Informe 2 Bioquímica, Semestre 2023-2
Propiedades Químicas de los Lípidos. Propiedades Químicas de Aminoácidos y
Proteínas. Estructura de las Proteínas. Comportamiento de las Enzimas
PROPIEDADES DE LAS BIOMOLÉCULAS: AMINOÁCIDOS, LÍPIDOS Y PROTEÍNAS.
ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLÓGICOS
Jessica Paola Pinzón Robles - Daniela Alarcón Silva
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales/Instituto de Química, Medellín, Colombia
OBJETIVOS solubilidad del aceite de girasol en diferentes
● Determinar el índice de acidez y de solventes (Ver Tabla 1.); se observa un aumento
saponificación en una muestra de aceite. en la solubilidad a medida que disminuye la
● Mediante pruebas húmedas, identificar la polaridad del solvente, comprobando así las
presencia de diferentes tipos de lípidos, cualidades apolares de los lípidos.
aminoácidos y proteínas en las muestras Agua Insoluble
problema
● Identificar por cromatografía de capa fina Etanol Insoluble
los lípidos contenidos en la yema de huevo
● Determinar el punto isoeléctrico de la Acetona Poco Soluble
caseína
Eter Soluble
● Estudiar los efectos del cambio de
condiciones ambientales en la estabilidad de Cloroformo Soluble
la estructura terciaria de las proteínas
● Verificar el comportamiento de las CCl4 Soluble
reacciones catalizadas enzimáticamente y Tabla 1. Solubilidad del aceite de girasol en diferentes
obtener los parámetros cinéticos Vmax y solventes
Km para la enzima tirosinasa. Las pruebas de identificación de lípidos
RESULTADOS Y DISCUSIÓN iniciaron por la prueba de yodo, la cual consiste
Lípidos en el reconocimiento de ácidos grasos
Los lípidos son un grupo de biomoléculas insaturados por su reacción con una solución de
orgánicas solubles en solventes no polares o de I2/CCl4, la cual inicia siendo de un color
baja polaridad; sus funciones más relevantes rojo/violeta que va cambiando conforme se da
incluyen ser componentes estructurales de la la reacción [2]. Las pruebas realizadas dieron
membrana celular (uniéndose por fuerzas un resultado positivo en insaturaciones para el
hidrofóbicas ya que no se pueden polimerizar), ácido oleico y el aceite de girasol (Ver figura
pueden ser almacenados y metabolizados por 1.); esto puede observarse por el cambio
las células para producir energía, y algunos son drástico en la coloración que termina en un
material de partida para la síntesis de hormonas marrón oscuro. El ácido palmítico al no tener
y vitaminas. Se pueden clasificar por sus insaturaciones, se esperaba que mantuviera su
propiedades químicas, estructurales y actividad coloración inicial [3]; la manteca tuvo una
biológica, y estas características nos permiten reacción parcial pues está en su mayor parte
identificarlos. [1] compuesta por grasas saturadas, sin embargo
La primera característica química comprobada también cuenta con algunas insaturaciones; el
durante este trabajo experimental, fue la ácido oleico cuenta con una insaturación, por lo
1
que la prueba dió positiva, al igual que el aceite 2.), que a comparación del reportado (0.16) [5],
de girasol, el cual en su mayoría lo componen es mucho mayor, esto indica una cantidad
grasas insaturadas. superior de ácidos grasos, lo que puede deberse
Figura 1. Prueba de yodo para: 1. Ácido palmítico al tiempo de almacenamiento, rancidez o la
2. Ácido oléico 3. Aceite de girasol 4. Manteca calidad del aceite.
[KOH] VKOH Índice de
W aceite (g)
N (mL) acidez
La prueba de Liebermann-Buchard permite 1.07 0.0067 2.2 0.773
identificar esteroles mediante la coloración Tabla 2. Datos y resultado del cálculo de índice de
acidez para el aceite de girasol
verde intensa que produce la reacción por el
El índice de saponificación del aceite de girasol
aumento de la conjugación de la insaturación en
empleado dio un resultado de 202.63 (Ver Tabla
el anillo [4]. Se tuvo un resultado positivo para
3.), es cual de igual forma es mayor al
el colesterol y se evidenció presencia de este
reportado (191) [6].
último en el aceite de girasol; con la manteca se
obtuvo un resultado negativo.
Figura 2. Prueba de Liebermann-Burchard 1. Colesterol W Índice
[H2SO4] V Vexceso
2. Aceite de girasol 3. Manteca aceite saponifi-
N Blanco KOH
(g) cación
1.01 0.96 1.4 5.2 202.63
Tabla 3. Datos y resultado del cálculo de índice de
Mediante cromatografía de capa fina (TLC), saponificación para el aceite de girasol
también fue posible observar la presencia de Aminoácidos y Proteínas
trioleína y colesterol en el extracto de yema de Las proteínas son bio-macromoléculas de gran
huevo. importancia biológica. Son polímeros cuyas
Figura 3. TLC de identificación de lípidos en yema de unidades monoméricas son 22 α-L-aminoácidos
huevo, extracto de yema de huevo (H) comparado con que se producen por hidrólisis ácida, básica o
patrones de trioleína (T) y colesterol (C) en fase móvil enzimática de las proteínas de los seres vivos
8:2 Hexano:Acetato de etilo. Revelador: vainillina [7]. Las proteínas llevan a cabo diversas
funciones dentro de los diferentes procesos
celulares, como el transporte de iones o
nutrientes al interior de las células, el
reconocimiento y neutralización de patógenos,
o actividad catalítica que asisten la mayoría de
procesos que se llevan a cabo en la célula [1].
Los aminoácidos consisten en un átomo de
carbono (carbono alfa) ligado a un grupo
Para medir la calidad de un aceite, se utiliza el
carboxilo (COO-), un grupo amino (NH3+), un
índice de acidez y saponificación; el primero
átomo de hidrógeno, y una cadena lateral
indica la cantidad de KOH requerido para
característica. Las propiedades químicas de las
neutralizar los ácidos grasos libres de un gramo
diferentes cadenas laterales de los aminoácidos
de grasa, y el segundo la cantidad necesaria
determinan los papeles de cada uno de estos en
para saponificarlo. Para el aceite de girasol, se
la estructura y función proteica. Los
calculó un índice de acidez de 0.773 (Ver Tabla
aminoácidos sirven la función primordial de ser
2
precursores de las proteínas y otras Reacción de Ehrlich: Identifica anillos
biomoléculas. Sin embargo, cuando la fenólicos o nitrogenados, reaccionando con
disponibilidad de estas sustancias excede los ellos para dar productos coloreados. El
requerimientos celulares, pueden ser utilizados resultado fue positivo para la tirosina libre, la
como fuente de energía [8]. leche y la albúmina.
Para la caracterización de estos aminoácidos y Para la determinación del punto isoeléctrico de
proteínas en muestras de glicina, leche y la caseína (proteína más abundante en la leche),
albúmina, se realizaron diferentes test (Ver se midió el pH en el punto en que se da la
anexos) separación de ésta de la leche, ya que al estar en
Prueba de ninhidrina: este reactivo funciona su estado zwitterion tiene una solubilidad
como agente oxidante para que se de una mínima. El pH medido fue de 5, el cual se
desaminación reductiva en el aminoácido libre, acerca al reportado en la literatura (4.6) [12].
esto genera un complejo que colorea la solución La desnaturalización de proteínas fue posible
a azul o violeta, indicando presencia de con la adición de iones de metales pesados a la
aminoácidos [10]. Ya que las 3 muestras tenían leche y la albúmina, los que resultó en un
presencia de aminoácidos y al utilizar calor las precipitado coloreado para la primera y una
proteínas se desnaturalizaban, todas dieron solución turbia blanca azulada para la segunda.
positiva a esta prueba, sin embargo, aquellas También esta desnaturalización se vió con el
con estructura más compleja, tardaron más en cambio de condiciones en la solución: calor,
colorear. adición de etanol, acidificación y basificación;
Reacción Xantoproteica: se da una reacción en estas generaron una coagulación por la
proteínas con aminoácidos aromáticos que alteración en la conformación de la proteína,
resulta en una coloración amarilla que pasa a comprometiendo su estructura terciaria.
naranja al añadir una base. Puesto que la leche Estabilidad de la estructura terciaria de las
y la albúmina contienen triptófano (aminoácido proteínas
aromático), dieron positivo a la prueba. La estructura de las proteínas es fundamental
Hopkins Cole: Es una prueba específica para para su función, esta se puede dividir en cuatro
triptófano, al igual que en la anterior, leche y niveles: primario, cuando refiere a la secuencia
albúmina dieron positivo. de aminoácidos que componen la proteína;
Aminoácidos azufrados: Al adicionar una sal de secundario, teniendo en cuenta la disposición
plomo (II) a un aminoácido que contiene tridimensional de los aminoácidos cercanos
azufre, se forma sulfuro de plomo, un sólido entre sí en la cadena polipeptídica; terciario al
negruzco que precipita. Leche y albúmina observar la disposición tridimensional completa
dieron positivo. de la proteína: describe el plegamiento de sus
Prueba de Biuret: permite identificar péptidos y elementos de la estructura secundaria y
proteínas gracias a la coordinación de pares de especifica las posiciones de cada átomo en la
electrones libres de nitrógenos en enlaces proteína, incluidos los de sus cadenas laterales;
peptídicos con el cobre (II) en solución acuosa, y cuaternario refiriéndose a la organización
este complejo presenta coloración violeta como tridimensional de las subunidades que
indicativo de la presencia de péptidos o componen una proteína compleja [9].
proteínas, tal como se observa con la leche y la Aunque la estructura terciaria de una proteína
albúmina. Como la glicina es un aminoácido se pliega espontáneamente para llevar a cabo
libre no forma el complejo [11]. sus funciones biológicas, esta puede ser
perturbada por cambios en las condiciones
3
ambientales, como temperatura, pH o solventes, [13], se favorece la formación de agregados y la
y si llega a ser extremo, se puede desnaturalizar coagulación.
y perder esa estructura. El cambio de polaridad por la adición de etanol,
Experimentalmente se cambiaron las disminuyó la solvatación de la proteína y la
condiciones de una solución acuosa de precipitó.
albúmina al variar fuerza iónica, pH, La adición de ácidos concentrados genera lo
temperatura y polaridad del medio para alterar mismo que se habló en el párrafo pasado, y la
las interacciones que estabilizan la estructura base fuerte sigue dando el mismo resultado
terciaria de las proteínas. [Link] adición de un ácido débil, no produce
La adición de NaCl al aumentar la fuerza un mayor cambio.
iónica, disminuyó el número efectivo de La adición de metales favorece la precipitación
moléculas que solvatan la proteína, lo que de las sales del metal, y por los complejos
indujo la precipitación. formados se da una coloración.
Al adicionar ácido se induce la precipitación Cinética enzimática
del catión,, adicionar base no genera un cambio Se realizó un análisis de los datos de
al no haber un catión metálico con el que pueda absorbancia obtenidos por el comportamiento
precipitar, sin embargo con el buffer, al enzimático de la tirosinasa con L-DOPA para
acercarse al punto isoeléctrico de la albúmina
determinar la velocidad inicial, la constante de puede llegarse al mismo punto de actividad, ya
Michaelis-Menten y la cinética de inhibición. que el inhibidor solo disminuye la actividad
Comportamiento de las enzimas “taponando” los sitios activos de la enzima; al
Se realizó la lectura de la absorbancia cada 5 contrario con el efecto de la temperatura, se da
minutos para 3 muestras: cinética enzimática, una desnaturalización total del extracto, lo que
correspondiente al extracto de la fruta con hace la enzima inútil al no poder cumplir con su
solución del sustrato L-DOPA; Efecto de la proceso biológico.
temperatura, con el mismo sistema anterior Parámetros cinéticos de las enzimas
pero sometiendo el extracto previamente a un Para calcular la velocidad de la reacción, es
aumento en la temperatura; Presencia de necesario conocer los parámetros de la
inhibidores, el mismo sistema inicial pero velocidad máxima y la constante de
adicionando ácido ascórbico como inhibidor. Se Michaelis-Menten. Se inició por determinar la
realizaron las siguientes curvas: velocidad inicial calculando la pendiente de la
Figura 4. Comparación de curvas de absorbancia en el línea tangente a la curva de absorbancia en el
tiempo para un sistema cinético enzimático con tiempo al comienzo de la reacción (en los
modificaciones en temperatura e inhibidores.
primeros 10 segundos aproximadamente)
Figura 5. Curvas de absorbancia vs tiempo para
diferentes concentraciones de sustrato sin inhibidor
Puede verse que la presencia de inhibidores
ralentiza el proceso enzimático, sin embargo
4
Para determinar la constante de
Michaelis-Menten [1], se realizó un análisis de
saturación enzimática adicionando diferentes
concentraciones de sustrato y midiendo la
absorbancia en diferentes momentos. Luego,
los datos se graficaron en un gráfico de doble
recíproco (Lineweaver-Burk), donde la
pendiente representa la constante de
Figura 6. Curvas de absorbancia vs tiempo para Michaelis-Menten y el punto de intersección
diferentes concentraciones de sustrato con inhibidor con el eje y representa la velocidad máxima.
Figura 9. Diagrama de Lineweaver-Burk (1/V0 vs 1/[S])
en presencia y ausencia de inhibidor
Figura 7. Determinación de V0 con la pendiente de la
recta tangente a la parte inicial de la curva de
absorbancia vs tiempo para cada concentración de
sustrato sin inhibidor
La presencia del inhibidor cambia tanto la
pendiente de la línea como la inserción en el eje
de ordenadas, entonces el tipo de inhibición es
mixta, por lo que el inhibidor se une al sitio
activo de la enzima y a otros sitios, esto resulta
en una inhibición de la actividad enzimática y
una alteración en la afinidad entre la enzima y
el sustrato. La inhibición no competitiva
cambia la pendiente de la línea, pero no afecta
el valor de la inserción con el eje de ordenadas,
Figura 8. Determinación de V0 con la pendiente de la la inhibición competitiva no cambia la
recta tangente a la parte inicial de la curva de
pendiente de la línea, pero disminuye la
absorbancia vs tiempo para cada concentración de
sustrato con inhibidor velocidad máxima, pues el inhibidor se une al
sitio activo de la enzima.
Tabla 4. Parámetros cinéticos del sistema con y sin
inhibidor y constantes del inhibidor.
Inhibidor mixto
V_max 0.0943 V_max Inhibidor 0.0246
K_M 0.0072 K_M Inhibidor 0.0003
5
CONCLUSIONES symbiotic deltaproteobacterium of gutless worm
● Se logró determinar el índice de acidez y Olavius algarvensis. Nucleic Acids Research,
35(15), 4952–4963.
saponificación del aceite de girasol
[Link]
● Se calcularon los parámetros cinéticos [8] Book @8474010063. Carbonero Zalduegui,
Vmax y Km para la enzima tirosinasa, Pilar. Madrid. 1976. upm:54762. E.T.S.I.
verificando el comportamiento de la Agrónomos. Metabolismo de aminoácidos.
reacción catalizada enzimáticamente [Link]
[9] Voet, D., & Voet, J. G. (2011), Fundamentos de
● Mediante pruebas húmedas, cambios físicos bioquímica a nivel molecular (3.a ed.). Editorial
y cromatografía de capa fina, se logró Médica Panamericana.
identificar una gran variedad de lípidos, [10] Admin. (2022, May 18). Ninhydrin test -
aminoácidos y proteínas de ciertas muestras reaction, principle, procedure, result interpretation.
problema comunes Retrieved February 25, 2023, from
[Link]
● Se estudiaron los efectos del cambio de drin-Test-Principle
condiciones ambientales para la estabilidad [11] Biuret Test for Protein- Principle, Procedure,
de la estructura terciaria de las proteínas Results, Uses (2023, April 16). Microbe Notes.
5. REFERENCIAS [Link]
[1]Guía de práctica. Laboratorio de Bioquímica. [12] A.R. Sarode, P.D. Sawale, C.D. Khedkar, S.D.
Universidad de Antioquia. Kalyankar, R.D. Pawshe, Casein and Caseinate:
[2]Britannica, T. Editors of Encyclopaedia (2022, Methods of Manufacture, Editor(s): Benjamin
August 22). iodine value. Encyclopedia Britannica. Caballero, Paul M. Finglas, Fidel Toldrá,
[Link] Encyclopedia of Food and Health, Academic Press,
[3] National Center for Biotechnology Information 2016, Pages 676-682, ISBN 9780123849533,
(2023). PubChem Compound Summary for CID [Link]
985, Palmitic Acid. Retrieved October 9, 2023 -7.
from [13] Pereira, M. M., Cruz, R. A., Almeida, M. R.,
[Link] Lima, Á. S., Coutinho, J. A., & Freire, M. G.
tic-Acid. (2016). Single-Step Purification of Ovalbumin
[4] Wikipedia contributors. (2022, April 22). from Egg White Using Aqueous Biphasic Systems.
Liebermann–Burchard test. In Wikipedia, The Free Process biochemistry (Barking, London, England),
Encyclopedia. from 51(6), 781–791.
[Link] [Link]
ann%E2%80%93Burchard_test&oldid=108411124 [14] Schnell, S. (2013, October 12). Validity of the
3 Michaelis-Menten equation - Steady-state or
[5] Acid value and free fatty acids in edible oils reactant stationary assumption: That is the...
(2020, May). Metrohm. ResearchGate; Wiley.
[Link] [Link]
on-notes/aa-t-001-100/[Link] 8_Validity_of_the_Michaelis-Menten_equation_-_
[6] Saponification Chart (n.d.). From nature with Steady-state_or_reactant_stationary_assumption_T
love. Retrieved October 9, 2023, from hat_is_the_question
[Link] [15]
[Link] [Link]
[7] Zhang, Y., & Gladyshev, V. N. (2007). High ular-energetics/environmental-impacts-on-enzyme-
content of proteins containing 21st and 22nd amino function/a/basics-of-enzyme-kinetics-graphs
acids, selenocysteine and pyrrolysine, in a
6
Anexos
Propiedades de aminoácidos y proteínas
Pruebas húmedas
Prueba Determina Glicina Leche Albúmina
α-aminoácido Positivo Positivo Positivo
s
Ninhidrina
Anillos Negativo Positivo Positivo
aromáticos en
proteínas
Xantoproteica
Triptófano Negativo Positivo Positivo
Hopkins Cole
Aminoácidos Negativo Positivo Positivo
azufrados Azufre Sin cambio Verde oscuro Café oscuro
Uniones Negativo Positivo Positivo
peptídicas
Biuret
Reacción de Ehrlich -
Para anillos fenólicos o Precipitación
nitrogenados Punto isoeléctrico Caseina 1. Leche 2. Albúmina
1. Tirosina 2. leche (Sal adicionada: CuSO4)
3. Albúmina
