Clase PCR III: RT-PCR, PCR cuantitativas, y otros diseños

2017- Docente: Adriana Krapp

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ADN molde
PCR

Productos largos de
longitud variable

Producto delimitado
por los cebadores

Después de 30 ciclos  10 12 copias del producto 2

delimitado por los cebadores- PCR de punto final
 Para qué se usa la PCR?? Cuáles son sus aplicaciones??

Diagnóstico de enfermedades infecciosas con alta especificidad y sensibilidad

(antes de que aparezcan los anticuerpos): por virus (sida, hepatitis B, hepatitis
C, influenza), determinaciones de carga viral (pronóstico, respuesta
terapéutica); tuberculosis, etc. No es necesario que haya organismos vivos.
Diagnóstico de cáncer: leucemias, cancer de próstata (detección de
marcadores, expresión de genes específicos), etc.
Detección de enfermedades hereditarias y prenatales: distrofia muscular de
Duchenne, fibrosis quística, hiperlipidemias, enfermedad celíaca, etc
Medicina forense: identificación de individuos
Filiación: pruebas de paternidad
Tipificación de tejidos para determinar compatibilidad en transplantes
Determinación de bacterias patógenas en alimentos
Paleontología, etc,etc.
Investigación : Clonado de genes, generar mutaciones puntuales o deleciones,
secuenciación, estudios de expresión de genes, amplificación de secuencias
desconocidas, etc, etc. 3
 Si el molde/templado es un RNAm específico ?? El RNA por sí mismo no puede
servir como templado, hay que convertirlo en cDNA y luego amplificarlo
esto es la RT-PCR: la retrotranscripción de un RNAm seguida de PCR
más sensible que otras técnicas usadas para detectar RNAm

- diagnóstico clínico de enfermedades por retrovirus (que tienen un genoma de RNA,

ej. virus hepatitis C),
- detección de transcriptos específicos que estarían indicando una infección activa,
cronicidad (cuantificación),
- cuando dan negativos los anticuerpos: detectar ARN etc.
- para hacer estudios de la expresión de un gen específico en un tejido determinado
(cuantificación), etc.

PREPARACION DE LA RT-PCR
Degradado

1) Obtener el RNA: es el paso crucial (especialmente si la cantidad de

material biológico es limitante o el transcripto de interés es de baja
abundancia) no debe estar contaminado con ADN porque va a RNAm
competir con el RNA dando un resultado erróneo.

2) Tratar con Dnasa e inactivarla por

calentamiento previo a la
retrotranscripción
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Que cantidad de RNA se precisa para
hacer una RT?? 1 ug de RNA
citoplasmático es más que suficiente y
no es estrictamente necesario aislar el
RNAm, podemos evitar ese paso que
es trabajoso.
1-2 ul de
muestra
Hecha la preparación se puede
cuantificar por espectrofotometría:
Abs 260 nm (A260 nm=1 equivale a 40
ug ARN/litro) en un espectrofotómetro.

La pureza del RNA se puede estimar con la

A260 / A280 (disuelto en agua o buffer baja sal
a pH neutro, este cociente es de 1.9-2.1). Si
hay proteínas contaminantes absorben a
280 nm y los fenoles a 230 nm.

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 Retrotranscripción

95º-10 min para

desnaturalizar
el híbrido cDNA-RNA
e inactiva la transc. Reversa

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6
RETROTRANSCRIPCION
1) elegir la transcriptasa reversa
2) el cebador que vamos a usar para el RNA
3) las condiciones óptimas para esta reacción (puede variar en su eficiencia desde 10-
90%)

Transcriptasa reversa: es una polimerasa de DNA dependiente de RNA

- AMV (avian mieloblastosis virus) Tóptima 42 ºC esta enzima posee actividad RNasa H
que remueve rNTPs desde cualquier nick llevando a la degradación del templado de
RNA. Actualmente se comercializa una AMV que tiene mutaciones que eliminan la
actividad RNasaH y también tienen mayor estabilidad térmica (55ºC).

- MMLV (Moloney murine leukemia virus) Tóptima 37 º C

USD
AMV Reverse Transcriptase P/RNA de alta estructura 2ría. Tº incubación hasta 58º. 300 u 194.6 Promega
AMV Reverse Transcriptase P/RNA de alta estructura 2ría. Tº incubación hasta 58º. 600 u 372.3 Promega

M-MLV Reverse Transcriptase P/transcriptos largos. 10000 u 124.7 Promega

M-MLV Reverse Transcriptase P/transcriptos largos. 50000 u 480.0 Promega

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Oligonucleótidos para RT: hay tres tipos de primers que se pueden usar, depende de cuál
es el propósito de hacer una RT-PCR

I) oligo dT12-18 se une al tallo de poliA en

el extremo 3’ del RNAm. Se usa si se
desea obtener el “full length cDNA” (cDNA
de longitud completa), o si el RNAm es
escaso, de pocas copias. Anchored oligo
dT: asegura que el primer se una donde
comienza la cola de poliA. Aumenta el
rendimiento. Se obtiene cDNA de todos
los RNAm.

II) N6: hexanucleotidos al azar

(“random” NNNNNN) [random hexamer
oligont] que pueden unirse al RNAm en
cualquier sitio complementario: se obtienen
cDNAs de tamaño variado. Si el RNAm
forma estructuras secundarias se obtienen
mejores resultados con N6 o si la región a
amplificar es más cercana al 5’. Se usa
para RNAm bacterianos (no tienen
poliA). Amplifica también RNAt y RNAr. Se
obtiene cDNAs de todos los RNA.

III) oligonucleótido específico : se une al

RNAm de interés. Con fines diagnósticos
usar oligo específico. Se obtiene el cDNA
específico.

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Podemos hacer la RT y PCR :
En Dos pasos (two steps) Paso 1) Se hace la RT con el primer reverso elegido.
Después de la RT se usa una pequeña alícuota de la retrotranscripción para
hacer la PCR. Paso 2) Hacer la PCR agregando los primers reverso (por lo
general distinto al anterior) y directo. Ventaja: Puedo hacer distintas PCRs con
distintos primers porque el cDNA total se guarda (freezer)

En un paso (one step): Se agregan los primers reverso y forward (específicos) en

la mezcla para hacer la RT, se hace la RT y se prosigue en el mismo tubo con la
PCR. Se preparan los controles correspondientes. Se siguen los pasos A, B y C

One step: Se usa

mucho para el
diagnóstico pues
se evitan
contaminaciones.

Transcriptasa reversa y DNA polimerasa

Es importante al hacer la RT-PCR que no haya contaminación
con ADN porque daría falsos positivos!!

Si el gen no tiene intrones: es necesario tratar el RNA con

una DNasa libre de RNasa previo a la RT (porque no vamos a
distinguir si hay contaminación por el tamaño del producto),
Ej: genes bacterianos no tienen intrones, virus de RNA, o
transcriptos de RNA de virus integrados en un genoma. El
tratamiento con DNasa se debe hacer para evitar los falsos
positivos.

- Se trata el RNA con DNasaI por 30 min a 37 º previo a la RT

- Inactivación de la DNasa (dos formas)
1) el RNA puede ser extraído con fenol/cloroformo
con riesgo de perder algo de RNA
2) desnaturalización de la DNasaI por calor
(inactivación) a 75º durante 5 min.

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Estrategias para amplificar RNAm (y no DNA genómico y/o RNAhn)
Si el gen tiene intrones: diseñamos oligos en dos exones distintos
(generalmente sucesivos) porque nos va a indicar si había ADN contaminante al
analizar el tamaño del fragmento obtenido.

Gen con intrones: diseñamos oligos en exones sucesivos

Producto más
largo !!!!!

Producto del
tamaño
esperado

Los tamaños de los productos nos van a indicar si hubo

contaminación con ADN genómico. 11
CONTROLES cuando hacemos la RT-PCR

1) Control con RNA sin retrotranscribir: para estar seguros de que no hay
contaminación con ADN (debe dar negativo).

2) Controles de la PCR usuales es decir un control negativo (sin ADNc), (puede

hacerse un control positivo con un cDNA que tengamos clonado).

3) En el caso de que estemos evaluando expresión (RT-PCR semicuantitativa) :

Control con un gen endógeno cuya expresión no varíe ya que permite evaluar
la calidad de la preparación de RNA, la eficiencia de la transcripción reversa,
y de la amplificación dando una referencia de las variaciones tubo a tubo.
Se deben ajustar los ciclos de la PCR para trabajar en la etapa donde la
amplificación está en una etapa lineal, no llegar al plateau.

Al hacer la electroforesis en un gel de agarosa tenemos que obtener la banda del

tamaño esperado. (Si el RNAm tiene splicing alternativo podríamos encontrar
varios productos de PCR).

Podemos cuantificar un determinado RNAm en una muestra?? SI !

la cuantificación del RNAm es útil en los casos que es necesario hacer
estudios de expresión, conocer la carga viral, controlar la respuesta
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terapéutica a drogas, etc.
RT-PCR semicuantitativa :
Se hace la amplificación en el mismo tubo con 2 pares de cebadores: 1) para el gen que
estamos investigando y 2) para el control endógeno cuya expresión no cambia (gen
housekeeping). Luego se hace la corrida electroforética, se toma una imagen del gel y
luego una densitometría. Obtenemos una cuantificación que es relativa a un control no
tratado. El control endógeno sirve para normalizar (controlar las variaciones por tubo,
etc.) ,debe ser amplificado con la misma eficiencia y estar presente en concentración
similar a la secuencia target (!!!) Compite por los reactivos pero no por los primers. Se
deben ajustar los ciclos de la PCR para trabajar en la fase exponencial de la misma.

RT-PCR cuantitativa competitiva: se

agrega un competidor (RNA) de
concentración conocida que también se
retrotranscribe y amplifica con los
mismos primers, pero debe dar un
tamaño ligeramente distinto para poder
identificarlo. Compite con los primers, y
luego se determina la concentración por
comparación con la del competidor. Es
impráctica por eso no se hace.

La cuantificación exacta de los

ácidos nucleicos (RNA o DNA) se
hace por la técnica de real time
(PCR en tiempo real) 13
REAL TIME PCR: PCR en tiempo real o qPCR (PCR cuantitativa o PCR cinética)

Combina la PCR tradicional (de punto final) con moléculas fluorescentes

que se unen al amplicón (producto de la PCR) permitiendo detectarlo en el
mismo tubo de reacción (sistema homogéneo).

Se unen los pasos de amplificación y detección para el producto

amplificado sin necesidad de hacer una electroforesis en gel (evita la
manipulación del producto y las contaminaciones en el laboratorio)
Es una técnica rápida, precisa, reproducible, etc.

Con ADN o ARN (cDNA). Involucra moléculas reporteras que fluorescen

a medida que aparece el producto de PCR mostrando la cantidad
de ADN producido en cada ciclo. La fluorescencia es proporcional
a la cantidad de producto.

Los tiempos en la PCR son pequeños y los productos 60-200 pb (para

asegurar una buena eficiencia): MAS RAPIDA
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Químicos fluorescentes de unión al ADN: pueden ser inespecíficos
(fluoróforos de unión al ADN doble hebra p.ej Syber Green) o
específicos (sondas u oligonucleótidos fluorescentes)
En la real time se determina el Nº del ciclo en el cual un producto de PCR es detectado, o
sea cuando supera un nivel “umbral” por arriba del background. Este umbral se llama
Threshold y cada muestra tiene un Threshold cycle (Ct) o sea cuando cruza ese umbral que
depende de la cantidad inicial de ADN blanco. En la fase de amplificación exponencial la
cantidad de ADN producido y la fluorescencia tienen una relación lineal.
El Ct es inversamente proporcional al Nº de copias del templado.

> nº de copias iniciales < Ct

< nº de copias > Ct

Ct

Graficando la fluorescencia detectada durante el experimento de qPCR en función

de los ciclos se obtiene una curva sigmoidea. Se realizó con diluciones 1/10 de un
templado, si diluyo la muestra necesito más ciclos para ver señal. 15
 Si graficamos el Ct en función del log Nº de
copias iniciales tenemos una relación lineal

Ct
Log Nº Copias

Equipos: sistema de iluminación láser y sistema para hacer el ciclado térmico anexado a una PC.

Tubos (strips) o placas multipocillos (multiwells) o

capilares
Primeros ciclos (3 – 15) hay poco cambio en la fluorescencia, línea de base 20
(background). Luego empieza a aumentar significativamente con cada ciclo.

El umbral o threshold se fija en la parte lineal de la curva logarítmica, cuando hay un

aumento significativo de la fluorescencia por arriba de la línea de base calculada (fit point
method). Otra forma es con el método de la segunda derivada (se hace la transformación
matemática de la curva de amplificación a una 2da derivada y el Ct es el 20% de la altura del
pico). El método para calcularlo depende de la plataforma de qPCR. En algunos equipos el
software del instrumento usualmente setea el threshold a 10 veces la desviación estándar de la
fluorescencia de la línea de base.

El Ct o Cp
(punto de cruce)
para cada
reacción
de amplificación
es cuando
cruza ese
umbral .

Se hace la corrección
de la línea de base
llevando todas las
muestras a un punto
de iniciación igual.
NTC (no template control) es el control sin ADN