se tomaron muestras sanguíneas con jeringas
heparinizadas. Se realizó un recuento de eritrocitos en cámara Nuebauer. Asimismo,
frotis sanguíneos fueron elaborados y teñidos con colorante de Giemsa. Los frotis se
observaron y analizaron en 10 campos homogéneos con microscopio óptico.
Posteriormente cada alteración fue evaluada de acuerdo a su importancia patológica
y grado de diseminación para conocer el diagnóstico de salud de los bagres.

Los peces tuvieron, en promedio, 1.9 X106 eritrocitos por mililitro. Las alteraciones
categorizadas por su importancia patológica fueron: poiquilocitos, equinocitos e
hipocromía como alteraciones moderadas reversibles (valor de 2) mientras que
células blásticas y variación en la morfología nuclear corresponden a alteraciones
severas irreversibles (valor 3).

Los bagres de Tecolutla, Veracruz presentaron diferentes grados de alteraciones

que indican principios de anemia. Sin embargo, estas alteraciones no comprometen
su estado de fisiológico actual pero, eventualmente, incrementarán los daños a su
salud.

1
Abstract

Alterations in erythrocytes provide information of the health status in fish as well as

the environment in which they develop. However, these alterations have not been
well categorized in a semiquantitative way. It is important to know the pathological
importance of alterations in erythrocytes to generate evaluation protocols that can be
used in environmental monitoring programs. For this reason, the aim of this study
was to categorize alterations in erythrocytes of the catfish Ariopsis felis with
reference values to establish a health diagnosis.

10 catfish were collected in Tecolutla, Veracruz. The organisms were anesthetized

with benzocaine (5%) and blood samples were taken with herparinized syringes. A
count of erythrocytes was performed in the Nuebauer chamber. Also, blood smears
were prepared and stained with Giemsa stain. The smears were observed and
analyzed in 10 homogeneous fields with an optical microscope. Subsequently each
alteration was evaluated according to its pathological importance and degree of
dissemination to know the health diagnosis of the catfish.

The fishes had, on average, 1.9 X106 erythrocytes per milliliter. The alterations
categorized by their pathological importance were: poikilocytes, equinocytes and
hypochromia, has moderate reversible alterations (value of 2) while blast cells and
variation in nuclear morphology correspond to severe irreversible alterations (value
3).

The catfish from Tecolutla, Veracruz showed different degrees of alterations

indicating the principles of anemia. However, these alterations do not compromise
their current physiological state but, eventually, they will increase the damage to their
health.

2
Introducción

Las actividades humanas tienen un impacto negativo en el ambiente que conlleva a

la contaminación de los cuerpos acuáticos. Son diversos los contaminantes que se

pueden encontrar en los medios acuáticos, entre los que se encuentran los

hidrocarburos, plaguicidas y metales pesados (Ansoar et al., 2009). La

ecotoxicología se encarga de estudiar las interacciones y efectos de los

contaminantes tóxicos en los organismos acuáticos y terrestres, así como sus

consecuencias en el ambiente (Bratosin et al., 2016).

Los contaminantes presentes en un sistema pueden ser evaluados a través del

monitoreo biológico. Las evaluaciones ecotoxicológicas son una de las principales

herramientas, definidas como métodos que analizan células vivas, tejidos,

organismos o comunidades para evaluar los efectos de la exposición con los

productos químicos relacionados (Maceda et al., 2015; Olivares et al., 2014)

En la evaluación de los contaminantes, los peces han sido utilizados como

indicadores de la calidad del agua en diversos países desde hace tiempo. Los peces

son el grupo más diverso entre los vertebrados, sin embargo, muchas especies de

agua dulce y marina se encuentran amenazadas por las actividades humanas.

(Maceda et al., 2015). Los organismos indicadores de los sistemas biológicos, tal

como el pez bagre Ariopsis felis (cuyas características fisiológicas, morfológicas y

comerciales lo hacen un buen organismo bioindicador) son de gran utilidad en el

monitoreo de la contaminación (Figura 1).

3
 Figura 1. Pez bagre Ariopsis felis de Tecolutla Veracruz.

El monitoreo biológico está bien representado en el campo internacional, sin

embargo, en México los programas de monitoreo se encuentran en fase de

desarrollo (Guzmán-García et al., 2007). Los proyectos de investigación

desarrollados en México, y particularmente en el Golfo de México en el municipio de

Tecolutla Veracruz, agrupan respuestas macroscópicas, de condición y tisulares,

dejando de lado las respuestas celulares (Guzmán-García et al., 2007). Los datos de

investigación e información sobre las respuestas tisulares y celulares en organismos

acuáticos aún no han sido clasificadas ni almacenadas en bases de datos de una

manera normalizada y sistematizada.

En México existen pocas bases de datos cuyo propósito es dar a conocer aspectos

biológicos y morfológicos como: volúmenes de captura de peces, distribución

espacial, índices de reproducción y otros aspectos ecológicos y económicos de tipo

relacional entre las que se encuentran CONABIO, CCUD y la Base de Datos

Ecotoxicológica para el Manejo Integral de los Recursos Acuáticos (EtMIRA, 2011).

Aunado a lo anterior, existe el Banco de Tejidos del Estado de México como base de

4
datos nacional (2008), sin embargo, no existe una base que recopile información

sobre el estado tisular y celular en organismos acuáticos.

5
Antecedentes

El laboratorio de Ecotoxicológia de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad

Iztapalapa, está desarrollando una base de datos ecotoxicológica relacional

(EtMIRA), cuya finalidad es presentar un sistema estructurado que facilita el acceso

y el manejo de la información utilizando un modelo de tablas relacionales. Dicha

base de datos compila información relevante obtenida a partir del análisis de las

respuestas tisulares y celulares de organismos acuáticos recolectados, así como de

muestras de órganos, genera información que puede ser utilizada en programas de

biomonitoreo y de la contaminación acuática. (Guzmán-García et al., 2007;

Jerónimo-Jurez, 2013).

Las respuestas celulares funcionan como indicadores de sustancias tóxicas que han

sido incorporadas de los organismos en el medio en el que se desarrollan. En este

sentido, el análisis de la sangre de peces se recomienda para establecer

diagnósticos de salud por la contaminación acuática (Witeska, Kondera y

Szczygielska, 2011).

En los peces, las células sanguíneas son sensibles ante diversos agentes

ambientales (Vazzana et al., 2009; Valdebenito et al., 2011; Yilmaz y Mutaf, 2015),

respondiendo a estos con cambios en su morfología y variaciones citogenéticas, las

cuales pueden ser analizadas a través de la histopatología y determinar si

eventualmente el daño se refleja en tejidos y órganos a través de pruebas

complementarias.

6
En este sentido, el ensayo cometa (electroforesis alcalina) resulta ser un

biomarcador útil en estudios de alteraciones celulares así como en estudios

ecotoxicológicos y para determinar la contaminación acuática debido que es un

método rápido y sensible ante agentes genotóxicos, permite evidenciar rupturas en

sitios lábiles del material genético (Singh et al., 1988).

El análisis genotóxico, a través del ensayo cometa, así como los estudios

histopatológicos, son herramientas que se recomiendan ampliamente en estudios

ecotoxicológicos y que pueden ser aplicados en programas de monitoreo de la

contaminación para establecer índices sobre el diagnóstico de salud en los peces

(Zimmerli et al., 2007; Witeska, Kondera y Szczygielska, 2011; Maceda et al., 2015).

Sin embargo, existen pocos estudios que categoricen o clasifiquen de manera

ordenada las alteraciones de células sanguíneas en peces, como el tipo de

alteraciones asociadas a su nivel de impacto patológico, o la gravedad de la lesión.

Estas alteraciones pueden ser de tipo reversible o irreversible (Bernet et al., 1999;

Zeitz y Sens, 2012). Las alteraciones relacionadas con la membrana y citoplasma

del eritrocito, como la poiquilocitosis, equinocitosis e inclusiones citoplasmáticas,

suelen ser reversibles debido a los mecanismos de reparación así como a la vida

media de la célula lo que permite a los organismos generar nuevos eritrocitos.

Por otra parte, las alteraciones relacionadas con el material genético como los

micronúcleos, lobulación del material genético y ruptura de los sitios lábiles son

ejemplos irreversibles de daño genotóxico que eventualmente evidencian problemas

en el desarrollo y fisiología de los peces.

7
La categorización, de acuerdo a Bernet et al., (1999) ordena las respuestas tisulares

en reacciones patrón que están estrechamente relacionadas con el impacto

patológico. Sin embargo, estos criterios aún no han sido establecidos en

alteraciones de las células sanguíneas, aún cuando estos elementos celulares

expresan respuestas biológicas que pueden ser evaluadas de manera rápida y

económica (Bernet et al., 1999; Zimmerli et al., 2007).

Existen protocolos para la evaluación de lesiones tisulares y órganos en peces a

partir de la asignación de valores referenciales que indican su importancia patológica

en términos numéricos. Las escalas utilizadas, que pueden ir de 0 a 3, se asocian al

nivel de la alteración (Yilmaz y Mutaf, 2015). A pesar de esto, no se han asignado

valores referenciales a las alteraciones en células sanguíneas para su uso en los

diagnósticos de salud y protocolos para la evaluación de la contaminación acuática,

generando con estos elementos una forma estandarizada de la evaluación tisular y

una escala numérica que pueda ser de fácil interpretación en los programas del

control de la contaminación (Bernet et al., 1999; Maceda et al., 2015).

A partir de la información antes mencionada, se puede dar paso a análisis de tipo

semicuantitativo cuya información pueda ser estructurada dentro de una base de

datos normalizada y sistematizada. Las ventajas de estructurar la información

radican en que los resultados de los estudios de investigación pueden ser

consultados y analizados en diferentes escalas de espacio y tiempo. Esta

herramienta de consulta puede servir para reestablecer protocolos para determinar

8
 la salud de los organismos acuáticos, así como su relación con la

contaminación acuática (Bernet et al., 1999; Guzmán-García et al., 2007).

9
Justificación

En los programas de biomonitoreo se evalúan diferentes parámetros de salud en los

organismos como: valores morfométricos, aspectos macroscópicos, evaluaciones

tisulares y celulares. Sin embargo, no existen matrices que compilen esta

información con el fin de tener una base de datos que permita la consulta de dichas

evaluaciones.

La Base de Datos Ecotoxicológica tiene como finalidad la construcción de tablas que

permitan la normalización y sistematización de datos biométricos que permitan hacer

inferencias cuantitativas más precisas para estimar índices, valores de vulnerabilidad

y valores de referencia que puedan ser utilizados para determinar el estado de salud

de los organismos acuáticos. En este sentido, los peces aportan importante

información a los programas de biomonitoreo, pero se ha dejado de lado el análisis

en células sanguíneas, siendo éstas un indicador importante de la salud de los

organismos.

La evaluación y categorización de las alteraciones sanguíneas, así como el

establecimiento de valores de referencia que indiquen su grado de alteración e

importancia patológica, no han sido establecidos en los estudios ecotoxicológicos y

en el monitoreo biológico.

10
Área de estudio

Tecolutla comprende una importante zona turística ya cuenta con playas y

geográficamente está ubicada en un punto cerco a la Ciudad de México. La cuenca

del río Tecolutla se forma en las inmediaciones de los estados de Veracruz y Puebla

con una extensión de 7 950.05 km2, el polígono presenta una Latitud 20°28'48''-

19°27'36'' N, Longitud 98°14'24''-96°57'00'' W.

La cuenca está rodeada por las sierras de Huachinango al este y Zacapoaxtla al sur

(Arriaga et al., 2009). El río Tecolutla tiene una extensión de 100 km

aproximadamente. Atraviesa varios municipios Coyutla, Espinal, Papantla, y

Gutiérrez Zamora, desembocando en Tecolutla (Figura 2).

Aunque existen pocos estudios de la calidad del agua, en estos se detecta la

presencia de metales y plaguicidas así como coliformes totales y fecales. A partir del

monitoreo de la cuenca, se establece que se encuentra en una escala regular (de

acuerdo al rango de Brown 51-70) indicando que los desechos urbanos se depositan

en el río (Arriaga et al., 2009; Guevara et al., 2014).

Sin embargo, es una región para la cual existen escasos estudios en cuanto a su

riqueza faunística y la presencia de contaminantes tóxicos.

11
Figura 2. Mapa del municipio y estuario de Tecolutla, Veracruz (tomado de Jerónimo-Juárez et
al., 2018:).

12
Pregunta de Investigación

¿Cuál es el estado de salud del bagre Ariopsis felis según la categorización de las

alteraciones en células sanguíneas?

Hipótesis

Si las alteraciones en células sanguíneas del pez bagre Ariopsis felis pueden ser

categorizadas con valores de referencia entonces se podrá conocer el grado de las

alteraciones y el diagnóstico de salud de los organismos.

13
Objetivo general

Analizar las alteraciones en células sanguíneas del pez bagre Ariopsis. felis y

categorizarlas con valores de referencia para establecer un diagnóstico de salud.

Objetivos particulares

 Realizar una consulta en la base de datos Ecotoxicológica para determinar el

número de preparaciones histológicas sanguíneas disponibles.

 Caracterizar la morfología de células sanguíneas y recuento de eritrocitos del

pez Bagre A. felis.

 Detectar las alteraciones morfológicas y genotóxicas de los eritrocitos para

definir si son reversibles o irreversibles.

 Asignar valores de referencia de acuerdo a la importancia patológica e

intensidad de reacción de las alteraciones.

 Analizar y calcular los índices histopatológicos de las alteraciones para

establecer el diagnóstico de salud en los bagres Ariopsis felis.

14
Materiales y Métodos

Recolecta de muestras

Se realizó una consulta en la Base de datos Ecotoxicológica para determinar el

número de peces bagre (Ariopsis felis) para el estudio, así como el número de

laminillas almacenadas. Posteriormente se cotejó el número de organismos que se

utilizarían para el estudio y se llevó a cabo una colecta en Tecolutla, Veracruz

(Padrós, 2005). Para realizar el análisis, a cada organismo se le extrajo sangre

periférica usando jeringas de 3 mL previamente heparinizadas. Las muestras fueron

transportadas dentro de una hielera a 4°C para su procesamiento histológico en el

laboratorio.

Parámetros fisicoquímicos, biológicos y morfométricos

Se tomaron parámetros fisicoquímicos del agua: pH, salinidad y temperatura con

ayuda de un multianalizador marca HACH® modelo DR/2000s. Los datos se

concentraron en los formatos del laboratorio de Ecotoxicología.

Por otra parte, se realizó una evaluación macroscópica de cada organismo

colectado para obtener los parámetros biométricos de un microscopio

estereoscópico, se analizó la presencia de ectoparásitos, hongos, vermes,

perforaciones o lesiones en tejido blando. El registro de cada parámetro se

consideró para la selección de los organismos, aquellos peces que no presentaron

ninguno de los parámetros antes mencionados, fueron los seleccionados para la

toma de muestras sanguíneas.

15
Posteriormente, a los peces seleccionados se les tomaron datos morfométricos con

un ictiómetro y una balanza marca OHAUS® modelo CT6000-S. Los parámetros

registrados fueron longitud total, longitud patrón, altura, ancho y peso.

Los parámetros fisicoquímicos, biológicos y morfométricos fueron registrados en la

base de datos EtMIRA del laboratorio de Ecotoxicología para su consulta.

Conteo de eritrocitos

Para el conteo de eritrocitos, se tomó 1 mL de sangre de los 10 organismos

colectados y se realizaron diluciones 1:100. Posteriormente se tomaron 10µL de la

muestra diluida y se colocaron en una cámara de Neubauer. Se realizó el recuento

en todos los organismos y las concentraciones fueron registradas a una base de

datos en Excel para su interpretación.

Caracterización Histológica

A partir de las muestras sanguíneas se realizaron frotis colocando 10 µL de sangre

en un porta objetos y realizando un extendido con ayuda de un cubre objetos. 20

frotis fueron elaborados (2 réplicas por organismo) y se fijaron con alcohol al 96%

durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se colocaron una hora

en alcohol al 96% y después se dejaron secar durante 5 minutos. Los frotis fijados

se colocaron durante una hora en colorante de Giemsa. Terminando este paso, se

dejaron secar y se introdujeron rápidamente en agua acética para posteriormente

lavarlos con agua corriente. Finalmente los frotis se colocaron en alcohol absoluto

durante 1 minuto y consecutivamente se colocaron en xilol por 3 minutos.

16
Los frotis fueron observados en un microscopio óptico marca CARL ZEISS® Primo

Star. Se tomaron microfotografías de los eritrocitos, linfocitos, monocitos y otros

tipos celulares observados para su caracterización con una cámara acoplada marca

CANON® modelo Power Shot G10.

Análisis de alteraciones (Histopatología)

Se revisaron 20 frotis en un microscopio invertido Axio Observer Z1 Apotome. Se

tomaron microfotografías aleatorias en 10 campos a 100X de cada organismo para

reconocer y cuantificar las alteraciones observadas.

Las microfotografías fueron analizadas en el programa Stepanizer e Image-J 1.50i

para determinar el número de alteraciones encontradas. Posteriormente las

alteraciones fueron medidas y categorizadas de acuerdo a un protocolo de análisis

de extendidos sanguíneos de peces elaborado para este proyecto.

Categorización de alteraciones

Para la categoría de las alteraciones se tomaron los criterios propuestos por Bernet

(1999) y Zeitz y Sens (2012) de acuerdo a la capacidad en que una alteración es

reversible o irreversible.

Factor de Importancia (FI)

A cada una de las alteraciones categorizadas, se les asignó un valor de acuerdo a

su importancia patológica (reversible e irreversible), propuesta por Bernet (1999)

donde, una alteración mínima (reversible) tiene un valor de 1, moderada (reversible)

un valor de 2 y severa (irreversible) un valor de 3.

17
 Intensidad de Reacción (IR)

Posteriormente a cada alteración detectada y categorizada se le asignó una

intensidad de reacción (IR), según el grado de diseminación de las alteraciones

observadas en el extendido sanguíneo. La intensidad de reacción se evaluó de

acuerdo con el porcentaje de diseminación de una alteración donde 0 se considera

sin cambios (0-%5), ocurrencia leve 2 (5-30%), ocurrencia moderada 4 (40-60%) de

mínima a moderada ocurrencia y 6 (70-100%) de severa ocurrencia. Una vez

categorizadas las alteraciones, a partir de su importancia patológica y su intensidad

de reacción se construyó una matriz con los datos obtenidos para el cálculo de

índices.

18
Índice de diagnóstico de salud (Índice de Reacción)

Los resultados obtenidos del análisis de alteraciones en eritrocitos de 10 peces

bagre fueron concentrados en una matriz. Se agregó el número del pez al que se le

tomó la muestra sanguínea (No. de organismo) así como la clave de la laminilla

observada (frotis).

Una vez en la base de datos, a partir del software “IINDEX-PH: Índice de impacto de

contaminación y salud”, se calculó el índice de reacción, es decir, el estado en el que

se encuentra afectado el tejido sanguíneo de los 10 bagres a partir de la siguiente

fórmula:

Dónde: Irp= Índice de reacción patrón, alt= alteración, 𝑎=intensidad de reacción

(diseminación de la alteración), w= factor de importancia (importancia patológica).

19
Daño del material genético (Ensayo cometa)

Por otra parte, se realizó la técnica del ensayo cometa con sangre de 7 peces

bagres. Se tomaron 150 µL de agarosa regular y se colocaron en un portaobjetos,

después de que se enfriara, se tomaron 70 µL de agarosa con bajo punto de fusión

(0.5%) y 30 µL de muestra completa sanguínea de los peces bagre que se colocaron

en el mismo portaobjetos. La laminilla con agarosas y sangre completa se dejó

enfriar durante 20 minutos para que, posteriormente, se colocara otra capa de

agarosa regular. 21 laminillas (3 réplicas por pez) fueron elaboradas y se dejaron 1

hora en solución de lisis. A continuación se realizó una electroforesis en una cámara

horizontal de las 21 laminillas a 25 V y 300 mA durante 20 min. Posteriormente 14

laminillas se tiñeron con Syto-Green13 y se observaron en un microscopio de

epifluorescencia marca OLYMPUS® modelo BX41 con un objetivo de 20X para la

observación de los cometas. Se tomaron microfotografías de cometas, los cuales

fueron medidos y analizados en el software Carl Zeiss ® Axio Vision 40V versión

4.8.0.0.

Por otra parte, 7 laminillas fueron teñidas con 20 µL de ioduro de propidio y se

observaron en un microscopio vertical Axio Imager confocal LSM 710 NLO

(multifótonico) y se realizaron reconstrucciones en 3D de los cometas.

Los valores de referencia del ensayo cometa para categorizar y determinar el grado

de daño genotóxico fueron los propuestos por Singh et al., 1988 y utilizados en

peces por Brugés y Reguero (2007) de acuerdo a la longitud de la cauda del cometa

contando 100 células por pez que se clasifican en niveles de daño donde: No

genotóxico= estado 0 (0-24 µm), ligeramente genotóxico= estado 1 (25-32 µm),

20
moderadamente genotóxico= estado 2 (33-40 µm), altamente genotóxico= estado 3

(41-53 µm) y extremadamente genotóxico= estado 4 (mayor a 53 µm).

La frecuencia de la magnitud de daño fue expresada en unidades arbitrarias (UA),

con valoraciones posibles en un rango de 0-400, de acuerdo a la siguiente fórmula:

CTM (conteo total de la muestra) = [(% de células en clase 0) x 0] + [(% de células

en clase 1) x 1] + [(% de células en clase 2) x 2] + [(% de células en clase 3) x 3] +

[(% de células en clase 4) x 4].

Diagnóstico de salud de los peces bagre (Ariopsis felis)

A partir del índice de reacción (Irp) y del grado de daño genotóxico se obtuvo el

diagnóstico de salud de cada uno de los peces bagre. Finalmente se realizó un

promedio de los 10 bagres analizados para determinar el nivel de contaminación

acuática según Zimmerli et al., (2007) a través de una escala dónde un índice de

reacción <10= Normal (Sistemas acuáticos no contaminados), 11-12=Leve y 21-30=

Moderado (Sistemas poco contaminados), 31-40=Alto y >40 Severo (Sistemas

altamente contaminados).

21
Resultados

Parámetros fisicoquímicos

Los parámetros fisicoquímicos del agua tales como el pH, la salinidad y la

temperatura indican que los peces bagre (A. felis) colectados en Tecolutla, Veracruz,

se desarrollan en sistemas acuáticos salobres estuarinos. Los datos se presentan en

la tabla 1.

Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos obtenidos en la colecta.

Lugar de Geoposición pH Salinidad (ppm) Temperatura (°C)

colecta
Tecolutla, N 20° 28’ 392” 7 3 23
Veracruz W 97° 00’ 296”

22
Parámetros biológicos

Dentro de la evaluación macroscópica de los peces colectados, se identificaron y

seleccionaron 10 peces bagre (A. felis) los cuales, dentro de los parámetros

biológicos de las muestras, no presentaron ectoparásitos, hongos, vermes,

perforaciones o lesiones en su tejido blando. Se obtuvo de cada organismo 3 mL de

sangre periférica (Figura 3).

Figura 3. Aspecto del pez bagre (A. felis) colectado en Tecolutla, Ver.

23
Parámetros morfométricos

Los datos morfométricos de los peces colectados fueron en promedio 34.6 cm de

longitud total (Long T.), 29.6 cm en longitud patrón (Long P.), 5.6 cm de alto, 5.8 cm

de ancho y 381 g en su peso. El promedio de las medidas morfométricas indican que

los organismos se encuentran en estado juvenil-adulto (tabla 2) y que no presentan

alteraciones macroscópicas.

Tabla 2. Parámetros morfométricos de los peces bagre A. felis colectados en Tecolutla,

Veracruz.

No. Long T. Long P. Altura (cm) Ancho Peso (g)

organismo (cm) (cm) (cm)

1 37 31 7 6.5 422.5
2 41 34 6.5 7 526
3 33 28 4.5 6 321
4 34 30.5 6.5 6 379
5 37 32.5 5.5 7 390
6 36 30.5 6 7 462.5
7 36 30.5 5 6 335
8 28 24 4.7 3.7 186.5
9 27 22.5 4.6 3.6 169.1
10 37 33 6.2 6 618.7
Promedio 34.6±4.2 29.65±3.7 5.65±0.9 5.88±1.2 381.03±139.2

24
Conteo de eritrocitos

El recuento de eritrocitos de los 10 organismos colectados mostró que, en promedio,

los peces bagre tiene una concentración de eritrocitos de 1.93 X10 6 células por

mililitro. Los organismos (2 y 4) que presentaron las concentraciones de eritrocitos

más bajos fue de 1.84 X106 mL y 1.82 X106 mL respectivamente. Otros organismos

(1, 6 y 10) tuvieron un conteo de eritrocitos de 2.01 X106 mL, 2.01 X106 mL y 2.03

X106 mL (tabla 3).

Tabla 3. Concentración promedio de eritrocitos y desviación estándar en bagres A. felis de

Tecolutla Veracruz.

No. organismo Cel/mL

1 2.01
2 1.84
3 1.93
4 1.82
5 1.99
6 2.01
7 1.91
8 1.95
9 1.94
10 2.03
Promedio 1.939
D.S. ±0.067

25
Caracterización Histológica

Se caracterizaron células sanguíneas (eritrocitos, linfocitos y monocitos) de los 10

peces bagres colectados. Se determinó que los eritrocitos miden entre 12 y 15 µm,

los cuales presentan forma ovoide con un citoplasma color rosa pálido y un núcleo

semi-condensado y redondo color morado (Figura 4-A).

Los linfocitos midieron entre 8 y 12 µm y presentaron un núcleo abundante y un

citoplasma en menor proporción en relación con el núcleo (Figura 4-A y B).

Los monocitos midieron entre 14 y 16 µm presentando pequeñas proyecciones

membranales (seudópodos), el núcleo fue abundante y su relación citoplasmática

fue menor (Figura 4-C y D).

26
Figura 4. Caracterización morfológica de células sanguíneas del pez bagre A. felis. En A se
observan eritrocitos (Er) y linfocitos (L). En B se observa el núcleo de eritrocitos (Nu) y
linfocito (L). En C se observa un monocito (M) y citoplasma de eritrocitos (Ci) y en D un
linfocito (L) y eritrocitos (Er).

27
Análisis de alteraciones (Histopatología)

Dada la abundancia y fácil reconocimiento de los eritrocitos se presentan los

cambios histopatológicos de estas células. Fueron evidentes alteraciones en la

membrana (Me), citoplasma (Ci) y núcleo (Nu) de eritrocitos (Figura 5-A). Estos

cambios se han reportado como: poiquilocitosis, equinocitosis, eritrocitos

hipocrómicos, variaciones en la morfología nuclear (VMN) y células blásticas.

La poquilocitosis (PQ) y la equinocitosis (EQ) fueron alteraciones que afectaron la

membrana de los eritrocitos (Figura 5-B y C). Los eritrocitos hipocrómicos (HC) se

observaron principalmente en el citoplasma (Figura 5-E).

Por otra parte, la variación en la morfología nuclear (VMN) fue evidente en la

condensación de la cromatina (Figura 5-D). Finalmente se detectó la presencia de

algunas células blásticas (BL) (Figura 5-F).

A pesar de reconocer las alteraciones, se desconoce el impacto de estas en la salud

de los organismos acuáticos, por ello, se procedió a establecer categorías que

permitan elucidar el diagnostico de salud.

28
 Figura 5. Microfotografías de alteraciones en eritrocitos de peces bagre Ariopsis felis de
Tecolutla, Veracruz. En A observa la membrana, citoplasma y núcleo. En B poiquilocitos (PQ) y
un eritrocito hipocrómico (HC). En C se observan equinocitos (EQ). En D eritrocitos con
variaciones en la morfología del núcleo (VMN). En E eritrocitos hipocrómicos (HC) y en D
células blásticas (BL).

29
Categorización de alteraciones

Las alteraciones en eritrocitos de peces bagre fueron categorizadas dependiendo si

son reversibles o no a partir de los criterios de Bernet et al., (1999) y Zeitz y Sens,

(2012).

La poiquilocitosis y equinocitosis se presentan en anemias tempranas, exposiciones

a tóxicos o desnutrición (Witeska et al., 2011; Zeitz y Sens, 2012 y Gill y Pant, 1985)

por lo que se categorizan como alteraciones reversible con un grado de importancia

moderado

Por otra parte, la hipocromía se considera como reversible con un grado de

importancia moderado ya que se presenta en situaciones donde existe anemia

temprana por deficiencia de hierro, envenenamiento por metales o factores de

maduración (Witeska et al., 2011; Zeitz y Sens, 2012 y Gill y Pant, 1985).

En la variación de la morfología nuclear (VMN) el material genético puede presentar

descondensación de la cromatina así como fragmentación y lobulación del núcleo

provocados por metales pesados, plaguicidas, virus, etc; correspondiendo estas

alteraciones a un grado de importancia patológica severo irreversible (Witeska et al.,

2011; Zeitz y Sens, 2012 y Gill y Pant, 1985).

Finalmente, la presencia de células blásticas, en bajas concentraciones no provocan

cambios fisiológicos importantes, mientras que en concentraciones altas se relaciona

con problemas en la médula ósea o daño en órganos hematopoyéticos por lo cual,

se categorizan como una alteración irreversible con un grado de importancia severo

(Witeska et al., 2011; Zeitz y Sens, 2012 y Gill y Pant, 1985).

30
 Factor de Importancia (FI)

El factor de importancia patológica para poquilocitos, equinocitos e hipocromía

corresponden a un factor tipo 2 ya que son alteraciones de importancia moderada

reversibles mientras que la variación en la morfología nuclear y las células blásticas

presentan un factor de importancia de tipo 3 debido a que son de importancia severa

e irreversibles (tabla 4).

Tabla 4. Categorías de las alteraciones y Factor de Importancia (FI) en eritrocitos de bagre.

Categoría de Grado de Importancia Alteración Factor de

Alteración Importancia (FI)
Reversible Moderada importancia Poquilocitos 2
Reversible Moderada importancia Equinocitos 2
Reversible Moderada importancia Hipocromía 2
Irreversible Severa importancia VMN 3
Irreversible Severa importancia Células blásticas 3

31
 Intensidad de Reacción (IR)

El bagre 1 tuvo un porcentaje de prevalencia del 39% en la variación de la

morfología nuclear (VMN). El bagre 2 presentó un 44% de equinocitos, mientras que

el bagre 3 obtuvo un 31% de prevalencia en la VMN. El bagre 4 y 5 presentaron un

mayor porcentaje en poquilocitosis con un 31% y 55% respectivamente (tabla 5).

Tabla 5. Porcentaje de la prevalencia de las alteraciones observadas en los peces bagre A.

felis de Tecolutla, Veracruz.

Prevalencia por organismo (%)

Alteraciones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Poiquilocitos 25 24 24 30 30 30 30 30 30 30
Equinocitos 0 44 44 15 15 15 15 15 15 15
Hipocromía (deficiencia de Hierro) 34 17 17 8 8 8 8 8 8 8
Variación en la morfología nuclear 39 12 12 30 30 30 30 30 30 30
Células blásticas 2 3 3 16 16 16 16 16 16 16

32
Por otra parte, el bagre 6 presentó 39% para poquilocitosis y VMN mientras que el

bagre 7 para esta última alteración obtuvo un 28%. La prevalencia de poiquilocitosis

fue de 50% y 42% para el pez 8 y 9 respectivamente. Finalmente el bagre 10

presentó una mayor prevalencia en la VMN con un 31% (Figura 6).

Figura 6. Porcentaje de la prevalencia de las alteraciones observadas en los peces bagre A.

felis de Tecolutla, Veracruz.

33
 A partir del porcentaje diseminación, se asignó la intensidad de reacción (IR) en los

bagres utilizando valores que van de 0 a 6 según el porcentaje. Para poquilocitosis,

la intensidad de reacción más alta (valor de 6) corresponde al bagre 8. La IR para

equinocitos más alta fue en el bagre 2. Los peces 1, 5, 6, 8 y 9 no presentaron

equinocitos. Por otra parte, la intensidad de reacción para hipocromía se presentó en

el bagre 3 y 9 con valores de 4.

En la variación de la morfología nuclear, la IR con valor de 4 se presentó en los

organismos 1, 3, 6, 7, 8 y 10. Finalmente las células blásticas tienen una intensidad

de reacción baja (valor de 2) que se presentó en todos los organismos excepto en el

bagre 1, 5 y 9 (tabla 6).

Tabla 6. Intensidad de Reacción (IR) de acuerdo al porcentaje de prevalencia de las

alteraciones los preces bagre Ariopsis felis de Tecolutla, Veracruz.

Matriz de Intensidad de Reacción (IR) por organismo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Alteraciones (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR (%) IR

Poiquilocitos 25 2 23 4 18 2 30 2 55 4 39 4 25 2 50 6 42 4 30 4

Equinocitos 0 0 44 6 18 2 15 2 0 0 0 0 17 2 0 0 0 0 12 2

Hipocromía 34 2 17 2 28 4 8 2 9 2 16 2 27 2 13 2 33 4 20 2

VMN 39 4 12 2 31 4 30 2 36 2 39 4 28 4 35 4 25 2 31 4

células 2 0 3 2 5 2 16 2 0 0 6 2 3 2 3 2 0 0 6 2
blásticas

Obteniendo el Factor de Importancia (FI) e Intensidad de Reacción (IR) de las 5

alteraciones observadas en los 10 bagres de Tecolutla, Veracruz, se calculó el

Índice de reacción patrón (Irp).

34
Índice de Reacción Patrón (Irp)

El índice de reacción patrón (Irp) permitió estimar el grado de daño de la serie roja

(eritrocitos) de cada organismo a partir de la sumatoria del Factor de Importancia (FI)

por la Intensidad de Reacción (IR) de cada alteración observada en los eritrocitos de

los bagres.

Se calcularon 10 índices en total correspondientes a cada pez bagre analizado por el

software histopatológico (IHB). El valor del índice más bajo fue de 18 que

corresponde al bagre 5 mientras que el más alto fue de 36 para el bagre 2 (tabla 7).

Tabla 7. Índice de reacción patrón (Irp) de 10 peces bagre a partir del cálculo del factor de
importancia (FI) e intensidad de reacción (IR) de las 5 alteraciones categorizadas.

Alteración Factor Intensidad de reacción (IR)

Importancia (No. de organismo)
(FI) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Poiquilocitos 2 2 4 2 2 4 4 2 6 4 4
Equinocitos 2 0 6 2 2 0 0 2 0 0 2
Hipocromía 2 2 2 4 2 2 2 2 2 4 2
VMN 3 4 2 4 2 2 4 4 4 2 4
Células 3 0 2 2 2 0 2 2 2 0 2
blásticas
Índice de
Reacción
20 36 34 24 18 30 30 34 22 34
Patrón (Irp)

35
Daño del material genético (Ensayo Cometa)

Los peces bagre de Tecolutla, Veracruz presentaron diferentes niveles de daño

genético en sus eritrocitos. La cauda de los cometas evidenció valores de daño que

van de 0 a 4 y presentan longitudes desde 13.19 µm a 41.62 µm (Figura 7).

Figura 7. Microfotografías que evidencian la presencia de cauda de cometas en eritrocitos. En

A se observa un campo a 20X de cometas. En B cometas con nivel de daño 1. En C y D
cometas con nivel de daño 4. En E y F se observa un arreglo fotográfico de un cometa
observado en un microscopio confocal multifotónico

36
Se observó que la frecuencia en los niveles de daño genético fue diferente en los

peces. El bagre 2 y 3 tuvieron niveles 0 a 1 con una media de 0.85 y 0.56

respectivamente. Los organismos 1 y 4 presentaron niveles de daño entre 2 y 3 con

una media de 2.56 y 2.66. Para el bagre 5, los niveles de daño van de 2 a 4 con una

media de 2.96 mientras que el 6 presentó niveles de 1 y 2 con una media de 1.75.

Finalmente, el organismo 7 presentó un nivel de daño 0 con una media de 0.01

(Figura 8).

Figura 8. Gráfica de la frecuencia de los niveles de daño genético en eritrocitos de peces bagre
(Ariopsis felis).

37
A partir de la frecuencia de los niveles de daño, se evaluó el la magnitud de daño

genético a través de la fórmula del conteo total de muestra. El bagre 7 presentó una

magnitud de 1, siendo este el de menor valor. Los organismos 3 y 2 presentaron

valores de 56 y 85 mientras que el 6 tuvo una magnitud de daño de 174 UA.

Finalmente los organismos 1, 4 y 5 tuvieron una magnitud de daño de 258, 266 y

296 UA respectivamente (tabla 8). Los peces con valores bajos representan poco

daño en el material genético mientras que los valores intermedios y altos reflejan

estados moderados y altamente genotóxicos en los eritrocitos de los bagres.

Tabla 8. Evaluación de la magnitud de daño genético y desviación estándar a partir de los

niveles de daño en eritrocitos de bagres de Tecolutla, Veracruz.

No. Estado (%) Estado (%) Estado (%) Estado (%) Estado (%) CTM (UA)
Organismo
0 1 2 3 4

1 2 7 33 47 11 258 ±19.1
2 47 31* 12 10 0 85 ±18.8
3 61 27 7 5 0 56 ± 25.1
4 3 4 25 60* 8 266 ± 24.0
5 1 5 21 43 30* 296 ± 17.4
6 2 31* 58* 9 0 174 ± 24.5
7 99* 1 0 0 0 1 ± 44.1

En resumen, los resultados demuestran que los niveles de daño más frecuentes en

el material genético de los eritrocitos de los bagres analizados estuvieron entre

moderado y altamente genotóxicos.

38
Diagnóstico de salud de los peces bagre (Ariopsis felis)

Para establecer el diagnóstico de salud de los bagres de Tecolutla, Veracruz, se

consideró el grado de daño de la serie roja obtenido a partir de los índices de

reacción patrón (Irp) calculados. Se observa que 3 organismos presentaron valores

entre 20 y 22 mientras que 2 bagres tuvieron un índice de 30. Por otra parte, 3

organismos presentaron un índice de 34 y el bagre 2 presentó el grado de daño más

alto del lote de organismos con un valor de 36 en la serie roja. En promedio, los

bagres tienen un índice general de 28. Al ordenar estos datos, la tendencia se

muestra en la Figura 9.

Figura 9. Grado de daño en la serie roja de 10 peces bagre Ariopsis felis de Tecolutla,
Veracruz.

39
Los índices de reacción patrón expresan el nivel de impacto que presentan los

bagres respecto al porcentaje de daño en los eritrocitos. En promedio, los 10 bagres

presentaron un índice de 28.2 (Figura 10) y de acuerdo a la escala propuesta por

Zimmerli et al., (2007), estos peces se encuentran en un nivel moderado lo que

corresponde a sistemas acuáticos poco contaminados.

Figura 10. Nivel y porcentaje de daño en eritrocitos de bagres de Tecolutla, Veracruz.

De acuerdo con la concentración de eritrocitos, así como del índice histopatológico y

la frecuencia de daño en el material genético, se observa que los bagres Ariopsis

felis de Tecolutla, Veracruz, presentan alteraciones con una importancia patológica

de nivel 3. Sin embargo la diseminación de no representa un estado de severa

ocurrencia. Esto indica que los organismos no presentan aún un riesgo en su salud

pero, eventualmente, pueden provocar daño en otros órganos así como poner en

riesgo el estado fisiológico de los bagres.

40
Discusión

Los parámetros fisicoquímicos registrados en Tecolutla, Veracruz indican que los

peces bagre Ariopsis felis se desarrollaron en un ambiente estuarino favoreciendo su

crecimiento y desarrollo (Wang y Walker, 2011; Wakida-Kusunoki y Amador del

Ángel, 2017 y Jones et al., 1978). Por esta razón no se registraron daños en los

organismos como parásitos, malos olores u otro parámetro biológico asociado. Esta

especie se distribuye en zonas costeras desde el norte de California a través del

Golfo de México: Veracruz, Tabasco y la península Yucatán (Wakida-Kusunoki y

Amador del Ángel, 2017). A pesar de que los parámetros biológicos medidos indican

que los organismos colectados no estaban afectados, existen reportes en Tecolutla

de contaminantes que son vertidos en los estuarios y pueden ser potencialmente

bioacumulados por los organismos acuáticos (Arriaga et al., 2009; Botello et al.,

2010).

De acuerdo a los parámetros morfométricos de los peces estudiados, estos se

encontraron en una etapa de crecimiento juvenil-adulto (Wang et al., 2011), además

por tener un ciclo de vida corto (5 a 6 años) y hábitos alimenticios relacionados con

el sistema bentónico (Wang, Surge y Walker, 2011; Wakida-Kusunoki y Amador del

Ángel, 2017); estos peces son buenos indicadores para diagnósticos de salud

relacionados con la contaminación acuática (Botello et al., 2010).

Por otra parte, el número de eritrocitos por mililitro encontrado en los peces

analizados fue de 1.9 X106, sugiere que estos presentan una concentración baja

41
dentro de los parámetros hematológicos reportados en otras especies de bagres

como lo indica Breazile (1982) y Montes de Oca (2015) en la especie Ictalurus

punctatus.

Aunque el recuento de eritrocitos de los bagres Ariopsis felis señala una baja

concentración a comparación de otras especies, esto no sugiere un compromiso en

la salud de los organismos, pero sí está relacionado con la presencia de

contaminación en los cuerpos acuáticos de Tecolutla, Veracruz (Arriaga et al., 2009;

Maceda-Veiga et al., 2015; Witeska et al., 2011).

Los eritrocitos en los peces bagre presentaron una forma ovoide y un núcleo semi-

condensado al igual que otros estudios en peces. Vergara y Aldana, (1996); así

como Conroy, (1972) menciona que esta forma es eficaz en el transporte de oxígeno

debido a su mayor superficie de contacto. La descondensación de cromatina indica

que ésta se encuentra en un estado metabólico activo, es decir se están

transcribiendo los genes que codificarán para las proteínas útiles para que los

eritrocitos realicen su función biológica. La Por otra parte, (Valdebenito et al., 2011)

reporta eritrocitos con forma elíptica y de menor tamaño en el pez puye (Galaxus

maculatus) sugiriendo que los peces con mayor actividad natatoria requieren mayor

concentración de eritrocitos con forma elíptica para el transporte de oxígeno a los

órganos mientras que los peces con eritrocitos con forma ovalada tienden a tener

comportamientos bentónicos por lo que el eritrocito adopta esta forma para tener

mayor superficie de contacto en comparación con la forma elíptica.

El tamaño de los linfocitos y monocitos de los peces bagres A. felis analizados es

similar a los reportados por diversos autores (Vergara y Aldana, 1996; Barrios, 2011;

42
Minaya Ibáñez, 2018) señalando que la variación del tamaño en linfocitos de peces

se debe a su estado de madurez, sugiriendo que los pequeños constituyen células

en desarrollo que deben incrementar su tamaño para cumplir sus funciones y los

grandes son linfocitos productores de anticuerpos (Vergara y Aldana, 1996; Minaya

Ibáñez, 2018).

Las alteraciones observadas en los eritrocitos como poiquilocitosis, equinocitosis y

eritrocitos hipocrómicos pueden ser reversibles con un factor 2, lo que representa

un bajo impacto (Bernet et al., 1999) dentro de la serie roja y no ponen en riesgo la

salud de los peces bagres analizados. Por otra parte, la alta diseminación de células

blásticas representan una alteración irreversible cuando hay daño en órganos

hematopoyéticos o principios de anemia (Yilmaz y Mutaf, 2015), sin embargo, en los

bagres de Tecolutla, esta alteración presentó poca diseminación por lo que se infiere

que la presencia de estas células no afectan la serie roja de los organismos.

De acuerdo a la variación en la morfología nuclear de los eritrocitos, estos

presentaron un valor de 3 en su importancia patológica lo que indica que, si esta

alteración se encuentra diseminada en el torrente sanguíneo del bagre, puede

volverse una lesión de alto impacto que eventualmente puede afectar la salud de los

peces analizados (Witeska y Szczygielska, 2011).

Al observar la variación en la morfología nuclear de los eritrocitos a partir del análisis

histopatológico, se realizó una evaluación genotóxica a través de un ensayo cometa

para determinar el daño en el material genético. Los bagres de Tecolutla

presentaron niveles moderados de daño en el material genético. Los trabajos de

Guevara et al., (2014); así como de Arriaga et al., (2009) mencionan que en

43
Tecolutla Veracruz existe la presencia de metales provenientes de actividades

industriales y que son vertidos en el río de Tecolutla. Por tal razón, es probable que

estas sustancias sean las causantes de alteraciones genómicas en los eritrocitos

de los peces bagre (Martins y Costa, 2015; Olivares et al., 2014; Witeska et al.,

2011). La ruptura en sitios lábiles del material genético en eritrocitos de peces, es

sugerido como un biomarcador de efecto producido por exposición a contaminantes

acuáticos, principalmente por exposición a metales y especies reactivas del oxígeno

(EROS) (Olivares et al., 2014). Por esta razón, el ensayo cometa resulta ser un

método ampliamente recomendado para determinar el daño producido por agentes

tóxicos en los cuerpos de agua, además de generar información sobre el estado de

salud que pueden presentar los organismos acuáticos al estar en exposición a

contaminantes del agua Singh et al., (1988); Witeska, Kondera y Szczygielska,

(2011).

En cuanto a la genotoxicidad de los eritrocitos, Brugés y Reguero (2007) y Olivares

et al., (2014) mencionan que las principales causas de daño en el material genético

en peces se deben a la presencia de metales en los cuerpos de agua por lo que,

cuando se observan alteraciones preliminares que modifiquen la estructura del

material genético en eritrocitos de peces, resulta de gran importancia realizar estos

estudios con el fin de establecer criterios de evaluación genotóxicos e

histopatológicos.

El diagnóstico de salud de los peces obtenido a través de los indicadores:

importancia patológica e intensidad de reacción de las alteraciones en los eritrocitos,

mostró que los bagres de Tecolutla presentan alteraciones que eventualmente

44
pueden afectar su estado de salud, sin embargo, según nuestros resultados, el

sistema acuático en el que se desarrollan aún no presentan niveles altos de

contaminación. Bernet et al., (1999) y Zimmerli et al., (2007) mencionan que el

análisis histopatológico a partir de estos criterios de evaluación (Importancia

patológica) resultan de gran importancia para determinar la relación de alteraciones

con la contaminación acuática, además añadir a los estudios tisulares análisis

semicuantitativos ayudan a generar diagnósticos de salud confiables.

Los estudios hematológicos, como los elaborados en este trabajo, resultan ser de

gran utilidad para el monitoreo de la contaminación debido a su bajo costo,

obtención de muestras biológicas y obtención de resultados en un corto tiempo. Por

esta razón, se recomiendan como un primer paso para generar diagnósticos de

salud preliminares. Estos acercamientos permiten evaluar la importancia patológica

de las alteraciones que presentan los organismos acuáticos, así como su relación

con la contaminación acuática y con base a los resultados obtenidos, sirven de

indicadores para que posteriormente se realicen pruebas específicas. De acuerdo a

Rodak y Carr (2014) y Castelletto, (2013), es importante establecer protocolos

hematológicos estandarizados para realizar diagnósticos de salud más confiables y

que coadyuven a los programas de monitoreo de la contaminación en los cuerpos

acuáticos.

45
Conclusiones

 Los parámetros morfométricos y biológicos de los peces bagre Ariopsis felis,

así como los fisicoquímicos del agua señalan que estos organismos

presentan un crecimiento y desarrollo óptimo del sistema en el que habitan.

 La concentración de eritrocitos se considera un biomarcador hematológico

integral para establecer un diagnóstico de salud en peces, por lo que se

sugiere reportar este parámetro en los estudios relacionados con la

contaminación acuática.

 El Factor de importancia (FI) así como la Intensidad de reacción (IR) se

consideran criterios de evaluación que pueden ser aplicados en alteraciones

tisulares del torrente sanguíneo de peces como se demostró en este estudio.

 Las alteraciones observadas en los organismos analizados fueron:

poiquilocitosis, equinocitosis, eritrocitos hipocrómicos, células blásticas y.

variación en la morfología nuclear, siendo esta última la de mayor importancia

patológica e intensidad de reacción de los bagres analizados.

 El material genético evidenció daño en los eritrocitos de los bagres A. felis por

lo cual se recomienda el uso del ensayo cometa como prueba

complementaria para determinar daño genotóxico en organismos silvestres.

 Los índices de reacción permitieron estimar el grado de daño en los eritrocitos

de los peces bagre Ariopsis felis de Tecolutla, Veracruz por lo que se

46
 recomienda utilizar éstos índices en la evaluación de la contaminación

acuática.

 El índice de salud, indicó que las alteraciones observadas no representan un

riesgo para los organismos. Sin embargo, las alteraciones pueden progresar

si el estrés ambiental se incrementa causando lesiones más severas que

comprometan la condición fisiológica.

 El presente estudio demuestra que el recuento de eritrocitos, así como los

índices histopatológicos y la frecuencia de daño genotóxico resultan ser

biomarcadores importantes para la evaluación de la contaminación acuática.

 Se recomienda complementar los estudios sanguíneos con análisis en otros

órganos para establecer un diagnóstico de salud más robusto en los peces

bagre Ariopsis felis así como su importancia dentro de los programas de

monitoreo ambiental.

47
Bibliografía

Ansoar, Y., Fontanetti, C., Christofoletti, C., & Díaz, C. (2015). Aplicaciones del

ensayo cometa en genética ecotoxicológica. CENIC Ciencias Biológicas, 46(1),

51–62.

Arriaga, M., Hernández, L., Sandoval, F., Vera, J., Vargas, E., & García, L. (2009).

Monitoreo de la calidad del agua del Río Tecolutla desde Coyutla hasta

Gutierrez Zamora, Veracruz. Revista Latinoamericana de Recursos Naturales,

5(2), 141–147.

Barrios, R. C. (2011). Características morfométricas de las células sanguíneas de

Cachama blanca (Piaractus brachypomus) alimentadas con suplemento de

ensilaje de vísceras de pescado durante la etapa de ceba. Citecsa, 2(2), 68–74.

Recuperado de:

http://www.unipaz.edu.co/ojs/index.php/revcitecsa/article/view/14

Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt, P., & Wahli, T. (1999). Histopathology

in fish: proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish

Diseases, (June 1999), 25–34. https://doi.org/10.1046/j.1365-2761.1999.00134.x

Botello, A., Fragoso, S., Gutiérrez, J., & Rojas, J. L. (2010). Vulnerabilidad de las

zonas costeras mexicanas ante el cambio climatico. Journal of Chemical

Information and Modeling (Vol. 53).

https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004

48
Bratosin, D., Dobre, A., Rugina, A., Calu, L., & Tuşa, I. (2016). Flow cytometry of

nucleated red blood cells used as monitoring technique for aquatic risk

assessment. A. Recuperado de

:https://www.researchgate.net/profile/Daniela_Bratosin/publication/310257782_2

016_BRATOSIN_Flow_cytometry_of_nucleated_red_blood_cells_used_as_mon

itoring_technique_for_aquatic_risk_assessment_A_review/links/582ad8d308ae0

04f74af12aa.

Brugés, K., & Reguero Reza, M. T. (2007). Evaluación preliminar de toxicidad,

genotoxicidad y actividad antimicrobiana de Sida rhombifolia L. Revista

Colombiana de Biotecnología, IX(No1), 5–13. Recuperado de:

www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/702

Castelletto, E. (2013). Recomendaciones para la interpretación del frotis sanguíneo

del subprograma de morfología sanguínea. (p. 39). Departamento Biomédico

Nacional y de Referencia. Instituto de Salud Pública de Chile.

Guevara Carrió, E. del C. Amador del Ángel, L. E., González Elías, J. M., Brito, Y.,

Pérez, R., & Huerta, E. (2014). Análisis de los parámetros físico-Químicos y

algunos aspectos biológicos en el Sistema Fluvio Lagunar Deltaico Río Palizada

, en el Área de Protección de Flora y Fauna Laguna de Tér ..., (October).

Guzmán-García, X., Martínez-López, A., Rodríguez-Medina, L., González-Márquez,

H., & Vázquez-Botello, A. (2007). Cambios tisulares en el ostión Crassostrea

virginica por exposición y depuración al cadmio. Hidrobiologica, 17(1 SUPPL.),

41–48.

49
Jeronimo, J. J. R. (2013). “ Biomarcadores de salud y calidad aplicados a la almeja

Polymesoda caroliniana ( Bosc , 1801 ) ( Bivalva : Corbiculidae ) de Tecolutla ,

Veracruz ” ., 1–99.

Maceda-Veiga, A., Figuerola, J., Martínez-Silvestre, A., Viscor, G., Ferrari, N., &

Pacheco, M. (2015). Inside the Redbox: Applications of haematology in wildlife

monitoring and ecosystem health assessment. Science of the Total

Environment, 514, 322–332. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2015.02.004

Martins, M., & Costa, P. M. (2015). The comet assay in Environmental Risk

Assessment of marine pollutants: Applications, assets and handicaps of

surveying genotoxicity in non-model organisms. Mutagenesis, 30(1), 89–106.

https://doi.org/10.1093/mutage/geu037

Minaya Ibáñez, A. P. (2018). Evaluación del perfil hematológico y bioquímico en

Gamitana (Colossoma macroponum) de la amazonia peruana. Universidad

Peruana Cayetano Heredia. Perú.

Olivares, H. G., Muñoz, R. G., Vásquez, D. C., Valladares, M. M., & Valenzuela, G.

L. (2014). Assessment of genotoxicity of coastal waters of central Chile on fishes

Mugil cephalus and Odontesthes brevianalis | Evaluación de la genotoxicidad de

las aguas costeras de Chile central sobre los peces Mugil cephalus y

Odontesthes brevianalis. Hidrobiologica, 24(3), 271–279.

Olivares, H. G., Muñoz, R. G., Vásquez, D. C., Valladares, M. M., & Valenzuela, G.

L. (2014). Evaluación de la genotoxicidad de las aguas costeras de Chile central

sobre los peces Mugil cephalus y Odontesthes brevianalis. Hidrobiologica,

50
 24(3), 271–279.

Padrós, F. (2005). Manual de Técnicas básicas de diagnóstico patológico en peces.

1–62.

Rodak, B. F. y Carr, J. H. (2015). Atlas de Hematología Clínica. 4ta Edición. Médica

Panamericana.

Singh, N. P., M. T. Mccoy, R. R. Tice & E. L. Schneider. (1988). A simple technique

for quantization of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental

Cell Research 175: 184-191.

Valdebenito, I., Busse, K., Jaramillo, N., & Hernández, A. (2011). Blood cytology of

the common jollytail (Galaxias maculatus) (Jenyns, 1842) (Osmeriformes:

Galaxiidae) at postlarval and adult stages. Archivos de Medicina Veterinaria,

43(3), 233–239. https://doi.org/10.4067/S0301-732X2011000300005

Vazzana, M., Salerno, G., Celi, M., Vizzini, A., Parrinello, D., Luigia, M., Nn, F. F.

(2009). Effect of in vitro exposure to cadmium and copper on sea bass blood

cells, 2(Cd), 884–886.

Vergara Pinzón, E. V., & Mantilla Aldana, L. (1996). Morfología comparativa de las

celulas sanguíneas del tiburón nodriza Ginglymostoma cirratum con diversos

peces. Dahlia, 1, 97–102.

Wakida-Kusunoki, A. T., & Amador del Ángel, L. E. (2017). Vertebral deformities in

hardhead catfish Ariopsis felis (Siluriformes: Ariidae) in the southeastern Mexico.

Revista de Biología Marina y Oceanografía, 52(1), 159–162.

https://doi.org/10.4067/S0718-19572017000100013

51
Wang, T., Surge, D., & Walker, K. J. (2011). Isotopic evidence for climate change

during the vandal minimum from ariopsis felis otoliths and mercenaria

campechiensis shells, Southwest Florida, USA. Holocene, 21(7), 1081–1091.

https://doi.org/10.1177/0959683611400458

Witeska, M., Kondera, E., & Szczygielska, K. (2011). The Effects of Cadmium on

Common Carp Erythrocyte Morphology, 20(3), 783–788.

Yilmaz, M., & Mutaf, B. F. (2015). Comparative Morphometry of Erythrocytes of

Different Fish Species, 1–4.

Zeitz, M., & Sens, P. (2012). Reversibility of red blood cell deformation. Physical

Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics, 85(5), 1–9.

https://doi.org/10.1103/PhysRevE.85.051904

Zimmerli, S., Bernet, D., Burkhardt-Holm, P., Schmidt-Posthaus, H., Vonlanthen, P.,

Wahli, T., & Segner, H. (2007). Assessment of fish health status in four Swiss

rivers showing a decline of brown trout catches. Aquatic Sciences, 69(1), 11–25.

https://doi.org/10.1007/s00027-006-0844-3

52
53