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Norma UNE-EN ISO 10993-10:2023

Este documento presenta la Norma Española UNE-EN ISO 10993-10:2023 sobre la evaluación biológica de productos sanitarios. Establece los requisitos para realizar ensayos de sensibilización cutánea con el objetivo de identificar el potencial alergénico de materiales y dispositivos médicos. Incluye métodos de ensayo como el ensayo con ganglios linfáticos locales utilizando ratones, que evalúa la capacidad de sensibilización mediante la medición de la proliferación de linfocitos

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Norma Española

UNE-EN ISO 10993-10

Octubre 2023

Evaluación biológica de productos sanitarios

Parte 10: Ensayos de sensibilización cutánea
(ISO 10993-10:2021)

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

CTN-UNE 111 Aparatos y dispositivos médicos y quirúrgicos,
cuya secretaría desempeña FENIN.

Asociación Española Calle de Génova, 6 915 294 900

de Normalización 28004 Madrid. España info@[Link] – [Link]

Evaluación biológica de productos sanitarios

Parte 10: Ensayos de sensibilización cutánea
(ISO 10993-10:2021)

Biological evaluation of medical devices. Part 10: Tests for skin sensitization (ISO 10993-10:2021).

Évaluation biologique des dispositifs médicaux. Partie 10: Essais de sensibilisation cutanée
(ISO 10993-10:2021).

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 10993-10:2023, que a
su vez adopta la Norma Internacional ISO 10993-10:2021.

Esta norma anula y sustituye a la Norma UNE-EN ISO 10993-10:2013.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
info@[Link]
[Link]

© UNE 2023
Prohibida la reproducción sin el consentimiento de UNE.
Todos los derechos de propiedad intelectual de la presente norma son titularidad de UNE.

Este documento ha sido adquirido por: UNIVERSIDAD INTERNACIONAL DE LA RIOJA a través de la suscripción AENORmás. Para uso en red interna se requiere de
autorización previa de AENOR.
18/02/2024
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN ISO 10993-10
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Febrero 2023

ICS 11.100.20 Sustituye a EN ISO 10993-10:2010

Versión en español

Evaluación biológica de productos sanitarios

Parte 10: Ensayos de sensibilización cutánea
(ISO 10993-10:2021)

Biological evaluation of medical Évaluation biologique des dispositifs Biologische Beurteilung von
devices. Part 10: Tests for skin médicaux. Partie 10: Essais de Medizinprodukten. Teil 10: Prüfungen
sensitization (ISO 10993-10:2021). sensibilisation cutanée auf Hautsensibilisierung
(ISO 10993-10:2021). (ISO 10993-10:2021).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2021-09-13.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión de CEN/CENELEC, tiene el mismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia,
Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta,
Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, República de Macedonia del
Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium

© 2023 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

Índice

Prólogo europeo .................................................................................................................................6

Declaración ...........................................................................................................................................6

Prólogo ...................................................................................................................................................7

0 Introducción ........................................................................................................................8

1 Objeto y campo de aplicación........................................................................................8

2 Normas para consulta ......................................................................................................9

3 Términos y definiciones..................................................................................................9

4 Principios generales. Enfoque por etapas ............................................................. 11

5 Consideraciones sobre los ensayos previos ......................................................... 12

5.1 Generalidades .................................................................................................................. 12
5.2 Tipos de material............................................................................................................ 12
5.2.1 Consideraciones iniciales ............................................................................................ 12
5.2.2 Cerámicas, metales y aleaciones ............................................................................... 12
5.2.3 Polímeros .......................................................................................................................... 12
5.2.4 Materiales de naturaleza biológica .......................................................................... 13
5.3 Información sobre la composición química.......................................................... 13
5.3.1 Generalidades .................................................................................................................. 13
5.3.2 Fuentes de datos existentes ........................................................................................ 13

6 Ensayos de sensibilización cutánea ......................................................................... 13

6.1 Elección de los métodos de ensayo .......................................................................... 13
6.2 Ensayo con ganglios linfáticos locales (LLNA) de múridos ............................. 14
6.2.1 Fundamento del método .............................................................................................. 14
6.2.2 Preparación de la muestra de ensayo ..................................................................... 15
6.2.3 Animales y cuidado de los mismos........................................................................... 15
6.2.4 Procedimiento de ensayo ............................................................................................ 16
6.2.5 Grupos de tratamiento ................................................................................................. 17
6.2.6 Determinación de la proliferación celular y preparación del tejido ........... 17
6.2.7 Resultados e interpretación ....................................................................................... 18
6.2.8 Informe del ensayo ........................................................................................................ 19
6.3 Ensayos en cobayas para la detección de sensibilización cutánea ............... 19
6.3.1 Fundamento del método .............................................................................................. 19
6.3.2 Elección de las concentraciones de la muestra de ensayo .............................. 19
6.3.3 Inducción ........................................................................................................................... 19
6.3.4 Provocación ...................................................................................................................... 20
6.4 Factores importantes que afectan el resultado del ensayo............................. 20
6.5 Ensayo de maximización en cobayas (GPMT, en inglés Guinea Pig
Maximization Test) ......................................................................................................... 21
6.5.1 Fundamento del método .............................................................................................. 21
6.5.2 Preparación de la muestra de ensayo ..................................................................... 21
6.5.3 Animales y cuidado de estos....................................................................................... 21
6.5.4 Procedimiento de ensayo ............................................................................................ 22

6.5.5 Observación de los animales ...................................................................................... 25

6.5.6 Evaluación de los resultados ...................................................................................... 25
6.5.7 Informe del ensayo ........................................................................................................ 26
6.6 Ensayo con parche ocluido (Ensayo de Buehler) ................................................ 26
6.6.1 Fundamento del método .............................................................................................. 26
6.6.2 Preparación de la muestra de ensayo ..................................................................... 26
6.6.3 Animales y cuidado de estos....................................................................................... 26
6.6.4 Procedimiento de ensayo ............................................................................................ 27
6.6.5 Observación de los animales ...................................................................................... 28
6.6.6 Evaluación de los resultados ...................................................................................... 28
6.6.7 Informe del ensayo ........................................................................................................ 29

7 Factores clave para la interpretación de los resultados de ensayo ............. 29

Anexo A (Normativo) Preparación de los materiales para los ensayos de

sensibilización ............................................................................... 31

Anexo B (Informativo) Método para la preparación de los extractos de

materiales de ensayo poliméricos .......................................... 33

Anexo C (Informativo) Métodos sin utilización de animales para los

ensayos de sensibilización cutánea ....................................... 36

Anexo D (informativo) Información general sobre ensayos de

sensibilización para la sensibilización cutánea................. 54

Bibliografía ........................................................................................................................................ 58

Anexo ZA (Informativo) Relación entre esta norma europea y los requisitos

generales de seguridad y prestaciones del
Reglamento (UE) 2017/745 ...................................................... 69

Prólogo europeo

El texto de la Norma EN ISO 10993-10:2023 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 194
Evaluación biológica y clínica de los productos sanitarios en colaboración con el Comité Técnico
CEN/TC 206 Evaluación biológica y clínica para los productos sanitarios, cuya Secretaría desempeña DIN.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de agosto de 2023, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de agosto de 2023.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN no es responsable de la identificación de dichos derechos de patente.

Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 10993-10:2010.

Esta norma europea ha sido elaborada bajo una solicitud de normalización dirigida a CEN por la
Comisión Europea y por la Asociación Europea de Libre Comercio, y sirve de apoyo a los requisitos
esenciales de las Directivas/Reglamentos.

La relación con las Directivas/Reglamentos se recoge en el anexo informativo ZA, que forma parte
integrante de esta norma.

Cualquier comentario o pregunta sobre este documento deberían dirigirse al organismo nacional de
normalización del usuario. En la web de CEN se puede encontrar un listado completo de estos
organismos.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, República de Macedonia del Norte, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.

Declaración

El texto de la Norma ISO 10993-10:2021 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 10993-10:2023
sin ninguna modificación.

Prólogo

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos

nacionales de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de elaboración de las Normas
Internacionales se lleva a cabo normalmente a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo
miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho
de estar representado en dicho comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no
gubernamentales, vinculadas con ISO, también participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con
la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todos los temas de normalización electrotécnica.

En la Parte 1 de las Directivas ISO/IEC se describen los procedimientos utilizados para desarrollar este
documento y aquellos previstos para su mantenimiento posterior. En particular debería tomarse nota
de los diferentes criterios de aprobación necesarios para los distintos tipos de documentos ISO. Este
documento ha sido redactado de acuerdo con las reglas editoriales de la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC
(véase [Link]/directives).

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan
estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de alguno o
todos los derechos de patente. Los detalles sobre cualquier derecho de patente identificado durante el
desarrollo de este documento se indicarán en la Introducción y/o en la lista ISO de declaraciones de
patente recibidas (véase [Link]/patents).

Cualquier nombre comercial utilizado en este documento es información que se proporciona para
comodidad del usuario y no constituye una recomendación.

Para una explicación de la naturaleza voluntaria de las normas, el significado de los términos específicos
de ISO y las expresiones relacionadas con la evaluación de la conformidad, así como la información
acerca de la adhesión de ISO a los principios de la Organización Mundial del Comercio (OMC) respecto a
los Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC), véase [Link]/iso/[Link].

Este documento ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 194, Evaluación biológica y clínica de
los productos sanitarios, en colaboración con el Comité Europeo de Normalización (CEN) Comité Técnico
CEN/TC 206, Evaluación biológica y clínica para los productos sanitarios, conforme al acuerdo de
cooperación técnica entre ISO y CEN (Acuerdo de Viena).

Esta cuarta edición anula y sustituye a la tercera edición (ISO 10993-10:2010) que ha sido revisada
técnicamente.

Los cambios principales en comparación con la edición previa son los siguientes:
– este documento contiene ahora una descripción de los ensayos de sensibilización cutánea solamente;
– se ha actualizado el anexo C sobre métodos que no utilizan animales para estudios de sensibilización
cutánea (anteriormente el anexo D);
– el ensayo de irritación se describe ahora en la Norma ISO 10993-23.
En el sitio web de ISO se puede encontrar un listado de todas las partes de la serie de Normas ISO 10993.
Cualquier comentario o pregunta sobre este documento deberían dirigirse al organismo nacional de
normalización del usuario. En [Link]/[Link] se puede encontrar un listado completo de
estos organismos.

0 Introducción
Este documento evalúa los posibles peligros del contacto con sustancias químicas liberadas de
productos sanitarios, que pueden producir sensibilización cutánea.

Se han ensayado algunos materiales que se incluyen en los productos sanitarios, y se ha documentado
su potencial de sensibilización cutánea. Especialmente para los materiales dentales, se han notificado
las propiedades de sensibilización – véase la referencia [51]. Otros materiales y sus componentes
químicos no se han ensayado y pueden inducir efectos adversos cuando entran en contacto con tejido
humano. El fabricante está entonces obligado a evaluar los efectos adversos potenciales de cada
producto antes de su comercialización.

Tradicionalmente, se realizan ensayos en animales pequeños antes del ensayo en seres humanos para
ayudar a predecir la respuesta humana (en el anexo D se da información sobre los antecedentes). Desde
el año 2015, se han validado varios ensayos in chemico e in vitro y se han publicado directrices de ensayo
de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) para evaluar el potencial de
sensibilización cutánea de productos químicos [75][79][104]. En el anexo C se da un resumen de los ensayos
de sensibilización cutánea alternativos disponibles para productos químicos puros. Estos métodos de
ensayo, cada uno desarrollado para abordar un evento clave específico, pueden posiblemente no ser
suficientes considerados individualmente para decidir sobre la presencia o ausencia de potencial de
sensibilización cutánea de productos químicos y se deberían considerar en el contexto de enfoques
integrados tales como los enfoques integrados de ensayo y evaluación (IATA, del inglés Integrated
Approaches to Testing and Assessment), combinándolos con otra información complementaria.
Adviértase que los ensayos in vitro e in chemico de sensibilización cutánea en el anexo C se han validado
hasta ahora solamente para productos químicos puros y no para productos sanitarios. Para confirmar
que son aplicables para la evaluación del potencial de sensibilización cutánea de productos sanitarios,
es preciso evaluar y validar sus ensayos.

Cuando proceda, se recomienda la utilización preliminar de métodos in vitro para fines de cribado antes
de efectuar ensayos con animales. Para reducir el número de animales utilizados, este documento
presenta un enfoque por etapas, con una revisión y análisis de los resultados de ensayo en cada etapa.
Está previsto que, para presentación de documentación reglamentaria, los estudios de sensibilización
cutánea se realicen utilizando GLP (Buenas prácticas de laboratorio) o la Norma ISO/IEC 17025 según
proceda para el país respectivo y que se cumpla la reglamentación que atañe al bienestar de los
animales. Se recomienda la utilización de análisis estadísticos de los datos y su utilización siempre que
proceda. Este documento incluye herramientas importantes para el desarrollo de productos seguros y
está previsto para ser utilizado por profesionales apropiadamente cualificados mediante formación y
experiencia, que puedan interpretar sus requisitos y juzgar los resultados de la evaluación para cada
producto sanitario, teniendo en cuenta todos los factores pertinentes para el producto, su utilización
prevista y el conocimiento actual del producto sanitario proporcionado mediante la revisión de la
literatura científica y la experiencia clínica previa.

Este documento se basa en numerosas normas y directrices, incluyendo las directrices de la OCDE, de la
Farmacopea de los Estados Unidos y de la Farmacopea Europea. Está previsto que sea el documento
básico para la selección y realización de ensayos que permitan la evaluación de respuestas de
sensibilización dérmica pertinentes para la seguridad de materiales médicos y productos sanitarios.

1 Objeto y campo de aplicación

Este documento especifica el procedimiento para la evaluación de productos sanitarios y sus materiales
constituyentes respecto a su potencial para inducir sensibilización cutánea.

Este documento incluye:

– detalles de los procedimientos de ensayo de sensibilización in vivo;

– factores clave para la interpretación de los resultados.

NOTA En el anexo A se dan instrucciones para la preparación de los materiales específicamente en relación con los ensayos
anteriormente citados.

2 Normas para consulta

En el texto se hace referencia a los siguientes documentos de manera que parte o la totalidad de su
contenido constituyen requisitos de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la
edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier modificación
de esta).

ISO 10993-1, Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 1: Evaluación y ensayos mediante un
proceso de gestión del riesgo.

ISO 10993-2, Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 2: Requisitos relativos a la protección de
los animales.

ISO 10993-12, Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 12: Preparación de muestras y
materiales de referencia.

ISO 10993-18, Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 18: Caracterización química de
materiales de productos sanitarios dentro de un proceso de gestión de riesgos.

3 Términos y definiciones
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones incluidos en la Norma
ISO 10993-1 además de los siguientes.

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su utilización en normalización en las siguientes
direcciones:

– Plataforma de búsqueda en línea de ISO: disponible en [Link]

– Electropedia de IEC: disponible en [Link]

3.1 alérgeno; sensibilizante:

Sustancia o material que es capaz de inducir una reacción de hipersensibilidad específica tras un
contacto repetido con tal sustancia o material.

3.2 dermatitis de contacto alérgica:

Diagnóstico clínico basado en la observación de una reacción cutánea inmunomediada a una sustancia.

3.3 blanco:
Vehículo (3.17) de extracción que no contiene el material de ensayo (3.15), retenido en un recipiente
idéntico al que contiene el material de ensayo y sometido a condiciones idénticas a las que se somete el
material de ensayo durante su extracción.

NOTA 1 El propósito del control blanco es evaluar los posibles efectos de confusión debidos al recipiente de extracción, al
vehículo y al proceso de extracción.

3.4 provocación:
Proceso que sigue a la fase de inducción (3.8), en el que se examinan los efectos inmunológicos de las
exposiciones subsiguientes en un individuo al material inductor.

3.5 elicitación:
Reacción inmunológica a la exposición a un sensibilizante en un individuo previamente sensibilizado.

3.6 eritema:
Enrojecimiento de la piel o membrana mucosa.

3.7 extracto:
Líquido que resulta de la extracción de la muestra de ensayo (3.16) o control.

[FUENTE: Definición 3.6 de la Norma ISO 10993-12:2021]

3.8 inducción:
Proceso que conduce a la generación de novo de un estado intensificado de actividad inmunológica en
un individuo, después de la exposición inicial a un material específico.

3.9 irritante:
Agente que produce irritación (3.10).

3.10 irritación:
Respuesta inflamatoria no específica localizada tras la aplicación única, repetida o continua de una
sustancia/material.

NOTA 1 La irritación cutánea es una reacción reversible y está caracterizada principalmente por síntomas tales como eritema
(3.6) (enrojecimiento), hinchazón, prurito, exfoliación, fisuración y descamación local de la piel.

3.11 control negativo:

Cualquier material o sustancia bien caracterizada que, cuando se evalúa por un método de ensayo
específico, demuestra la idoneidad del procedimiento para producir una respuesta reproducible,
apropiadamente negativa, no reactiva o mínima en el sistema de ensayo.

NOTA 1 En la práctica, los controles negativos incluyen blancos (3.3), vehículos (3.17) /disolventes y materiales de referencia.

[FUENTE: Modificación de la definición 3.10 de la norma ISO 10993-12:2021 – La nota original se ha

sustituido]

3.12 edema:
Hinchazón debida a la infiltración anormal de fluido en los tejidos.

3.13 control positivo:

Cualquier material o sustancia bien caracterizada que, cuando se evalúa por un método de ensayo
específico, demuestra la idoneidad del sistema de ensayo para producir una respuesta reproducible,
apropiadamente positiva o reactiva en el sistema de ensayo.

3.14 sensibilización cutánea:

Reacción de hipersensibilidad de tipo retardado mediada por células T inducida por productos químicos
(alérgenos) reactivos de peso molecular bajo que comprende dos fases, inducción y elicitación.

NOTA 1 En seres humanos, las respuestas se pueden caracterizar por prurito, eritema (3.6), edema (3.12), pápulas, vesículas,
ampollas o una combinación de éstas. En otras especies, las reacciones pueden diferir y pueden observarse solamente
eritema y edema.

3.15 material de ensayo:

Material, producto, porción de producto o componente de este que se muestrea para someterlo a un
ensayo biológico o químico.

3.16 muestra de ensayo:

Material, producto, porción de producto, componente, extracto (3.7) o porción de este que se somete a
ensayo o evaluación biológica o química.

3.17 vehículo:
Líquido utilizado para humedecer, diluir, suspender, extraer (3.7) o disolver la sustancia/material de
ensayo.

4 Principios generales. Enfoque por etapas

Los métodos disponibles para los ensayos de sensibilización se desarrollaron específicamente para
detectar el potencial de sensibilización cutánea. Otros tipos de efectos adversos no se predicen
generalmente mediante estos ensayos.

Este documento requiere un enfoque por etapas, considerando que cualquier etapa puede conducir a la
conclusión que ya no es necesario ningún ensayo adicional de sensibilización cutánea:

a) revisión de publicaciones e información de proveedores, incluyendo propiedades químicas y físicas,

e información del potencial de sensibilización cutánea de cualquier producto sanitario constitu-
yente, así como productos químicos y materiales estructuralmente relacionados; consúltese la
Norma ISO 10993-1 para recabar detalles; efectuar una determinación del riesgo basada en
información existente, para determinar si el riesgo de sensibilización cutánea es aceptable o si son
necesarios ensayos adicionales;

b) caracterización y determinación del riesgo adicional, si es necesaria, del material del producto, que
entraña caracterización y análisis químico de la muestra de ensayo de acuerdo con los principios
generales descritos en la Norma ISO 10993-18;

c) los ensayos in vitro se deben considerar preferentemente a ensayos in vivo, de acuerdo con la Norma
ISO 10993-2, y la sustitución de estos últimos conforme nuevos ensayos in vitro se validen
científicamente y estén disponibles de forma razonable y práctica;

NOTA Para detectar el potencial de sensibilización de productos químicos, existen actualmente un número de ensayos
in vitro validados y aceptados internacionalmente; sin embargo, estos ensayos in vitro no están todavía validados
para productos sanitarios. Existe trabajo en curso para algunos de estos ensayos para cualificarlos para su
utilización con productos sanitarios.

d) Los ensayos con animales in vivo son solamente apropiados cuando los materiales de ensayo no se
pueden caracterizar y no se pueden efectuar determinaciones del riesgo utilizando información
obtenida por los medios establecidos en a), b) y c).

5 Consideraciones sobre los ensayos previos

5.1 Generalidades
Es importante destacar que las consideraciones sobre los ensayos previos pueden llevar a la conclusión
de que los ensayos de sensibilización no son necesarios.

Son aplicables los requisitos dados en el capítulo 5 de la Norma ISO 10993-1:2018 y los siguientes.

Las muestras no estériles in vivo se deben investigar solamente por investigación tópica, dado que la
posibilidad de contaminación microbiana de la muestra de ensayo puede confundir la interpretación de
la determinación final. En los casos en que no se pueda garantizar la esterilidad de una muestra de
ensayo, pero la muestra se considera todavía exenta de contaminación microbiana, puede estar
justificada la administración intradérmica.

5.2 Tipos de material

5.2.1 Consideraciones iniciales

Se debe considerar que, durante la fabricación y el ensamblado de los productos sanitarios, se pueden
utilizar componentes químicos adicionales como facilitadores del proceso, por ejemplo, lubricantes o
agentes para liberar moldes. Además de los componentes químicos del material de partida y de los
facilitadores del proceso de fabricación, en un producto terminado pueden estar presentes residuos de
adhesivos/disolvente provenientes del ensamblado y también residuos del agente esterilizante o
productos de reacción resultantes del proceso de esterilización. Si estos compuestos presentan un
riesgo, depende de las características de lixiviación o degradación de los productos terminados. Se
deben identificar estos componentes químicos que tienen un potencial de sensibilización cutánea.

5.2.2 Cerámicas, metales y aleaciones

Estos materiales son normalmente menos complejos que los polímeros y materiales derivados
biológicamente en lo que respecta al número de constituyentes químicos.

5.2.3 Polímeros
La composición química de estos materiales es normalmente más compleja que la de los materiales en
el apartado 5.2.2. Puede estar presente un número de productos de reacción/impurezas/aditi-
vos/catalizadores residuales, y el grado o alcance de la polimerización puede variar.

5.2.4 Materiales de naturaleza biológica

La composición de estos materiales es inherentemente compleja. A menudo contienen también residuos
del proceso, por ejemplo, agentes reticulantes y agentes antimicrobianos. Las características de los
materiales biológicos pueden no ser constantes de una muestra a otra.

Los métodos en este documento no han sido diseñados para el ensayo de materiales de naturaleza
biológica y pueden por tanto resultar menos adecuados. Por ejemplo, los ensayos en este documento no
consideran la sensibilización entre especies diferentes.

5.3 Información sobre la composición química

5.3.1 Generalidades
Se deben establecer datos cualitativos completos sobre los constituyentes químicos del material. Se
deben obtener también los datos cuantitativos sobre la composición química. Si no se obtienen datos
cuantitativos, las razones se deben documentar y justificar.

5.3.2 Fuentes de datos existentes

La información cualitativa y cuantitativa sobre la composición se debe obtener siempre que sea posible
del proveedor del material de partida.

Para los polímeros, esto a menudo requiere el acceso a información patentada; se deberían tomar las
medidas pertinentes para la transferencia y utilización de tal información confidencial.

La información cualitativa sobre cualquier aditivo adicional del proceso (por ejemplo, agentes de
liberación de moldes) se debe obtener también a partir de los miembros apropiados de la cadena de
fabricación, incluyendo convertidores y fabricantes de componentes.

Si la información sobre la composición es incompleta, se recomienda un estudio de las publicaciones

para establecer la naturaleza probable del material de partida y de cualquier aditivo para facilitar la
selección de los métodos más apropiados de análisis del material a considerar.

La composición química de los productos terminados se debe determinar de acuerdo con la Norma
ISO 10993-18.

NOTA La composición de las cerámicas, metales y aleaciones se puede especificar de acuerdo con normas internacionales ISO
o ASTM y/o puede ser especificada por el usuario. Sin embargo, para obtener los detalles completos cualitativos y
cuantitativos sobre la composición, puede ser necesario solicitarlos del proveedor o fabricante del material de partida
y también de los fabricantes de componentes para garantizar que las ayudas de proceso están también identificadas.
Los archivos maestros de materiales que poseen las autoridades reglamentarias son otra fuente de datos, cuando estos
están accesibles.

6 Ensayos de sensibilización cutánea

6.1 Elección de los métodos de ensayo

Se han desarrollado enfoques alternativos in vitro e in chemico para productos químicos puros
utilizando una combinación de diferentes ensayos para identificar sensibilizantes cutáneos. Varios de
estos métodos se han incluido en las directrices de ensayo de la OCDE (TG 442C [75], TG 442D[79] y
TG 442E[104]) o en el programa[121] de directrices de ensayo de la OCDE (véase el anexo C).

Conjuntamente, los ensayos descritos en estas directrices de ensayo cubren tres eventos clave de los
mecanismos explicativos de resultados adversos (AOP, del inglés Adverse Outcome Pathway) ahora
identificados para la sensibilización cutánea, incluyendo el episodio molecular de iniciación (unión
covalente de proteínas), inducción de la inflamación, y activación de las células dendríticas. Estos
métodos de ensayo desarrollados para abordar un evento clave específico pueden posiblemente no ser
suficientes individualmente para decidir sobre la presencia o ausencia de potencial de sensibilización
cutánea de productos químicos y se deberían considerar en el contexto de enfoques integrados tales
como los enfoques integrados de ensayo y evaluación (IATA), combinándolos con otra información
complementaria.

De acuerdo con la Norma ISO 10993-2, tales enfoques integrados se deben tener en cuenta para evaluar
el potencial de sensibilización cutáneo de productos químicos puros. No se conoce todavía si estos
enfoques son también aplicables para productos sanitarios o extractos de productos sanitarios. En el
anexo C se presenta un resumen de los ensayos de sensibilización cutánea alternativos disponibles para
productos químicos puros.

Existen actualmente tres ensayos con animales disponibles para la determinación del potencial de
sensibilización cutánea de productos químicos. Éstos incluyen dos ensayos con cobayas y un ensayo en
ratones. Los dos ensayos con cobayas son el ensayo de maximización en cobayas (GPMT, del inglés
Guinea Pig Maximization Test) y el ensayo de parche ocluido (ensayo de Buehler). De estos dos ensayos,
el ensayo de maximización es el método más sensible. Véase la referencia [9]. El ensayo de parche
ocluido es adecuado para los productos tópicos.

El ensayo con ganglios linfáticos locales de múridos (LLNA, del inglés Local Lymph Node Assay) se aceptó
internacionalmente como una directriz de ensayo de la OCDE en el año 2010[33] para el ensayo de
productos químicos individuales como una alternativa independiente a los ensayos en cobayas, y es
ahora la determinación preferida in vivo para productos químicos. Véanse las referencias 19 y 32. En
algunos casos, los ensayos con cobayas pueden ser necesarios para la evaluación del potencial de
sensibilización de ciertas muestras de ensayo. Esto puede ser cierto para ciertos metales (véase la
referencia [44]) que pueden dar resultados de falsos negativos en el ensayo LLNA o para irritantes
cutáneos que pueden dar resultados de falsos positivos, así como sustancias de alto peso molecular, que
no penetran la piel o sustancias que no son solubles en los vehículos recomendados.

NOTA Los tres ensayos con animales se desarrollaron para la detección del potencial de sensibilización cutánea de productos
químicos, es decir, dermatitis de contacto, hipersensibilidad retardada (de tipo IV).

A tenor de las disposiciones especificadas en la Norma ISO 10993-2 sobre los requisitos del bienestar
animal, cuando se efectúa un ensayo in vitro, el LLNA se debe tener en cuenta. Además de las
consideraciones sobre el bienestar animal, el LLNA tiene la ventaja de proporcionar datos cuantitativos
objetivos.

6.2 Ensayo con ganglios linfáticos locales (LLNA) de múridos

6.2.1 Fundamento del método

Después de la aplicación tópica de una muestra de ensayo en el dorso de las orejas, el alcance de la
proliferación linfocítica se mide en los ganglios linfáticos que drenan los lugares de aplicación (orejas).
Se designa un material de ensayo como sensibilizante cuando induce una respuesta en proliferación
celular del triple o mayor comparada con la actividad de los controles.

El LLNA se debe efectuar utilizando un enfoque de relación dosis-respuesta cuando se utilizan

sustancias. Para productos/productos sanitarios finales puede ser suficiente ensayar solamente el
extracto sin diluir.

NOTA Las referencias [15] a [44] contienen publicaciones de ensayos LLNA representativos. Se exhorta a los laboratorios que
realizan este ensayo que revisen estas y otras publicaciones pertinentes disponibles.

6.2.2 Preparación de la muestra de ensayo

La muestra de ensayo debe ser un líquido, suspensión, gel o pasta tal que se pueda aplicar a las orejas
de los ratones. Cuando sea posible, se debe investigar una serie de dosificaciones (diluciones). De lo
contrario, se debería utilizar la concentración más alta preparada como una solución, suspensión
química o como un extracto. Cuando se detecta una respuesta intensa en el LLNA con un extracto, puede
ser necesario un estudio de seguimiento que evalúe múltiples dosificaciones para determinar la posible
potencia de sensibilización cutánea del extracto. Una toxicidad sistémica y una irritación cutánea local
excesiva pueden invalidar los resultados del ensayo; por tanto, se deberían evitar estas reacciones. En
ciertas circunstancias, pueden ser necesarios ensayos previos.

Un vehículo utilizado comúnmente para sustancias/productos químicos es una mezcla 4:1 de acetona y
aceite de oliva (AOO, del inglés Acetone Olive Oil). Las muestras líquidas que son hidrofílicas y/o que no
se adhieren adecuadamente a la piel de la oreja se deberían modificar para que se adhieran al lugar de
ensayo. Esto se puede lograr añadiendo un agente como la carboxymetilcelulosa o la hidroxietilcelulosa
(solución 0,5 % peso/volumen) o utilizando un tensioactivo tal como Pluronic® L921) con una fracción
en volumen de 1 %. Para los productos químicos solubles en agua, se prefieren el dimetilsulfóxido
(DMSO) o la dimetilformamida (DMF) mejor que el tensioactivo Pluronic® L92. Véase la referencia [34].
De forma alternativa, se pueden utilizar otros vehículos de extracción, como se han indicado. Véase la
referencia [33]. Se deben validar y documentar el efecto de las adiciones sobre los medios de extracción
y/o los cambios en la composición del vehículo. Esto se puede hacer efectuando experimentos que
utilicen sensibilizantes cutáneos de débiles a moderados tal como se usan comúnmente como control
positivo. Además, se podría practicar la adición a la muestra de ensayo de un control positivo para
demostrar que el LLNA es todavía capaz de detectar la presencia de sensibilizantes cutáneos potenciales
en el extracto preparado. Otros aspectos fundamentales de la extracción del artículo de ensayo se
especifican en la Norma ISO 10993-12.

Para cada aplicación diaria, se debe preparar un extracto diferente.

NOTA Para los materiales políméricos, un método de extracción opcional se da en el anexo B.

6.2.3 Animales y cuidado de los mismos

Se deben utilizar ratones hembra sanas no embarazadas de las cepas CBA/Ca, CBA/J o BALB/c, a menos
que se valide otra cepa. Véanse las referencias [33], [41] y [42]. Varias cepas de ratones se han notificado
como aceptables (DBA/2, B6C3F1). Véase la referencia [35]. La edad de los ratones debe estar
comprendida entre 7 semanas y 12 semanas; los ratones en cada estudio deben tener una edad
equiparable (dentro de un rango de edad de una semana).

El cuidado y la selección de los animales deben estar de acuerdo con la Norma ISO 10993-2. Los ratones,
aclimatados regularmente al laboratorio, deben estar identificados de forma individual. Para algunas
muestras de ensayo, puede ser necesario el alojamiento individual. Esto se debe justificar y documentar.

1) Pluronic® L92 es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información se da para comodidad
de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de la ISO para este producto.

Los animales deberían estar identificados utilizando métodos que no incluyan la perforación de sus
orejas ni etiquetas en las mismas.

Cuando se efectúa el alojamiento en grupo, se deberían tener en cuenta la contaminación cruzada y la

ingesta oral no deseada.

6.2.4 Procedimiento de ensayo

Para productos químicos, el LLNA se efectúa generalmente según un método que utilice la relación
dosis-respuesta. Para productos sanitarios sólidos, las muestras a ensayar deben ser extractos. En estos
casos, solamente una única dosis está disponible para el ensayo. En general, el extracto se puede
investigar sin diluir. Sin embargo, cuando el extracto contiene componentes altamente tóxicos, esto
puede dar lugar a una respuesta negativa en el LLNA debido a la toxicidad. Por tanto, cuando se
investigan extractos citotóxicos (véase la Norma ISO 10993-5), se recomienda efectuar el LLNA según
la relación dosis-respuesta y diluir el extracto. Además, cuando se detecta una respuesta intensa en el
LLNA, se puede efectuar un seguimiento estudiando la relación dosis-respuesta para evaluar la posible
potencia sensibilizante del extracto.

Para asegurar la reproducibilidad y la sensibilidad del procedimiento de ensayo, el laboratorio de

ensayo debe incluir un ensayo de una sustancia de control positivo para la sensibilización cutánea para
validar el sistema de ensayo y demostrar una respuesta positiva. Como control positivo se deben utilizar
alérgenos de contacto débiles a moderados bien conocidos (por ejemplo, mercaptobenzotiazol, aldehído
hexil cinámico o benzocaína). Los ejemplos mencionados podrían no ser adecuados para cada vehículo
utilizado para la preparación de la muestra (por ejemplo, vehículo acuoso); en tales casos, se puede
seleccionar otro control positivo. La Norma ASTM F2148 indica que en tales circunstancias se debería
utilizar formalina y 2,4 dinitroclorobenceno (DNCB) como controles positivos. Esto se debe justificar y
documentar.

Si bien se recomienda la inclusión de un grupo de control positivo concurrente, pueden existir

situaciones en las que puede ser adecuado utilizar solamente ensayos periódicos (es decir, a intervalos
 6 meses) de la sustancia de ensayo de control positivo. Este es el caso para laboratorios que efectúan
el LLNA regularmente (es decir, efectuando el LLNA con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y
que tienen una base de datos del control positivo histórico establecida que demuestra la competencia
del laboratorio para obtener resultados reproducibles y exactos con los controles positivos. La
competencia adecuada con el LLNA se puede demostrar con éxito generando resultados coherentes con
el control positivo en al menos 10 ensayos independientes efectuados durante un periodo de tiempo
razonable (es decir, menos de un año).

Los pesos corporales individuales se deben registrar al principio y al final del estudio. Para detectar la
toxicidad potencial de la muestra de ensayo, se debe efectuar una observación clínica y se debe registrar
durante el estudio.

La utilización de un control positivo una vez cada seis meses puede tener consecuencias para los
resultados obtenidos en el periodo de seis meses precedente cuando este control positivo muestra un
resultado negativo. La referencia [33] indica que los ensayos periódicos (es decir, a intervalos  6 meses)
de la sustancia de control positivo se pueden considerar en laboratorios que efectúan el LLNA
regularmente (es decir, con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y que tienen un historial y una
competencia documentada para obtener resultados coherentes con controles positivos. Es importante
reconocer que la decisión de incluir solamente un control positivo periódicamente en vez de forma
concurrente puede tener ramificaciones en la idoneidad y aceptabilidad de los resultados negativos del
estudio generados sin un control positivo concurrente durante el intervalo entre cada estudio del
control positivo periódico. Por ejemplo, si se obtiene un resultado falso negativo en el ensayo del control
positivo periódico, pueden ser cuestionables todos los resultados negativos de la sustancia de ensayo
obtenidos en el intervalo entre el último ensayo del control positivo periódico aceptable y el ensayo del
control positivo periódico no aceptable. Para demostrar que los resultados de la sustancia de ensayo
negativos anteriores son aceptables, un laboratorio puede tener que repetir todos los ensayos negativos,
lo que requeriría un gasto adicional y un aumento de la utilización de animales.

6.2.5 Grupos de tratamiento

Cuando se efectúa el LLNA, los datos de un mínimo de cinco ratones por grupo deben estar disponibles
para su evaluación. Las respuestas del ganglio linfático se pueden determinar ya sea por medición
individual o por medición de muestras agrupadas de ganglios linfáticos. Para el análisis estadístico, se
prefiere la medición individual.

Cuando solamente una única dosis está disponible para su evaluación, por ejemplo, un extracto, se debe
utilizar un mínimo de cinco ratones para cada grupo, cuando se miden las respuestas individuales.

Los grupos de tratamiento se deben asignar a:

– el blanco de cada tipo de vehículo empleado (véase el anexo A);

– cuando proceda, el control positivo para cada vehículo empleado;

– los grupos de ensayo para cada vehículo de extracto empleado.

Cuando se ensaya un único producto químico o sustancia, el LLNA se debe efectuar evaluando la relación
dosis-respuesta. Para otros tipos de ensayo y extractos similares a la muestra, una evaluación dosis-
respuesta podría no ser factible. Cuando se utiliza solamente un grupo de ensayo, esto se debe justificar
y documentar.

NOTA Cuando se han recogido datos suficientes para demostrar la coherencia de la relación dosis-respuesta del control
positivo, se podría incluir una única dosis para demostrar la sensibilidad de la determinación. Véase la referencia [32].

La muestra apropiada se debe aplicar al lado dorsal de ambas orejas de los ratones designados a una
dosis de 25 l/d durante tres días consecutivos. Cada día, se observan las orejas para detectar señales
de irritación que pueden interferir con la interpretación de los resultados. Véanse las referencias [23],
[27] y [29].

6.2.6 Determinación de la proliferación celular y preparación del tejido

Las células proliferantes en los ganglios linfáticos de drenaje se pueden marcar utilizando ya sea un
marcaje radioactivo o fluorescente. Los productos para el marcaje radioactivo comúnmente utilizados
son 3H-metil timidina y 125I-iododeoxiuridina, mientras que para la fluorescencia se puede utilizar
fluorodeoxiuridina.

A las (72 ± 2) h después del último tratamiento, se registran los pesos individuales de los ratones y se
administra intravenosamente el marcador para la proliferación celular. Se inyectan 0,25 ml de solución
tampón fosfato (PBS, del inglés Phosphate Buffered Saline) conteniendo 740 KBq (20 Ci) unidades de
radioactividad de 3H-metil timidina en todos los ratones de ensayo y de control a través de la vena de la
cola. Para la 125I-iododeoxiuridina, se inyectan 0,25 ml de PBS conteniendo 74 KBq (2 Ci), y para la
fluorodeoxiuridina, se inyectan 0,25 ml conteniendo 10-5 mol/l en la vena de la cola. Véase la referencia
[33].

Existen disponibles otros procedimientos alternativos que no requieren el marcaje radioactivo y se

deberían considerar [por ejemplo, determinación de adenosintrifosfato (ATP) (OCDE TG 442A)[122]
(método DA), determinación de bromodeoxiuridina BrdU (OCDE TG 442B)[123] (método ELISA o FCM).

NOTA 1 Para más información, véanse las referencias [33], [36], [42], [43] y [49].

Se sacrifican los ratones (5 ± 0,75) h después de la administración de la solución de marcaje de acuerdo

con la Norma ISO 10993-2. Se extirpa el ganglio linfático auricular de drenaje. Se debe proceder con
cuidado para evitar la contaminación cruzada de las muestras de tejido. Se pueden agrupar los ganglios
linfáticos de cada grupo, o pares de ganglios linfáticos de cada animal individual. Se prefieren los datos
de cada animal individual dado que proporcionan la variabilidad entre cada animal en un grupo. La
preparación de células individuales se hace presionando suavemente los ganglios linfáticos a través de
una malla metálica de acero inoxidable o malla de nylon de 200 m sobre un recipiente. La malla se
aclara con PBS enfriado recogiendo el líquido de aclarado en el recipiente para extraer las células del
filtro de malla. El recipiente contiene ahora la preparación celular. Las preparaciones celulares se lavan
dos veces por centrifugación y se vuelven a suspender en PBS. Las células se precipitan con ácido
tricloroacético 5 % (TCA) a (4  2) °C durante (18 ± 1) h. Después de una centrifugación final, el
sedimento de cada etapa se vuelve a suspender en 1 ml de TCA y se transfiere a viales de gammagrafía
conteniendo 10 ml de líquido de gammagrafía para el recuento de 3H, o se transfieren directamente a
tubos de recuento gamma para el recuento de 125I. Véanse las referencias [21], [35] y [36].

NOTA 2 De forma alternativa, el marcado y la determinación de la proliferación celular se pueden efectuar ex vivo. Véanse las
referencias [37] y [38].

6.2.7 Resultados e interpretación

Se mide el nivel de radioactividad en las células de ganglios linfáticos en recuentos por minuto por ratón
(cpm/ratón). Se convierten los recuentos por minuto (cpm, en ingles Counts Per Minute) en valores de
desintegraciones por minuto (dpm, en inglés Disintegration Per Minute). Se calcula la media y la
desviación estándar del dpm para al menos tres recuentos por cada animal o cada grupo de ratones. Se
resta el valor del fondo de cada resultado.

Cuando se utiliza el método de muestreo individual se continúa para calcular la media y la desviación
estándar del dpm para cada grupo de cinco ratones. Se determina el índice de estimulación (SI, del inglés
Stimulation Index) dividiendo el dpm de ensayo medio por el dpm del blanco. Un SI de tres o más ( 3,0)
se debe considerar positivo para designar una muestra de ensayo como un sensibilizante. Véase la
referencia [16].

Las muestras de control positivo deben producir un SI  3,0.

Para un estudio válido, el control positivo se debe efectuar ya sea de forma concurrente o dentro de los
seis meses anteriores. Véase la referencia [33].

6.2.8 Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir:

a) una descripción del (de los) material(es) o producto de ensayo;

b) la utilización/aplicación prevista de la muestra o material de ensayo;

c) la norma internacional utilizada (incluyendo el año de su publicación);

d) una descripción detallada del método empleado para preparar la muestra de ensayo o el material o
producto de ensayo;

e) una descripción de los animales de ensayo;

f) el método de aplicación a las orejas;

g) una descripción del método para determinar la proliferación celular;

h) cualquier desviación del procedimiento;

i) los registros de las observaciones, incluyendo las observaciones clínicas y el peso corporal;

j) una evaluación de los resultados, incluyendo el control positivo;

k) la fecha del ensayo.

6.3 Ensayos en cobayas para la detección de sensibilización cutánea

6.3.1 Fundamento del método

Los dos ensayos en cobayas utilizados actualmente para la detección de la actividad de productos
químicos y productos sanitarios son el ensayo de Buehler y el GPMT. Ambos ensayos consisten en una
fase de inducción y provocación, cubriendo así todas las etapas de hipersensibilidad.

6.3.2 Elección de las concentraciones de la muestra de ensayo

Las directrices actuales para los ensayos del potencial de sensibilización de productos químicos
individuales recomiendan utilizar solamente una concentración para el ensayo.

NOTA En el anexo B se da un método de extracción óptimo para materiales poliméricos.

6.3.3 Inducción
La tasa de sensibilización depende fuertemente de la dosis de inducción, que para los ensayos en
cobayas debe ser de leve a moderadamente irritante, cuando sea posible. Si no se alcanza el umbral de
irritación, se debe utilizar entonces la concentración más alta posible. Sin embargo, no debe interferir
con la salud de los animales. La dosis de inducción para los ensayos en cobayas se selecciona
normalmente basándose en experimentos preliminares según se describen para los ensayos en cobayas
individuales (véase [Link]). Los extractos sin diluir con los disolventes usuales no necesitan ser
sometidos a un ensayo preliminar.

6.3.4 Provocación
La concentración de provocación en los ensayos con cobayas está basada también en ensayos
preliminares en animales no previamente expuestos al material de ensayo. Se debe utilizar la dosis no
irritante más alta, determinada en las evaluaciones preliminares. Se aconseja la utilización de más de
una concentración para el procedimiento de provocación, para facilitar la evaluación de los resultados.

6.4 Factores importantes que afectan el resultado del ensayo

Las características bioquímicas y físicas de la muestra de ensayo pueden influir sobre la elección de éste,
dado que el ensayo de maximización requiere inyecciones intradérmicas. Si la muestra de ensayo no se
puede inyectar intradérmicamente, se debe utilizar un método alternativo (es decir, aplicación tópica).
Las soluciones del extracto se deben preparar en condiciones asépticas. Las muestras no estériles se
deben investigar solamente de forma tópica, debido a la posibilidad de que la contaminación microbiana
de la muestra de ensayo pueda confundir la interpretación final del ensayo. En los casos en que no se
puede garantizar la esterilidad de una muestra de ensayo, pero la muestra se considera todavía que no
está contaminada, puede estar justificada la administración intradérmica.

La biodisponibilidad del material de ensayo está influenciada por la elección del vehículo. Aunque no
existe ningún vehículo que sea óptimo para todos los materiales, se debería seleccionar un vehículo que
optimice la exposición por solubilización y penetración. La concentración del material de ensayo debería
ser la más alta posible sin que afecte la interpretación de los resultados. La mayoría de los investigadores
prefieren que la muestra de ensayo sea una solución porque las dispersiones son propensas a formar
un sedimento, haciendo difícil la dosificación exacta. Ejemplos de vehículos para la inyección
intradérmica incluyen solución salina, propilenglicol y aceites vegetales.

La variación entre los resultados obtenidos en laboratorios diferentes puede tener varios orígenes. Los
factores siguientes en el procedimiento de ensayo son importantes:

– las condiciones ambientales del ensayo;

– el lugar anatómico de ensayo en el animal;

– el método de eliminación del pelo (esquilado/rasurado o depilación química);

– el tipo de diseño del parche;

– la cantidad de material de ensayo;

– la calidad de la oclusión;

– el tiempo de exposición y la lectura de los animales.

El alcance de la respuesta del animal varía también de acuerdo con los factores genéticos y a la forma de
tratar a los animales.

La comparación del número de animales de ensayo con una respuesta positiva a la provocación con los
controles apropiados es esencial para la indicación de un resultado de ensayo positivo, aunque la
gravedad de la reacción facilitará la interpretación. Las reacciones marginales a la provocación resultan
mejor clarificadas mediante la reprovocación. La histopatología no ha demostrado ser de ayuda en la
evaluación de los resultados de ensayo.

Para asegurar la reproducibilidad y sensibilidad del procedimiento de ensayo, el laboratorio de ensayo

debe incluir un ensayo de una sustancia de control positivo para sensibilización cutánea para validar el
sistema de ensayo y demostrar una respuesta positiva. Los controles positivos deberían
preferentemente ser alérgenos de contacto de débiles a moderados (por ejemplo, mercaptobenzotiazol,
aldehído hexil cinámico y benzocaína). Sin embargo, cuando se ha demostrado consistencia durante un
periodo igual o superior a seis meses, no es necesario incluir un control positivo en cada ensayo, pero
se puede efectuar a intervalos regulares que no deben ser superiores a seis meses. En los ensayos con
cobaya se utilizan normalmente diez animales como controles positivos. Se puede utilizar un número
menor de cobayas cuando un ensayo con una sustancia de control positivo se efectúa con mayor
frecuencia que una vez cada seis meses. Se deberían utilizar al menos cinco animales de ensayo con una
sustancia positiva y cinco animales de control. Véase la referencia [1].

NOTA Para obtener una respuesta positiva, se pueden utilizar diluciones de sensibilizantes de fuertes a moderados [por
ejemplo, formaldehído y DNCB]. Sin embargo, esto no garantiza que el ensayo pueda identificar también respuestas de
sensibilizantes débiles en extractos de productos sanitarios.

6.5 Ensayo de maximización en cobayas (GPMT, en inglés Guinea Pig Maximization

Test)

6.5.1 Fundamento del método

Se hace una evaluación del potencial del material objeto del ensayo para producir sensibilización
cutánea en cobayas utilizando la técnica aplicada para productos químicos individuales en el ensayo de
maximización en cobayas.

6.5.2 Preparación de la muestra de ensayo

La muestra de ensayo se debe preparar según se especifica en el anexo A. La concentración de la muestra
de ensayo debe ser lo más alta posible sin afectar la interpretación de los resultados (véase [Link]).

NOTA En el anexo B se da un método de extracción óptimo para materiales poliméricos.

6.5.3 Animales y cuidado de estos

Se deben utilizar cobayas albinos, adultos, sanos y jóvenes, de uno u otro sexo y pertenecientes a una
misma cepa no consanguínea, que pesen de 300 g a 500 g al comienzo del ensayo. Si se utilizan animales
hembra, deben ser nulíparas y no embarazadas.

Los animales se deben aclimatar y cuidar como se especifica en la Norma ISO 10993-2. Los ensayos
preliminares, cuando sean necesarios, se deberían efectuar en un conjunto de animales para determinar
las concentraciones óptimas de ensayo (véase [Link]).

Si el material de ensayo es un polvo o está en estado líquido, se deben tratar un mínimo de 10 animales
con la muestra de ensayo, y un mínimo de cinco animales deben constituir el grupo de control. Si se
requiere un ensayo preliminar, se debe utilizar un número adicional de animales.

Para el ensayo de extractos, se deben tratar un mínimo de 10 animales con cada extracto, y un mínimo
de cinco animales deben actuar como un grupo de control del disolvente. Si se requiere un ensayo
preliminar, se debe utilizar un número adicional de animales.

Si el ensayo utilizando 10 animales de ensayo y cinco animales de control produce resultados

completamente negativos, es poco probable que el ensayo utilizando otros 10 animales más de ensayo
y otros cinco animales más de control produzca resultados positivos. Sin embargo, si se exhibe cualquier
respuesta equívoca, se debe efectuar reprovocación (véase 6.5.6). Si persisten las respuestas equívocas,
se realiza un estudio nuevo utilizando un mínimo de 20 animales de ensayo y 10 animales de control.

6.5.4 Procedimiento de ensayo

[Link] Preparación
Se esquila y rasura el pelo en todas las zonas de tratamiento antes de ninguna otra etapa del
procedimiento de ensayo.

[Link] Ensayos preliminares

Los ensayos preliminares tienen por objeto determinar la concentración de la muestra de ensayo a
utilizar en el ensayo principal descrito en el apartado [Link].

Los extractos sin diluir utilizando los disolventes usuales (por ejemplo, solución salina o aceite vegetal)
no precisan ser sometidos al ensayo preliminar.

Para la aplicación tópica, se satura un papel de filtro o apósito de gasa absorbente (4 cm 2 a 8 cm2) o
cámara con la muestra de ensayo que sean apropiados, y se aplica el parche a la piel rasurada bajo un
apósito oclusivo asegurado mediante una envoltura y/o una faja alrededor del torso del animal.

Cuando se envuelva al animal para asegurar un apósito oclusivo, se debería proceder con cuidado para
permitir que el animal pueda respirar de forma normal. Se prefiere un envoltorio flexible, que debería
ser aplicado por personal bien entrenado.

Se aplican tópicamente una gama de diluciones de la muestra de ensayo a cada costado de al menos dos
animales. Se retiran los apósitos oclusivos y los parches después de 24 h, y se evalúan los lugares de
aplicación por observación de las reacciones de eritema y de edema, utilizando la graduación de
Magnusson y Kligman indicada en la tabla 1. Puede ser apropiado también explorar la dilución del
artículo por inyección intradérmica cuando se utilicen disolventes no usuales.

Para la fase de inducción tópica en el ensayo principal, se selecciona la concentración más alta que cause
un eritema de leve a moderado pero que no afecte adversamente al animal, de acuerdo con la Norma
ISO 10993-2. Se debería reconocer que, para los extractos de productos sanitarios, puede que no se
obtenga el umbral de irritación. En tales casos, se debe utilizar la concentración más alta posible (por
ejemplo, el extracto sin diluir). Para productos/ productos sanitarios terminados, puede ser suficiente
ensayar solamente el extracto sin diluir.

Para la fase de provocación en el ensayo principal, se selecciona la concentración más alta que no
produzca eritema (véase la tabla 1).

Tabla 1 – Escala de Magnusson y Kligman

Reacción al ensayo de parche Escala de graduación

Sin cambios visibles 0
Eritema ligero o en manchas localizadas 1
Eritema moderado y confluente 2
Eritema intenso y/o tumefacción 3

Se debe considerar el tratamiento previo de todos los animales por inyección con el coadyuvante
completo de Freund (FCA, en inglés Freud´s Complete Adjuvant).

[Link] Ensayo principal

[Link].1 Fase de inducción intradérmica

En cada animal, se efectúan dos inyecciones intradérmicas de 0,1 ml sobre los puntos de inyección (por
ejemplo, puntos A, B y C) en la región interescapular esquilada, según se indica en la figura 1, con cada
una de las preparaciones siguientes.

– Lugar A: Una emulsión estable al 50:50 en volumen de coadyuvante completo de Freund mezclado
con el disolvente seleccionado. Se utiliza solución salina fisiológica (BP, USP o equivalente) o
vehículo/disolvente de extracción.

– Lugar B: La muestra de ensayo (extracto sin diluir); los animales de control se inyectan solamente
con el vehículo/disolvente de extracción.

– Lugar C: La muestra de ensayo a la concentración utilizada en el lugar B, emulsificada en una

emulsión estable al 50:50 en volumen de adyuvante completo de Freund y el disolvente/vehículo de
extracción (la solución utilizada en el lugar A); los animales de control se inyectan con una emulsión
del líquido blanco con adyuvante.

[Link].2 Fase de inducción tópica

A los (7 ± 1) d después de completar la fase de inducción intradérmica, se administra la muestra de
ensayo por aplicación tópica sobre la región interescapular de cada animal, utilizando un parche de un
área aproximada de 8 cm2 (papel de filtro o gasa absorbente), a fin de cubrir los puntos de inyección
intradérmica (véase figura 1). Se utiliza la concentración seleccionada en el ensayo preliminar por
aplicación tópica (si se hizo, véase [Link]). Si la concentración máxima que se puede alcanzar en el
apartado [Link].1 no produce irritación, se trata previamente el lugar con dodecil sulfato sódico (SDS)
al 10 % aplicado con masaje a la piel (24 ± 2) h antes de aplicar el parche. Cualquier SDS residual se
debería eliminar antes de la aplicación de los parches para la fase de inducción tópica, dado que
cualquier residuo de SDS puede afectar la absorción del extracto. Se aseguran los parches con un apósito
oclusivo. Se levantan los apósitos y los parches después de transcurridas (48 ± 2) h.

Se prefieren extractos recientemente preparados. Si un extracto se almacena durante más de (24 ± 2) h,

se debería verificar la estabilidad del mismo en las condiciones de almacenamiento.

Los animales del grupo de control se tratan de forma similar, utilizando solamente la solución blanco.

Leyenda
1 Extremo craneal
2 Inyecciones intradérmicas de 0,1 ml (véase [Link].1)
3 Región interescapular esquilada
4 Extremo caudal
A, B, C Lugares de inyección

Figura 1 – Localización de los lugares de inyección intradérmica

[Link].3 Fase de provocación

Para el ensayo de la fase de provocación se debe seguir el procedimiento descrito a continuación:

a) Todos los animales de ensayo y de control se deben someter a esta fase (14 ± 1) d después de haber
completado la fase de inducción tópica.

b) Para extractos de ensayo sin diluir utilizando disolvente estándar (por ejemplo, solución salina o
aceite vegetal):

1) tanto a los animales de ensayo como a los de control se les debe aplicar la dosis respectiva de
los extractos de ensayo y de control; o

2) a los animales de control se les debe aplicar la dosis del vehículo sin diluir y a los animales de
ensayo, el extracto de ensayo sin diluir.

Para la fase de provocación, se recomienda la utilización de la concentración no irritante más

alta de la muestra de ensayo. Para el ensayo con extractos de productos sanitarios, no se
efectúan generalmente ensayos preliminares para determinar la concentración no irritante
más alta de los extractos. En el apartado [Link] se indica que los extractos sin diluir utilizando
los disolventes usuales no necesitan someterse a ensayos preliminares.

La utilización de la opción b), 1) permite determinar si cualquier reacción cutánea observada en los
animales de ensayo es debida a irritación en vez de sensibilización. Para la opción b), 1), a ambos
animales de ensayo y control se les dosifican ambos extractos de ensayo y control. Si se observa
cualquier reacción cutánea a los extractos de ensayo en los animales de control, la(s) reacción(es)
puede(n) ser debida(s) a irritación y no a sensibilización, dado que los animales de control no han sido
previamente expuestos a los extractos de ensayo.

Para la opción b), 2), a los animales de control no se les dosifica el extracto de ensayo y a los animales
de ensayo no se les dosifica el extracto de control. En el caso de observarse reacciones cutáneas en los
animales de ensayo cuando no se ha efectuado ningún ensayo preliminar para determinar la
concentración no irritante más alta de los extractos, pueden ser necesarios ensayos adicionales para
descartar un falso positivo.

c) Cuando se utilizan disolventes no estándar, a todos los animales de ensayo y de control se les deben
dosificar tanto los extractos de ensayo como los de control.

d) Los extractos se deben administrar por aplicación tópica en lugares rasurados que no fueron
tratados durante la fase de inducción, tales como el costado superior de cada animal, utilizando
parches o cámaras apropiadas saturadas en la muestra de ensayo a la concentración seleccionada
en el apartado [Link].1 para el lugar B. En el caso que la concentración seleccionada en el apartado
[Link].1 para el lugar B no sea la concentración no irritante más alta, se debe utilizar la
concentración no irritante más alta determinada en el ensayo preliminar (véase [Link]). Se debe
especificar y justificar el volumen de extracción utilizado para la saturación de parches/cámaras.

e) Los parches/cámaras se deben asegurar utilizando apósitos oclusivos.

f) Los apósitos y los parches se deben retirar después de haber transcurrido (24 ± 2) h.

6.5.5 Observación de los animales

Se observa el aspecto de los lugares de la piel provocados de los animales de ensayo y de los animales
de control al cabo de (24 ± 2) h y (48 ± 2) h después de levantar los apósitos. Se recomienda
encarecidamente la utilización de iluminación natural o de espectro completo para visualizar las
reacciones cutáneas. Se describen y gradúan las reacciones cutáneas para eritema y edema, de acuerdo
con la escala de Magnusson y Kligman dada en la tabla 1 para cada lugar de provocación y para cada
intervalo de tiempo. Se recomienda encarecidamente efectuar la lectura sin conocer el tratamiento, para
reducir al mínimo el sesgo en la evaluación de los resultados.

El esquilado y la rasurado se deberían efectuar antes de cada etapa en el procedimiento de ensayo (véase
[Link]). Sin embargo, el rerasurado puede no ser necesario después de la provocación o reprovocación
si un animal se rasura el día anterior.

6.5.6 Evaluación de los resultados

Las graduaciones Magnusson y Kligman de 1 o mayores en el grupo de ensayo indican generalmente
una sensibilización, siempre que se encuentren valores menores de 1 en los animales del grupo de
control. Si se observan graduaciones de 1 o mayores en los animales del grupo de control, las reacciones
de los animales del grupo de ensayo que excedan las reacciones más fuertes de las del grupo de control
se supone que son debidas a sensibilización. Si la respuesta es equívoca, se recomienda la reprovocación
para confirmar los resultados de la primera provocación. El resultado del ensayo se presenta como la
frecuencia de resultados positivos a la provocación en los animales de ensayo y de control.

De vez en cuando, el grupo de ensayo contiene un número mayor de animales que exhiben reacciones
que el grupo de control, aunque la intensidad de la reacción no es mayor de la exhibida por el grupo de
control. En estos casos, puede ser necesaria una reprovocación para definir claramente la reacción. Una
reprovocación se debe efectuar de 1 a 2 semanas después de la primera provocación. El método utilizado
debe ser como el que se ha descrito para la primera provocación, utilizando el otro costado no tratado
del animal.

6.5.7 Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir:

a) una descripción del (de los) material(es) o producto de ensayo;

b) la utilización/aplicación prevista de la muestra o material de ensayo;

c) la norma internacional utilizada (incluyendo el año de su publicación);

d) una descripción detallada del método utilizado para preparar la muestra o el material o el producto
de ensayo;

e) una descripción de los animales de ensayo;

f) el método de aplicación sobre los lugares de ensayo;

g) cualquier desviación del procedimiento;

h) la forma en que se marcaron los lugares de ensayo, y las lecturas realizadas;

i) los registros de las observaciones;

j) la evaluación de los resultados;

k) la fecha del ensayo.

6.6 Ensayo con parche ocluido (Ensayo de Buehler)

6.6.1 Fundamento del método

Se efectúa una evaluación del potencial del material objeto del ensayo para producir sensibilización
cutánea en cobayas.

6.6.2 Preparación de la muestra de ensayo

La muestra de ensayo se debe preparar como se especifica en el anexo A. La concentración de la muestra
de ensayo debe ser la más alta posible sin que afecte a la interpretación de los resultados (véase [Link]).
Cuando la forma y el tamaño así lo permitan, los productos tópicos (por ejemplo, electrodos) se pueden
utilizar directamente como están.

6.6.3 Animales y cuidado de estos

Se deben utilizar cobayas albinas, adultas, sanas y jóvenes, de uno u otro sexo, y pertenecientes a una
misma cepa no consanguínea, que pesen de 300 g a 500 g al comienzo del ensayo. Si se utilizan animales
hembra, deben ser nulíparas y no embarazadas.

Los animales se deben aclimatar y cuidar como se especifica en la Norma ISO 10993-2. Los ensayos
preliminares se deberían efectuar en un conjunto de animales para determinar las concentraciones de
la muestra de ensayo (véase [Link]).

Para el ensayo de materiales en polvo o en estado líquido, se deben tratar un mínimo de 10 animales
con el material de ensayo, y un mínimo de cinco animales deben constituir el grupo de control. Si se
requiere un ensayo preliminar, se debe utilizar un número adicional de animales.

Para el ensayo de extractos, se deben tratar un mínimo de 10 animales con cada extracto, y un mínimo
de cinco animales debe constituir el grupo de control para cada disolvente. Si se requiere un ensayo
preliminar, se debe utilizar un número adicional de animales.

Si el ensayo utilizando 10 animales de ensayo y cinco animales de control produce resultados

6.6.4 Procedimiento de ensayo

[Link] Preparación
Se esquila o rasura el pelo en todas las zonas de tratamiento antes de ninguna otra etapa del
procedimiento de ensayo.

[Link] Ensayos preliminares

Los ensayos preliminares tienen por objeto determinar las concentraciones de la muestra de ensayo a
utilizar en el ensayo principal descrito en el apartado [Link].

Los productos sanitarios previstos para uso tópico y los extractos sin diluir en los que se han utilizado
disolventes usuales, no precisan ser sometidos a ensayos preliminares.

Para todas las aplicaciones tópicas, se satura un parche (papel de filtro o gasa absorbente) de las
dimensiones apropiadas con el material de ensayo o el extracto y el parche se aplica a la zona esquilada
bajo un apósito oclusivo durante (6 ± 0,5) h. Se puede utilizar sujeción de cada animal para asegurar la
oclusión de los lugares de ensayo. si se utiliza una envoltura, su idoneidad se debería evaluar en cada
experimento. Se evalúan los lugares de aplicación para asignar las graduaciones para eritema y edema
utilizando la escala de Magnusson y Kligman dada en la tabla 1 a las (24 ± 2) h y (48 ± 2) h después del
levantamiento de los parches.

Se aplican tópicamente cuatro concentraciones de la muestra de ensayo a cada costado de al menos dos
animales utilizando parches apropiados. Se levantan los apósitos y los parches oclusivos después de
(6 ± 0,5) h. Se evalúan los lugares de aplicación por observación de las reacciones de eritema y de edema
utilizando la graduación de Magnusson y Kligman dada en la tabla 1, al cabo de (24 ± 2) h y (48 ± 2) h
después de levantar los parches.

Se selecciona:

a) para la fase de inducción en el ensayo principal, la concentración más alta que causa no más que un
eritema leve pero que no afecte adversamente a los animales de otra forma;

b) para la fase de provocación en el ensayo principal, la concentración más alta que no produzca
eritema.

[Link] Ensayo principal

[Link].1 Fase de inducción

Se administra la muestra de ensayo por aplicación tópica en la región esquilada del dorso superior
izquierdo de cada animal utilizando parches apropiados empapados en la muestra de ensayo a la
concentración seleccionada en el apartado [Link] a). Se retira el sistema de restricción de cualquier
apósito y parche oclusivo después de (6 ± 0,5) h. Se efectúa este procedimiento durante tres días a la
semana durante tres semanas. El grupo de animales de control se trata de forma similar, utilizando
solamente la solución blanco.

[Link].2 Fase de provocación

A los (14 ± 1) d después de la última aplicación de inducción, se somete a todos los animales del grupo
de ensayo y a los del grupo de control a una provocación con la muestra de ensayo. Se administra la
muestra de ensayo en una sola aplicación tópica sobre una zona esquilada no ensayada de cada animal,
utilizando parches apropiados empapados en la muestra de ensayo con la concentración seleccionada
en el apartado [Link] b). Se retira el sistema de restricción y se levantan los apósitos y los parches
oclusivos después de (6 ± 0,5) h.

6.6.5 Observación de los animales

Si es necesario, tras un período de (24 ± 2) h después del comienzo la provocación primaria o de la
exposición de reprovocación, se opta por

a) se depilan todos los animales con un producto depilatorio comercial colocando el material sobre el
lugar de ensayo y las zonas adyacentes según las instrucciones del fabricante; o

b) se rasura a todos los animales sobre los lugares de la provocación y las áreas adyacentes.

Se lava totalmente la zona depilada con agua caliente y se secan los animales con una toalla antes de
devolverlos a sus jaulas. Tras (24 ± 2) h después del levantamiento de los parches de provocación y un
mínimo de 2 h después de la eliminación del pelo, se gradúan las reacciones observadas en los lugares
de ensayo utilizando la escala dada en la tabla 1. Se repite la graduación al cabo de (48 ± 2) h después
de haber levantado el parche de provocación. Se recomienda encarecidamente la utilización de
iluminación natural o de espectro completo para visualizar las reacciones cutáneas. Se recomienda
encarecidamente efectuar la lectura sin conocer el tratamiento, para reducir al mínimo el sesgo en la
evaluación de los resultados.

6.6.6 Evaluación de los resultados

Se debe aplicar la escala de graduación de Magnusson y Kligman dada en la tabla 1.

Las graduaciones de Magnusson y Kligman de 1 o mayores en los animales del grupo de ensayo indican
generalmente una sensibilización, siempre que se encuentren valores menores de 1 en los animales del
grupo de control. Si se observan graduaciones de 1 o mayores en los animales del grupo de control, las
reacciones de los animales del grupo de ensayo que excedan las reacciones más fuertes de las del grupo
de control se supone que son debidas a una sensibilización. Se recomienda la reprovocación para
confirmar los resultados de la primera provocación. El resultado del ensayo se presenta como la
frecuencia de resultados positivos a la provocación en los animales de ensayo y de control.

Ocasionalmente, el grupo de ensayo contiene un número mayor de animales que muestran una
respuesta que el grupo de control, aunque la intensidad de la reacción no es mayor de la exhibida por el
grupo de control. En estos casos, puede ser necesaria una reprovocación para definir claramente la
respuesta. Se debe efectuar una reprovocación transcurrido un período entre 1 semana y 2 semanas
después de la provocación inicial. El método utilizado debe ser el que se ha descrito para la primera
provocación, utilizando un área no ensayada en el costado del animal.

En estas situaciones, se recomienda utilizar un nuevo grupo de control negativo.

6.6.7 Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir:

a) una descripción del (de los) material(es) o producto de ensayo;

b) la norma internacional utilizada (incluyendo el año de su publicación);

c) la utilización/aplicación prevista del (de los) material(es) o producto de ensayo;

d) una descripción detallada del método utilizado para preparar las muestras y materiales de ensayo;

e) una descripción de los animales de ensayo;

f) el método de aplicación sobre los lugares de ensayo;

g) cualquier desviación del procedimiento;

h) una descripción de cómo se marcaron los lugares de ensayo, y las lecturas realizadas;

i) los registros de las observaciones;

j) la evaluación de los resultados, incluyendo los métodos estadísticos;

k) la fecha del ensayo.

7 Factores clave para la interpretación de los resultados de ensayo

Los ensayos incluidos en este documento son herramientas importantes para el desarrollo de productos
seguros, y se deben efectuar de acuerdo con medidas de aseguramiento de la calidad apropiadas (por
ejemplo, la Norma ISO/IEC 17025 o las buenas prácticas de laboratorio, GLP) y los resultados de los
ensayos se deben interpretar por personal entrenado. Se debe proporcionar evidencia de que quienes
planifican, efectúan e interpretan los resultados de los ensayos poseen la experiencia y entrenamiento
apropiados que les capacita para emprender las tareas a realizar.

La evidencia de sensibilización cutánea por cualquier método no excluye necesariamente al material de

ensayo o al producto de ser utilizado porque la cantidad de material de ensayo en el procedimiento de
ensayo puede ser exagerada comparada con las condiciones de uso reales. Un hallazgo adverso
utilizando cualquiera de los procedimientos descritos indica la necesidad de efectuar análisis
adicionales que permitan la determinación del riesgo de la exposición prevista para los seres humanos.

Los resultados de los ensayos predictivos generados por los procedimientos descritos en este
documento no se pueden considerar de forma individual y necesitan ser interpretados junto con otra
información para determinar el riesgo de una reacción de hipersensibilidad u otras formas de
inmunotoxicidad. Un resultado de ensayo negativo no excluye la posibilidad de que un producto pueda
causar reacciones alérgicas cutáneas. Los resultados se deberían validar por comparación con otras
fuentes de información, tales como:

– los datos de reclamaciones de la industria y de los consumidores;

– la experiencia con productos que contienen componentes similares;

– los resultados de ensayos diagnósticos en las clínicas dermatológicas;

– los datos epidemiológicos retrospectivos.

Anexo A (Normativo)

Preparación de los materiales para los ensayos de sensibilización

A.1 Generalidades
La realización de los ensayos y la interpretación de los datos de los ensayos de sensibilización deben
tener en cuenta la naturaleza, el grado, la frecuencia, la duración y las condiciones de la exposición del
ser humano al producto sanitario. Uno de los parámetros críticos para estos ensayos es la preparación
del material de ensayo.

A.2 Materiales para la exposición por contacto directo

A.2.1 Materiales de ensayo sólidos

Los materiales sólidos que poseen estados físicos apropiados (por ejemplo, láminas, películas) se deben
ensayar sin modificación. Se preparan muestras de 2,5 cm  2,5 cm y de un espesor aproximadamente
igual al de utilización normal aunque no superior a 0,5 cm. Se preparan muestras adecuadas de control
negativo de la misma manera. El control negativo se debe parecer mucho físicamente al material de
ensayo y debería ser no irritante. Se puede utilizar gasa absorbente como un sustituto si no se puede
identificar un control más adecuado.

El sólido se puede pulverizar, procediendo con cuidado para tener la certeza de que no se produce
contaminación alguna durante el proceso, o humedeciendo con agua o con un disolvente no irritante
apropiado a fin de tener la certeza que se produce un buen contacto con los tejidos. En el caso de
materiales cerámicos que precisen pulverización, se debe tener en cuenta que las propiedades
fisicoquímicas del material cerámico se pueden ver alteradas por el proceso de pulverización, con
efectos potencialmente marcados sobre la actividad biológica.

Los materiales en polvo (por ejemplo, los superabsorbentes) se deben ensayar por deposición directa o
mediante la formación de una pasta en un disolvente apropiado. En paralelo con el material de ensayo
humedecido, diluido o suspendido, se debe evaluar un control utilizando el mismo disolvente.

NOTA El área superficial y/o el tamaño de partícula son factores importantes que influyen sobre las respuestas biológicas
tales como la fagocitosis, que juega un papel importante en las respuestas inflamatorias e inmunes.

A.2.2 Materiales de ensayo líquidos

Los materiales líquidos se deben ensayar sin diluir por deposición directa, o si ello no resulta práctico,
en solución diluida preparada en un disolvente apropiado. En paralelo con el líquido de ensayo diluido,
se debe evaluar un control utilizando el mismo disolvente.

A.3 Extractos de los materiales de ensayo

Un sólido se puede ensayar preparando extractos a partir del mismo. Si los extractos se someten a
ensayo, se deben preparar como se describe en la Norma ISO 10993-12, utilizando disolventes polares,
apolares y/u otros adicionales según sea apropiado. Se debe justificar la idoneidad de un método de
extracción utilizado.

Una muestra blanco, utilizando el disolvente utilizado para la extracción, se debe evaluar en paralelo
con el extracto del material de ensayo.

NOTA En el anexo B se describe un método de extracción opcional para materiales poliméricos.

A.4 Disolventes
Si el material de ensayo precisa ser extraído, diluido, suspendido o humedecido, se debe utilizar un
disolvente apropiado no irritante. La Norma ISO 10993-12 proporciona una lista de disolventes
apropiados.

A.5 Materiales de ensayo estériles

Si el producto final se suministra en condición estéril, el material de ensayo se debe esterilizar utilizando
el mismo proceso antes de ser ensayado. Los productos esterilizados con óxido de etileno presentan una
dificultad técnica por cuanto el óxido de etileno y sus productos de reacción pueden producir una
respuesta biológica en los ensayos descritos en este documento.

Para permitir hacer la distinción entre los efectos producidos por el material de ensayo y aquéllos
producidos por los residuos de esterilización del óxido de etileno cuando se observa una reacción
irritante adversa, se debe considerar debidamente la evaluación de esta reacción al producto antes y
después de la esterilización con óxido de etileno.

Anexo B (Informativo)

Método para la preparación de los extractos de materiales

de ensayo poliméricos

B.1 Generalidades
Este anexo proporciona recomendaciones sobre la preparación de extractos de un material de ensayo
polimérico a utilizar en el ensayo de maximización en cobaya (GPMT). La preparación del extracto se
describe originalmente en la referencia [3] y se da información adicional en el capítulo D.2 de la Norma
ISO 10993-12:2021 para los “Puntos a considerar para la extracción exhaustiva de productos sanitarios
poliméricos para ensayos biológicos”.

B.2 Método de preparación

B.2.1 Extracción preliminar

Se efectúa un procedimiento de extracción preliminar en la muestra de ensayo para determinar el
proceso de extracción más idóneo para utilización en el GPMT.

Metanol y acetona son los disolventes recomendados para la extracción. La muestra de ensayo se corta
en trozos pequeños (si es posible) y se coloca en dos matraces diferentes. Se añade un volumen de 10 a
20 veces mayor (es decir, 10 ml a 20 ml de disolvente por cada gramo de muestra de ensayo) de cada
disolvente a cada matraz y los matraces se agitan a temperatura ambiente para la extracción. La
extracción por agitación se efectúa tres veces [por ejemplo, durante (4 ± 1) h, (8 ± 1) h, o (24 ± 2) h]
dentro de un periodo comprendido entre 24 h y 72 h utilizando el mismo volumen de disolvente fresco
cada vez. Se recoge el extracto proveniente de cada periodo de extracción y se agrupa. El disolvente se
elimina por evaporación para obtener un residuo.

El disolvente más idóneo para el ensayo se determina según la masa de residuo obtenido. Se debería
determinar el rendimiento porcentual de la extracción del residuo. El disolvente que extraiga la mayor
cantidad de residuo se escoge como el disolvente de extracción para el ensayo de sensibilización.

Se determina la solubilidad del residuo añadiendo aceite de oliva, acetona, metanol o dimetilsulfóxido
(DMSO). La solución que disuelva la mayor cantidad de residuo se utiliza como vehículo para el ensayo
en el GPMT.

NOTA Si la muestra de ensayo se disuelve o degrada en acetona o metanol o si no se puede obtener una cantidad adecuada de
residuo, se puede utilizar n-hexano o una mezcla 1:1 de ciclohexano y 2-propanol como un disolvente de extracción.

B.2.2 Extracción final

B.2.2.1 Generalidades
Existen dos métodos para preparar la solución de ensayo a partir del extracto del disolvente orgánico.

El método 1 es aplicable cuando la cantidad de residuo obtenida por extracción con disolvente de una
muestra de ensayo y el peso de una muestra de ensayo son relativamente altos por cuanto se han
obtenido cantidades suficientes de residuo. Además, el método 1 se recomienda especialmente para
evaluar el riesgo de productos sanitarios que se utilizan de forma repetida. Véase la referencia [14].

El método 2 es aplicable cuando la cantidad de residuo obtenida por extracción con disolvente de una
muestra de ensayo o el peso de una muestra de ensayo es relativamente bajo. Ejemplos de este último
caso son las lentes de contacto y las lentes intraoculares.

Para ambos métodos 1 y 2, en paralelo a la extracción de la muestra de ensayo, la cantidad de disolvente

igual al volumen total utilizado durante la extracción de la muestra de ensayo se somete al mismo
procedimiento de concentración que los extractos de ensayo. Este blanco del disolvente se utiliza como
control negativo para cada fase del ensayo.

B.2.2.2 Preparación de la muestra de ensayo para el método 1

Para el método 1, la extracción se efectúa cubriendo la muestra de ensayo con un volumen de 10 a 20
veces mayor del disolvente apropiado (según se ha determinado en el ensayo de extracción preliminar)
y agitando (sacudiendo) a temperatura ambiente. El disolvente se recoge en otro matraz. El disolvente
se cambia tres veces [por ejemplo, transcurridas (4 ± 1) h, (8 ± 1) h, o (24 ± 2) h desde el comienzo de
la extracción], y se repite agitando a temperatura ambiente dentro de un periodo comprendido entre
24 h y 72 h dependiendo de la lixiviación y estabilidad de las sustancias extraídas del material de ensayo.

Se obtiene un residuo por evaporación del disolvente recogido. Se utiliza un evaporador rotatorio a la
temperatura más baja posible que proporcione evaporación controlada a presión reducida.

El residuo se disuelve en un vehículo apropiado (aceite de oliva/acetona/etanol/DMSO) según se haya

determinado por el experimento de solubilidad en el ensayo de extracción preliminar, para preparar
sendas soluciones de ensayo al 10 % (p/p) y al 20 % (p/p) para la fase de inducción intradérmica y para
la fase de inducción tópica en el GPMT. Para la fase de provocación en el GPMT se prepara una solución
al 10 % (p/p) en el vehículo. La solución al 10 % se diluye adicionalmente con el vehículo para obtener
soluciones de ensayo al 1 %, 0,1 %, 0,01 % y 0,001 %.

B.2.2.3 Preparación de la muestra de ensayo para el método 2

Para el método 2, la extracción se efectúa cubriendo la muestra de ensayo con un volumen de 10 a 20
veces mayor del disolvente apropiado (según se ha determinado en el ensayo de extracción preliminar)
y agitando a temperatura ambiente durante (24 ± 2) h. El disolvente se recoge en otro matraz. El
procedimiento de extracción se repite tres veces dentro de un periodo comprendido entre 24 h y 72 h
utilizando el mismo volumen de disolvente fresco cada vez. Los extractos se agrupan en un matraz y el
disolvente se evapora.

Para la fase de inducción intradérmica, los extractos obtenidos se evaporan hasta que el número de
mililitros residuales del extracto sea igual o ligeramente inferior a la mitad del número original de
gramos de la muestra utilizada (es decir, si se extraen 10 g de la muestra de ensayo entonces el extracto
del disolvente combinado se evapora hasta aproximadamente 5 ml), o se evapora completamente para
obtener un residuo. Cuando se obtiene un residuo, éste se disuelve en el vehículo apropiado (según se
haya determinado en el ensayo de extracción preliminar) para obtener un volumen de 5 ml. Esta
solución se considera como solución de ensayo 200 %.

Además, la solución de ensayo 100 % se prepara diluyendo la solución de ensayo 200 % con el vehículo.

Para la fase de inducción tópica, se utiliza la solución de ensayo 100 %. Para ambos ensayos de la fase
de inducción intradérmica y tópica, el vehículo en las soluciones de ensayo 200 % y 100 % se sustituye
por aceite de oliva combinando la solución de ensayo con un volumen igual de aceite de oliva y
evaporando el vehículo bajo una corriente de nitrógeno gaseoso.

Para la fase de provocación, se utilizan soluciones de ensayo 100 %, 50 %, 25 %, 12,5 % y 6,25 %. La

solución de ensayo 100 % se diluye con el vehículo para obtener las soluciones de ensayo 50 %, 25 %,
12,5 % y 6,25 %. El vehículo en las soluciones de ensayo no se sustituye por aceite de oliva para la fase
de provocación.

B.3 Ensayo de maximización en cobayas (GPMT)

B.3.1 Generalidades
El GPMT se debe efectuar según se describe en el apartado 6.5 con la excepción de la fase de provocación
que se describe a continuación. La fase de provocación, utilizando el método de extracción con
disolvente, se debería efectuar sin un apósito oclusivo.

B.3.2 Fase de provocación

Dos semanas después de la aplicación del parche ocluido, todos los animales de ensayo y de control se
provocan con la muestra de ensayo.

Para el método 1, una alícuota de 0,1 ml de las soluciones de ensayo 10 % (p/p), 1 % y 0,1 % se aplica
tópicamente en el costado derecho de cada animal de ensayo y de control negativo. Además, una alícuota
de 0,1 ml de las soluciones de ensayo 0,01 % y 0,001 % y del vehículo de control negativo se aplica
tópicamente en el costado izquierdo de cada animal de ensayo y de control negativo.

Para el método 2, una alícuota de 0,1 ml de las soluciones de ensayo 100 %, 50 % y 25 % se aplica
tópicamente en el costado derecho de cada animal de ensayo y de control negativo. Además, una alícuota
de 0,1 ml de las soluciones de ensayo 12,5 % y 6,25 % y del vehículo de control negativo se aplica
tópicamente en el costado izquierdo de cada animal de ensayo y de control negativo.

Para ambos métodos, método 1 y método 2, los animales de control positivo se tratan con una alícuota
de 0,1 ml de DNCB al 0,1 % en etanol en el costado derecho y de etanol en el costado izquierdo.

NOTA La provocación oclusiva se puede efectuar de forma similar.

Anexo C (Informativo)

Métodos sin utilización de animales para los ensayos

de sensibilización cutánea

C.1 Introducción

C.1.1 Información general sobre métodos alternativos para los ensayos de

sensibilización cutánea
El esfuerzo para reducir o sustituir la utilización de animales en los ensayos de toxicidad ha conducido
al desarrollo de muchos métodos nuevos en los que no se utilizan animales. Mientras se aceptan para el
ensayo de productos químicos, el interés en utilizar estos métodos nuevos para la evaluación de la
seguridad de fármacos y productos sanitarios ha aumentado en años recientes. Para la sensibilización
cutánea, se utilizan a menudo métodos de ensayo in vivo que utilizan animales o seres humanos porque
permiten la observación del resultado adverso (es decir, dermatitis alérgica por contacto), en el sujeto
vivo. Sin embargo, conforme se ha logrado una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y
celulares del proceso de sensibilización cutánea, se han desarrollado ensayos en los que no se utilizan
animales para la evaluación del potencial de sensibilización cutánea de productos químicos y
materiales[57]. Estos ensayos se pueden agrupar en tres categorías:

– ensayos in chemico: estudio o procedimiento que está relacionado con la reactividad intrínseca de un
material que entraña mediciones fisicoquímicas en vez de ensayos biológicos;

– ensayos in silico: estudio o procedimiento que se efectúa utilizando una simulación por ordenador
(por ejemplo, un modelo creado en ordenador de una molécula o de una célula que simula con
exactitud su comportamiento, o la evaluación cuantitativa de la relación estructura-actividad, QSAR);

– ensayos in vitro: estudio o procedimiento que se efectúa fuera de un organismo vivo y en condiciones
controladas (por ejemplo, cultivos celulares en una placa).

Hasta la fecha, ninguno de los ensayos validados en estas categorías es capaz de reproducir enteramente
el conjunto preciso e intrincado de los mecanismos moleculares, celulares, y a nivel de un órgano que
tienen lugar en organismos vivos. Por consiguiente, cada ensayo, considerado individualmente, no es
capaz de replicar completamente los eventos que dan lugar al resultado adverso. En vez de ello, la
predicción de la potencia sensibilizante cutánea de un producto químico en un ser humano se basa en
enfoques mecanísticos que combinan varios ensayos individuales en estrategias de ensayo [66][70].

C.1.2 AOP (secuencia de resultados adversos) de la OCDE para la sensibilización

cutánea
La OCDE ha descrito la cadena secuencial de eventos conectados a nivel molecular, celular, tisular y del
órgano que generan el efecto de sensibilización cutánea[5]. Esta serie de eventos se estructuró para
desarrollar y generar una imagen detallada y normalizada de los mecanismos explicativos del resultado
adverso observado en el organismo completo (animal o humano). Esta serie de eventos se denomina el
AOP. El AOP concatena de forma lineal el conocimiento existente en una o más series de eventos clave
(KE, del inglés Key Event) causalmente conectados entre dos puntos – un episodio molecular de
iniciación (MIE, del inglés Molecular Initiating Event) y un resultado adverso (AO, del inglés Adverse
Outcome)[56]. El AOP es el elemento central de una base de conocimiento tecnológico creado para
refrendar la determinación del riesgo químico construida sobre un razonamiento mecanístico.

El AOP para la sensibilización cutánea comienza después de la exposición a un agente de adsorción o

sensibilizante. Después de que el agente penetra el estrato córneo de la piel, tiene lugar una serie de
eventos a nivel molecular, celular y del órgano afectado que conducen al punto final adverso de
dermatitis alérgica por contacto o hipersensibilidad por contacto. Los cuatro eventos clave en el AOP
para la sensibilización cutánea son:

– Evento clave 1: unión covalente a proteínas de la piel: el evento iniciador molecular después de la
penetración del estrato córneo es la formación irreversible del complejo hapteno-proteína. En el
animal, este evento está asociado con la producción de una respuesta de las células T de memoria
específica.

– Evento clave 2: respuesta inflamatoria de queratinocitos: este evento clave entraña la activación de
reacciones bioquímicas en los queratinocitos e incluye respuestas inflamatorias del mediador, así
como cambios en la expresión génica relacionados con mecanismos de señalización celular tales
como el elemento de respuesta al estrés oxidativo (antioxidante/electrófilo) (ARE).

– Evento clave 3: activación de las células dendríticas: los eventos bioquímicos detallados después de
la formación del complejo hapteno-proteína no han sido completamente elucidados. Sin embargo, se
sabe que los mecanismos que intervienen están relacionados con la respuesta inflamatoria, tales
como el mecanismo de señalización de proteínas cinasas activadas por mitógenos y el mecanismo de
respuesta al estrés oxidativo que ocurren especialmente en queratinocitos y células dendríticas. Los
efectos a nivel celular y tisular tampoco son completamente conocidos, pero entrañan respuestas
epidérmicas que incluyen:

1) reconocimiento inmunológico de alérgenos químicos por los queratinocitos, células dendríticas

epidérmicas especializadas (es decir, células de Langerhans) y células dendríticas dérmicas;

2) respuestas en la forma de expresión de los marcadores de superficie celular específicos, como

moléculas de adhesión celular, quimiocinas, y citocinas tales como IL-1 o IL-12p70, se toman
normalmente como evidencia de la maduración de células dendríticas.

– Evento clave 4: proliferación de células T: A nivel del órgano (ganglios linfáticos y piel), las respuestas
son:

1) migración de células dendríticas al ganglio linfático, donde el antígeno es presentado por molé-
culas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) a linfocitos T nativos (células T), y

2) diferenciación y proliferación de las células T como efector específico del alérgeno y linfocitos T
de memoria.

La respuesta fisiológica final es la adquisición de sensibilidad. La respuesta clave del organismo es la

inflamación dérmica tras recibir el desafío de la sustancia en la fase de elicitación. Esta respuesta está
asociada a la estimulación de células T de memoria específicas producidas en la fase de inducción. El
efecto global en los mamíferos, incluidos los seres humanos, es la dermatitis alérgica por contacto, o su
equivalente en roedores, la hipersensibilidad por contacto[65].

C.1.3 Enfoques integrados a ensayos y evaluación

Los IATA son enfoques pragmáticos con base científica para la caracterización de peligros químicos que
se basan en un análisis integrado de la información existente junto con la generación de información
nueva utilizando estrategias de ensayo. Para predecir el potencial de sensibilización cutánea de
productos químicos en seres humanos, se utilizan métodos alternativos sin animales, bien en
combinación o con información pertinente existente para caracterizar totalmente el punto final
biológico. El punto final de sensibilización se puede determinar utilizando un enfoque integrado por el
cual toda la información existente y fiable sobre un producto químico o un material se combina con
datos provenientes de métodos bioquímicos (in chemico), informáticos (in silico), y/o basados en células
(in vitro) para predecir adecuadamente la toxicidad del material o producto químico. A veces, el enfoque
integrado puede requerir datos adicionales a generar utilizando enfoques sin animales para obtener una
aceptación completa como un predictor de un punto final específico de la toxicidad.

Ejemplos de ensayos de sensibilización cutánea in vitro incluyen KeratinoSens™, LuSens, U-SENS™,

ensayo de activación de la línea celular humana (h-CLAT), y el ensayo del gen marcador de la
interleucina-8 (IL-8 Luc). El ensayo directo de reactividad peptídica (DPRA, del inglés Direct Peptide
Reactivity Assay) es un ejemplo de un ensayo de sensibilización cutánea in chemico. Ejemplos de métodos
informáticos de sensibilización cutánea in silico incluyen QSAR Toolbox y la plataforma TImes
MEtabolism Simulator utilizada para predecir sensibilización cutánea (TIMES SS) [56][67]. Varios de estos
métodos se pueden combinar en un IATA para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de
productos químicos o materiales.

Para normalizar la evaluación de los IATA en la toma de decisiones reglamentarias, la OCDE ha

desarrollado orientación para proporcionar fundamentos y plantillas para notificar enfoques definidos
(DA, del inglés Defined Approach) y fuentes de información individuales [57][67]. Un DA consiste en un
procedimiento de interpretación de datos (DIP, del inglés Data Interpretation Procedure) fijo aplicado
a datos generados con un conjunto definido de fuentes de información para obtener un resultado que
puede utilizarse por si mismo, o junto con otras fuentes de información dentro de un IATA, para cumplir
un requisito reglamentario específico.

Para lograr la aceptación reglamentaria de los IATA para el potencial de sensibilización cutánea, los
enfoques integrados incluyen enfoques definidos (DA) en los que para cada DA, se indica claramente
cual es la información y los métodos sin animales a utilizar en combinación y se da un procedimiento
para interpretar los datos que genera la aplicación de estos métodos identificados. De esta forma, los DA
son estrategias basadas en reglas que pueden obviar la necesidad de un juicio experto una vez se
describe, valida, normaliza y acepta un enfoque específico[61].

El documento de orientación de la OCDE 256:2017, anexo I[124] (véase la tabla C.1) señala 12 estudios de
casos ilustrativos de DA para sensibilización cutánea. La OCDE está considerando algunos de ellos para
una directriz de ensayo futura “Defined Approaches for Skin Sensitization (Enfoques definidos para
sensibilización cutánea).

Tabla C.1 – Estudios de casos del documento de orientación de la OCDE 256:2017, anexo I[124]

Estudio de casos Propósito

I Enfoque estratégico de ensayo integrado “2 de 3” de la identificación de Identificación del peligro
peligros para la piel basado en el AOP (del inglés Adverse Outcome Pathway-
based) (BASF)
II Estrategia de ensayos secuenciales (STS, del inglés Sequential Testing Strategy) Identificación del peligro
de identificación de peligros de sensibilizantes cutáneos) (RIVM)
III Enfoque Pipeline sin ensayos para la sensibilización cutánea(G. Patlewicz) Identificación del peligro
IV Meta-modelo de apilamiento para la identificación de peligros de Identificación del peligro
sensibilización cutánea (L’Oréal)
V Estrategia de decisión integrada para el peligro de sensibilización Identificación del peligro
cutánea(ICCVAM)
VI Consenso de árboles de clasificación para la predicción de peligros de Identificación del peligro
sensibilización cutánea(EC-JRC)
VII Predicción de la potencia sensibilizante basada en eventos clave 1 + 2: Predicción de la potencia
Combinación de datos cinéticos de reactividad peptídica y datos de
KeratinoSens® (Givaudan)
VIII El modelo de red neuronal artificial para la predicción de LLNA EC3 (Shiseido) Predicción de la potencia
IX Red bayesiana DIP (BN-ITS-3) para la identificación de peligros y de la potencia Predicción de la potencia
de sensibilizantes cutáneos (P&G)
X Estrategia de ensayos secuenciales para la clasificación de la potencia Predicción de la potencia
sensibilizante basada en datos in chemico e in vitro (Kao Corporation)
XI Estrategia de ensayos integrados (ITS, del inglés Integrated Testing Strategy) Predicción de la potencia
para la clasificación de la potencia sensibilizante basada en datos in silico, in
chemico e in vitro (Kao Corporation)
XII DIP para la valoración del riesgo de alergia cutánea (SARA, del inglés Skin Predicción de la potencia
Allergy Risk Assessment) (Unilever)

C.2 Ensayos in vitro para determinación de sensibilización cutánea

C.2.1 Generalidades
El apartado C.2 proporciona resúmenes de ensayos de sensibilización cutánea in vitro que se han
incluido en revisiones y estudios de evaluación internacionales recientes [58][59][65][68].

C.2.2 Métodos de ensayo

C.2.2.1 DPRA (Ensayo directo de reactividad peptídica)

El DPRA o ensayo directo de reactividad peptídica es un método in chemico que cuantifica la reactividad
de un producto químico de ensayo midiendo la disminución de péptidos sintéticos que contienen
residuos de cisteína o lisina. Se calculan los valores de la disminución porcentual de la concentración de
estos péptidos y un modelo predictivo categoriza el producto químico como un sensibilizante o no
sensibilizante. Véase la tabla C.2.

Tabla C.2 – DPRA

Evento clave 1: Evento molecular de iniciación de la unión covalente a proteínas de la piel

Directriz de la OCDE OECD TG 442C[75]
Desempeño Exactitud 80 %, sensibilidad 80 %, especificidad 77
(Respuesta si/no)
Sistema experimental La concentración de cisteína o lisina que queda en un péptido sintético se determina tras
la incubación a temperatura comprendida entre 22,5 °C y 30 °C durante 24 h con el
producto químico objeto del ensayo. Para facilitar la detección, los péptidos sintéticos
contienen fenilalanina. Las concentraciones de los péptidos se miden utilizando
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High-Performance Liquid
Chromatography) de elución con gradiente y por detección UV a 220 nm.
Fundamento del Se determinan los valores de la disminución porcentual de cisteína y lisina y se utilizan
ensayo en un modelo predictivo que asigna el producto químico de ensayo a una de cuatro
posibles clases de reactividad que categorizan al producto como un sensibilizante o no
sensibilizante cutáneo.
Lectura Las concentraciones relativas de péptido se miden utilizando HPLC por detección UV a
220 nm.
Duración de la 24 h
exposición
Aplicabilidad No aplicable para ensayos de compuestos metálicos dado que pueden reaccionar con
proteínas utilizando mecanismos diferentes al de unión covalente. El producto químico
de ensayo precisa estar totalmente disuelto en un disolvente apropiado a una
concentración de 100 mM. El ensayo de mezclas es posible si se conocen sus
constituyentes.
Aplicación a productos No existen datos. El DPRA funciona con acetonitrilo, agua, isopropanol y acetona. Sin
sanitarios embargo, puede posiblemente no funcionar con disolventes de productos sanitarios
apolares, tales como aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, o aceite de oliva.
Dado que el ensayo utiliza un exceso de producto químico frente a los péptidos
utilizados en el ensayo, es improbable que el ensayo sea adecuado para detectar
sensibilizantes cutáneos en extractos de productos sanitarios.
Véanse las Referencias [74] a [76].

C.2.2.2 KeratinoSens™ 2)
El ensayo KeratinoSens™ utiliza una línea de células adherentes de queratinocitos humanos
inmortalizados que contiene un gen reportero de luciferasa controlado por el elemento de respuesta a
estrés oxidativo (ARE, del inglés Antioxidant Response Element) del gen AKR1C2, que se sabe está
regulado positivamente por sensibilizantes cutáneos. Véase la tabla C.3.

2) KeratinoSens es la marca registrada de un producto suministrado por Givaudan Schweiz AG, CH-8310 Kemptthal. Esta
información se da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto
nombrado. Se pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

Tabla C.3 – KeratinoSens™

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

Directriz OCDE OECD TG 442D[79]
Desempeño Exactitud 77 %, sensibilidad 78 %, especificidad 79 %.
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Línea celular transgénica KeratinoSens™: línea de células adherentes inmortalizadas
derivadas de queratinocitos humanos que albergan de forma estable un gen reportero
de la luciferasa bajo el control del ARE (elemento de respuesta a estrés oxidativo) del
gen AKR1C2 humano.
Fundamento del La línea celular KeratinoSens™ contiene el gen de la luciferasa bajo el control
ensayo transcripcional de un promotor constitutivo fusionado con el elemento ARE. La señal de
la luciferasa indica la activación de genes dependientes de Nrf2 endógenos por
sensibilizantes cutáneos electrófilos. La inducción del gen de la luciferasa se determina
cuantitativamente midiendo la luminiscencia producida por sustratos de luciferasa que
emiten luz. Los productos químicos de ensayo se consideran sensibilizantes cutáneos si
inducen un aumento estadísticamente significativo de la actividad de la luciferasa (es
decir, un aumento del 50 %), por debajo de una concentración que no causa una
reducción significativa de la viabilidad celular.
Lectura Medición cuantitativa (por detección de luminiscencia) de la inducción del gen de la
luciferasa
Duración de la 48 h
exposición
Aplicabilidad El ensayo KeratinoSens™ es aplicable a productos químicos de ensayo que cubren una
diversidad de grupos funcionales orgánicos, mecanismos de reacción, potencia
sensibilizante cutánea y propiedades fisicoquímicas. Además, el ensayo es aplicable a
productos químicos solubles o que forman dispersiones estables (por ejemplo,
suspensiones o coloides) en el medio de exposición.
Aplicación a productos No existen datos. KeratinoSens™ funciona con DMSO y disolventes acuosos, pero puede
sanitarios posiblemente no funcionar con disolventes de productos sanitarios apolares tales como
aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón o aceite de oliva porque sus valores del
log P son superiores a 15,0.
Véanse las referencias [77] a [80].

C.2.2.3 LuSens
El ensayo LuSens utiliza una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados que albergan un
gen reportero de la luciferasa bajo el control del elemento de respuesta a estrés oxidativo (ARE) del gen
de quinona oxidoreductasa 1 de rata (NQO1), que se sabe está regulado positivamente por
sensibilizantes cutáneos. Véase la tabla C.4.

Tabla C.4 – LuSens

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

Directriz OCDE OECD TG 442D
Desempeño Exactitud 74 %, Sensibilidad 74 %, Especificidad 74 %.
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Línea celular transgénica LuSens: línea de células adherentes inmortalizadas derivada
de queratinocitos humanos que albergan de forma estable un gen reportero de la
luciferasa bajo el control del elemento de respuesta a estrés oxidativo (ARE) del gen de
rata NQO1.
Principio del ensayo La línea celular transgénica LuSens contiene un gen reportero de la luciferasa bajo el
control transcripcional de un promotor fusionado en el elemento ARE. La señal de la
luciferasa refleja la activación por electrófilos de genes dependientes de Nrf2
endógenos. La inducción del gen de la luciferasa se determina cuantitativamente por
medición de la luminiscencia producida por sustratos de la luciferasa, como un indicador
de la actividad del factor de transcripción Nrf2 en células después de la exposición a
sensibilizantes cutáneos electrófilos.
Lectura Medición cuantitativa (por detección de luminiscencia) de la inducción del gen de la
luciferasa.
Duración de la 48 h
exposición
Aplicabilidad El ensayo LuSens es aplicable a productos químicos de ensayo que cubren una variedad
de grupos funcionales orgánicos, mecanismos de reacción, potencia sensibilizante
cutánea y propiedades fisicoquímicas. Además, el ensayo se aplica a productos químicos
solubles o aquéllos que forman dispersiones estables (por ejemplo, suspensiones o
coloides) en el medio de exposición.
Aplicación a productos No existen datos. LuSens funciona con DMSO y disolventes acuosos pero puede
sanitarios posiblemente no funcionar con disolventes de productos sanitarios apolares tales como
aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón o aceite de oliva porque sus valores del
log P son superiores a 15,0.
Véanse las referencias [81] to [84].

C.2.2.4 SENS-IS
El ensayo SENS-IS es un modelo in vitro desarrollado para productos químicos y mezclas de éstos, que
mide la activación de queratinocitos epidérmicos (evento clave 2, KE2) evaluando perfiles de expresión
génica en modelos de piel humana (Episkin® RhE o SkinEthic™ RHE3)). SENS-IS permite la clasificación
de sensibilizantes cutáneos en categorías[84] de potencia. El ensayo SENS-IS se ha validado en un estudio
dirigido por la industria [86] [87] y está siendo evaluado actualmente por EURL-ECVAM. Véase la tabla C.5.

3) Episkin® RhE y SkinEthic™ RHE (EPISKIN) son ejemplos de productos adecuados disponibles comercialmente. Esta
información se da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto
nombrado. Se pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

Tabla C.5 – SENS-IS

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

Directriz OCDE Proyecto 4.107: Nuevo TG: Análisis toxicogenómico en epidermis reconstituida en 3D
para medición de la potencia sensibilizante cutánea – el ensayo SENS-IS.
Desempeño Exactitud 96,6 %, Sensibilidad 97,7 %, Especificidad 95,2 %[86][87].
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Modelos de epidermis humana reconstituida (RhE) Episkin® RhE o SkinEthic™ RHE
(EPISKIN).
Principio del ensayo Se mide la expresión génica de dos grupos: un grupo (grupo REDOX) incluye una selección
de 17 genes que tienen un elemento de respuesta antioxidante en su promotor y
monitorizan las señales protectoras redox inducidas por la interacción de sensibilizantes
cutáneos que se unen a aminoácidos de cisteína del complejo Keap1-Nrf2[89]. El segundo
grupo (grupo SENS-IS) incluye una selección de 21 genes implicados en inflamación,
señales de peligro y migración celular para responder a la cascada compleja de episodios
que conducen a la activación de células dendríticas por un sensibilizante cutáneo químico.
Lectura Análisis cuantitativo de la expresión de 64 genes medida por la reacción en [Link] de la
polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Duración de la Exposición de 15 min; los tejidos de la RhE se aclaran entonces y se post-incuban durante
exposición 6 h.
Aplicabilidad El ensayo SENS-IS utiliza tejidos de RhE en 3D para mejor tener en cuenta la etapa de
penetración de la piel de productos con solubilidad o estado físico diferente. SENS-IS
puede cuantificar no solamente productos químicos puros, sino también productos
naturales, mezclas, y productos terminados[90][91].
Aplicación a productos Los ensayos SENS-IS funcionan con vehículos de extracción polares (solución salina) y
sanitarios apolares (aceite de sésamo) y se pueden posiblemente utilizar para ensayar extractos de
productos sanitarios. En un estudio prueba de concepto para evaluación de la
sensibilización cutánea por extractos de productos sanitarios, se analizaron cinco
sensibilizantes cutáneos conocidos incorporados en silicona de calidad médica y
controles negativos. Todos los artículos de ensayo se extrajeron en disolventes polares
(solución salina) y apolares (aceite de sésamo) y se identificaron correctamente como
sensibilizantes y no sensibilizantes cutáneos [88].
Véanse las referencias [85] to [91].

C.2.2.5 Ensayo IL-18RhE

Para la evaluación de la sensibilización por medición de la liberación de IL-18 basal después de la
aplicación de un producto químico a la interfaz aire-líquido de la RhE, véase la tabla C.6.

Tabla C.6 – Ensayo IL-18RhE

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

Directriz de la OCDE No existe en este momento.
Desempeño En un conjunto limitado ( 10) de compuestos para los diferentes modelos ensayados.
(Respuesta si/no) Andres et al.[92] calcularon el desempeño en un conjunto de 19 productos químicos. En
esta separata, se describen cinco modelos de predicción que ofrecen prestaciones
diferentes.
Sistema experimental Modelos de epidermis humana reconstruida SkinEthic™ RHE (EPISKIN), VUmc-EE,
EpiCS®a (CellSystems), y EpiDerm™ (MatTek Corp.)b [92][93][94][95]
Principio del ensayo Al final de la exposición química, las epidermis se sometieron a un ensayo de viabilidad
celular y los medios de mantenimiento se recuperaron para el ensayo de ELISA IL-18.
Lectura Cuantificación del IL-18 por ELISA en el medio de cultivo de la RhE; en paralelo, la
viabilidad celular se mide por un ensayo MTT.
Duración de la 24 h
exposición
Aplicabildad El ensayo es aplicable para ensayar alérgenos por contacto solubles y metales
catiónicos para determinar su potencial de sensibilización cutánea [94].
Aplicación a productos No existen datos. Dado que este ensayo utiliza tejidos de RhE puede posiblemente
sanitarios funcionar con extractos de productos sanitarios en medios polares y apolares.
a VUmc-EE, EpiCS® (CellSystems) es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información se
da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto nombrado. Se
pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.
b Epiderm™ EPI-200 (MatTek Corp.) es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información
se da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto nombrado. Se
pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

C.2.2.6 EpiSensA4)
El ensayo de sensibilización epidérmica “EpiSensA” utiliza modelos de tejido de RhE. El ensayo se basa
en la inducción de genes marcadores relacionados con respuestas de queratinocitos por inflamación y
citoprotección en la inducción de sensibilización cutánea. Véase la tabla C.7.

4) EpiSensA es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información se da para comodidad de
los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto nombrado. Se pueden utilizar productos
equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

Tabla C.7 – EpiSensA

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

OECD Guideline No existe en este momento
Desempeño Exactitud 90 %, Sensibilidad 94 %, Especificidad 78 %[96].
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Modelos de epidermis humana reconstruida, LabCyte EPI-MODEL 24 (Japanese Tissue
Engineering Co., Ltd.)a y Epiderm™ EPI-200 (MatTek Corp.).
Principio del ensayo Este ensayo se basa en la inducción de genes marcadores múltiples (ATF3, IL-8,
DNAJB4 y GCLM) relacionados con dos respuestas de queratinocitos (inflamatoria o
citoprotectora) en la inducción de sensibilización cutánea. La pertinencia mecanística
de los genes marcadores se ha confirmado centrándose en moléculas clave que regulan
las respuestas de queratinocitos in vitro (P2X7 para respuestas inflamatorias y Nrf2
para respuestas citoprotectoras). La regulación positiva de ATF3 e IL-8, o DNAJB4 y
GCLM inducida por 2,4-dinitroclorobenceno en queratinocitos humanos está
significativamente suprimida por KN-62, un antagonista especifico de P2X7, o por Nrf2
siRNA, respectivamente, que refrenda la pertinencia mecanística de los genes
marcadores.
Lectura Análisis cuantitativo de la expresión de 64 genes medida por la reacción en cadena de
la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR).
Duración de la Exposición de 6 h
exposición
Aplicabilidad EpiSensA puede ser un ensayo de sensibilización cutánea basado en mecanismo,
aplicable a conjuntos amplios de productos químicos incluidos productos químicos
lipofílicos y pre/prohaptenos[97].
Aplicación a productos No existen datos. Dado que este ensayo utiliza tejidos de la RhE, puede posiblemente
sanitarios funcionar con extractos de productos sanitarios en medios polares y apolares.
a LabCyte EPI-MODEL 24 (Japanese Tissue Engineering Co., Ltd.) es un ejemplo de un producto adecuado disponible
comercialmente. Esta información se da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo
de ISO al producto nombrado. Se pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos
resultados.

C.2.2.7 SenCeeTox®5)
El ensayo SenCeeTox® mide la expresión de 11 genes relacionados con la sensibilización cutánea en
queratinocitos de tejidos de RhE en 3D. La expresión aumentada de los genes, más la reactividad y
citotoxicidad determinan el potencial de sensibilización cutánea. Véase la tabla C.8.

5) SenCeeTox® es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información se da para comodidad
de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto nombrado. Se pueden utilizar productos
equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

Tabla C.8 – SenCeeTox®

Evento clave 2: Activación de queratinocitos epidérmicos

Directiz de la OCDE Ninguna en este momento
Desempeño Exactitud 84 %, Sensibilidad 81 %, Especificidad 92 %[99].
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Modelos de epidermis humana reconstruida, EpiDerm™ EPI-200 (MatTek Corp.) and
SkinEthic™ RhE (EPISKIN).
Principio del ensayo La expresión de ocho genes, dos controlados por Nrf2/ARE, uno controlado por
AhR/XRE y dos controlados por Nrf1/MRE se mide por la reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). El
aumento de inducción en cada concentración de exposición se combina con datos de
reactividad y citotoxicidad para determinar el potencial de sensibilización.
Lectura El análisis cuantitativo de la expresión de 11 genes se mide por qRT-PCR. Se
determinan también la reactividad química y el potencial citotóxico. Los resultados de
estos ensayos individuales se analizan utilizando un algoritmo que incorpora todos los
datos de cada ensayo para predecir el potencial de sensibilización cutánea.
Duración de la 24 h
exposición
Aplicabilidad El ensayo SenCeeTox® se puede utilizar para evaluar sensibilizantes, tanto productos
químicos como metales, de distintas potencias sensibilizantes [98].
Aplicación a productos El ensayo SenCeeTox® funciona con vehículos de extracción tanto polares (solución
sanitarios salina) como apolares (aceite de sésamo) y se puede utilizar posiblemente para
ensayar extractos de productos sanitarios. En las referencias [98] y [100], se notificó
que el ensayo SenCeeTox® pudo identificar exactamente soluciones de ciertos
productos químicos relacionados con productos sanitarios y sensibilizantes cutáneos
metálicos o sensibilizantes extraídos de silicona de calidad médica utilizando
disolventes polares y apolares tales como solución salina y aceite de sésamo.

C.2.2.8 h-CLAT
El h-CLAT cuantifica los cambios en la expresión de marcadores de la superficie celular asociados con el
proceso de activación de monocitos y células dendríticas después de la exposición a sensibilizadores
cutáneos. Los niveles de expresión de los marcadores de superficie se utilizan para identificar
sensibilizantes cutáneos y aquéllos que no lo son. Véase la tabla C.9.

Tabla C.9 – h-CLAT

Evento clave 3: Activación de células dendríticas epidérmicas

Directriz de la OCDE OCDE TG 442E
Desempeño Exactitud 85 %, Sensibilidad 93 %, Especificidad 66 %.
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Línea celular h-CLAT: Línea celular de la leucemia monocítica humana THP-1
Principio del ensayo El ensayo h-CLAT mide los cambios en la expresión de los marcadores de superficie
celular CD86 y CD54 en células de la leucemia monocítica humana THP-1 después de
la exposición al producto químico de ensayo durante 24 h. Estos marcadores de
moléculas de la superficie celular son marcadores usuales de la activación de las
células de la leucemia monocítica humana THP-1 y pueden imitar la activación de
células dendríticas, que juegan un papel importante en la presentación a células T.
Los cambios en la expresión de los marcadores de superficie se miden por citometría
de flujo basada en fluorescencia. Se determina la fluorescencia relativa de los
marcadores de superficie comparada con la de los vehículos de control y se utiliza
para diferenciar entre sensibilizantes y no sensibilizantes cutáneos [104].
Lectura Los niveles de expresión de los marcadores de superficie celular CD86 y CD54 se
miden por citometría de flujo después de tinción celular con anticuerpos marcados
con fluorocromos.
Duración de la exposición Exposición de 24 h
Aplicabilidad El ensayo h-CLAT es aplicable a productos químicos de ensayo que sean solubles en
un disolvente apropiado o que formen dispersiones estables en un vehículo
adecuado. Los productos químicos de ensayo con valores del Log P superiores a 3,5
han mostrado una tendencia a generar resultados de falsos negativos [104][105].
Aplicación a productos No existen datos. El h-CLAT funciona con los disolventes solución salina y DMSO, pero
sanitarios es improbable que funcione con disolventes apolares de productos sanitarios tales
como aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón o aceite de oliva porque sus
valores del Log P son superiores a 15,0.

C.2.2.9 U-SENS™6)
El método de ensayo de activación de la línea celular U937 (U-SENS™) es un ensayo in vitro que
cuantifica los cambios en la expresión del marcador celular CD86 por citometría de flujo en una línea
celular del linfoma histiocítico humano, células U937. Véase la tabla C.10.

6) U-SENS es la marca comercial de un producto suministrado por LÓréal, 41 rue Marthe, Clichy, 92110. Esta información se
da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO al producto nombrado. Se pueden
utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos resultados.

Tabla C.10 – U-SENS™

U-SENS™ – Evento clave 3: Activación de células dendríticas epidérmicas

Directriz OCDE OECD TG 442E
Desempeño Exactitud 86 %, Sensibilidad 91 %, Especificidad 65 %.
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Línea celular U-SENS™: U937, línea celular del linfoma histiocítico humano
Principio del ensayo CD86 se sabe que es una molécula coestimulatoria que puede simular la activación
monocítica, que juega un papel crítico en la estimulación de las células T. Los cambios
de expresión del marcador de la superficie celular CD86 se miden por citometría de
flujo tras tinción celular normalmente con anticuerpos marcados con isotiocianato
de fluoresceína (FITC). Se efectúa también la medición de citotoxicidad (por ejemplo,
utilizando PI) concurrentemente para evaluar si la regulación positiva de la
expresión del marcador de la superficie celular CD86 tiene lugar a concentraciones
subcitotóxicas, Se calcula el índice de estimulación (SI) del marcador de superficie
celular CD86 comparado con el del control del disolvente/vehículo, para refrendar la
discriminación entre sensibilizantes cutáneos y no sensibilizantes [104].
Lectura Los cambios de expresión del marcador de la superficie celular CD86 se miden por
citometría de flujo tras tinción celular normalmente con anticuerpos marcados con
isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Duración de la exposición Exposición de (45 ± 3) h
Aplicabilidad Aplicable a productos químicos de ensayo que son solubles o que forman una
dispersión estable (es decir, un coloide o suspensión en la que el producto químico
de ensayo no precipita ni se separa del disolvente/vehículo en fases diferentes) en
un disolvente/vehículo apropiado [104].
Aplicación a productos No existen datos. U-SENS funciona con solución salina y DMSO pero es improbable
sanitarios que funcione con disolventes de productos sanitarios apolares tales como aceite de
sésamo, aceite de semillas de algodón, o aceite de oliva, porque sus valores del Log P
son superiores a 15,0.

C.2.2.10 Ensayo IL-8 Luc

El ensayo del gen reportero de interleucina-8 (Ensayo IL-8 Luc) hace uso de células indicadoras de IL-8
derivadas de THP-1 (células THP-G8) que permite la medición cuantitativa de la inducción del gen de la
luciferasa por detección de luminiscencia de sustratos de la luciferasa que emiten luz que están bien
establecidos como un indicador de la actividad de la IL-8 y GAPDH en células tras la exposición a
productos químicos sensibilizantes cutáneos. Véase la tabla C.11.

Tabla C.11 – Ensayo IL-8 Luc

Evento clave 3: Activación de células dendríticas epidérmicas

Directriz OCDE OECD TG 442E
Desempeño Exactitud 86 %, Sensibilidad 96 %, Especificidad 41 %.
(Respuesta si/no)
Sistema experimental Línea celular IL-8: línea celular del gen reportero de IL-8 derivado de THP-1
(THP-G8).
Principio del ensayo El ensayo IL-8 Luc utiliza una línea celular del gen reportero de IL-8 derivado de
THP-1, THP-G8, que alberga los genes del naranja estable de Luc (SLO, del inglés
Stable Luciferase Orange) y del rojo estable de Luc (SLR, del inglés Stable Luciferase
Red) bajo el control del promotor de la IL-8 y de la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa GAPDH, respectivamente (1). Esto permite la medición cuantitativa
de la inducción del gen de la luciferasa por detección de luminiscencia de sustratos
de la luciferasa que emiten luz que están bien establecidos, como un medio indicador
de la actividad de la IL-8 y GAPDH en células tras la exposición a productos químicos
sensibilizantes cutáneos [104].
Lectura Cambios de la expresión de la IL-8, una citocina asociada con la activación de células
dendríticas.
Duración de la exposición Exposición de 16 h
Aplicabilidad Aunque el ensayo IL-8 Luc utiliza X-VIVO™ 15 como un disolvente, evalúa
correctamente productos químicos con un coeficiente de reparto n-octanol/agua de
log Kow  3,5 y aquéllos con una solubilidad en agua de aproximadamente 100 µg/ ml.
Sin embargo, los resultados negativos para productos químicos de ensayo que no se
disuelven a 20 mg/ml pueden producir resultados falsos negativos debido a su
incapacidad de disolverse en XVIVO™15. Por tanto, no se deberían considerar los
resultados negativos para estos productos químicos. En el estudio de validación se
observó una tasa alta de falsos negativos para anhídridos. Además, debido a la
capacidad metabólica limitada de la línea celular (8) y las condiciones
experimentales, los pro-haptenos (sustancias que requieren activación metabólica) y
los pre-haptenos (sustancias activadas por oxidación del oxígeno del aire) pueden
dar resultados negativos en el ensayo. El ensayo IL-8 Luc puede clasificar productos
químicos como sensibilizantes cutáneos o no sensibilizantes, sin embargo, en el
momento actual, no proporciona evaluaciones de la potencia sensibilizante [105].
Aplicación a productos No existen datos. El medio de cultivo X-VIVO™ 15, DMSO, o agua se utilizan como
sanitarios disolventes para disolver los productos químicos de ensayo. Se desconoce si el
ensayo funcionará con disolventes de productos sanitarios apolares tales como aceite
de sésamo, aceite de semillas de algodón, o aceite de oliva.

C.2.2.11 Detección rápida de alérgenos genómicos™ 7)

El ensayo de detección rápida de alérgenos genómicos™ (GARD™) es un ensayo basado en células que
utiliza el reconocimiento innato de sustancias extrañas por células dendríticas, con medición en forma
de lectura de multivariables de marcadores genómicos. Tras la estimulación celular, los productos
químicos se clasifican como sensibilizantes cutáneos o no sensibilizantes en función de los perfiles
transcripcionales inducidos. Véase la tabla C.12. El ensayo GARD ha sido validado en un estudio
promovido por la industria[118] y está siendo evaluado actualmente por EURL-ECVAM, y el GARD™ skin
ha recibido una opinión científica ESAC positiva.

7) GARD es la marca comercial de un producto suministrado por SenzaGen AB, Medicon Village (406) adecuado disponible
comercialmente. Esta información se da para comodidad de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de
ISO al producto nombrado. Se pueden utilizar productos equivalentes si se demuestra que conducen a los mismos
resultados.

Tabla C.12 – GARD™

Evento clave 3: Activación de células dendríticas

Directriz OCDE Proyecto 4.106: Nuevo TG: Ensayo GARD™skin: Un método in vitro para la
identificación de sensibilizantes cutáneos basado en una interpretación genómica de
la acción de productos químicos sobre células humanas similares a células
dendríticas (AOP, evento clave 3) [121].
Desempeño Exactitud 94 %, Sensibilidad 93 %, Especificidad 96 % [118]
(Respuesta si/no) NOTA El ensayo GARD™skin se puede complementar también con el ensayo GARD™potency
para obtener la clasificación de productos químicos (por ejemplo, como sensibilizantes
cutáneos fuertes o débiles) de acuerdo con la Reglamentación europea para la
clasificación, etiquetado y envasado de sustancias (CLP, del inglés Classification,
Labelling and Packaging).
Sistema experimental La línea celular del GARD™skin: SenzaCells™ (SenzaGen) es de origen mieloide
humano con características similares a células dendríticas.
Principio del ensayo GARD™skin mide la expresión génica de 200 genes inducida en células SenzaCells™
en respuesta a la exposición química. Los 200 genes, a los que se hace referencia como
“GARD prediction signature” (GPS) incluyen biomarcadores para la activación y
maduración de células dendríticas (evento clave 3), varias vías de señalización de
peligros y receptores de reconocimiento de patrones (evento clave 2), y moléculas
presentadoras de antígeno y vías de proliferación celular (evento clave 4) [116][117].
Lectura El GPS incluye genes mecanísticamente pertinentes implicados en el proceso de
sensibilización cutánea, tales como regulación positiva de moléculas coestimuladoras
e inducción de estrés celular y oxidativo[115]. La expresión génica de los 200 genes en
el GPS se mide utilizando el sistema de análisis Nanostring® a. La expresión génica
resultante se analiza por reconocimiento de patrones, utilizando un algoritmo de
aprendizaje automático basado en un conjunto fijo de muestras de referencia [114].
Cada muestra se clasifica como sensibilizante cutáneo o no sensibilizante sin requerir
ningún juicio subjetivo.
Duración de la exposición Exposición de 24 h
Aplicabilidad GARD™skin es aplicable a un amplio espectro de productos químicos con grupos
funcionales orgánicos diversos y usos previstos incluyendo pre/pro-haptenos y
sustancias con baja solubilidad en agua [113][116].
Aplicación a productos El ensayo GARD™ funciona con vehículos de extracción polares (solución salina) y
sanitarios apolares (aceite de sésamo y aceite de oliva) y se puede utilizar posiblemente para
ensayar extractos de productos sanitarios. En un estudio prueba de concepto para
evaluación de la sensibilización cutánea de extractos de productos sanitarios, se
analizaron cuatro sensibilizantes cutáneos conocidos incorporados en silicona y
poliuretano de calidad médica y controles negativos. Todos los artículos de ensayo se
extrajeron en disolventes polares (solución salina) y apolares (aceite) y se
identificaron correctamente como sensibilizantes cutáneos o no sensibilizantes [119].
a Nanostring® es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta información se da para comodidad
de los usuarios de este documento y no constituye un respaldo de ISO o IEC al producto indicado.

C.3 Discusión

C.3.1 Ensayos validados por la OCDE

Los seis ensayos in vitro[75][79][104]TG 442 validados por la OCDE para la identificación de sensibilizadores
cutáneos químicos, cuyos mecanismos están cubiertos en eventos clave 1, 2 y 3, parecen tener utilidad
potencial para detectar sensibilizantes químicos en extractos de productos sanitarios. Estos ensayos in
vitro son DPRA, KeratinoSens™, LuSens, h-CLAT, U-SENS™, e IL-8 Luc. Sin embargo, dado que el DPRA
utiliza un exceso de producto químico para detectar la reactividad peptídica, puede no ser capaz
posiblemente de identificar niveles bajos de sensibilizantes en extractos diluidos de productos
sanitarios. Estos ensayos se han validado utilizando sustancias de ensayo puras y no mezclas químicas.
Dada la capacidad metabólica limitada de las líneas celulares utilizadas en algunos ensayos in vitro, los
pro-haptenos (es decir, sustancias que requieren activación enzimática, por ejemplo, mediante enzimas
P450) pueden también proporcionar resultados falsos negativos[82][104]. Por último, estos métodos de
ensayo desarrollados para abordar un evento clave específico pueden no ser suficientes, utilizados
individualmente, para decidir inequívocamente sobre la presencia o ausencia de potencial de
senbilización cutánea de productos químicos y se deberían considerar en el contexto de enfoques
integrados tales como los IATA, combinándolos con otra información complementaria.

Considerando el contexto específico de los ensayos de biocompatibilidad de productos sanitarios

utilizados para evaluar productos terminados o materiales, bien directamente o tras su extracción en
disolventes polares y apolares, la aplicabilidad de los ensayos de la OCDE debe confirmarse. Muchos de
tales ensayos pueden tener algunas limitaciones con los disolventes de extracción apolares utilizados
para los productos sanitarios, tales como aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón, o aceite de
oliva. Además del problema de las mezclas y de la incompatibilidad del disolvente, algunos ensayos
validados por la OCDE pueden posiblemente no ser capaces de detectar sensibilizadores cutáneos
potenciales en extractos de productos sanitarios porque a menudo están presentes en concentraciones
extremadamente bajas.

C.3.2 Ensayos genómicos

Los ensayos genómicos enumerados en C.2.2, cuyos mecanismos están cubiertos en eventos clave 2 y 3,
son SenCeeTox®, SENS-IS, EpiSensA y GARD™. Los tres primeros funcionan con tejidos de RhE, mientras
el cuarto está basado en una línea celular patentada. Todos ellos difieren entre si, si bien su común
denominador es la utilización de genes marcadores para identificar los sensibilizantes cutáneos.
Además, todos los ensayos, excepto EpiSensA, han completado con éxito proyectos piloto utilizando
extractos con disolventes polares y apolares de polímeros de productos sanitarios, a los que se les han
añadido pequeñas cantidades de sensibilizantes cutáneos. La exactitud notificada en el conjunto
limitado de muestras para los proyectos piloto ha sido comparable o mejor que la exactitud de los
ensayos validados de la OCDE. Dos de estos ensayos, SENS-IS, y GARDTM, están siendo revisados
actualmente bajo la Test Guidelines Programme Section 4[121] de la OCDE (proyectos relacionados con
ensayos de las directrices sobre efectos sanitarios).

Dependiendo de su exactitud, de su capacidad para funcionar con disolventes polares y apolares, y del
potencial para ser utilizados como métodos “independientes” para ensayos de sensibilización cutánea
de productos sanitarios, estos ensayos pueden ser métodos efectivos para evaluar el potencial de
sensibilización cutánea de productos sanitarios. Sin embargo, su capacidad para detectar sensibilizantes
metálicos catiónicos precisa todavía ser confirmada.

C.3.3 Otros ensayos

El ensayo IL-18 RhE es el ensayo que queda cuyo mecanismo está cubierto en el evento clave 2. Este
ensayo mide la liberación de IL-18 y la viabilidad celular. Los datos de ensayo para el IL-18 RhE son
limitados. Dado que este ensayo utiliza tejidos de RhE, puede posiblemente funcionar con disolventes
polares y apolares de productos sanitarios. Sin embargo, dado que este ensayo no ha sido validado por
la OCDE, ni se ha incluido en ninguno de los estudios comparativos importantes de ensayos de
sensibilización cutánea, su utilización para ensayos de productos sanitarios debería confirmarse.

C.3.4 Consideraciones generales para la validación de métodos in vitro para ensayos de

productos sanitarios
Existen actualmente seis ensayos in chemico e in vitro validados (DPRA, KeratinoSens™, LuSens, h-CLAT,
U-SENS™, e IL-8 Luc.) incluidos en las directrices de ensayo de la OCDE para determinar el potencial de
sensibilización cutáneo de productos químicos, y dos más (GARD™, SENS-IS) [75][79][104] incluidos en el
Test Guideline Programme[121] (Programa de directrices de ensayo) de la OCDE. La inclusión de
cualquiera de estos ensayos de sensibilización cutánea in vitro para ensayos de productos sanitarios
debería estar refrendada por los datos de validación que confirmen la equivalencia/superioridad del
método in vitro comparado con los métodos in vivo actuales utilizados para evaluar el potencial de
sensibilización cutánea de productos sanitarios/extractos de productos sanitarios.

Tal proceso de validación se debe diseñar para permitir las comparaciones del desempeño entre los
ensayos candidatos y para investigar su utilización como ensayos utilizados individualmente o en
combinación dentro de una estrategia de ensayo.

Se deben considerar los puntos generales siguientes para diseñar tales estudios de validación:

– decidir si utilizar o no materiales de referencia sensibilizantes cutáneos o extractos de materiales no

sensibilizantes a los que se añadirán sensibilizantes en concentraciones conocidas;

– identificar clases representativas de productos químicos sensibilizantes cutáneos que pueden estar
presentes en productos sanitarios;

– seleccionar una lista de productos químicos de referencia para construir una base de datos de
validación que contenga características fisicoquímicas y datos históricos de métodos con animales y
seres humanos, así como datos in vitro e in chemico de ensayos de la OCDE validados;

– identificar materiales de control negativo y positivo a utilizar en la validación;

– definir los valores mínimos de fiabilidad (reproducibilidad intra e interlaboratorios) y exactitud

(sensibilidad, especificidad) comparados con los valores de métodos en los que se utilizan seres
humanos y/o animales para validar un ensayo in vitro;

– identificar cualquier propiedad química o física de los materiales del producto sanitario que pueda
causar interferencias de ensayo, y resultados falsos negativos o falsos positivos;

– definir el dominio de aplicabilidad de los ensayos in vitro considerados, por ejemplo, para los
materiales adecuados para la extracción o no adecuados para la extracción (por ejemplo, líquidos,
geles, pastas, vapores, aerosoles, condensados, nanomateriales).

C.4 Conclusiones
Aproximadamente 20 % de los productos químicos en el comercio mundial son sensibilizantes [72]. Sin
embargo, históricamente solo un 1 % de los extractos de productos sanitarios produce resultados
positivos en los ensayos de sensibilización cutánea en animales[94]. Estos hechos, además de la
disponibilidad de ensayos sofisticados de sensibilización cutánea in vitro, han llevado a los expertos a
creer que es inevitable[73] un cambio de paradigma hacia la aceptación de ensayos in vitro para
determinar los datos de sensibilización cutánea de productos sanitarios. Pero para que esto ocurra, será
necesario disponer de estudios de evaluación/validación bien diseñados de los ensayos de
sensibilización cutánea in vitro o de combinación de estos ensayos que resulten lo más altamente
prometedores.

Anexo D (informativo)

Información general sobre ensayos de sensibilización para la

sensibilización cutánea

La sensibilización en el ser humano se produce después de una o múltiples exposiciones epicutáneas y

es iniciada y condicionada por componentes del sistema inmunológico. En primer lugar, el hapteno
(producto químico) ha de penetrar la piel. Luego reacciona con proteínas de la piel para formar
complejos inmunogénicos. Las células de Langerhans en la frontera epitelial presentan el antígeno a
linfocitos específicos que se activan entonces para iniciar las respuestas inmunes. Un pequeño
porcentaje de estos linfocitos son células de memoria de vida larga, y actúan como los activadores
principales durante la fase de provocación. De esta forma, las re-exposiciones subsiguientes pueden
generar reacciones adversas mediadas por linfocinas liberadas por los linfocitos activados y otras
células inflamatorias que son atraídas a la zona de la lesión.

En 1895, Jadassohn utilizó el ensayo de parche para mostrar la alergia por contacto al mercurio en un
paciente clínico. Este enfoque innovador proporcionó la base científica para los ensayos subsiguientes
dirigidos al diagnóstico y predicción de alergias por contacto en el ser humano y en animales. El
desarrollo de ensayos prospectivos/predictivos para evaluar el potencial sensibilizante de productos
químicos siguió al trabajo pionero de Landsteiner y Chase[11], que sustanciaron firmemente la
utilización de cobayas para estudiar la sensibilización cutánea.

En 1969, Magnusson y Kligman[12] exploraron muchas de las variables de los ensayos en cobayas y
presentaron un procedimiento, el GPMT, basado en inyecciones intradérmicas (sin y con adyuvante
completo de Freund), seguido de la aplicación tópica del material de ensayo a la misma zona. El
procedimiento original requiere el tratamiento previo del lugar de ensayo, si el material de ensayo no
es un irritante. Por definición, detecta supuestamente sensibilizadores cutáneos débiles, porque
“débiles” incluye una incidencia cero de efectores de una reacción positiva. Es un ensayo sensible y se
ha utilizado extensamente. La utilización del adyuvante completo de Freund aumenta la sensibilidad del
método de ensayo y puede en algunos casos sobreestimar el potencial sensibilizante del compuesto
objeto del ensayo.

En 1965, Buehler[7] propugnó la utilización del ensayo de parche oclusivo para proporcionar oclusión,
como un método para optimizar la exposición e imitar los procedimientos utilizados en seres humanos
[ensayo de parche en humanos con aplicación repetida (HRIPT, del inglés Human Repeat Insult Patch
Test)]. Se sugirió que el procedimiento del parche oclusivo era sensible y podía predecir con exactitud
la reacción adversa durante la realización de ensayos HRIPT. Los datos presentados demostraron la
superioridad de la oclusión sobre las inyecciones intradérmicas y la aplicación de parches tópicos del
tipo abierto. La estimulación del sistema inmune por adyuvantes no se utilizaba. Este método está
establecido como una técnica que es suficientemente sensible para detectar la mayoría de
sensibilizantes cutáneos débiles y se ha demostrado que es suficientemente flexible para ser utilizada
en el proceso de determinación del riesgo. Sin embargo, el ensayo de parche oclusivo (ensayo de
Buehler) es menos sensible comparado con el GPMT. Véase la referencia [9].

Estos dos ensayos, el ensayo de parche oclusivo en los EEUU y el GPMT en Europa, han sido los más
frecuentemente utilizados para la determinación de la seguridad. El resultado de los ensayos de
sensibilización en cobayas depende de muchos factores relacionados con el animal y factores técnicos
que explican la variación interlaboratorios en los resultados del ensayo, por ejemplo, la cepa del animal,
el sexo, la edad, las condiciones ambientales durante el ensayo, el lugar anatómico del animal utilizado
para la exposición, el método de eliminación del pelo (esquilado/rasurado o la depilación química), el
tipo de diseño del parche, la cantidad del material de ensayo, la calidad de la oclusión, la duración de la
exposición y la lectura de la respuesta del tejido. Se han utilizado e investigado numerosos otros ensayos
y todos ellos tienen sus proponentes. Existen actualmente varios procedimientos que se han reconocido
como aceptables para fines reglamentarios, siempre que el procedimiento se documente de forma
apropiada y sea validado por el investigador. En todos los casos, los procedimientos se deberían efectuar
de acuerdo con las referencias originales. Una lista de otros ensayos se da a continuación.

La referencia [8] da una actualización de los ensayos de sensibilización cutánea.

a) Ensayo con el coadyuvante completo de Freund.

b) Ensayo con coadyuvante administrado separadamente.

c) Ensayo epicutáneo abierto.

d) Ensayo de optimización Mauer.

e) Ensayo en la almohadilla plantar de cobaya.

f) Ensayo de intensificación por contacto acumulado.

g) Ensayo de arañado de la piel (coadyuvante y parche).

h) Ensayo de tumefacción de la oreja de ratón.

El LLNA se prefiere ahora al GPMT y al ensayo con parche ocluido de Buehler para la identificación de
los peligros derivados de productos químicos. El LLNA ha sido aceptado en el año 2010 por la OCDE
como una alternativa independiente a los ensayos actuales con cobayas, y como una mejora que redunda
en beneficio del bienestar de los animales. Véase la referencia [33]. El LLNA se ha validado para la
determinación de la actividad sensibilizante de productos químicos. Véanse las referencias [39] y [40].

La base científica del ensayo es la medición de la incorporación de 3H-metil timidina en linfocitos de

nódulos linfáticos de drenaje de ratones expuestos tópicamente a la muestra de ensayo como una
medida de sensibilización. El ensayo no incluye una fase de provocación. El criterio de valoración de
interés es un índice de estimulación que da la proporción de incorporación de timidina en los nódulos
linfáticos de animales que han sido tratados, comparada con la proporción de incorporación en los
nódulos linfáticos de los animales de control. El ensayo es positivo cuando el índice de estimulación es
superior a 3 (Is  3). Una evaluación intralaboratorio e interlaboratorios del LLNA ha demostrado que
en ambos casos se obtiene una relación dosis-respuesta reproducible. Véanse las referencias [16],[17],
[21], [25], [26], [28] y [32]. Sin embargo, se han notificado dificultades para diferenciar entre sustancias
irritantes y alergénicas cuando se utiliza el LLNA. Véanse las referencias [18], [25] y [28]. Esto significa
que el LLNA puede dar resultados positivos falsos con irritantes y puede sobreestimar la alergenicidad
de sustancias que posean ambas propiedades irritantes y alergénicas. Véase la referencia [16]. Sin
embargo, el LLNA posee ventajas comparado con los ensayos en cobayas, tales como una duración más
corta del ensayo, un criterio de valoración más objetivo, menor cantidad de sustancia requerida para el
ensayo, y no son precisas las inyecciones del coadyuvante completo de Freund. Son posibles mejoras del
procedimiento de ensayo utilizando análisis de marcadores de la activación celular y citometría de flujo.
Véanse las referencias [23] y [24]. No se ha determinado si tales mejoras se pueden implementar en la
práctica en los protocolos LLNA normalizados para la toxicología sistemática. Por el contrario, el LLNA
permite una elección más limitada de los vehículos de ensayo; la mayoría de los estudios han utilizado
una mezcla de acetona y aceite de oliva. Un estudio reciente muestra una variabilidad de los resultados
cuando se utilizan vehículos diferentes. Véase la referencia [27]. Por último, no es posible con el LLNA
estudiar la fase de provocación ni los patrones de reactividad cruzada porque los animales son
sacrificados después del tratamiento de inducción antes de la extirpación de los nódulos linfáticos.

El ensayo del nódulo linfático poplíteo (PLNA, del inglés Popliteal Lymph Node Assay) utilizando la
administración subcutánea en la almohadilla plantar (véanse las referencias [19], [22] y [31) es una
alternativa al ensayo de nódulo linfático local. En el ensayo PLNA, además de la medición directa de la
activación de los nódulos linfáticos, se pueden utilizar antígenos reporteros para una clarificación más
completa de la inmunomodulación causada por el producto químico objeto de la investigación. Véase la
referencia [15].

El proceso de determinación del riesgo no se debería basar en un solo modelo o enfoque, sino que se
debería realizar atentamente para garantizar una seguridad máxima al consumidor. Generalmente, esto
implica optar por modelos experimentales tanto en animales como en seres humanos. Debería existir
flexibilidad suficiente en la elección de modelos y enfoques, en tanto que la justificación de tal elección
esté documentada y/o validada.

Los ensayos que muestran resultados negativos en cobayas, cuando se efectúan de forma adecuada,
pueden generalmente ser definitivos si la concentración de ensayo presenta un factor de seguridad
suficiente con respecto a las condiciones de utilización. Sin embargo, se debería evitar clasificar a los
materiales de ensayo basándose exclusivamente en la incidencia y/o gravedad de la respuesta, sin
prestar la debida consideración a las eventuales condiciones de utilización del producto.

El riesgo, es decir, la incidencia y la gravedad de la reacción alérgica al producto, se determina

principalmente evaluando los cuatro factores siguientes: la potencia sensibilizante del alérgeno
químico, la cantidad del mismo en el producto, la biodisponibilidad y las condiciones de exposición. Las
potencias sensibilizantes relativas de los productos químicos se pueden definir en términos de la
concentración de inducción mínima requerida para inducir un nivel dado de sensibilización: cuanto
menor sea esta concentración tanto mayor será la potencia del sensibilizante. Véanse las referencias [6]
y [30]. Se ha demostrado que se observó una incidencia significativa de dermatitis alérgica por contacto
en usuarios, cuando el nivel residual del alérgeno en el producto era superior a su concentración de
inducción mínima obtenida utilizando el GPMT. Véase la referencia [14].

Por el contrario, los ensayos predictivos de mezclas y productos están mucho menos validados y se
pueden efectuar después de ensayar los ingredientes del producto. Por consiguiente, el diseño y la
interpretación del resultado del ensayo están sujetos a incertidumbre, pero varios ejemplos
documentan esta posibilidad. En experimentos con animales utilizando extractos en acetona de una
sudadera que había causado dermatitis de contacto en seres humanos, se demostró la presencia de
alérgenos [fosgeno (clorofenil) hidrazonas]. Véase la referencia [11]. En otro caso, en el que
experimentos con animales utilizando extractos en acetona/cloroformo de botas de goma, habían
demostrado causar dermatitis de contacto en seres humanos, se identificaron eventualmente
mercaptobenzotiazol y disulfuro de di(benzotiazol 2-ilo) como los alérgenos causantes. Véase la
referencia [10]. Se demostró claramente la importancia de utilizar un disolvente orgánico apropiado.
Los extractos obtenidos con un disolvente orgánico indujeron sensibilización cutánea en cobayas, no así
los extractos en solución salina.

La referencia [4] adopta el mismo procedimiento de preparación de la muestra con disolvente orgánico,
seguido de evaporación del disolvente para obtener el residuo, y el procedimiento de determinación del
riesgo se efectúa comparando la masa porcentual del residuo del material con la dilución porcentual
mínima del residuo (mezcla) que logró todavía inducir sensibilización cutánea en animales.

Los métodos in vitro para los ensayos de sensibilización cutánea no están todavía disponibles para su
utilización de rutina, pero a tenor de la nueva reglamentación en Europa que prohíbe la utilización de
ensayos con animales para cosméticos, parece probable que aparecerán disponibles estrategias
novedosas para la identificación de sensibilizantes cutáneos. Véase el anexo C.

Bibliografía

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y funcionamiento del Reglamento (UE) 2017/745

Esta norma europea se ha preparado bajo M/575 para proporcionar un medio voluntario de
conformidad con los Requisitos Generales de Funcionamiento y Seguridad del Reglamento (UE)
2017/745 de 5 de abril de 2017 sobre los productos sanitarios [OJ L 117] y para los requisitos de sistema
o proceso incluyendo los relativos a los sistemas de gestión de la calidad, gestión del riesgo, sistemas de
vigilancia postventa, investigaciones clínicas, evaluación clínica o seguimiento clínico postventa.

Una vez esta norma se cite en el Diario Oficial de la Unión Europea bajo este Reglamento, el
cumplimiento con los capítulos normativos de esta norma dados en la tabla ZA.1 y la aplicación de la
edición de los capítulos de esta norma a las que se hace referencia en la tabla ZA.2 confiere, dentro de
los límites del campo de aplicación de esta norma, presunción de conformidad con los correspondientes
Requisitos Generales de Funcionamiento y Seguridad y de los Reglamentos de la AELC asociados.

Si hay una definición en esta norma diferente de una definición del mismo término establecida en el
Reglamento (UE) 2017/745, se deben las diferencias indicar en este anexo Z. Para el propósito de uso
de esta norma en apoyo de los requisitos establecidos en el Reglamento (UE) 2017/745, las definiciones
establecidas en este Reglamento prevalecen.

Como esta norma europea es una adopción de una norma internacional, el alcance de esta norma puede
diferir del alcance de la Reglamentación Europea que apoya. Dado que el alcance de los requisitos
reglamentarios aplicables difiere de un país a otro y de una región a otra, la norma solo puede cumplir
los requisitos reglamentarios europeos en la medida del alcance de la Reglamentación europea sobre
productos sanitarios (UE) 2017/745.

NOTA 1 Cuando se haga referencia en un capítulo de esta norma al proceso de gestión de riesgos, este proceso de gestión de
riesgos necesita ser conforme con el Reglamento (UE) 2017/745. Esto significa que los riesgos tienen que reducirse
“tanto como sea posible”, “al nivel más bajo posible”, “tanto como sea posible y apropiado”, “eliminar o reducir tanto
como sea posible”, “eliminar o reducir tanto como sea posible”, “reducir o minimizar tanto como sea posible”, o
“minimizarse” de acuerdo con la redacción del requisito general de funcionamiento y seguridad correspondiente.

NOTA 2 La política del fabricante para determinar el riesgo aceptable debe ser conforme a los requisitos de funcionamiento y
seguridad 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22 del Reglamento.

NOTA 3 Cuando un requisito general de funcionamiento y seguridad no aparece en la Tabla ZA.1, esto significa que no está
abordado por esta norma europea.

Tabla ZA.1 – Correspondencia entre esta norma europea y el Anexo I del Reglamento (UE)
2017/745 [OJ L 117] y a los requisitos de los sistemas o procesos, incluidos los relativos a los
sistemas de gestión de la calidad, la gestión de riesgos, los sistemas de vigilancia postventa, las
investigaciones clínicas, la evaluación clínica o el seguimiento clínico postventa

Requisitos de seguridad y Capítulo(s)/apartado(s) de Notas

funcionamiento del Reglamento esta EN
(UE) 2017/745
10.1 [(a) y (b)] 4, 5, 6 y 7 El ER 10.1[(a) y (b)] están cubiertos
solo parcialmente por este documento,
ya que la norma no establece requisitos
sobre el diseño, la fabricación y el
envasado. No obstante, esta norma
proporciona un medio para evaluar la
sensibilización cutánea a las sustancias
utilizadas en la fabricación de
productos sanitarios. No se contemplan
otras formas de toxicidad e
inflamabilidad.
10.2 4, 5, 6 y 7 El ER 10.2 está cubierto solo
parcialmente por este documento, ya
que la norma no establece requisitos
sobre el diseño y la fabricación. No
obstante, esta norma proporciona un
medio para evaluar la sensibilización
cutánea a las sustancias utilizadas en la
fabricación de productos sanitarios.
10.4.1 (primer párrafo) El ER 10.4.1(primer párrafo) está
cubierto solo parcialmente por este
documento, ya que la norma no
establece requisitos sobre el diseño y la
fabricación. No obstante, esta norma
proporciona un medio para evaluar la
sensibilización cutánea a las sustancias
utilizadas en la fabricación de
productos sanitarios. No se contemplan
otras formas de toxicidad e
inflamabilidad.

NOTA Esta parte de la Norma EN ISO 10993 hace referencia a la Norma ISO 10993-1, que a su vez hace referencia a la Norma
ISO 14971. En Europa, debe asumirse que la referencia a la Norma ISO 14971 es a la Norma EN ISO 14971:2020.

Nota general: La presunción de conformidad depende de que también se cumplan las partes
pertinentes de la serie de Normas ISO 10993.

Tabla ZA.2 – Normas aplicables para conferir la presunción de conformidad

descrita en el presente anexo ZA

Columna 1 Columna 2 Columna 3 Columna 4

Referencia en el Edición de la norma Título Edición de la
capítulo 2 internacional correspondiente
norma europea
ISO 10993-1 ISO 10993-1:2018 Evaluación biológica de productos EN ISO 10993-1:2020
sanitarios. Parte 1: Evaluación y
ensayos mediante un proceso de
gestión del riesgo.
ISO 10993-2 ISO 10993-2:2006 Evaluación biológica de productos EN ISO 10993-2:2006
sanitarios. Parte 2: Requisitos relativos
a la protección de los animales.
ISO 10993-12 ISO 10993-12:2021 Evaluación biológica de productos EN ISO 10993-12:2021
sanitarios. Parte 12: Preparación de
muestras y materiales de referencia.
ISO 10993-18 ISO 10993-18:2020 Evaluación biológica de productos EN ISO 10993-18:2020
sanitarios. Parte 18: Caracterización
química de materiales de productos
sanitarios dentro de un proceso de
gestión de riesgos.

Los documentos enumerados en la columna 1 de la tabla ZA.2, en su totalidad o en parte, están

referenciados normativamente en este documento, es decir, son indispensables para su aplicación. El
logro de la presunción de conformidad está sujeto a la aplicación de la edición de las normas
enumeradas en la columna 2 de la tabla ZA.2.

ADVERTENCIA 1: La presunción de conformidad solo será válida mientras se mantenga la referencia a

esta norma europea en la lista publicada en el Diario Oficial de la Unión Europea. Los usuarios de esta
norma deberían consultar frecuentemente la última lista publicada en el Diario Oficial de la Unión
Europea.

ADVERTENCIA 2: Los productos incluidos dentro del campo de aplicación de esta norma pueden estar
afectados por otra legislación de la Unión.

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