Práctica 5: Métodos de siembra y cultivo microbiano

Objetivos:
 Conocer y aplicar los distintos métodos de siembra, para el cultivo y
aislamiento microbiano
Antecedentes
Métodos de siembra:
 Inmersión: Se introduce el asa en punta con el inóculo en un tubo conteniendo
agar en columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma paralela asegurándose
que el inóculo quede distribuido a lo largo de toda la punción. Se retira el asa y se
quema. Esta técnica permite conocer el comportamiento de los microorganismos
frente al oxígeno y su movilidad
 Estrías (tubo): Se siembra el cultivo en la superficie del agar inclinado, mediante
un tubo de ensayo, seguidamente se recubre toda la superficie con el asa
bacteriológica, esterilizada y contenida con el material que se sembrará,
realizando estrías angostas. Se comienza por el lado más profundo de la superficie
inclinada y se concluye la estría en la parte más cercana a la parte inicial del tubo
 Agotamiento en estrías: Es el método más sencillo y el más empleado para la
obtención de cultivos axénicos, el cual está formado por una única especie
o cepa. Para este procedimiento se emplea un asa de siembra y se coge una
muestra de la población mixta y luego se procede a hacer estrías sobre la
superficie de un medio sólido listo en una placa Petri. Según se va realizando las
estrías en forma de zigzag con la ayuda del asa se van colocando en la superficie
del medio menos microorganismos. Luego se flamea el asa y se palpa en la zona
donde se realizaron las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma
técnica en la parcela de medio donde no se había sembrado. Rehaciendo el
proceso anterior más veces se logrará la separación de células.
 Agotamiento: Para este método se utiliza un asa de siembra, después de su
esterilización se recoge una porción de la muestra a inocular. Para posteriormente
extenderlo en forma de zig-zag a lo largo de toda la placa y en un solo sentido.

Incubadora
Las incubadoras son dispositivos, los cuales tienen como principal función, crear un
ambiente con temperatura adecuada para el crecimiento o reproducción, así como,
añadir humedad a dicho ambiente.
En el estudio de la microbiología o análisis de muestras, es indispensable contar con
una incubadora. Este dispositivo permite controlar las diferentes condiciones que son
necesarias para que un cultivo microbiológico o los cultivos celulares, se desarrollen. El
rango de temperatura que manejan las diferentes incubadoras es de 20ºC a 65ºC,
aunque en muchas ocasiones pueden llegar hasta los 100ºC.
Una de sus principales características y aplicaciones son el control del dióxido de
carbono, gas antioxidante generador de la fotosíntesis. Otra de sus características es el
controlar la velocidad de vibración, la cual es medida en revoluciones por minuto.
Estas incubadoras son esenciales para la investigación de biología celular,
microbiología, biología molecular, tanto para cultivos de bacterias como de células
eucariotas.

Medios utilizados:
 MacConkey: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram
negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir de
muestras clínicas, aguas y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las
peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el
cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte
de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de
la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la
precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de
lactosa producen colonias incoloras.
 Eosina azul de metileno: Este medio (también denominado E.A.M.) es
utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido
desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae. Es nutritivo por la presencia de
peptona que favorece el desarrollo microbiano. La diferenciación entre
organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son
incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno;
éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias
Gram positivas. El agar es el agente solidificante. Muchas cepas de Escherichia
coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que
utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia a
 Sangre: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de
numerosos microorganismos. Al ser suplementado con sangre
ovina, permite el crecimiento de microorganismos nutricionalmente
exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis.:
 Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo
de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la
oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de
color verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado por los
microorganismos. Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se
observa un halo claro, brillante alrededor de la colonia en estudio.
Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio
de cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor
de la colonia en estudio.
 Verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para
el aislamiento de Salmonella spp., excepto Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi a partir de muestras clínicas, alimentos, y
otros materiales de importancia sanitaria. En el medio de cultivo, la
pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de
nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los
hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de
pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de
la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo
que inhibe fundamentalmente el desarrollo de flora Gram positiva y
de algunos microorganismos Gram negativos. Interpretación de
resultados
Bacterias que fermentan la lactosa y/o sacarosa: colonias amarillo-
verdosas, rodeadas por un halo de color amarillo verdoso del medio
de cultivo. Bacterias que no fermentan la lactosa y/o sacarosa:
colonias de color blanco rosadas o transparentes rodeadas por un
halo rojizo del medio de cultivo.