VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Introducción:
La Conferencia Internacional sobre Armonización de Requerimientos Técnicos para el
Registro de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) establece que el objetivo de la
validación de un método analítico es demostrar que es adecuado para su propósito.
Definiciones de validación:
USP: la validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante estudios
de laboratorio, que el método cumple los requisitos para la aplicación analítica propuesta.
ISO 8402: es la confirmación mediante ensayos y el suministro de pruebas evidentes que
los requerimientos particulares para un uso específico se han cumplido.
FDA: establecer mediante documentación evidente, con un alto grado de seguridad, que
mediante un proceso específico se obtendrá un producto que cumple con las especificaciones y
atributos de calidad previamente determinados.
Historia:
USP
USP publica normas públicas incluyendo los métodos para determinar su cumplimiento.
Estos métodos deben basarse en datos que documenten su aptitud.
Capítulo General <1225> Validación de Valoraciones y Métodos de Farmacopea
▪ Propuesto por primera vez en 1986
▪ Adoptado en USP 21, 1989
▪ Revisiones en USP 23, & Suplemento 2, 4, y 10 para armonizar con ICH
▪ Adoptado de USP 24 hasta la fecha.
ICH
▪ ICH Q2A- Text on Validation of Analytical Procedures (October 1994)
▪ ICH Q2B- Text on Validation of Analytical Procedures: Methodology
(November 1996)
▪ Q2(R1) Validation of Analytical Procedures Text And Methodology (November
2005)
Procedimientos analíticos a validar:
La discusión sobre la validación de métodos analíticos se dirige principalmente a los cuatro
tipos de metodologías comúnmente utilizadas:
▪ Ensayos de identificación
▪ Valoración cuantitativa de impurezas
▪ Ensayo límite para valoración de impurezas
▪ Análisis cuantitativos de principios activos en materia prima y producto
terminado u otros componentes de un producto terminado
En necesario aclarar que existen otras metodologías como metodología analítica para
ensayos de disolución o determinación de tamaño de partícula que ICH no menciona hasta
el momento en la guía y que probablemente en el futuro si las mencione.
Con respecto a los ensayos de identificación con el propósito de asegurar la identidad de
un analito en una muestra: generalmente se determina por comparación ya sea de un
espectro, del comportamiento cromatográfico o de la reactividad química, similar a la
sustancia de referencia.
Los ensayos de determinación de impurezas pueden ser de cuantificación o ensayos
límite. Ambos ensayos tratan de demostrar que la metodología utilizada refleja la pureza de
la muestra. Cada uno presenta diferentes requerimientos.
Parámetros de Validación:
▪ ESPECIFICIDAD (SELECTIVIDAD)
▪ EXACTITUD
▪ RANGO
▪ PRECISION
▪ LINEALIDAD
▪ LIMITE DE DETECCION
▪ LIMITE DE CUANTIFICACION
▪ ROBUSTEZ
Re-validación:
Puede ser necesaria en los siguientes casos:
▪ Cambios en la síntesis del principio activo
▪ Cambios en la composición del producto terminado
▪ Cambios en el procedimiento analítico.
Elementos requeridos para un ensayo de Validación según ICH
Tipo de procedimiento Identificaci Ensayos de Impurezas Valoración:
analítico ón
Disolución
Cuantificación Límite Contenido/pote
Características ncia
Exactitud - + - +
Precisión
Repetibilidad - + - +
Precisión Interm. - + (1) - +
Especificidad (2) + + + +
Límite de detección - - (3) + -
Límite de cuantificación - + - -
Linealidad - + - +
Rango - + - +
- Significa que esta característica normalmente no se evalúa
+ Significa que esta característica normalmente se evalúa
(1) En caso de que se halla realizado Reproducibilidad, no se requiere el
ensayo de Precisión Intermedia.
(2) La pérdida de especificidad de un procedimiento analítico se puede
compensar con otro procedimiento analítico.
(3) Puede ser necesario en algunos casos.
Elementos requeridos para un ensayo de Validación según USP
Categoría I: procedimiento analítico para la cuantificación del componente mayoritario de
una materia prima o del principio activo (incluyendo conservantes) en una forma farmacéutica
terminada
Categoría II: procedimiento analítico para la determinación de impurezas en una materia
prima o de productos de degradación en una forma farmacéutica terminada. Incluye los límites
de cuantificación y de detección.
Categoría III: procedimiento analítico para la cuantificación de principios activos en otros
ensayos (test de disolución y liberación de drogas)
Categoría IV: ensayos de identificación
Parámetro I II
cuantifica límite III IV
ción
Exactitud SI SI * * NO
Precisión SI SI NO SI NO
Especificidad SI SI SI * SI
Límite NO NO SI *
NO
detección
Límite NO SI NO *
NO
cuantificación
Linealidad SI SI NO * NO
Rango SI SI * * NO
* Puede ser requerida
Procedimiento para hacer una validación
▪ Identificar el método a ser validado
▪ Clasificar el tipo de método
▪ Determinar parámetros a analizar
▪ Escribir el protocolo de validación para registrar datos analizar los datos
estadísticamente
▪ Efectuar el informe de validación.
La validación solo puede ser verificada por ensayos de laboratorio.
La validación de un método debe ser completa cuando se desarrolla un nuevo método
analítico para cualquiera de las categorías.
Cuando se hace ensayo de endotoxinas bacterianas o determinación de agua por el método
de Karl Fisher, hay que validar para considerar la ausencia de interferentes y exactitud del
método empleado.
En caso de emplear un método codificado se debe efectuar la adecuación del método a las
condiciones de trabajo, para verificar que los excipientes no interfieran.
Aplicabilidad
La habilidad o capacidad de un método para determinar la sustancia de interés libre de
interferencias de otros materiales que puedan estar presentes en la muestra bajo estudio.
Un aspecto importante de la aplicabilidad es el ámbito de utilización del método.
Ciertos métodos tales como los gravimétricos o las titulaciones convencionales, son
adecuados únicamente para el análisis de los macrocomponentes de una muestra.
La mayor parte de los métodos instrumentales, pueden determinar hasta trazas de
sustancias. Cuando se excede la concentración que puede ser adecuadamente medida por un
procedimiento dado, la dilución o el partir de una muestra de menor peso, resolverá el
problema. Si la concentración de la sustancia en estudio es demasiado baja para el método, el
problema se puede solucionar utilizando una muestra de mayor tamaño o concentrando la
sustancia de interés, ya sea extrayéndola de la muestra y después evaporando los solventes o
empleando técnicas que conduzcan al mismo resultado.
Especificidad o selectividad
Es la capacidad de determinar inequívocamente al analito en presencia de componentes
que probablemente se encuentren presentes (ICH).
La característica de un método para responder exclusivamente con la sustancia en estudio o
un pequeño grupo de sustancias similares. Esto incluye impurezas de síntesis, metabolitos y
productos de degradación de los distintos componentes. En la práctica la especificidad absoluta
no es posible puede ser compensada con otro método analítico soporte.
La especificidad absoluta en el análisis de trazas, puede usualmente lograrse solamente a
expensas de otros atributos del método. En algunas circunstancias, la falta de especificidad en
los métodos; es compensada por métodos separativos que preceden a la determinación
propiamente dicha.
Si se dispone de las impurezas: es necesario demostrar en la técnica analítica que es
posible discriminar al analito de las impurezas o de los componentes de la matriz.
Para la selectividad se realizan análisis de degradación forzada para determinar la ausencia
de interferentes. Para la degradación forzada se utilizan el principio activo, el placebo y la
formulación farmacéutica para la que se utilizará ese método analítico.
A cada uno se le realiza una hidrólisis neutra (reflujo por 60 minutos), una hidrólisis ácida
(HCl 1 N por 60 minutos), hidrólisis alcalina (NaOH 1 N por 60 minutos), fotólisis (UV 254 nm
por 8 horas), oxidación (agua oxigenada por 30 minutos) y termólisis a 105 °C por 5 horas.
Luego se realizan las determinaciones para comprobar que la degradación forzada del principio
activo, el placebo y la formulación presentan interferencias en el ensayo.
Precisión
Es el grado de dispersión entre una serie de medidas obtenidas de varios ensayos a partir
de una muestra homogénea, bajo condiciones predeterminadas (ICH)
La precisión puede ser considerada a tres niveles:
REPETIBILIDAD: es la precisión bajo las mismas condiciones operativas en un período
corto de tiempo, también denominado precisión intra-ensayo (ICH) Se determina realizando un
mínimo de 9 determinaciones dentro del rango del procedimiento ( 3 concentraciones / 3
replicados ) o un mínimo de 6 replicados al 100 %
PRECISION INTERMEDIA: expresa las variaciones intra-laboratorio: diferentes días,
diferentes analistas, diferentes equipos (ICH).
REPRODUCIBILIDAD: es la utilización de un procedimiento analítico en diferentes
laboratorios (ICH ).
Es el grado de variación de los resultados de la medición de una misma propiedad realizada
en condiciones similares.
La precisión de un método analítico generalmente se expresa como la desviación estándar,
la varianza o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación)
Las variaciones en mediciones repetidas son causadas por el error al azar (aleatorios), por
ejemplo, cambios en la línea de voltaje, estimación al pesar o medir volúmenes, etc.
La precisión se mide en términos de desviación estándar y se define como la raíz cuadrada
de la suma de las desviaciones individuales al cuadrado, dividido entre el número de resultados
menos uno.
√ (x1 – x) 2
n-1
La desviación estándar relativa o coeficiente de variación en porcentaje, es la desviación
estándar multiplicada por 100 y dividida por el promedio.
Cada ensayo tiene una variabilidad proveniente de las pequeñas e inevitables variaciones
de manipulación, medio ambiente y medida.
La precisión del ensayo está limitada por esa variabilidad y puede ser perfeccionada por el
mejoramiento del método o por la repetición si el método ha sido mejorado hasta un máximo en
cuanto a la técnica del analista y del equipo, el único camino que queda para el mejoramiento
de la precisión del ensayo es la repetición.
Los valores de la precisión interlaboratorio, son determinados en el curso de estudios
colaborativos. La precisión entre analistas del mismo laboratorio, debe ser mejor que la de
analistas interlaboratorios. Un solo analista, controlando la misma muestra en diferentes días,
frecuentemente da resultados similares a otro analista con experiencia y entrenamiento
comparables en el mismo laboratorio.
Los valores de desviación estándar relativa o coeficiente de variación, refleja la precisión y
habilidad del analista. La precisión obtenida por analistas expertos, podrá servir como criterio
para el control de calidad del personal de un laboratorio.
Un factor adicional, es la dificultad del análisis. Estudios en muestras impuras, que requieran
más pasos de purificación, han mostrado valores de coeficiente de variación más altos que las
soluciones puras.
Un método que es preciso pero que tiene un error determinante, es aceptable porque la
desviación puede ser eliminada por el uso de un factor de corrección, un método altamente
exacto pero no preciso, es usualmente menos deseado porque requiere de varias repeticiones
para reducir el coeficiente de variación, en orden para obtener un valor confiable del valor
verdadero.
Los datos de precisión y exactitud pueden ser usados de muchas maneras, por ejemplo:
para validar métodos analíticos, para conocer si un analista tiene un método bajo control, o para
la verificación continua y sistemática de la validación de resultados.
Entre las características prácticas de los métodos analíticos se incluyen el costo de la
ejecución, el tiempo requerido y el nivel de adiestramiento, incluyendo costo de reactivos e
instrumentos.
Con el propósito de investigación estos atributos prácticos de los métodos son de
importancia secundaria. Sin embargo los mismos son de gran importancia cuando se trata de
análisis con fines regulatorios para verificar cumplimiento de la ley o vigilancia sanitaria debido
al alto número de muestras que se requiere analizar en estos casos.
Linealidad
Es la habilidad (dentro de un rango determinado) de obtener resultados que son
directamente proporcionales a la concentración (cantidad) de analito en la muestra” (ICH)
La mayoría de los métodos analíticos se basan en procedimientos donde la respuesta es
lineal. Al aumentar o disminuir la concentración la señal se modifica linealmente. Se utiliza el
método estadístico que relaciona si la variable dependiente tiene relación lineal frente a un
cambio de la variable independiente. La ecuación de la recta es la siguiente:
y = a + bx
donde a es el punto de intercepción de la recta en el eje y b es la pendiente de la recta. Un
coeficiente de correlación (r) mayor a 0.998 es considerado como indicativo de linealidad.
Procedimiento para determinar la linealidad:
▪ Seleccionar el número de concentraciones a ser analizadas, las
recomendaciones estadísticas determinan un mínimo de 5 niveles de
concentración (ICH)
▪ Determinar el número de alícuotas para cada concentración, recomendado
determinar 5 alícuotas del valor menor, 3 de intermedio y 5 de nivel alto.
▪ Seleccionar los valores de concentración
▪ Preparar las muestras usando material representativo
▪ Analizar las muestras según el nuevo método
▪ registrar los datos y graficar la concentración del analito en función de la
respuesta en un sistema adecuado que permita calcular la regresión lineal.
▪ Calcular estadísticamente la regresión lineal
▪ Hacer el informe.
El valor de la respuesta medida por unidad o concentración de la sustancia, es decir, la
pendiente de la curva de respuesta o de calibración corresponde a la Sensibilidad del método.
Si la curva de calibración es una línea recta, la sensibilidad es constante a lo largo del
rango. Si la pendiente es pronunciada, el método es altamente sensible, es decir, pequeños
cambios de concentración producirán un gran cambio en respuesta medida. Si la pendiente no
es muy marcada, el método tiene baja sensibilidad, es decir, un cambio en la concentración
dará como resultado un cambio pequeño en la respuesta medida.
Rango
El rango de un método analítico es el intervalo de las concentraciones de analito que
pueden ser determinadas con precisión, exactitud y linealidad
Depende de la aplicación del método analítico:
▪ Para la valoración de un principio activo en un producto terminado,
normalmente entre el 80 y el 120% de la concentración.
▪ Para uniformidad de contenido: se debe cubrir entre el 70 y el 130% de la
concentración.
▪ Para ensayos de disolución: ±20% del valor especificado. Para una droga de
liberación prolongada del 0 al 110%
▪ Para la determinación de una impureza: desde el valor especificado hasta el
120%.
Exactitud
Es una medida de cuan cerca se halla el valor experimental del valor aceptado
convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia (ICH)
La baja exactitud es causada por un error sistemático asignable o determinado. La
diferencia entre el valor experimental y el verdadero es denominada error absoluto.
El error relativo es el error absoluto multiplicado por 100 y dividido por el valor verdadero. Si
no se conoce el valor verdadero no se puede determinar la exactitud.
El error sistemático también se denomina sesgo.
Las fuentes de error sistemático o determinado que provocan la baja exactitud incluyen una
estandarización inadecuada de las soluciones, mediciones volumétricas o de peso inexactas,
uso de reactivos contaminados, instrumentos mal calibrados, errores de cálculo, sesgo personal
por ejemplo: en la determinación de un color.
Los errores determinados o sistemáticos pueden ser aditivos o proporcionales.
El error aditivo se produce cuando el error medio tiene un valor constante independiente de
la muestra. Una gráfica del valor analítico contra el valor teórico va a mostrar una intersección
diferente de cero.
El error proporcional tiene una magnitud que cambia con la concentración de la sustancia en
la muestra.
La gráfica del valor analítico contra el valor teórico tendrá una interrupción diferente de cero
y además no es lineal.
La determinación de la exactitud y la detección del error determinado o sistemático se logran
mediante el análisis de una muestra oficial certificada o de manera menos confiable por un
procedimiento de recuperación utilizando una muestra fortificada preparada en el laboratorio.
Las especificaciones para la aceptación de resultados analíticos, están determinadas
usualmente por el conocimiento actual y el uso final de los resultados.
La recuperación de sustancias dentro del ámbito de aplicabilidad de cualquier método
puede ser alta o baja o aproximarse a 100 a medida que el error disminuye y nos aproximamos
al límite superior del rango de calibración.
Los procedimientos para el análisis de trazas que tiene grandes errores en si mismos
cuando se operan cerca del límite de sensibilidad, muestran una baja exactitud en base al
criterio analítico clásico. Sin embargo, ellos podrían ser bastante aceptables desde el punto de
vista práctico de su utilidad. Siempre debe intentarse descubrir y eliminar los errores
determinados o sistemáticos relacionados con la obtención de un valor incorrecto, en una
muestra certificada o cuando se obtiene una baja o alta recuperación en una muestra fortificada.
El análisis de un componente específico en una muestra por dos o más métodos que no
tienen relación en principio puede ayudar a resolver el error sistemático.
Los errores sistemáticos pueden reducirse a niveles tolerables en los análisis, mediante la
cuantificación de su magnitud a lo largo del ámbito de aplicabilidad del método e introduciendo
una manipulación correctiva directamente en el procedimiento o una corrección matemática en
el cálculo final. Un ejemplo es el coeficiente de temperatura que se aplica ampliamente, tanto en
mediciones físicas como químicas.
Los instrumentos y los métodos nunca deberían usarse más de los ámbitos operativos
establecidos en donde las respuestas tienden a ser menos lineales y los errores más probables.
Esto es mucho más evidente en los análisis de tipo biológico que en los de naturaleza físico-
química.
El método de estandarización interna es usado con muchos instrumentos para compensar
fluctuaciones mecánicas y electrónicas. El estándar interno es un compuesto similar, en
composición química y respuesta instrumental, a la sustancia en estudio, se agrega a la
muestra y a los estándares en una cantidad conocida y constante que se aproxime a la
concentración de la sustancia en estudio. La relación de la respuesta de la sustancia en estudio
con la respuesta del estándar interno, para muestra y estándar determina la concentración de la
sustancia en la muestra.
Las condiciones durante el análisis afectarán el estándar interno y a la sustancia en estudio
en forma idéntica y por lo tanto los cambios se compensan.
Las sustancias interferentes pueden producir diferentes errores:
a) Reaccionar con los reactivos de la misma manera que reacciona la sustancia en
estudio (interferencia positiva).
b) Reaccionar con la sustancia en estudio impidiendo el aislamiento (interferencia
negativa).
c) Combinarse con los reactivos e impedir una reacción posterior de estos con la
sustancia en estudio (interferencia negativa)
Las recuperaciones por encima de 0 o por debajo de 100 % pueden deberse por lo menos
en parte a una o más de estas interferencias.
Existen diferentes métodos para determinar la exactitud y los que se mencionan a
continuación pueden ser adaptados a muchos instrumentos analíticos y procedimientos
químicos:
a) Agregar cantidades conocidas de un constituyente particular a una muestra real o
simulada en concentraciones en las cuales la precisión es satisfactoria.
b) Agregar una cantidad a una muestra cerca del límite de sensibilidad, suficiente
como para duplicar la concentración y agregar otra cantidad a una muestra con una
concentración intermedia para llevar la concentración final hasta aproximadamente el 75
% del límite superior de aplicabilidad del método.
c) Para el ensayo de exactitud se debe realizar un mínimo de 9 determinaciones (
3 concentraciones / 3 replicados ) ICH
d) Calcular el porcentaje de recuperación a cada concentración como la media de
los replicados.
Limite de detección
Es la menor cantidad de analito que puede ser detectada pero no necesariamente
cuantificada como un valor exacto. (ICH) se determina que el analito está por encima o por
debajo de un límite dado.(ICH)
Limite de cuantificación
Es la menor cantidad de analito que puede cuantificarse con adecuada precisión y exactitud
(ICH) Este es un parámetro utilizado en las valoraciones cuantitativas de compuestos que se
encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra, como por ejemplo impurezas en
las materias primas y productos de degradación en el producto terminado.
En algunos métodos la sustancia de interés está presente en cantidades tales que no se
requiere bajo nivel de detectabilidad, mientras que esto es muy importante en los métodos
usados en análisis de trazas.
En general, el límite práctico para muchas clases de métodos es del orden de los
microgramos (10-6 g) que corresponde a 0,1 ppm. Cuando se comienza con una muestra de
10 g se debe resaltar que no solamente el valor absoluto del blanco es importante sino también
la variabilidad del mismo.
Métodos de determinación de los Límites de detección y cuantificación
1-Basado en la evaluación visual: se utiliza en métodos no instrumentales. Se analizan
muestras de concentración conocida de analito y se establece el menor nivel que puede
detectarse y/o cuantificarse con aceptable exactitud y precisión.
2-Basado en la relación señal-ruido: se utiliza en procedimientos analíticos que presentan
ruido en la línea de base. La relación señal-ruido se determina por comparación de la señal
producida por muestras de concentración conocida de analito y la producida por blancos; así se
establece la menor concentración de analito que puede detectarse y/o cuantificarse. En general
se consideran aceptables para el límite de detección una relación señal/ruido de 3 y para el
límite de cuantificación de 10.
3-Basado en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente
3.3 s 10 s
LD = ----------- LC = -----------
S S
s = desviación estándar de la respuesta
S = pendiente de la curva de calibración
El cálculo de s se puede realizar:
a) Según la desviación estándar de distintas muestras blanco: se analiza un cierto
número de muestras blanco y se calcula la desviación estándar de esas respuestas.
b) Según la curva de calibración: se realiza una nueva curva de calibración
específica conteniendo el analito en el rango de detección o de cuantificación y se
grafica concentración vs desviación estándar (DS) para cada punto, y se extrapola la
DS a concentración 0.
Robustez
Es una medida de la capacidad del método de permanecer sin afectarse por variaciones
pequeñas, pero deliberadas, en los parámetros del mismo, e indica la confiabilidad durante el
uso normal del mismo. (ICH)
Este término se refiere a cuanto es resistente la precisión y la exactitud de un ensayo frente
a pequeñas variaciones en el método: por ejemplo cambio de instrumentos, ligeras variaciones
en el procedimiento de extracción, sensibilidad a impurezas menores en los reactivos, etc.
Ejemplos de variaciones típicas:
▪ Estabilidad de las soluciones
▪ Tiempo de extracción
En HPLC:
▪ Influencia de la variación del pH de la fase móvil
▪ Influencia de la variación de la composición de la fase móvil
▪ Diferentes columnas (lotes y proveedores)
▪ Temperatura
▪ Flujo
En GLC:
▪ Columnas diferentes (diferentes lotes y proveedores)
▪ Temperatura
▪ Flujo
Los datos obtenidos de los estudios de robustez, generalmente no se informan, se
recomienda que sean parte del estudio de validación.
