PRÁCTICA 2
COCOS GRAM POSITIVOS
(Géneros Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Micrococcus)
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico
IV Semestre Bacteriología General
Resultados de Aprendizaje
• Conocer los Cocos Gram Positivos en los aspectos relacionados con taxonomía, propiedades
importantes, fisiología, características antigénicas, factores de patogenicidad y virulencia,
metabolismo, diagnóstico, prevención de la enfermedad y promoción de la salud.
• Aplicar los protocolos establecidos para el aislamiento, identificación y diagnóstico de los Cocos
Gram positivos.
• Utilizar las herramientas técnicas y tecnológicas en el laboratorio para el diagnóstico.
• Identificar otras funciones de los cocos Gram Positivos como la relación con el microbioma
humano en ambientes como la piel y leche materna entre otros. Resaltar el uso de algunas de
estas bacterias en la industria alimentaria.
Staphylococcus aureus en agar sangre a contra
luz para observar la hemólisis beta.
Género Staphylococcus: Taxonómicamente hacen parte
de la familia Micrococcaceae, descomponen el peróxido
de hidrógeno debido a que poseen la enzima catalasa,
característica que los diferencia del género
Streptococcus.
Pueden causar infección cuando ingresa al cuerpo a
través de una cortadura, una úlcera, un catéter o un tubo
de respiración. La infección puede ser menor y local
como un forúnculo o puede ser más seria como una
endocarditis.
Cocos gram positivos 100x
El MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meticilina)
es un tipo común de bacteria que normalmente vive en la
piel y algunas veces en las fosas nasales; no responden
a los antibióticos normalmente utilizados.
Género Streptococcus: la clasificación de Lancefield de
los Streptococcus se efectúa tomando como base el
polisacárido C de la pared bacteriana y se mencionan
con las letras A, B, C, D, F y G; otra clasificación está
dada por el tipo de hemólisis, estructura antigénica y
propiedades fisiológicas.
•Beta hemolíticos: especialmente los grupos A, B, C, G y
F, de los cuales el A es el más importante.
•Alfa hemolíticos: Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus del grupo viridans, Streptococcus grupo D
y Enterococcus.
•Gamma hemolíticos: Streptococcus grupo D,
Streptococcus del grupo viridans
Se aíslan frecuentemente de cuadros infecciosos
humanos; en animales pueden producir procesos
sépticos, abortos y mastitis; en alimentos, aguas de
consumo humano y suelos pueden ser indicadores de
contaminación fecal. En la industria, son esenciales en
procesos de producción de lácteos y cárnicos entre
otros.
El género Enterococcus (E.): Los miembros de este
género eran clasificados como Streptococcus del
Grupo D hasta 1984 cuando los análisis de ADN
genómicos indicaron que un género separado era más
apropiado.
Son habitantes normales del tubo digestivo y de las
vías biliares, ocasionalmente de vagina y uretra
masculina. Se aíslan de procesos sépticos son la
segunda causa de infecciones asociadas a servicios
de salud (IASS) y de heridas.
Además se aíslan de alimentos, aguas de consumo
humano y suelos, son indicadores de contaminación
fecal.
Los Enterococcus presentan resistencia a las
penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos y
vancomicina.
Género Micrococcus se encuentran en ambientes
diversos, incluyendo agua y suelo, generalmente es un
organismo comensal o saprofítico, aunque podría ser
también un patógeno oportunista, particularmente en
pacientes con inmunodeficiencia, sin embargo también
hace parte de la microbiota cutánea.
Son bacterias esféricas de diámetro comprendido entre 0,5
y 3 micrómetros que típicamente aparecen en
tétradas. Poseen una gruesa pared celular que puede
abarcar tanto como el 50% del material celular. Su genoma
es rico en guanina y citosina(GC), típicamente en
porcentaje del 65 al 75% de contenido GC. A menudo
contienen plásmidos (de tamaño comprendido entre 1 y
100 MDa) que proporcionan al organismo características
útiles. Algunas especies de Micrococcus
sobreproducen riboflavina cuando crecen sobre medios
orgánicos tóxicos tales como piridina
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
Muestras bacterianas de los géneros Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Micrococcus.
Medios de Cultivo Reactivos Materiales
Caldo nutritivo, agar nutritivo, Aceite de inmersión, solución Asa recta y curva, gradilla,
agar sangre, agar chocolate, agar salina isotónica estéril, Discos elementos de protección personal,
Azida de Sodio, Agar Baird-Parker, de identificación: bacitracina, láminas portaobjetos, encendedor,
Agar Salado Manitol, plasma de optoquina, novobiocina, microscopio, papel Japón, frasco
conejo, agar Dnasa, caldo cefinasa, HCl 1N, H2O2 al 3%, para desecho de materiales, toallas
Mueller-Hinton, agar bilis desoxicolato de sodio al 10%, de papel, cinta de enmascarar,
esculina, caldo NaCl al 6.5%. coloración de Gram, jabón líquido cepas bacterianas,
hipoclorito de sodio marcador para vidrio.
Cabina de flujo laminar, incubadoras, microscopios.
Staphylococcus Streptococcus Enterococcus
Tinción de gram, Prueba de la catalasa, Tinción de gram, Siembra por agotamiento Siembra por agotamiento Tinción de gram, Prueba de la catalasa,
Prueba de la coagulasa Tinción para capsula, en Agar Sangre, incubar en Agar Azida, incubar a
Prueba de la a 37°C por 18 a 24 37°C por 18 a 24 horas,
catalasa, horas, en aerobiosis. en aerobiosis. Prueba Bilis esculina, inocular el
PRUEBAS PARA COCOS GRAM POSITIVOS
Siembra por agotamiento en Agar Sangre, incubar a microorganismo en un tubo de agar bilis
37°C por 18 a 24 horas, en aerobiosis. esculina por estrías, incubar a 37º C por 24 a
Susceptibilidad a la Susceptibilidad al Sensibilidad a la 48 horas, en aerobiosis.
bacitracina, sembrar Trimetropin Sulfa SXT, optoquina, siembra
Siembra por Siembra por por agotamiento en sembrar por masiva en agar sangre,
agotamiento en Agar agotamiento en Agar agar sangre con un agotamiento en agar y colocar en el centro de Prueba Tolerancia al NaCl al 6.5 %, Inocular
Baird-Parker, incubar Salado Manitol, Incubar hisopo estéril o un sangre con un hisopo la siembra el disco de en el tubo el microorganismo, incubar a 37º
a 37°C por 18 a 24 24 a 72 horas a 37°C, asa Colocar un disco estéril o un asa Colocar optoquina de 5 μg/ml o C por 24 a 48 horas con una atmósfera del 5
horas, en aerobiosis. en aerobiosis de Bacitracina (A) de un disco de SXT Incubar menores. Incubar a 37°C a 10% de CO². Se utiliza como indicador el
0,04 Incubar a 37°C a 37°C por 24 a 48 por 24 a 48 horas en púrpura de Bromocresol.
por 24 a 48 horas en horas en aerobiosis. atmósfera del 5 al 7% de
Siembra en botón en Sensibilidad a la aerobiosis. CO2.
Agar DNASA Incubar Novobiocina, hacer una Fermentación de carbohidratos, sembrar por
a 37° C por 18 a 24 suspensión de las punción Incubar a 37°C por 18 a 24 horas,
horas, en colonias en 1 ml de Prueba de Camp, tomar una colonia de S. aureus beta en aerobiosis.
aerobiosis. Para caldo nutritivo (0.5 Solubilidad en bilis, lisina y sembrarla en el agar sangre; tomar una colonia
revelar agregar 1 o 2 McFarland) Sembrar coloque una gota de del microorganismo en estudio y sembrarlo
gotas de ácido masivamente con un la solución de perpendicularmente a la estría sembrada de S aureus
clorhídrico 1N dejar
actuar por 5 minutos
hisopo Agar Mueller-
Hinton, poner el disco
desoxicolato de sodio evitando que las estrías se toquen. Incubar a 37°C por
18 a 24 horas en aerobosis.
Micrococcus
al 10% directamente
con la tapa de la caja de 5 µg, Incubar a 37°C sobre una cepa
hacia arriba. (Control por 18 a 24 horas en sospechosa en agar
pos S. marcescens, aerobiosis. sangre, mantenga la Prueba Bilis esculina, inocular el microorganismo en un Tinción de gram, Prueba de la catalasa,
control neg E. coli) placa a 37°C, durante tubo de agar bilis esculina por estrías, incubar a 37º C
por 24 a 48 horas, en aerobiosis.
15 a 30 minutos.
Prueba Tolerancia al NaCl al 6.5 %,
Fermentación de carbohidratos, sembrar por punción Inocular en el tubo el microorganismo,
Incubar a 37°C por 18 a 24 horas, en aerobiosis. incubar a 37º C por 24 a 48 horas con una
Fermentación de Prueba O.N.P.G, en un tubo de ensayo con 0,5 ml de
atmósfera del 5 a 10% de CO². Se utiliza
carbohidratos, agua destilada estéril, prepare una suspensión densa con
sembrar por como indicador el púrpura de Bromocresol.
1 a 3 colonias puras aisladas en un medio de lactosa, se
punción Incubar a pone el disco en la suspensión se incuba en un baño
37°C por 18 a 24 maría a 37°C. Observe cada 5 minutos durante 1 hora: la Fermentación de carbohidratos, sembrar por
horas, en mayoría de las reacciones positivas (color amarillo) se punción Incubar a 37°C por 18 a 24 horas,
Adaptado por Monica Rodriguez, 2023 – UCMC aerobiosis. producen en 15 a 30 minutos. en aerobiosis.
Lectura:
Agar Baird-Parker • Proteólisis: Se evidencia por un halo
transparente alrededor de las colonias.
Este medio contiene todos los
componentes y además yema de • Producción de lecitinasa: se evidencia por
huevo y telurito de potasio, también la presencia de un brillo perlado sobre la
tiene litio y cloro que inhiben el superficie del crecimiento.
crecimiento de la flora acompañante, • Producción de lipasa: se evidencia por la
el piruvato y la glicola favorecen el presencia de un precipitado opaco
crecimiento de los Staphylococcus. alrededor de las unidades formadoras de
colonias.
• Reducción de Telurito de Potasio: Se
observa el desarrollo de colonias negras.
Agar Salado Manitol:
Lectura:
Se utiliza para diferenciar
Staphylococcus patógenos de los no • Fermentación de Manitol positiva: Cuando
patógenos. El NaCl al 7.5% actúa el indicador vira de rojo a amarillo
como inhibidor de flora • Fermentación de Manitol negativa: Cuando
acompañante, el indicador rojo de el indicador no vira y el medio conserva el
fenol vira de rosado a amarillo cuando color inicial.
se produce la fermentación de
manitol con producción de ácido.
Prueba de la DNASA
La DNAsa es una enzima que despolimeriza las bases
nitrogenadas y destruye el DNA; el medio utilizado
para esta prueba es en placa y en algunas ocasiones
contiene azul de toluidina como indicador.
Lectura:
• DNAsa Positivo (A): La formación de una zona clara
o transparente alrededor del crecimiento
bacteriano indica una hidrólisis del DNA.
• DNAsa Negativo (B): Si no se observa halo claro o
transparente alrededor del crecimiento bacteriano.
Fermentación de Carbohidratos
• Capacidad de un microorganismo de
fermentar o degradar un hidrato de
carbono específico produciendo ácido
o / y gas visible.
Lectura e interpretación:
• Fermentación Positiva: Si el indicador
de Andrade vira de rosado a fucsia.
• Fermentación Negativa: No hay ningún
cambio en el medio.
Susceptibilidad a la Bacitracina (A) y
Trimetoprima – sulfometoxazol (SXT)
Los Streptococcus beta hemolíticos del grupo A son
sensibles a la bacitracina, antibiótico que se
dispersa en el medio sólido inhibiendo el
crecimiento de la bacteria.
Lectura:
• Bacitracina y SXT sensible: la observación de un
halo de inhibición de cualquier diámetro, debe
considerarse como positivo.
• Bacitracina y SXT Resistente: No hay halo de
inhibición.
Prueba de susceptibilidad a la Optoquina (P)
El clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina) es una
sustancia química que inhibe selectivamente el
crecimiento de Streptococcus pneumoniae, a muy baja
concentración, lisa el microorganismo por cambios en la
tensión superficial. Esta prueba se emplea para la
diferenciación de Streptococcus pneumoniae (sensibles)
y Streptococcus del grupo viridans alfa hemolíticos
(resistentes) con P a concentración de 5 μg/ml o menos.
Lectura:
Optoquina sensible:
• Si el disco de optoquina es de 6 mm, un halo de inhibición de 14 mm o más se considera sensible.
• Si el disco de optoquina es de 10 mm, un halo de inhibición igual o mayor a 16 mm se considera sensible.
Optoquina Resistente: No hay halo de inhibición.
Prueba de CAMP
Los Streptococcus del grupo B producen el factor CAMP
(Christie, Atkins, Munich-Paterson) que potencializa la zona
de hemólisis del Staphylococcus aureus beta lisina
produciendo una lisis en forma de punta de flecha.
Técnica: tomar una colonia de Staphylococcus aureus beta
lisina y sembrarla en el agar sangre; tomar una colonia del
microorganismo en estudio y sembrarlo perpendicularmente
a la estría sembrada de Staphylococcus aureus evitando que
las estrías se toquen. Incubar a 37oC por 18 a 24 horas en
aerobosis.
Lectura
Positivo: La zona de lisis toma la forma de una punta de
flecha en la intersección de las dos estrías.
Negativo: No hay lisis.
Solubilidad en Bilis:
El desoxicolato de sodio lisa la pared de la bacteria, esta
prueba permite la diferenciación entre Streptococcus del
grupo viridans, el cual es resistente a la lisis, del Streptococcus
pneumoniae el cual es sensible a la acción del desoxicolato.
Lectura:
Las colonias de neumococo son solubles en bilis y pueden
desaparecer o aparecer como colonias aplastadas; por el
contrario, las colonias de Streptococcus resistentes a la bilis no
se verán afectadas.
Prueba de Bilis Esculina
Los Streptococcus del grupo D y Enterococcus son capaces de
desarrollarse en 40% de bilis e hidrolizar la esculina
produciendo glucosa y esculetina, la esculetina se combina
con los iones férricos del citrato ferroso que posee el medio,
dando un complejo de color negro.
Lectura:
• Positivo: si se observa un ennegrecimiento difuso en el pico
del agar. En caso de realizar la prueba en placa se ve un
halo marrón o negro alrededor de la colonia.
• Negativo: No hay cambio en el medio.
Tolerancia al NaCl al 6.5 %:
Los Enterococcus crecen en medios con alto
contenido salino (6.5%)
Técnica: Inocular en el tubo el microorganismo,
incubar a 37º C por 24 a 48 horas con una
atmósfera del 5 a 10% de CO². Se utiliza como
indicador el púrpura de Bromocresol.
Lectura:
• Positivo: Cambio de color de púrpura a amarillo
• Negativo: No hay cambio de color.
