Tecnología del ADN Recombinante y Clonamiento de

ADN
CONTENIDO PARA EL DIPLOMADO DE BIOLOGÍA MOLECULAR, DIPLOMADO DE BIOTECNOLOGÍA Y MATERIA
DE BIOTECNOLOGÍA

Contenido
Contenido........................................................................................................................................................0

Objetivo de aprendizaje..................................................................................................................................1

Definiciones....................................................................................................................................................1

Introducción....................................................................................................................................................3

Clonación celular de moléculas de ADN y ADN complementario............................................................8

Enzimas de Modificación..........................................................................................................................31

Vectores de clonamiento usados en la producción del ADNr y sus características..................................32

LO QUE CONTIENEN LOS VECTORES:.........................................................................................................34

Fagémidos.................................................................................................................................................64

Estrategias de clonación- formación del ADNr........................................................................................79

Ligación: unión de moléculas de ADN.................................................................................................79

Métodos de introducción del ADNr en las células anfitriona..............................................................90

Incorporación del ADNr en la célula anfitriona:.................................................................................91

Tipo de célula anfitriona.......................................................................................................................93

Propagación en medios de cultivo........................................................................................................95

Detección y clones recombinantes........................................................................................................95

Producción de genotecas: utilidad, construcción y análisis......................................................................95

Aplicación de RDT y su impacto social....................................................................................................95

Conocimiento de las principales aplicaciones de RDT y de los microorganismos en procesos de interés

biotecnológicos.........................................................................................................................................95

Referencias...................................................................................................................................................95
Objetivo de aprendizaje
❀ Conocer la historia y avances que han ocurrido para el desarrollo de la tecnología del ADN
recombinante.
❀ Definir la teoría del ADN recombinante (RDT) y otros términos de interés
❀ Conocer las diferentes enzimas de restricción y sus aplicaciones en las RDT.
❀ Conocer los tipos de vectores de clonamiento y expresión, así como sus características, diferencias
y aplicaciones.
❀ Conocer las células anfitrionas más utilizadas en RDT, sus características, diferencias y
mecanismo empleados para introducir el ADNr.
❀ Conocer las diferentes aplicaciones de la RDT, su importancia e impacto social.
❀ Conocer cómo se forma la genotéca, y su importancia.
❀ Conocer el modelo de acción de las enzimas recombinantes tipo II
❀ Conocer las características de las enzimas de restricción y como se clasifican.
❀ Conocer el tipo de enzima de restricción más empleado en RDT y por qué.
❀ Conocer otras enzimas esenciales para RDT.
❀ Conocer las características de los diferentes vectores de clonamiento y expresión
❀ Conocer los tipos de células anfitrionas utilizadas en clonamiento.

Definiciones
ADN recombinante (ADNr): molécula de ADN formada por ADN procedente de 2 o más fuentes
diferentes, la mayoría de las veces el ADNr está formado por ADN de diferentes especies.

Célula Anfitriona o Células hospedadora:

Endonucleasas de restricción:

FDA:

FAO:

Ingeniería Genética:

OMS (organización mundial de la salud):

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Plásmidos:

Recombinación genética: es un fenómeno común, usualmente observado en todo organismo vivo. La

recombinación genética ha sido observada que ocurre durante la reproducción normal, consiste
principalmente en la ruptura y unión de fragmentos de ADN de la misma especie o de especies diferentes.

Vector clonamiento:

Tecnología del ADN Recombinante (RDT: Recombinant DNA Technology): abarca todos los pasos de
necesarios para el clonamiento, permite imitar la recombinación genética natural. Por lo tanto, la
ingeniería genética y la clonación de genes ofrecen oportunidades potencialmente ilimitadas para crear
combinaciones únicas de genes en un período de tiempo muy corto que no existen actualmente en el
mundo en condiciones normales. RDT es definida por la real academia Británica como “la unión de
moléculas de ADN de diferentes organismos e insertadas en un organismo hospedador para producir
nuevas combinaciones genéticas que sin valiosas en ciencias, medicina, agricultura e industria”

Tecnología Genética: modificación de las propiedades genéticas de un organismo mediante el uso de la

RDT. En ingeniería genética se considera que el requisito básico es el ADN, el cual se puede asilar de
cualquier célula (plantas, animales, microorganismos, virus). Este ADN puede ser fragmentado con
endonucleasas de restricción, luego estos fragmentos pueden ser ligados en plásmidos o vectores, luego
este ADNr se introduce en células anfitrionas por transformación o transfección. Las células transfectadas
son propagadas en medios de cultivos específicos que permiten identificar cuales células poseen el ADNr
de interés, luego este ADNr clonado se puede aislar y utilizar para otros análisis.

Fagos:

Bacteriófagos:

Factor F:

Transgén: es un gen o material genético que ha sido transferido de un organismo a otro, ya sea de forma
natural, o artificial. Se usa el termino transgén para describir un segmento de ADN que contiene una
secuencia del gen que se ha aislado de un organismo y se introduce en un organismo diferente.

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Introducción
La tecnología del ADN recombinante (RDT: Recombinant DNA Technology) es definida por la
Enciclopedia Británica como “la unión de moléculas de ADN de diferentes organismos e insertados en un
organismo hospedador para producir nuevas combinaciones genéticas que son valiosas en ciencias,
medicina, agricultura, medio ambiente e industria (alimento, farmacéutica, etc.)”

La RDT es una técnica que cambio el paradigma en el campo de la biología molecular y bioquímica de
proteínas. Esta técnica usada en ingeniería genética para alterar la química del material genético donde 2 o
más moléculas de ADN de diferentes organismos son unidos y posteriormente incorporado en el genoma
de un organismo anfitrión. Este ADN modificado se prepara usando métodos de laboratorios que
producen un cambio en el fenotipo del organismo anfitrión y por lo tanto es llamado ADN recombinante
(ADNr). La tecnología involucrada en la formación de ADNr y su integración en el genoma son llamados
colectivamente Tecnología del ADN recombinante. Este elegante proceso involucra una cantidad de
métodos biotecnológicos como la creación del ADNr, clonamiento molecular de genes, transferencia de
genes.

El ADN recombinante ha sido una tecnología transformadora proporcionando herramientas que no solo
han sido permitido en una gran comprensión de la vida en los niveles más fundamentales, sino que
también ha llevado al desarrollo de sus aplicaciones en otras áreas biotecnológicas. El ADN recombinante
ha revolucionado la investigación biotecnológica. Esta técnica ha proporcionado la base para la
secuenciación genómica y el diseño de bibliotecas genómicas. Esto permite obtener información
invaluable tales como:

❀ Función de las células y los organismos.

❀ Comprender las relaciones evolutivas entre especies y genes; también permite comprender como
el entorno o el ambiente celular afecta la fisiología celular y la composición genética.
❀ Comprender y dilucidar las interacciones entre los compuestos terapéuticos y las macromoléculas
diana, como las proteínas y el ARN. Los efectos potenciales de los fármacos sobre la fisiología celular,
toxicológicamente, junto con el mecanismo de acción de compuestos y los perfiles de resistencia.
❀ Mejora el rendimiento o alteraciones químicas de las estructuras de las moléculas para los
productos terapéuticos naturales derivado de metabolitos.
❀ Mejora la producción de medicamentos tales como: insulina, factor de crecimiento humano,
interferón, etc.
❀ Mejora el desarrollo de vacunas.

❀ Mejora el crecimiento de animales y plantas.

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 ❀ Mejora la fijación de nutrientes en plantas, así como la resistencia a herbicidas, infecciones y
plagas.
❀ Desarrollo de terapia génica

❀ Mejora el aislamiento, desarrollo y purificación de enzimas, que son utilizadas en procesos

industriales mejorando la velocidad y especificidad de las reacciones. Esto se usa en el desarrollo de
detergentes, biocombustibles, etc.
❀ En las ciencias forenses, se emplea para mostrar la relación entre las muestras obtenidas de un
delito y los sospechosos; para identificación de personas, pruebas parentales, etc.
❀ Se emplea para comprender las herencias familiares, búsqueda de enfermedades genéticas,
estudiar funciones de genes y mutaciones.
❀ La metodología básica para la manipulación de genes y clonamiento del ADNr requiere:

❀ Endonucleasas de restricción (también llamadas enzimas de restricción) /enzimas de

modificación.
❀ Métodos de ampliación del ADN

❀ Vectores para transportar la molécula del ADNr.

El proceso que entro en la creación de moléculas de ADN recombinante se denomina clonación

molecular. La clonación es un proceso de generación de copias idénticas, ya sea un solo gen, una célula o
un organismo. Este proceso desde su inicio, ha sido ampliamente utilizado y constantemente
estandarizado. La clonación surgió como una técnica con el descubrimiento de las endonucleasas de
restricción y las ligasas, las enzimas que son muy específicas para cortar y unir el ADN, respectivamente.
El descubrimiento de estas enzimas hizo que las técnicas fueran más sofisticadas y proporcionó
herramientas poderosas para generar moléculas recombinantes. Por lo tanto, la clonación utilizando varios
vectores y sus diversas características se ha convertido en una técnica de laboratorio común que ayuda a
diseñar estrategias para responder preguntas críticas de investigación biológicas.

Para la formación del ADNr y la clonación celular se requiere que se realicen varios pasos:

1º. Aislamiento del gen o segmento de ADN que se desea clonar, que codifica la proteína específica
del organismo fuente. A veces, si la muestra de ADN que se desea clonar es muy limitada, es
necesario realizar una PCR para amplificar el gen y obtener una cantidad suficiente de ADN.

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 2º. Formación del ADNr; el gen de interés se inserta en un vector de clonamiento que proporcionan
los elementos del ADN exógeno, así como elementos reguladores reconocibles por la célula
anfitrionas adecuada como E coli.
3º. Clonamiento: transporte e introducción del ADNr en células anfitrionas y crecimiento de la célula
recombinantes. Para una expresión y purificación sólida, es importante comprender las
propiedades intrínsecas de las proteínas recombinantes de interés. La expresión de proteínas de
mamíferos extraños en un anfitrión microbiano plantea ciertos desafíos, por lo que, requiere
atención minuciosa antes de la clonación en un plásmido vector. La mayoría de los plásmidos son
adecuados para su uso en la célula anfitriona E coli., ya que es la célula anfitriona preferida para
la producción de proteínas a gran escala. Las cepas bacterianas se han modificado de manera que
produce proteína recombinante que representa casi el 20% de sus proteínas celulares totales. Por
lo tanto, un investigador debe tener conocimientos profundos de los sistemas de plásmidos
disponibles para clonar y expresar proteínas a fin de elegir con prudencia un sistema para obtener
los mejores resultados.
4º. Identificación de las células con el ADN recombinante.
5º. Aislamiento de las células recombinantes identificadas, para futuras aplicaciones.

El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las células para
replicar el ADN, el cual, surge gracias a la aparición de las técnicas que permiten el aislamiento del ADN
y de las enzimas de restricción, que hacen posible, que de forma in vitro, cortar el ADN de manera
contralada e incorporar los fragmentos en vectores que, a su vez, se introducen en células anfitrionas, en
las que tiene lugar la replicación.

Hoy en día se puede clonar ADN y ARN.

Aspectos Históricos
❀ Desde principio del siglo XVII, los científicos comenzaron a explorar la posibilidad de manipular
el genoma de un organismo y la posibilidad de introducir estos rasgos genéticos en otro organismo.

❀ En la década de 1960s, Stewart Linn y Warner Arber descubre aislaron endonucleasa y

exonucleasas de E. coli. Concibieron la idea de usar las endonucleasas de restricción en la modificación
del ADN. Las investigaciones y desarrollo que se dieron en los años que siguieron llevo al desarrollo de
nuevas técnicas asociadas a la biotecnología y las biologías moleculares, incluyendo electroforesis en gel,
PCR, mutagénesis y cultivo microbial.

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 ❀ 1966- Geller y col descubren la DNA ligasa que permitía unir fragmentos del ADN. Esto
permitió que la idea concebida en el siglo XVII se volviera poco a poco en realidad.

❀ Después de la década 1960s, se lograron enormes avances en entender la arquitectura de las

células, sus componentes celulares, la diferencia en la composición entre sistema procarioticos y
eucarióticos, replicación del ADN, etc.

❀ 1970- Paul Berg y col., desarrollan el primer ADN recombinante por ligación de fragmentos de
ADN de 2 diferentes organismos in vitro. Esta técnica de empalme de genes sentó las bases de la
ingeniería genética. Es este mismo año Her Gobind Khorana creo el 1er gen sintético del mundo, usando
oligonucleótidos sintetizados químicamente.

❀ 1971- Kathleen Danna y Daniel Nathans mancan el inicio de la era del ADNr, con la publicación
de su artículo donde describen el aislamiento de una enzima de una cepa bacteriana y su uso para cortar el
ADN vírico por secuencia especifica. En este mismo año Douglas Berg y col. Aíslan el 1er plásmido
bacteriano- vector de clonamiento λdvgal 120 del fago lambda.

❀ 1972- David Jackson y col., construyen la 1er molécula ADN quimérica in vitro usando una serie
de enzimas con propiedades conocidas. Desarrollan un protocolo donde combinan varias enzimas y
sustratos para un resultado óptimo. Por su parte, Janet Mertz y Ronald Davis demostraron una mayor
efectividad en la forma de unir los ADNr por incubación EcoRI-cut lineal DNA SV40 con ADN ligasa I,
los investigadores promovieron la EcoRI como enzima para cortar el ADN formando extremos pegajosos
y no extremos romo. Cohen S y col., construyen el 1er ADNr interespcie, usaron EcoRI para cortar
pSC101 y un plásmido de bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus, y se unió y propago a E. coli. El
hospedador recombinante expresa un único gen de resistencia a antibiótico en plásmido parental

❀ 1973- Monow y col., demostraron experimentalmente la clonación de genes eucarióticos en E.

coli. Con este experimento concluyeron que cualquier organismo puede ser clonado y replicado en E. coli.

❀ 1974- la universidad de Stanford y California proclaman a los investigadores Cohen y Boyer

como los creadores de RDT, y se solicita la patente, que se concedió en 1980.

❀ 1979- Burrel y col. Logran aislar y clonar el ADN del VHB en E. coli

❀ 1980- Ruddle y col. Introducen ADN foráneo en un ratón desarrollando el 1er animal
genéticamente modificado (ratón transgénico). Esto marco el inicio del estudio de genes humanos y
enfermedades genéticas en sistemas modelos animales. Este mismo año, Milstein y col., desarrolla la
tecnología del ADNr para la ingeniería de anticuerpos monoclonales.

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 ❀ 1981- Griffin y col. Realizan librería genómica con clones de ADN completo al virus Epstern
Barr (EBV). La familia de Vvirus Herpes se conoce que está asociada con daños o enfermedades graves.

❀ 1988- Waldman y col., desarrollaron la 1era IgG1 humanizada, anticuerpos monoclonales células
blanco B de leucemia linfocítica crónica (CLL)

❀ 1994- Coller y col., desarrollan el 1er anticuerpo monoclonal con fines terapéuticos. En este
mismo año, se crea el primer producto GMO creado a través de ingeniería genética: el tomate GMO,
puesto a la venta al pasar las pruebas y ser tan seguro como los tomates cultivados de forma tradicional.

❀ 1998- la FDA aprueba el 1er producto transgénico de consumo desarrollado por ingeniería
genética: la insulina humana para tratar la diabetes.

❀ 1990- una gran cantidad de productos GMO creados por ingeniería genética disponible para
consumo humano: Soya, Algodón, Maíz, Papayas, Tomates, Papas. Sin embargo, no todos salieron a la
venta.

❀ 2003- OMS y FAO (organización de las naciones unidas para alimentos y agricultura) crean
directrices y normas de seguridad de los alimentos GMO.

❀ 2005- l alfalfa y la remolacha GMO salen a la venta.

❀ 2015- la FDA aprueba el primer animal GMO para el consumo humano: el Salmon transgénico.

❀ 2016- la FDA aprueba las papas GMO para el consumo humano y salen a la venta.

❀ 2017- la FDA aprueba las manzanas GMO para el consumo humano y salen a la venta.

❀ 2018- la FDA aprueba la caña de azúcar GMO para el consumo humano y salen a la venta.

❀ 2020- la FDA aprueba piña rosa GMO para el consumo humano y salen a la venta.

Importancia de la RDT
Es una herramienta de investigación extremadamente importante en biología que permite a los científicos
manipular fragmentos de ADN para estudiarlos en el laboratorio. Implica el uso de una variedad de
métodos de laboratorio para colocar el fragmento de ADN en una célula anfitriona y una vez dentro
replicar el ADN exógeno con el propio.

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Producción de recombinantes

Clonación celular de moléculas de ADN y ADN complementario

Enzimas o endonucleasas de restricción
Antes de iniciar y describir el proceso de formación del ADNr y clonamiento celular, es necesario estudiar
las enzimas que permiten la manipulación del ADN y el proceso de clonamiento.

El descubrimiento y caracterización de las enzimas, hoy en día disponibles de manera comercial como un
reactivo más, fue lo que definió el concepto de ingeniería genética en general, y en particular, las técnicas
del ADNr. Estas enzimas se han comparado con un sistema de corte (enzimas de restricción) y pegamento
molecular (ligasa).

Las enzimas de restricción juegan un rol importante en la tecnología de ADNr. Debido a su especificidad
y patrones de escisión predefinidos, por lo que, las enzimas de restricción se pueden considerar la columna
vertebral de la RDT. Las propiedades de estas enzimas son utilizadas para cortar los plásmidos en un sitio
especifico e insertar el ADN de interés para su clonamiento y/o expresión.

Las enzimas en general se definen como biopolímeros biológicos que catalizan las reacciones químicas
que hacen posible la vida como se conoce. Las nucleasas son enzimas que hidrolizan ácidos nucleicos,
estas enzimas pueden escindir enlaces fosfodiéster.

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción desempeñan funciones propias en las células
procariotas. Estas enzimas actúan como un sistema de protección en las bacterias, ya que hidrolizan el
ADN exógeno que n ha sido metilado por enzimas propias de la célula bacteriana. Las nucleasas también
son conocidas como Fosfodiésterasas por su capacidad de escindir los enlaces fosfodiéster de la cadena
polinucleotídica. Las enzimas son biocatalizadores eficaces y específicos.

Una de estas enzimas es la que tiene la capacidad de cortar el material genético, las cuales son llamadas
NUCLEASAS. Estas pueden ser:

❀ Ribonucleasa (RNasas): corta el ARN

❀ Deoxyribonucleasa (DNasas): Cortan el ADN

Las endonucleasa pueden generar cortes hacia el extremo y son llamadas Exonucleasas que tienen
actividad Exonucleolitica (Exo: fuera de lugar), es decir corta nucleótidos de los extremos 3’ o 5’ de la
cadena de ADN. También, puede ocurrir corte con enzimas Endonucelasas con actividad

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Endonucleolitica (Endo: dentro) que cortan dentro de la secuencia de ADN. Las Endonucleasas de
Restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia especifica de ADN y cortan en una posición
específica.

En ocasiones no se puede utilizar las DNasas para cortar el ADN, esto se debe a la presencia de 1 o dos
bases nucleotídicas anormales en la composición de la secuencia. Un problema con el uso de las DNasas
es que los extremos de la molécula cortada no poseen secuencia de cadena simple, es decir genera
extremos romos, esto hace complicado que se pueda usar las secuencias cortadas para clonamiento. Sin
embargo, el problema pudo ser resuelto usando la DNA polimerasa adecuada.

La actividad de las enzimas de restricción pueden ser medidas en Unidades, donde una unidad es la
cantidad requerida de una enzima para digerir una cantidad estándar de ácido nucleico, normalmente es
1µg de ácido nucleico, bacteriófaga lambda o plásmido, en un tiempo de acción de 1h a una condición
adecuadas de concentración, temperatura y pH. Si la digestión del ADN contiene muchos sitios de
restricción, puede requerir aumentar la cantidad de enzimas requeridas para digerir el ADN.

El corte de las enzimas de restricción puede verse afectada o influenciada por diferentes factores:
metilación, tipo de buffer utilizado, concentración usada, estructuras secundarias en el sustrato,
temperatura durante el proceso, pH.

Diferentes enzimas de restricción pueden generar los mismos extremos, este hecho es importante para
saber se al cortar los ácidos nucleicos con estas enzimas se puede unir sin mayor problema, ya que
producen los mismos extremos. Estas son llamadas familias de enzimas de restricción y la característica
favorecen que dos fragmentos cortados con estas enzimas pueden recombinarse de manera específica
gracia a la complementariedad de sus bases en los extremos cohesivos generados.

❀ Una vez obtenido el ADN purificado que se desea clonar, el siguiente paso en el proceso de
clonación genética es la formación del ADNr. Para producir esta molécula recombinante, el vector, así
como el ADN a clonar deben ser cortados en un punto específico y luego unido o ligado (inserta el ADN
en el vector) de manera controlada, este proceso se conoce como corte y empalme, requiere la
participación de diferentes enzimas que permiten manipular el ADN. Para el proceso de corte se requiere
una enzima de restricción y para el proceso de unión de los fragmentos se requiere la enzima ADN ligase.

Las enzimas para la manipulación del ADN pueden ser agrupadas en 4 grandes clases, dependiendo de la
reacción que catalizan:

❀ Nucleasas: enzimas que cortan, o degradan las moléculas de ácidos nucleicos.

❀ ADN Ligase: une moléculas de ADN

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 ❀ ADN Polimerasa: Hace copias de moléculas de ADN

❀ Enzimas Modificadoras: remueven o añaden grupos químicos.

❀ Aunque algunas enzimas que se agrupan en estas 4 clases puede tener más de una actividad por lo
que podrían ubicarse en más de una clase.

❀ Nucleasas: enzimas degradan moléculas de ADN al romper los enlaces fosfodiéster que una los
nucleótidos entre sí.

❀ Hay dos tipos de nucleasas:

❀ Exonucleasa: remueve 1 nucleótido a la vez ubicados en los extremos del ADN.

❀ Endonucleasas: Capaz de romper enlaces internos de fosfodiéster.

Endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción, representan uno de los gropos de enzimas más importantes ara la
manipulación del ADN. Estas enzimas son encontradas en bacterias, donde funcionan como parte de un
mecanismo de protección llamado Sistema de Modificación-restricción. Con este sistema las enzimas de
restricción hidrolizan todo material genético exógeno que entra en la bacteria, como un mecanismo de
defensa contra las infecciones virales, como bacteriófagos (figura 1). Para prevenir la acción hidrolítica de
las enzimas de restricción sobre el ADN de la bacteria, el ADN bacteriano es metilado en bases
particulares en los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción por acción de las enzimas
modificadoras del sistema llamadas Metilasa, esto previene que las enzimas de restricción se puedan unir
a su sitio de reconocimiento y corte el ADN de la bacteria. El termino enzimas de restricción fue
concebido por Lederberg y Meselson en 1964 para definir a estas nucleasas que destruían el ADN
exógeno que entraban a las bacterias.

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Todas las enzimas de restricción se unen al ADN y reconocen secuencia especifica de nucleótidos
denominadas Secuencia de reconocimiento. Las enzimas de restricción cortan ambas cadenas de ADN
dentro de la secuencia de reconocimiento siguiendo un patrón de corte específico.

La principal utilidad de las enzimas de restricción para la clonación procede de si capacidad de cortar el
ADN genómico de manera precisa, específica y reproducible en un fragmento denominado Fragmento de
Restricción. El tamaño de los fragmentos de restricción viene determinado por cuan a mendo una enzima
de restricción determinad corta el ADN, esto es variable, ya que el número y la localización de la
secuencia de reconocimiento no está siempre distribuida de la misma forma en el ADN.

La mayoría de las secuencias de reconocimiento contiene un tipo de simetría en el que la secuencia

nucleotídicas se lee igual en ambas cadenas de ADN en dirección 5’3’ esto se denomina Palíndromo.
Cada enzima se une al ADN en un sitio de reconocimiento específico, y lo corta en un patrón de corte
característico. Muchas enzimas cortan el ADN de manera sesgada, produciendo extremos con segmentos
de cadena sencilla (simple cadena) esto se denomina Extremos pegajosos o extremos cohesivos, también
hay enzimas de restricción que cortan el ADN de manera simétrica produciendo extremos doble cadena,
estos son denominados Extremos Romos

❀ La actividad de escisión del ADN específica de secuencias de endonucleasas de restricción

(REasas), combinada con otras actividades enzimáticas que amplifican y ligan los ácidos nucleicos ha
permitido el avance de la biología molecular.
❀ La aplicación de las REasas ha evolucionado desde la clonación de ADN exógeno y el mapeo del
genoma hasta aplicaciones más sofisticado, como la identificación y el mapeo de modificaciones
epigenéticas y el ensamblaje de alto rendimiento de bibliotecas combinadas. También, ha permitido abrir
la puerta a otras técnicas como: amplificación isotérmica de ADN, entre otras.

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 ❀ Actualmente, se conocen más de 19000 REasas, que reconocen más de 300 secuencias distintas.
La lista completa de REasas se encuentra en REBASE (http://rebase.neb.com), aunque no todas son
usadas de forma rutinaria en investigación científica.
❀ Se conocen 4 tipos de REasas, tipo I al tipo IV. Las tipo II se han identificado varios subtipos.
Estas de tipos II son las que se usan principalmente en ingeniería genética y biología molecular.
❀ La manipulación del ADN utiliza un numero de enzimas. Estas enzimas están involucradas
normalmente en los procesos de transcripción, traducción y replicación, y otros procesos biológicos. Estas
reacciones catalizadas por la REasas juegan un rol esencial en la clonación genética. La mayoría de estas
enzimas ya están disponibles de manera comercial y altamente purificadas.
❀ Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos
útiles, tales como:

❀ Investigación Biomédica: construcción de vectores de clonamiento (ADNr) del genoma (humano,

microorganismos, animales, plantas, virus), RFLP, que son de gran interés en el área biomédica.

❀ Investigación Farmacéutica: ADN recombinante y clonamiento para el desarrollo de

medicamentos, vacunas, terapia génica.

❀ Investigación Biológica: Clonamiento, ADNr, PCR-RFLP, RFLP para el estudio biológico de

diferentes especies, estudios ambientales, etc.

❀ Las enzimas de restricción empleadas con mayor frecuencia en metodología de ADNr suelen
reconocer secuencias únicas de 4 a 8 nucleótidos, donde realizan el corte (estas secuencias se conocen
como secuencias de reconocimientos de las REasas).

❀ Las familias de REasas está formada por aquellas enzimas de restricción que no necesariamente
reconocen la misma secuencia blanco, pero producen extremos cohesivos similares. Un ejemplo de familia
es:BamHI y BclII que reconocen la secuencia diana 5’-GGATCC-3’ y 5’-AGATCT-3’, respectivamente
pero que genera extremos cohesivos idénticos:5’-GATC-3’

❀ Esta característica favorece que dos fragmentos cortados con estas enzimas pueden recombinarse
de manera específica gracias a la complementariedad de sus bases en los extremos cohesivos generados.

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 ❀

❀ Actualmente las RNasas se clasifican en cuatro (4) tipos de enzimas de restricción (I, II, II, IV).
Con subdivisiones por conveniencia. Casi todos los tipos de RNasas requieren de un cofactor de metal
divalente como el Mg2+ para su actividad. El tipo de enzima más utilizado son las enzimas tipo II, mientras
que los otros tipos no se usan o se hacen de rara vez para RDT y clonamiento, ya que esta clase de
enzimas clivan el ADN en regiones lejanas al sitio de reconocimiento y producen extremos romos.

RNASAS TIPO I:
❀ Complejo oligomerico REase y MTase (DNA-metilasa)

❀ Requiere hidrolisis de ATP para la restricción

❀ Corta la doble cadena de ADN de forma variable, a menudo lejo del sitio de restricción (CAJA-
DEAD), traslocando REase dominio de reconocimiento del ADN bipartido.

❀ Ejemplo: EcoKI

❀ Genes: hsdR; hasdM; hsdS

❀ Subunidades: aprox. 35; 62;52 kDa

❀ REBASE: 104 enzimas; 47 genes clonados; 34 genes secuenciados; 5140 supuestos.

❀ RNASAS TIPO III

❀ Complejo recombinante REase y MTase

❀ Requiere ATP para su actividad

❀ Corta en una posición fija fuera del sitio de reconocimiento de REase (Caja- DEAD o caja
Muerta)

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 ❀ Ejemplo: EcoP1IR

❀ Subunidades: 106 y 75 kDa

❀ REBASE: 21 enzimas; 19 genes clonado y secuenciado; 4822 supuestos.

❀ REASE TIPO IV

❀ Dependiente de metilación

❀ Corte distante y variable del sitio de reconocimiento

❀ No hay ningún ejemplo típico

❀ Proteínas no relacionadas

❀ REBASE: 18 enzimas; 15 genes clonados y secuenciados; 4822 supuestos.

(Tabla tomada de: A complete guide to gene cloning from to advanced)

Clase Característica Ejemplo

I  Diferentes subunidades para reconocimiento, clivaje y EcoBI
modificación.
 Reconoce y modifica algunas secuencias.
 Cliva bases a una distancia lejana del sitio de reconocimiento,
alrededor de 1000bp
II  Dos diferentes enzimas- endonucleasas y metilasas BamHI
 Ambas reconocen el mismo sitio EcoRI
 La mayoría reconoce un sitio el cual es simétrico. HinDIII
 Cada una trabaja de manera independiente
 No requiere ATP para su actividad
III  Dos subunidades- cada una para reconocimiento y modificación HinfIII
y para clivaje.
 La secuencia de reconocimiento es metilada

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  El clivaje ocurre a una distancia de 24-26pb
IV  Dos enzimas diferentes McrBC
 La secuencia de reconocimiento es asimétrica a menudo
metilada.
 El clivaje ocurre en un lado de la secuencia de reconocimiento
hasta 20-30pb de distancia y está a menudo mutilada.

Nombrar las enzimas de restricción o Nomenclatura de las enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción se nombran de acuerdo al microorganismo del cual se purifica o se aísla

La nomenclatura utilizada en las enzimas de restricción se basa en un numero de convenciones, que toman
en cuanta: genero, específicos y serotipo o cepa bacteriana, seguida por numero romano para diferenciar
enzimas de la misma cepa de los microorganimos del cual se encontró y se purifico.

1. Primera letra del nombre del género

2. Primera dos letras del nombre de la especie
3. En ocasiones puede tener una tercera letra, que identifica al tipo o variante antigénica de la
bacteria.
4. Numero romano que indica cuando hay más de un mismo género y especie de enzima
identificada y purificada del mismo microorganismo.
5. Ejemplo:
6. EcoRI 

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La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia
corta ADN bicentenario. Reconocen más comúnmente secuencias de 4, 5 o 6 pares de bases de longitud.

Las enzimas de restricción hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada cadena de ADN doble cadena en la
secuencia corta de reconocimiento, siempre en la misma posición.

Características de las endonucleasas tipo II

❀ Representa el grupo más grande de enzimas caracterizadas debido a su utilidad como herramienta
para la tecnología del ADNr.
❀ Corte dentro o en la posición fija cerca del sitio de reconocimiento.

❀ Actividad enzimática: endonucleasa – metaliza en una proteína independiente-

❀ Coenzima o sustrato: aunque la mayoría uso como cofactor el Mg 2+, existen algunas REasas que
pueden usar el Mn2+ en lugar del Mg2+, otras pueden usar variedad de cationes, tales como: Co 2+; Zn2+;
Ni2+; y Cu2+. Los iones Ca2+ por lo general, pero no siempre, inhiben la catálisis.
❀ Estructura proteica: 1 subunidad como homodimero

❀ Sitio de reconocimiento: palíndromo (4 a 8 pb) no interrumpido

❀ Punto de corte: corta las 2 cadenas de ADN en puntos equivalentes, muy específicos dentro de la
secuencia de reconocimiento.
❀ Punto de metilación: adenina o citosina muy específica dentro de la secuencia especifica de
reconocimiento. En ambas hebras.
❀ REBASE: 3938 enzimas; 633 genes clonados, 597 genes secuenciados, 9632 supuestos.

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 ❀ La primera RNase en ser descubierta fue HindII, descubierta en un laboratorio de Hamilton (Ham)
Smith, en la escuela de medicina Johns Hopkins en 1970, purificada de Haemophilus influenzae, serotipo
de esta actúa como un homodimero y corta el ADN de manera simétrica, aunque degenerado. Sin
embargo, luego se supo que lo que se creía que era HindIII pero realmente era HindII y HindIII, esto
demostró luego que estas dos enzimas actuaban en la misma secuencia de reconocimiento.
❀ Yoshimori durante su investigación del sitema de restricción presente en los plasmisdos de E. coli,
logro purificar EcoRI y EcoRII.
❀ Las RNase tipo II se descubrieron en la década de 1970s

❀ Los genes de las RNase tipo II se encuentran en los cromosomas y, ocasionalmente, en elementos
transmisibles como plásmidos, transpones y secuencias de inserción.
❀ Este tipo de enzimas generan un corte del ADNdc que produce fragmentos de ADN reproducible
y patrones electroforéticos en gel reproducibles, estas propiedades han convertido a las REasas tipo II en
reactivos invaluables para la manipulación e investigación del ADN en el laboratorio.

Diferentes enzimas de restricción generan diferentes rangos de tamaño de fragmentos de ADN, el tamaño
de los fragmentos depende de las frecuencias en que ocurre el reconocimiento de la secuencia de blanco.

Se puede predecir la frecuencia con la que una enzima reconoce su secuencia blanco. Por ejemplo, si la
enzima reconoce una secuencia blanco de 4pb se calcula la frecuencia como 4 n; donde n es la longitud de
la secuencia de reconocimiento de la enzima. Como la enzima reconoce 4pb de longitud, la frecuencia
seria 44= 256pb

EXISTEN SUBCLASES EN LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TIPO II:

Se han definido 11 subtipos, cada una con una propiedad particular, pero no necesariamente única: A, B,
C, E, F, G, H, M, P, S y T. la mayoría de las enzimas tipo II como EcoRI y EcoRV, utilizada en los
laboratorios para clonación pertenecen al subtipo IIP porque reconocen secuencias palindrómicas
(simétricas). En este esquema de clasificación, los subtipos no se excluyen mutuamente, por lo que las
enzimas pueden pertenecer a varios subtipos a la vez. La enzima FokI, es el miembro más conocido del
subtipo IIS (corte combinado), pero también pertenece al subtipo IIA porque su secuencia de
reconocimiento es asimétrica. La enzima BcgI, es un ejemplo extremo, pertenece a 6 subtipos al mismo
tiempo y posiblemente a más subtipos.

❀ Tipos IIA:
❀ Reconoce secuencias simétricas

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 ❀ Corta dentro de la secuencia de reconocimiento o a una distancia definida de las
secuencias de reconocimiento.
❀ Muchas van acompañadas de 1 o 2 ADN metilasa (MTasas) que modifican cada una de
las hebras de la secuencia de reconocimiento.
❀ Otras son enzimas combinas de restricción y modificación (RM), algunas de las cuales
tiene MTasas acompañantes separadas, mientras que otras no.
❀ Ocurre con mayor frecuencia las secuencias de reconocimiento asimétricas en el ADN
que las simétricas.
❀ Menos abundantes que la tipo IIP.
❀ Tipo IIB
❀ Corta en ambos lados de la secuencia de reconocimiento, liberando fragmentos pequeños
(ejemplo 34pb) que solo contienen la secuencia de reconocimiento.
❀ Son enzimas RM grandes y complejas que metilan al ADN, además, de escindirlo.
❀ Funcionan sin MTasas acompañantes.
❀ Son bipartidas y comprenden 2 semisitios específicos separados por un breve espacio no
especifico.
❀ Compartes características comunes, con las enzimas tipo I
❀ El corte produce salientes 3’ de 2 a 5 bases.
❀ Estas enzimas tipos IIB pueden ignorar las secuencias de reconocimientos (modo natural);
puede cortarlo (modo restricción) o bien pueden metilarlo (modo modificación). No está
claro cómo se implementan estos modos alternativos, pero es probable que la señal sean
los estados de metilación en los 3 sitios de reconocimiento.
❀ Las enzimas de este tipo así como otras, menos las de tipo IIP, antes de realizar el corte
analizan la situación:
 Varias secuencias no están metilada, la reconoce como ADN exógeno y lo corta.
 Si una no está metilada, se suprime el corte y la secuencia se vuelve a metilar, ya
que la identifica como ADN que no se ha terminado de metilar y pertenece a la
bacteria.
 La mayoría son inactivadas como endonucleasas cuando se unen a sitios de
reconocimientos únicos y activas cuando se unen a dos sitios.
❀ Tipo IIC:
❀ Enzimas combinadas, tienen actividad endonucleasas y metiltransferasa.

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 ❀ Para muchas enzimas tipo IIC, la eficiencia de corte aumenta cuando el sustrato del ADN
contiene múltiples sitios de reconocimiento o cuando se añaden oligos que contienen
secuencias de reconocimientos. Ejemplo: MmeI; NmeAIII; BpuSI.
❀ Tipo IIE
❀ Son sencillos y corte el ADN de manera eficiente independiente del número de sitios de
reconocimientos presentes en el ADN.
❀ Las enzimas tipo IIE también son enzimas Tipo IIP con dominios efectores alostéricos
que estimulan la catálisis cuando se unen a secuencias de reconocimiento adicionales.
❀ Tienen algunos miembros de este subtipo una intrigante conexión funcional con las
topoisomerasas de ADN. Ejemplo: NaeI (GCC/CCG)
❀ Algunos miembros forman bucles con el ADN que cortan y pueden ser estimulados por
oligos que contienen sus secuencias de reconocimientos para cortar sitio que de otro modo
seria refractario. La propiedad de formación de bucles y estimulación mediante la adición
de oligos específicos son típicos de estas enzimas.
❀ La función biológica no está clara, pero se cree que podría ser evitar que el propio ADN
de la célula se corte en sitios no modificados durante los periodos en los que la metilación
del ADN no logra seguir el ritmo de la síntesis del ADN.
❀ Tipo IIF:
❀ Se une a dos secuencias de reconocimiento y se corta coordinadamente, hidrolizando las 4
cadenas de ADN a la vez.
❀ Unen 2 o más secuencias
❀ Actúan como homotetrameros; sus sitios de unión son idénticos y catalíticos, pero
también tiene propiedades alostéricas o cooperativos.
❀ Algunos miembros de este subtipo reconocen secuencias asimétricas y otras secuencias
simétricas.
❀ El sitio de unión de cada homodímeros es catalítico, como homodimeros ordinarios, pero
no pueden cortar a menos que el otro sitio de unión también este ocupado. Ambos sitios
de unión deben estar ocupados, entonces, para que cualquiera de ellos este activo y
cuando lo están, ambas secuencias se cortan a la vez.
❀ Para mayor estabilidad, la unión de las dos secuencias deben estar en “cis” y no en
“trans” y esto da como resultado un bucle fuera del ADN intermedio.
❀ Existe una mutación (en interfase Bse6341) que inhibe la tetramerización y aun así el
corte es eficiente, es decir, la enzima puede cortar la secuencia de manera individual.
❀ Ejemplo: SgrAI; NgoMIV

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❀ Tipo IIG:
❀ Estimulada por AdoMet o lo requiere absolutamente.
❀ La mayoría de las enzimas Tipo IIB y IIC son de tipo IIG.
❀ Enzimas RM combinadas, como un dominio de corte de ADN y un dominio g de
metilación.
❀ La variedade de formas oligomericas, con o sin MTasas acompañante o separada.
❀ AdoMet es donante del grupo metilo, por lo que es esencial para la metilación pero
también es importante para el corte, se cree que es esencial para como activador
alosterico. Se cree, además, que una ventaja de la dependencia del AdoMet podría ser
autopreservación, ya que reduce la probabilidad de que el propio de ADN de la célula se
corte en momento de escasez de Ado Met y la consiguiente modificación.
❀ No se completa la digestión In vitro con este grupo de enzima, debido a su actividad de
metilación y corte del ADN.
❀ La mayoría de las procariotas codifican no mas de REasas tipo IIG junto con una variedad
de enzmias tipo I, tipo IIP, tipo IIS, y con menor frecuencia, Tipo III.
❀ Ejemplo: MvaI, HinP1I, BpuSI
❀ Tipo IIH:
❀ Menos importante
❀ Son enzimas que están entre tipo I y tipo III
❀ Tipo IIM
❀ Requieren secuencias de reconocimiento metiladas.
❀ Muy útiles para experimentos de mutagénesis dirigida al sitio
❀ Presentan DpnI dependencia absoluta de las adeninas, pero aun no está muy claro como
ocurre o a que se debe, otra dependencia dentro de su secuencia de reconocimiento. Los
grupos metilo pueden aumentar la afinidad entre una proteína y una secuencia de ADN a
través de interacciñones hidrofóbicas. Estos grupos metilo pueden producir cambios
conformacionales, esto interfiere y evita la unión.
❀ Tipo IIP:
❀ Las más ubicuas y variadas
❀ Reconoce secuencias simétricas (palindromicas)
❀ Corta simétricamente dentro de la secuencia de reconocimiento. Aunque, con mucha
menor frecuencia se han observado enzimas que cortan en el límite de la secuencia de
reconocimiento.

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 ❀ Acompañada de 1 o en raras ocasiones de 2 MTasas separadas, con una especificidad de
secuencias idénticas.
❀ Algunas actúan como monómeros, pero la mayoría actúan como homo o heterodimeros, y
su duplicación estructural explica su simetría en especificidad y catálisis. Siendo
principalmente homodimeros.
❀ Los multímeros cortan las cadenas en el mismo evento.
❀ Los monómeros cortan el ADN una hebra a la vez pero sn liberación del intermedio
mellado, lo que indica, que la misma enzima cortan ambas cadenas de ADN en cada
secuencia de reconocimiento, primero una cadena y luego la otra. Las REasas
monomericas deben disociarse de la secuencia de reconocimiento después del primer
corte, rotar 180º y luego volver a asociarse en la orientación opuesta para cortar la otra
cadena (segunda hebra). Esto lo hace sin separarse del ADN.
❀ Las secuencias de reconocimiento tipoIIP suelen tener una longitud de 4 a 8 pb, estas
secuencias pueden ser continuas (ej. HindIII) o discontinua (ej. HinfI) con pares de bases
interno no especifico.
 Discontinuos ejemplos:
 1 para de base no específico ej. HinfI = G/ANTC
 2 para de base no específico ej. Hpy188III =TCU/NGA
 3 para de base no específico ej. DRAIII = CACNNN/GTG
❀ Los cortes producen extremos pegajosos o cohesivos y también extremos romos (sin
cadenas desapareadas)
❀ Se conocen cientos de especificidades, las Reasas de especificidad idéntica y secuencia de
aminoácidos similares puede encontrarse en otras bacterias y arqueas, estos son llamadas
isoesquisomeros y esto representan versiones divergentes de la misma enzima ancestral,
cuyo gen se ha movido lateralmente entre procariotas y ha acumulado cambios naturales
con el tiempo.
❀ Ejemplo: EcoRI, PsTI, AscI, XmnI
❀ Son simétricas relativamente pequeñas y menos difíciles de cristalizar, se han cristalizado
aprox 35 enzimas en total.
❀ Aprovechan la dimerización para el corte del ADN, así como para el reconocimiento
mediante el uso de 2 copias del mismo sitio catalítico para yuxtaponer las 2 cadenas de
ADN.
❀ Tipo IIS
❀ Corte el ADN en posición fija fuera de la secuencia

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 ❀ La cortada se desplaza hacia un lado de las secuencia, a 1 o 2 vueltas de la doble hélice.
❀ Todas las enzimas tipoIIB sin también tipo IIS, igual ocurre con las tipo IIC y IIG que
pertenecen a este grupo IIS, poruq cortan fuera de la secuencia de reconocimiento.
❀ Son generalmente más grande del tipo IIP y comprende un dominio de reconocimiento
especifico de secuencia, un enlazador o brazo de conexión y un domino de corte de ADN-
C terminal sin especificidad de secuencia.
❀ Secuencias de reconocimiento suelen ser asimétricos y tiene lugar en un solo lado. Si
fuese simétrico, ambos lados se dividirán, primero uno y luego el otro.
❀ Suelen ir acompañada de 2 MTasas separadas, cada una de las cuales modifica una cadena
de la secuencia de reconocimiento al metilar una adenina o una citosina en esa cadena.
❀ Ejemplos: FokI es la enzima más estudiada y caracterizada del tipo IIS. Otros ejemplos:
BdvI, DpnII
❀ Tipo IIT
❀ Enzimas que actúan como heterodímeros
❀ Comprende 2 subunidades diferentes, tienen un tamaño similar y ambas participan en el
reconocimiento de secuencias, así como la catálisis.
❀ Dos sitios catalíticos diferentes
❀ Corta dentro o muy cerca de un solo lado de la secuencia
❀ En general, van acompañada de 2 MTasas separadas, una para modificar cada hebra de su
secuencia de reconocimiento asimétrico.
❀ Ejemplos: Bpu10I, BbvCI, BslI, BtsI, BsrDI, BspD6I

TIPOS DE CORTE QUE ORIGINAN LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Algunos sistemas cortan las dos hebras del ADN junto en el centro de simetría del palíndromo, esto da
como resultados 2 fragmentos de ADN bicentenario, cuyos extremos NO contienen bases desapareados,
estos tipos de enzimas producen lo que se conoce como extremos romos o Blunt end.

Las uniones entre fragmentos ROMOS son más inespecíficas, ya que no depende de la
complementariedad de regiones monocadena.

Ejemplos de enzimas que producen extremos Romos: SspI; SmaI; PvuII; HaeIII; AluI

Otras enzimas cortan cada hebra en puntos distintos del palíndromo, pero simétricos, resultando en dos
fragmentos de ADN bicentenario, cuyos extremos tienen bases desapareadas, estos se denomina extremos

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cohesivos, también llamados escalonados, extremos pegajosos o Sticks end. Los extremos cohesivos
pueden ser con saliente en el extremo 30 o con saliente en el extremo 5’.

Imágenes obtenidas de (Herráez, 2012)

❀ Ejemplos de enzimas que producen extremos cohesivos con saliente 5’: Acc65I; BamHI; BglII;
EcoRI; HindIII; MboI; NotI; Sau3AI; Tth111I.

❀ Ejemplos de enzimas que producen extremos cohesivos con saliente 3’: KpnI; PvuI; PsTI.

❀ Entre estas enzimas que producen extremos compatibles puede ocurrir que produzcan extremos
cuyo saleintes tienen la misma secuencia y estas enzimas pueden trabajar juntos. Ejemplos:
BamHI; BglII; MboI.

❀ También hay enzimas isoesquizomeros, enzimas que reconocen la misma secuencia, pueden
cortar en el mismo punto o bien se diferencian en que el corte o la metilación asociadas tienen
lugar en puntos distintas dentro de esa secuencia común de reconocimiento. Ejemplo: MboI;
Sau3AI; Acc65I; KpnI.

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Imagen tomada del libro Biología molecular. Fundamento y aplicaciones 2013

Isoesquisómeros: son enzimas de restricción obtenidas de diferentes especies bacterianas pero que
reconocen la misma secuencia ADN blanco, aunque no necesariamente cortan exactamente en el
mismo lugar y puede requerir alterar condiciones para la actividad enzimática.

Isocaudomeros: enzimas de restricción que tienen ligeramente diferentes secuencias de

reconocimiento, pero cuando corta en ADN generan secuencias terminales idénticas.

Neoesquisomeros: son un subconjunto de las enzimas de restricción isoesquisómeros que tienen el

mismo secuencia de reconocimiento, pero cortan en lugares diferentes, pero generan diferentes
extremos desapareados.

Ejemplo de neoesquisomeros: Asp718 y KpnI; Ambas reconocen la secuencia 5’-GGTAC-3’ pero

Asp718 corta el enlace entre GG mientras que KpnI corta entre AC. SphI (aislada de Streptomyces
phaeochromogenes) y BbuI (aislada de Bacillus ssp.) ambas cortan en un sitio común y reconocen la
misma secuencia CGTAC/G.

Imagen tomada del libro Biología molecular. Fundamento y aplicaciones

2013

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✿

Tabla obtenida de (Herráez, 2012)

FRECUENCIA DE RECONOCIMIENTO DE LA SECUENCIA EN LA MOLÉCULA DE ADN

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 El número de reconocimientos de la secuencia para una enzima de restricción especifica en el ADN
blanco se calcula conociendo la longitud del ADN que se va a digerir y puede ser calculado
matemáticamente. El cálculo matemático asume que los nucleótidos están ordenados de manera al
azar y que los 4 nucleótidos están presentes en igual proporciones (ejemplo; %G=%C=%A=%T), para
realizar el cálculo se considera el número de nucleótidos que corresponde la secuencia de
reconocimiento de la enzima de restricción.

Calculo:

4n=X

4= corresponde al número de nucleótidos (son 4 nt: adenina, timina, guanina y citosinas)

n= número de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (ejemplo de

4 a 8 nt)

X= cantidad de nucleótidos que ocurre el corte.

✿ Ejemplo 1: enzima con secuencia de reconocimiento de 4nt  44=256 nucleótido. Esto quiere
decir que el corte ocurre cada 256 nucleótidos.

✿ Ejemplo 2: enzima con secuencia de reconocimiento de 6nt  46=4096 nucleótido. Esto quiere
decir que el corte ocurre cada 4096 nucleótidos.

En la practica el numero obtenido del cálculo es un aproximado, ya que nunca se debe suponer que los
4 nt están repartidos en el mismo %. Si se desea conocer el cálculo exacto se debe hacer un estudio de
secuencia blanco en la enzima y con los datos del número de nt que forman la secuencia de
reconocimiento para esa enzima especifica.

Ejemplo: suponiendo un menor %GC< 50% los valores ya no darían como el ejemplo anterior, ya que
él %GC no es igual al %AT, por lo tanto %GC no es 50%. La molécula del ADN lambda= 49Kb de
longitud su ADN y contiene 12 sitios de restricción para una enzima de 6nt en su secuencia de
reconocimiento, indicando lo ante expuesto, que él %GC<50%.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

❀ El manejo y conservación inadecuada de las enzimas de restricción disminuye si vida media y en

consecuencia su actividad enzimática.

❀ Las enzimas de restricción deben ser conservadas a -20ºC.

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 ❀ Se debe almacenar en alícuotas para evitar procesos de congelación y descongelación constante.

❀ Se debe diluir a un volumen determinado de glicerol

❀ Al momento de ser uso se debe hacer en un envase con hielo o un contenedor que produzca la
menor variación de temperatura posible.

SELECCIÓN DE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ADECUADA

❀ Todos los organismos cuentan con un mapa de restricción que indica la posición donde se
encuentran los sitios de restricción y que enzimas cortan.

❀ Cuando se realizará el clonamiento lo primero es revidar el mapa de restricción para verificar los
tupos de enzimas de restricción y sitios de corte, el mapa ofrece un listado en orden alfabético de las
enzimas de restricción que cortan al plásmido, sitio de corte, tipo de corte, número y tamaño de cada
fragmento generado.

❀ Existen bases de datos que permiten introducir la secuencia del plásmido y se obtiene el listado de
las posibles enzimas de restricción que reconocen la secuencia blanca.

❀ La selección de la enzima de restricción a utilizar depende del objetivo de la investigación.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

❀ Pureza biológica del ADN: presencia de contaminación con otro ADN el buen funcionamiento de
la enzima.

❀ Presencia de otras contaminantes: detergentes y estabilizadores (Dodecil Sulfato de Sodio –SDS-):

Acido etilendiaminotetraacetico-EDTA-; ya que concentraciones elevadas de sales y detergentes inhiben
la actividad enzimática.

❀ Modificación del pH y temperatura de incubación, también inhibe la actividad enzimática.

❀ Grado de metilación del ADN, ya que algunas enzimas se inhiben su actividad por metilación de
ciertas secuencias.

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 ❀ El tiempo de incubación puede ser incrementado si la enzima está cerca de su fecha de caducidad
y su actividad está disminuyendo, pero no se puede aumentar mucho la temperatura ya que se puede
degradar el ADN.

❀ Es importan seguir las instrucciones que viene con cada una de las enzimas, estas instrucciones
indican: temperatura optima de incubación, necesidad y concentración de aditivos (ejemplo albumina,
ATP, etc.) todo calculado para un volumen determinado de solución o reacción. En el inserto informativo
de la enzima también indica método de almacenamiento y conservación; la concentración del ADN
blanco, protocolo de incubación de la reacción, diluciones para reaccionar y electroforesis. La
concentración de enzimas se expresa en U/µl para el volumen de una reacción.

❀ Una unidad de enzima de define como la cantidad de enzima requerida para producir la digestión
completa 1mg de ADN en 60 min a la temperatura optima de incubación.

CANTIDAD ADECUADA DE ENZIMA PARA UN ENSAYO

La cantidad de enzima utilizada en una reacción dependerá de la concentración de ADN en la muestra a

digerir. La concentración de la enzima está descrita en la hoja de instrucciones del proveedor, como
unidades por microlitro (u/μl). Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima requerida para
producir la digestión completa de un microgramo de ADN sustrato en 60 minutos a la temperatura óptima
de acción de la enzima. El tiempo de incubación de la reacción puede ser incrementado si la enzima
utilizada está cerca de su fecha de caducidad y su actividad está mermando. Sin embargo, el tiempo no
debe incrementarse demasiado, pues, aunque el ADN es una molécula resistente, se corre el riesgo de su
degradación.

ADN ligasa
❀ El ADN ligasa es una importante enzima celular, su función es reparar enlaces fosfodiéster rotos
que pueden ocurrir a azar o como consecuencia de replicación de ADN o recombinantes. En ingeniería
genética es usado para sellar discontinuidades en las cadenas fosfato-azúcar que ocurre cuando se realiza
recombinación genética de ADN o ADNc, donde los fragmentos de ADN se unen gracias a la acción del
ADN ligasa. Esta función es crucial para el desarrollo de diferentes experimentos, y el ADN ligasa es
además una enzima clave en ingeniería genética.

❀ La enzima ADN ligasa mas empleada en experimentos es la T4 ADN ligasa. Aunque la enzima
ligasa es más efectiva en fragmentos con extremos cohesivos. La T4 ADN ligasa es purificada de la

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bacteria E coli infectada con el bacteriófago T4. La enzima trabaja mejor a 37ºC, pero puede trabajar a
temperatura entre 4-15ºC, para prevenir la desnaturalización de regiones cortadas pares de bases contiene
los extremos cohesivos de moléculas de ADN.

❀ El ADN ligasa desempeña un rol en las células durante el proceso de replicación, en particular,
tiene mucha relevancia en la síntesis de la cadena retrasada del ADN para unir los fragmentos de Okazaki
entre sí, esto da a conocer que el ADN ligasa presenta una actividad opuesta a las nucleasas. Estas ligasa
requieren de la presencia de un grupo fosfato (P’) en el extremo 5’ de una hebra de ADN y un grupo OH -
en el extremo 3’ de la otra. Estos extremos se unen formando un enlace fosfodiéster usando la enzima del
bacteriófago T4 ADN en presencia de ATP.

❀ Aunque la acción de la ligasa es opuesta al de la nucleasas, ambas requieren de energía.

TRANSCRIPTASA REVERSA

❀ La transcriptasa reversa es una DNA polimerasa dependiente de RNA. La enzima usa RNA como
un templado para sintetizar una cadena completa de ADN complementaria, formándose un hibrido de
ARN:ADN la Enzima requiere para su reacción una ADN o ARN primer con extremo 3’-OH

❀ La transcriptasa reversa se utiliza para la síntesis de ADN Complementario (ADNc), se emplea

para librería genómica de ADNc y PCR.

FOSFATASA Y KINASA

❀ La fosfatasa alcalina remueve residuos de fosfatos de extremos 5’. Esta enzima es usada para
reducir el Backgraund en experimentos de ligación con fragmentos de ADN ligado a vectores plasmidico.

❀ La desfosforilación es comúnmente usada en clonación para que los vectores de ADN no vuelvan
a su forma circular durante el proceso de ligación, evitando que se forme productos de vectores de ADN
sin el inserto durante el paso de transformación.

Enzimas de Modificación
❀ Fosfatasa: son enzimas remueve hidrolíticamente remueve grupos fosfatos de la molécula de
ADN, remplazando estos grupos hidroxilos. El grupo fosfato terminal izquierdo son necesarios para la

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enzima de restricción para más reacciones de ligación, y la aplicación de fosfatasa en ligación de bloques
no deseados. La reacción de fosfatasa puede ser rápidamente inactivadas por calentamiento, esto es útil
cuando se desea terminar la actividad de la fosfatasa previo a una ligación.

❀ Polimerasa: se conoce 5 clases de polimerasa de ADN o ARN

❀ ADN polimerasa dependiente de ADN: esta enzima sintetiza ADN en dirección 5’ 3’ usando un
templado de ADN. Tienen actividad Exonucleasa 5’ 3’ y 3’ 5’. Esta característica puede ser
explorado en diferentes vías. Estas enzimas son ADN polimerasa termoestables con una particular
importancia para la amplificación por PCR. Estas enzimas son aisladas de bacterias termófilas como:
Thermus aquaticus, themococcus litoralis, pirococcus furiosus, algunas de estas bacterias resisten
temperatura elevadas de 100ºC y su polimerasa de ADN puede funcionar efectivamente in vitro a muy alta
temperatura. El ADN polimerasas son esenciales para la replicación de ADN viral en ausencia de la célula
hospedadora. La Ta ADN polimerasa tiene una particular actividad Exonucleasa 3’5’.

❀ ADN polimerasa dependiente de ARN: estas enzimas son conocidas como transcriptasa reversa,
abreviada RTasas, tiene la habilidad sintetizar la cadena complementaria al ARN formándose el hídrico
ARN:ADN, para finalmente obtener cadenas dúplex de ADN que son copas complementarias del ARN,
este ADN es denominado ADN complementario (ADNc). Es de mayor utilidad cuando se desea procesar
o estudiar genomas de ARN como el caso de retrovirus, con este ADNc se puede realizar PCR, librería de
ADNc, etc. Estas enzimas son obtenidas de Mioloblastosis virus aviar (AMV:Avian Myeloblastosis Virus)
y de virus leucemia moloney murino (M-MLV: murine moloney leukaemia virus)no tiene actividad
Exonucleasa 3’  5’, lo que hace que la enzima tenga una tasa de errores mayores que la ADN
polimerasa, donde en condiciones estándar puede incorporar 1 error cada 500 nucleotidos.

❀ ARN polimerasa dependiente de ADN: presente en virus que son capaces de producir o codificar
su propia ARN polimerasa. La ARN polimerasa del fago puede inactivar la ARN polimerasa de la celula
hospedadora para mantener la transcripción de su propio genoma. La ARN polimerasa de fago como T3,
T7, SP6 puede ser usada in vitro o in vivo

❀ Polimerasa independiente de Templado: algunas enzimas pueden añadir 1 o más nucleótidos a una
molécula sin depender del templado. 2 enzimas son particularmente importantes, uno es transferasa
terminal de timo de ternero. La enzima puede originas una serie de deoxynucleotidos 1 por 1 al extremo 3’
de una molécula de ADN. Estas enzimas se usan en PCR. Siendo un ejemplo la Taq polimerasa, también
se emplea en clonamiento de productos de PCR.

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 ❀ ARN dependiente de ARN polimerasa (esta en particular tiene poca importancia de tecnología de
ADN recombinante. Son síntesis de copias de moléculas de ácidos nucleicos y son ampliamente usadas en
ingeniería genética).

❀ Exonucleasa: tienen la función de eliminar o cortar los extremos despareados de ADN. Las células
tienen Exonucleasa que no están asociadas con ninguna actividad polimerasa. Estas enzimas se san para la
construcción de clones de ADN y para blancos de mutagénesis. La utilizado o añadida y el tiempo de
incubación controlando los parámetros, son importantes en la manipulación del ADN por dilección.

Vectores de clonamiento usados en la producción del ADNr y sus características

La introducción de un ADN externo o foráneo en una célula anfitriona en muchos casos requieren el uso
de vectores. Los vectores son moléculas de ADN usadas para transferir una secuencia de ADN o gen en
una célula anfitriona que puede ser animal, planta o microbiana, para proveer elementos de control para la
replicación y expresión. Los vectores usados son determinados por el tipo de célula hospedadora, tamaño
del fragmento de ADN o gen a introducir y el objetivo del experimento.

Los vectores son moléculas de ADN que se utilizan para transferir un gen o fragmento de ADN a una
célula hospedera (microbiana, animal o vegetal) para proporcionar elementos de control para la
replicación y la expresión. El vector a utilizar está determinado por el objetivo del experimento, el tipo de
célula hospedadora y el tamaño del gen que se desea clonar.

Los vectores de clonamiento permiten transferir material genético de un organismo (célula) a otro y
protegerlo de la acción de la célula hospedadora (sistema de defensa contra ADN externo). Esto permite
conferirle a la célula receptora del vector recombinante nuevas características, lo que ha permitido
revolucionar las diferentes áreas biotecnológicas como en el área de biomedicina, farmacéutica,
agricultura, industria de alimentos. Entre los ejemplos más interesantes están:

❀ Desarrollo de vacunas: COVID-19, insulina recombinante, VHB.

❀ Terapia génica para corrección de enfermedades hereditario.

❀ Desarrollo de cultivos transgénicos como: ricos en vitaminas, resistentes a plagas y enfermedades.

❀ El primer vector de clonamiento desarrollado fue el plásmido. Los plásmidos de ADN fueron
descritos por primera vez en bacterias. Los vectores actúan como un vehículo para transferir ADN en una
célula hospedadora. Existen otros vectores como: bacteriófagos, levaduras, virus, los cuales se usan para
varias aplicaciones.

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 ❀ Los vectores de clonamiento son usados para múltiples propósitos incluyendo transferencia y
expresión de transgenes dentro de la célula hospedadora par la recombinación de proteínas, conferir
características especiales al hospedador (ejemplo: características metabólicas, estructural, beneficio de
sobrevivencia, etc.) controlar la expresión de genes, edición del genoma, etc. En algunos casos los
vectores de clonamiento permiten la preservación de los ácidos nucleicos de interés mediante la
fabricación de librerías genómicas.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VECTORES:

❀ Habilidad para replicarse de forma independiente del genoma de la célula hospedadora (ejemplo:
bacterias, levadura, plantas, animales)

❀ Contiene un marcador genético para la selección de los vectores recombinante.

❀ Sitio de reconocimiento para una o más enzimas de restricción que permita la inserción del ADN
o ADNc de interés.

❀ Mínima cantidad de secuencia de ADN no esencial para el vector, que se pueda remover y
sustituir con el ADN exógeno.

❀ Los vectores de clonamiento varían en: estructura, diseño, tamaño, eficiencia de replicación,
capacidad para la inserción del ADN exógeno.

❀ Existen diferentes tipos de vectores, que varían en características, tamaño, eficiencia de

replicación y tamaño del ADN exógeno que son capaces de aceptar: Plásmidos, Cósmidos, Cromosoma de
levadura, Cromosoma Bacteriano Plásmido F, Cromosoma Humano, Vectores de plantan, Vectores
animales, Fagémidos, Bacteriófagos, virus, etc.

❀ Los vectores se pueden clasificar según el uso que se den en ingeniería genética:

❀ Vectores de clonamiento: su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de

grandes cantidades del ADN insertado. Los vectores de clonamiento sueles ser plásmidos, fagos,
fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos o de levaduras.

❀ Algunos Vectores/plásmidos también contienen una región promotora corriente arriba del sitio de
clonamiento múltiple, esto es lo que permite la transcripción y traducción del ADN insertado. En estos
vectores se debe tener cuidado para asegurar la inserción en el marco de la lectura adecuado. Estos
vectores se denominan Vectores de Expresión.

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 ❀ Vectores de Expresión: su objetivo es producir un transcripto de ARN o la proteína producto de
ese transcripto. Los vectores de expresión puede ser plásmidos o fagos.

❀ Una característica opcional en los vectores de expresión es añadir una secuencia de polihistidina
(secuencia que codifica 6 histidinas- ejemplo: 5’-CACCACCACCACCACCA-3’) para que la proteína
expresada tenga una polihistidina corta fusionada en el extremo N o C terminal. Esto permite la
purificación simple en un solo paso de la proteína fusionada mediante columnas de níquel. También se
puede usar otros tipos de poliproteínas.

LO QUE CONTIENEN LOS VECTORES:

Origen de replicación (ORI): es esencial que esté presente en el vector, ya que este ORI permitirá que
ocurra la replicación y propagación de la molécula de forma independiente del cromosoma de la célula
hospedadora. Es un componente crucial del sistema de plásmidos sin el cual el vector se perdería durante
la división celular. Por lo tanto, la secuencia ORI asegura que los plásmidos se repliquen y se distribuyan
durante la división celular.

Marcador seleccionable: es esencial para distinguir las células transformadas (las que poseen el vector
recombinante) de las que no lo tiene, ya que imparte un fenotipo característico especial, como resistencia a
antibióticos. Generalmente, estos marcadores son genes de resistencia a antibióticos (ejemplo: resistencia
a la ampicilina) pero también pueden ser genes de rutas metabólicas como el gen de triptófano, gen de
lactosa, etc., donde la inserción del gen a clonar interrumpe la función del gen, y por ende las células con
el vector recombinante no podrá activar esa ruta metabólica.

Sitio de restricción o Sitio de clonación (Región MCS): también son conocidas como regiones
policonectores, es un componente esencial de todo vector que contiene secuencias de reconocimiento para
varias endonucleasas de restricción. Son regiones que son reconocidas por enzimas de restricción y estos
sitios son usados para abrir el vector e introducir el gen o segmento de ADN a clonar el corte puede estar
ubicado incluso dentro de un gen propio del plásmido, por lo que, el gen insertado interrumpe la secuencia
del gen, afectando la función del gen, esto también es un mecanismo de marcador seleccionable para las
células transformadas. Un vector puede tener varios sitios de reconocimiento para diferentes enzimas de
restricción. Además, estos sitios de enzimas de restricción son exclusivos de la región MCS, ya que no
están presentes en ninguna otra parte del vector. Esto se hace para garantizar que le corte se realice en la
región MCS dejando intacto el resto del vector que, de lo contrario, se fragmentaria en pedazos.

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Tamaño del inserto: aunque el corte con enzimas de restricción solo reconoce una secuencia corta de pb,
el vector por admitir insertos de mayor tamaño, esto varía entre diferentes tipos de vectores, siendo esta
una característica importante en el diseño experimental, y en el objetivo del ensayo.

Elevado número de copias de vectores por células hospedadora: un elevado número de copias es
deseable, pero no esencial, para maximizar el número de células transformadas y el número de copias de
vectores por células transformada, se busca que sea el más alto posible. El número de copias del vector
que se puede obtener varia de un tipo de vector a otro, de allí que existan vectores muy restringidos que
solo permitan 4-5 copias máximo, mientras que otros son más relajados y se puede obtener entre 15-20
copias del vector por célula transformada. Los vectores con alto número de copias son deseables si se
busca un alto rendimiento del ADNr pero no lo son si se desea observar los efectos adversos que ocasiona
el gen 8º la proteína que es codificada por el gen) en la célula anfitriona.

Evitar la propagación del vector a otras células anfitrionas que no son de interés: desde inicio de los
experimentos de clonación una de las principales preocupaciones es que el vector se inserte en una célula
hospedadora que no sea de interés, esto se logró evitar eliminando el gen que le permite al plásmido esta
movilidad, por ejemplo: la capacidad del gen MOD presente en los plásmidos son los que permite la
movilidad de estas moléculas de una célula a otra por conjunción, como el caso del plásmido pBR322. Sin
embargo, si la célula anfitriona tiene un plásmido que contenga esta capacidad de conjugar, puede
transmitir este gen al plásmido que no lo posee o que se le haya eliminado el gen MOD, para evitar esto
también se elimina los genes NIC y bom del plásmido que podría movilizarse, ya que en estas regiones es
donde actúan las proteínas adaptadoras por los demás plásmidos, en ejemplo: es el vector a los que se le
ha eliminado esta región es el pUC.

Promotores: los promotores juegan un rol fundamental en la expresión génica. Tiene un tamaño de
aproximadamente 100 – 1000 pb y están ubicados aguas arriba del gen de interés. La secuencia promotora
modula la unión de la ARN polimerasa, así como otros factores de transcripción, y por lo tanto, es crucial
elegir un promotor adecuado para un plásmido/vector. Es importante asegurarse de que el promotor sea
compatible con el vector plamídico, así como en la maquinaria de transcripción del sistema anfitrión en el
que se introduce posteriormente para su expresión. Los promotores bacterianos son menos complejos y
distintos de sus homólogos de mamífero. Para un control estricto de la expresión se ha creado promotores
sintéticos que no permiten la expresión con fugas de proteínas toxicas. Aunque están disponible
promotores constitutivamente activos. Los promotores inducibles han ganado una enorme popularidad ya
que pueden activarse o desactivarse (mediante el calor, luz, productos químicos, etc.), basado en función
de los requerimientos experimentales individuales. Un ejemplo de promotor constitutivo de uso común es
el T7 (del bacteriófago T7), que requiere la ARN polimerasa T7 para su activación. Una versión

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modificada de T7 es T7lac en la que la ARN polimerasa está controlada por el operón lac, por lo que es un
operón inducible.

Un operón inducible negativamente utilizado de forma rutinaria incluye el promotor plac. Aunque este
promotor es constitutivamente activo, puede ser reprimido por el represor Lacl del sistema bacteriano de E
coli. Brevemente, en condiciones normales, cuando la lactosa está ausente del medio de cultivo, el operón
se encuentra en estado reprimido. En presencia de la lactosa o del IPTG (Isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside—un análogo de la lactosa) son activadores, por lo que, hace que la represión sea
eliminada.

Criterio para elegir un plásmido/vector para clonación

Hay ciertas propiedades importantes de los plásmidos, que se debe tomar en consideración antes de iniciar
el proceso de clonación.

Tamaño del inserto: cada vector tiene s propia capacidad con respecto a la captación del tamaño del
ADN exógeno (inserto), este se denomina tamaño del inserto. Si el inserto está más allá de la capacidad
del vector, surge la posibilidad de defectos en la eficiencia de la replicación del vector, especialmente en
los plásmidos/vectores de alto número de copias. Los vectores que aceptan tamaños grandes de insertos se
usan para generar librerías genómicas.

Número de copias: una de las propiedades deseables de un plásmido/vector seria poder producir un gran
número de copias del vector recombinante. Este rendimiento dl vector depende del sistema del anfitrión.
El número de copias depende del control del inicio de la replicación de la secuencia ORI. Para los vectores
de clonación siempre es deseable un alto número de copias para obtener un buen rendimiento del
plásmido. Sin embargo, a veces, un número de copias muy alto resulta indeseable, ya que podría
sobrecargar innecesariamente la maquinaria de replicación de la célula anfitriona. Además, hay varios
plásmidos/vectores de bajos números de copias que se han diseñado para clonar algunos genes con
características distintas que, de lo contrario podrían ser tóxicos para el sistema de la célula anfitriona.

Sitio de clonación múltiple (MCS): la clonación suele implicar la digestión del plásmido/vector y el
inserto de ADN exógeno con el mismo conjunto de enzimas de restricción para generar extremos
cohesivos compatibles seguido de la ligadura de los extremos compatibles generados, los
plásmidos/vector que generalmente se usan hoy en día, consiste en un sitio de clonación múltiple (MCS) o
la región polienlazadora en su columna vertebral en la que se concentran todo los sitios de enzimas de
restricción. También se garantiza que estas secuencias no se encuentran en ninguna otra parte del
esqueleto del plásmido. Para elegir un sitio de restricción adecuado en el MCS para la inserción del gen

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extraño, es importante confirmar que la secuencia del gen diana completa no contiene la secuencia de
reconocimiento de la enzima de restricción que se utilizará. Por lo tanto, cualquiera de las enzimas de
restricción que cumpla con este criterio puede usarse para la clonación.

Tipos de vectores de clonamiento:

Los vectores se pueden clasificar en dos tipos: vectores de clonamiento y vectores de expresión. Hay una
gran selección de vectores bacterianos (principalmente E coli.) se puede obtener comercialmente. Los
plásmidos se dieron a conocer por primera vez en 1952 cundo un joven científico llamado Joshua
Lederber en el citoplasma hereditario en bacterias cundo usan el termino plásmido por primera vez. Más
tarde los plásmidos fueron encontrados en otras especies procariotas incluyen bacterias y arqueobacterias.
Sin embargo, el termino plásmidos fue concebido en 1990 en la conferencia “plásmidos promiscuos” en
USA-California.

Plásmidos:

Los plásmidos para clonamiento se replica por si mismos en el interior de la célula anfitriona, para
producir copias idénticas de ellos mismos, denominados clones. Dado que los plásmidos de clonación solo
son capaces de hace copias de los insertos deseado, no albergan elementos reguladores necesarios para la
transcripción y traducción del inserto en su producto proteico. Así el objetivo de los plásmidos de
clonación es el mantenimiento y la ampliación del gen insertado para obtener un gran número de copias
puras para manipulaciones y estudios posteriores.

Al principio, la clonación se hacía con plásmidos naturales como ColEI y PSC101. ColEI lleva el nombra
de la colicinas EI que codifica. PSC101 fue uno de los primeros vectores bacterianos utilizados para la
clonación por Boyer y Cohen en 1973. Aunque estos plásmidos naturales permitieron llevar a cabo los
ensayos de clonación no tenían una gran flexibilidad para clonar de manera específica. Para solventar esto
surgieron diferentes plásmidos diseñados, como el pBR322, siendo uno de los más usados por su robustez
y capacidad para proporcionar una amplia gama de opciones. Una gran cantidad de otros plásmidos se han
diseñado para necesidades de clonación específicas. Los plásmidos de copias múltiples son los más
adecuados para clonación, ya que permite la síntesis de copias grandes de inserto.

Los plásmidos son pequeñas moléculas extracromosómicas circulares de ADN doble cadena, con
características particulares. Se replican y se transmiten independientemente del cromosoma de la célula
anfitriona. De manera natural son materiales genéticos móviles de la célula que contribuyen al material

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genético de la misma célula anfitriona, como: resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se mantienen
no integrados en el cromosoma de la bacteria, no integrativos, puede haber múltiples copias del mismo
plásmido, mientras que, los plásmidos integrativos, es decir integrados en el genoma de la bacteria
anfitriona, también llamados episomas, se pueden mantener estable en esta forma a través de numerosas
divisiones celulares. El tamaño y el número de copias de un plásmido en la célula anfitriona es importante
de conocer cuando se realiza clonación. Cuando la bacteria se reproduce el plásmido se transmite a las
células descendientes o hijas por distribución equitativa del citoplasma bacteriano durante la división
celular. Sin embargo, los plásmidos se pueden transmitir a través de los pili bacterianos. La replicación y
transcripción de los plásmidos dependen de la maquinaria enzimática de la célula hospedera.

Los plásmidos empleados como vectores por lo general están formados de ADN de 1kb para los
plásmidos/vectores más pequeños hasta 250kb para los más grandes, lo que facilita el análisis de los
insertos incorporados a él. Se considera que un tamaño de 10kb en los plásmidos es deseable como vector
de clonamiento. Los plásmidos se han manipulado genéticamente con la finalidad de mantener la
fidelidad de las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadir otras características
deseables que no poseen normalmente o de forma natural.

Los plásmidos son capaces de trasportar 1 o más genes y estos genes son responsables por brindar a la
célula hospedada nuevas características, por ejemplo: habilidad para sobrevivir concentraciones toxicas de
antibióticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, el plásmido confiere genes de resistencia a los
antibióticos. En el laboratorio esto confiere genes marcadores para identificar las células receptoras de
plásmido recombinante.

Hoy en día existen cientos de plásmidos disponibles comercialmente que ofrecen un amplia gama o
variedad de posibilidades en relación a las enzimas de restricción que se van a emplear para la clonación;
longitud del inserto; marcadores de selección de los clones transformados. Entre los plásmidos más
utilizados: pUC19, p6LO, pBR322 y pBluescript.

Imágenes tomada de (Brawn T.A, 2016)

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Características Básicas de los plásmidos
❀ PESO MOLECULAR O TAMAÑO: son relativamente pequeños comparado con el cromosoma de la
bacteria de 2 a 5 Kb, tanto para la transformación eficiente de la célula anfitriona y la entrega del ADN.
Separado del cromosoma de la bacteria.

❀ ORIGEN DE REPLICACIÓN (ORI): sitio para la replicación del ADN, los plásmidos se replican de
forma independiente del anfitrión. El número de plásmidos es una célula bacteriana son llamados números
de copias. El número de copias normal en la mayoría de las células bacterianas es pequeño, usualmente
menor a 12 plásmidos por célula, aunque esta información varia algunos autores reportan menos de 25
copias de plásmidos por célula. Los plásmidos solo poseen 1 solo sitio de replicación (ORI) y realiza
replicación unidireccional. Los plásmidos pueden ser de número de copias bajos (menos de 25 copias de
plásmidos por células), o números de copias elevados se refiere a mayor de 100 copias de plásmidos por
célula. Este es un factor clave para determinar la concentración de ADN por mililitro de caldo LB: bajo
número de copias 0,2 a 1 µg de ADN/ml de caldo LB; alto número de copias 3 a 5µg de ADN/ ml de
caldo LB. Los plásmidos con elevado número de copias pueden incluso replicar desde cientos hasta miles
de plásmidos/célula.

❀ MÚLTIPLES SITIOS DE CLONAMIENTO (MCS): también llamado Polylinkers con sitios de

reconocimiento para diferentes enzimas de restricción. Estos sitios son los utilizados para incorporar
segmentos de ADN para su clonado, etc. El tamaño de este segmento o inserto varía según el tipo de
vector y plásmidos, existen plásmidos que pueden incorporar hasta 10Kb, aproximadamente. Esto MCS
están muy cercanos entre sí, amplia gama de posibilidades de inserto cualquier fragmento de ADN. Sin
embargo, es crucial asegurarse de que estos sitios no estén ubicados en otra parte del plásmido que pueda
ocasionar que se afecte alguna de las funciones o genes del esenciales para el plásmido.

❀ GENES MARCADORES DE SELECCIÓN: los plásmidos vectores deben ser capaces de conferir a la
célula anfitriona un fenotipo seleccionable o una ventaja seleccionable, que distinga a la célula con el
vector recombinante de las que no lo poseen el vector recombinante. Estos genes son utilizados en
ingeniería genética y en RDT para la identificación de bacterias que transportan el plásmido recombinante
(con el inserto). Algunos de los marcadores más comunes son: (i) resistencia a los antibióticos: resistencia
a la ampicilina, tetraciclina, etc.; (ii) otros metabolitos: gen Lac Z, usado en la selección azul-blanco; (iii)
proteína fluorescente verde (GFP: Green Fluorescent Protein) o proteína fluorescente roja (RFP: Red
Fluorescent Protein)

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 ❀ SECUENCIAS PROMOTORAS ARN POLIMERASA (SOLO PARA VECTORES DE EXPRESIÓN): esta
secuencia se emplea para la transcripción de los ARN de forma in vivo e in vitro por la ARN polimerasa.
Se emplea de forma in vitro para sintetizar sondas de ARN las cuales se usan en la expresión de genes.

Imagen tomada del (Bose, 2022)

Tabla tomada de (Brawn T.A, 2016)

Los plásmidos grandes pueden ser adaptados para clonación en algunas circunstancias.

Los factores que controlan el número de copias de plásmidos en una célula bacteriana simple, aun no se
conoce muy bien. Algunos plásmidos, especialmente los grandes, son Rigurosos y tienen poco número de
copias por bacterias entre 1 0 2 copias, otros plásmidos llamados Relajados están presentes en múltiples
copias mayores o igual a 50 por célula anfitriona.

Los plásmidos se agrupan en dos categorías:

Plásmidos conjuntivos: se caracteriza por la habilidad para promover la conjugación sexual entre células
bacterianas, un proceso que puede resultar en un plásmido conmutativo de una célula a otra en un cultivo
bacteriano. La conjugación y transferencia de plásmido con controlados por un gen de transferencia
denominado gen Tra, los cuales están presentes en plásmidos conjugativos, pero ausente en los no

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conjugativos. Los plásmidos no conjugativos pueden, bajo algunas circunstancias co-tansferido con un
plásmido conjugativo cuando ambos están presentes en la misma célula.

Si dos plásmidos incompatibles se encuentran en la misma célula uno de los plásmidos sea eliminado de la
célula rápidamente. Diferentes tipos de plásmidos pueden estar asignados a diferentes grupos de
incompatibilidad en lo básico si puede o no coexistir, y plásmidos de un simple grupo compatibilidad con
frecuencia relacionado con otros en varias vías. La incompatibilidad básica aún no se comprende muy
bien, pero permite que durante los eventos de replicación se delimiten los fenómenos.

Clasificación de los plásmidos

La mayoría de las clasificaciones que ocurren naturalmente en los plásmidos están basados en
características codificadas por los genes de los plásmidos. Los 5 mayores tipos de plásmidos se clasifican
de la siguiente manera.

Plásmidos F o plásmido de fertilidad: transporta los genes Tra y no tienen características más allá de la
habilidad para promover la transferencia conjugal del plásmido. Ejemplo: plásmido F de E. coli

Plásmidos R o plásmido de Resistencia: transporta genes que confieren resistencia a la célula anfitriona a
1 o más agentes antibacteriales, tales como: ampicilina, tetraciclina, mercury, etc. Los plásmidos R son de
gran importancia en la microbiología clínica para determinar tratamientos a infecciones bacterianas.
Ejemplo: RP4, el cual es comúnmente encontrado en Psudomonas, per solo ocurre en algunas que otras
bacterias.

Plásmidos col: codifica colicinas, proteínas que matan bacterias. Ejemplo: ColE1 de E coli.

Plásmidos Degradativo: confiere habilidades especiales a la célula anfitriona de un metabolismo inusual,

por ejemplo: capaz de metabolizar tolueno o ácido salicílico. Ejemplo: TOL de Pseudomonas putida

Plásmidos de Virulencia: confiere patogenicidad en la célula anfitriona, esto incluye el plásmido Ti de

Agrobacterium tumefaciens, el cual induce enfermedad (Crown Gall) en plantas dicotiledóneas.

Plásmidos Conjugativo: son grandes, muestran un riguroso control de la replicación y están presentes en
pocas copias. pueden transferirse entre bacterias por el proceso de conjugación, el cual requiere funciones
específicas por la región Tra (trnsfer) y mob (mobilising) que transporta en el plásmido.

Plásmidos No Conjugativo: son plásmidos que no son capaces de transmitirse por ellos mismos de una
célula a otra, pero pueden ser movilizados si portan el gen mob por un plásmido conjugativo. Este tipo de
plásmido muestra una replicación relajada, están presente en muchas copias, y son de pequeño tamaño.

PÁGINA 40
(Herráez, 2012)

Plásmidos pBR
Los plásmidos pBR llamados así por los investigadores que lo descubrieron – Bolívar y Rodríguez – son
un grupo de plásmidos que se emplean ampliamente para clonación, permite confirmar la presencia del
inserto clonado mediante secuenciación. Además, se puede calcular la longitud exacta de cada fragmento
insertado. Un ejemplo de este grupo de plásmido es el pBR322 es el vector más común de esta serie de
vectores pBR, son varios plásmidos que forman parte de esta serie, cada uno con pequeñas diferencias en
sus características. Esta serie pBR también se ha empleado como plásmidos básicos para desarrollar más
vectores, al subclonar parte del vector y unirlos con otras secuencias de ADN, para formar un nuevo
plásmido/vector con diferentes características de clonación. Un ejemplo seria el plásmido pAT153 que se
derivó de la deleción de 2 regiones del plásmido pBR322usando enzimas de restricción HaeII, el tamaño
de la región removida es de 705pb, pero esto ha producido el efecto de aumentar el número de copias
aprox. 3 veces, pero se pierde la secuencia que permite la movilización. involucra una serie de
manipulaciones donde se colocaron segmentos de ADN juntos de 3 fuentes diferentes. Este plásmido tiene
las características de un buen vector: (i) bajo peso molecular; (ii) resistencia a antibióticos; (iii)ORI; (iv)
varios puntos de corte con enzimas de restricción.

El plásmido pBR322 es un plásmido muy famoso y es un requerimiento esencial como vector de

clonamiento. Es un plásmido de pequeño tamaño de 4362pb lo que le permite una fácil entrada a la célula
blanco, aumentando así la posibilidad de absorción por las células anfitrionas.

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 ❀ El plásmido consta de ORI (origen de replicación) de otro plásmido (pMB1), que se requiere para
el el plásmido pueda replicarse de manera independiente del cromosoma bacteriano. Este ORI
funciona solo en el sistema E coli., y no en ningún otro organismo.
❀ Presencia de la proteína Rop (codificada por el gen rop dentro del plásmido) esta proteína ayuda
en la formación de un complejo estable entre la ARN polimerasa I y II. Es también responsable de
controlar el número de copias del plásmido.
❀ El plásmido contiene también genes de resistencia a los antibióticos; el gen bla que codifica para
la -lactamasa proporciona resistencia contra los antibióticos -lactámicos como la ampicilina. El
gen ter confiere resistencia al antibiótico tetraciclina.
❀ Hay muchos sitios donde puede actuar las endonucleasas de restricción, dentro de los genes de
resistencia a antibióticos. Siempre que se utilicen estos sitios para la clonación, existe una
inactivación por inserción del gen de resistencia a los antibióticos, lo que ayuda a la selección de
plásmidos recombinantes. La clonación en otra parte del plásmido seria de menor utilidad ya que
no se inactivaría ninguno de los genes de resistencia a los antibióticos; por tanto, la selección de
recombinantes sería difícil.
❀ El número de sitios de enzimas de restricción en el genoma pBR es de alrededor de 40. De estos,
11 sitios están dentro del gen tetA (resistencia a tetraciclina o tet) y seis están contenidos dentro
del gen ampR. esto brinda flexibilidad para clonar un inserto y elegir una resistencia antibiótica
adecuada.
❀ Hay 3 promotores P1, P2 y P3. Tanto P1 y P3 son para el gen de la -galactamasa. Mientras que,
P2 es el promotor natural, P1 se diseñó para crear pBR322. P2 se encuentra en la misma región
que P1 pero en la hebra opuesta. Desempeña el rol de iniciación de la transcripción en la dirección
del gen tet.
❀ pBR327 es uno de los derivados de pBR322 en el que se eliminan los nucleótidos del 1427 al
2516 para reducir aún más el tamaño de este vector. Se descubrió que este tramo eliminado
interfiere con la extensión del inserto en caso de pBR322. Las otras características como los genes
ampR y tet siguen siendo los mismos en ambos vectores.

Por lo tanto, los plásmidos pBR pueden ocupar un tamaño de inserción de 4-5kb, lo que no permite la
clonación de inserciones muy grandes. El número de copias de estos plásmidos es de alrededor 20-30
copias por células. Este número de copias es más bajo en comparación con muchos derivados del
plásmido pBR disponible son muchos más preferidos. Algunas de las ventajas de esos plásmidos es que al
ser de pequeño tamaño aumenta su eficiencia de transformación. Además, también existen derivados de
otros plásmidos con mayor número de copias. Por lo tanto, se puede obtener una gran cantidad de ADN
clonado. Los dos genes de resistencia a antibióticos presentes con sitios de enzimas de restricción para la

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clonación aumentan la flexibilidad de clonación. Por lo tanto, los plásmidos pBR son más adecuados para
clonar o subclonar un inserto de tamaño moderado, pero no son adecuados para clonar insertos grandes, ya
que la eficiencia de transformación y el número de copias de los plásmidos se ven obstaculizados si el
inserto clonado está más allá de la capacidad del plásmido.

Imagen tomada de (Bose, 2022)

Imagen obtenida de (Desmond, 2008)

r
En el vector pBR322 se indica regiones de los genes para la resistencia a la ampicilina (Ap ) y resistencia
r
a tetraciclina (Tc ), la región de replicación (ORI). Se indican sitios de corte para diferentes enzimas de

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restricción (AfllII; EcoRI; BamHI; SalI; PvuI; PstI) también se muestra una región que puede ser removida
del plásmido pBR322 para generar otro plásmido como el pAT153.

Imagen tomada de (Patil & Sivaram, 2022)

Otra serie de plásmidos/vectores populares es la familia pUC. Estos plásmidos tienen una región que
contienen varios sitios únicos de corte para endonucleasas de restricción. Estas regiones son conocidas
como POLYLINKER (sitio de clonamiento múltiple) esto aumenta la flexibilidad del vector por proveer un
rango de sitios de restricción para clonación.

Plásmido/vector pUC

Estos plásmidos/Vectores se prepararon por primera vez en la universidad de california, de donde deriva
su nombre, pUC. Se consideran los derivados de pBR322, que se diseñó aún más para cumplir con ciertos
requisitos especiales de clonación, como se menciona a continuación:

❀ son de menor tamaño (2686pb) pero tiene la capacidad de transportar un tamaño de inserto mayor
de 10kb.
❀ Generalmente, tiene un alto número de copias (500-700copias por célula anfitriona) en
comparación con los plásmidos pBR322 (20 copias/célula anfitriona). Así, pueden producir gran
número de copias del fragmento de ADN clonado dentro de la célula anfitriona.
❀ Contiene el gen marcado seleccionable de resistencia a la ampicilina y la secuencia ORI derivada
de pBR322.

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 ❀ El vector contiene el gen lacZ, que se deriva de E coli., la región lacZ codifica para el operón lac
que produce la enzima -galactosidasa para el metabolismo de la lactosa. Un tramo corto del gen
lacZ (hasta 146 aminoácidos) está presente dentro de la región MCS donde se introduce el gen
foráneo. Después de la clonación del gen exógeno, cuando los plásmidos se transforman dentro de
un anfitrión adecuado, no se puede producir la enzima -galactosidasa funcional debido a la
interrupción del gen lacZ. Por otro lado, la falla en el procedimiento de clonación conduciría a las
síntesis de la enzima funcional. Este método ayuda en la selección de la célula anfitriona
recombinante a través del cribado azul-blanco en el que se añade un sustrato cromogénico X-gal a
la placa de agar cuyo hidrolisis por la enzima funcional de una coloración azul.

Por lo tanto, un plásmido de la serie pUC se usa cuando se necesita clonar un inserto de gran tamaño pero
al mismo tiempo se desea un alto rendimiento de plásmido sin comprometer la eficiencia de
transformación.

Imagen tomada de (Bose, 2022)

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figura tomada de (Desmond, 2008)

mapa del plásmido pUC18 donde se muestran el sitio ORI, resistencia a la ampicilina, gen represo LacI,
sitio de clonación múltiple (MCS), gen lac Z (fragmento de -galactosidasa -péptido) los multiples sitios
de restricción se ubican corriente debajo de LacZ’ (Plac). El plásmido pUC19 es igual al pUC18 lo que
varía es la orientación de MCS el cual va en dirección contraria en el pUC19 en relación al pUC18.

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Figura toma de (Herráez, 2012)

Plásmidos/vectores en organismos diferentes a las bacterias

Aunque los plásmidos se encuentran en bacterias, son pocos comunes en otros organismos. Los plásmidos
se pueden encontrar en los eucariotas, estos son de 2um de diámetro se presentan en las levaduras
Saccharomyces cerevisiae. Estos plásmidos son de gran importancia para la construcción de vectores de
clonamiento muy importante en la industria.

Los virus en general se replican mediante la introducción de su genoma en células procarióticas o

eucarióticas (infección). Esta propiedad biológica resulta útil para conseguir una alta eficiencia de
clonación, empleando como vectores virus modificados. Cada especie de virus infecta a células
específicas y, dependiendo del tamaño del genoma vírico, admite insertos más o menos grandes, pero en
general mayores que los que se pueden insertar en plásmidos. Así, se usan bacteriófagos para clonar en
bacterias, baculovirus para células de insecto, y virus SV40 o retrovirus para células de mamífero. La
proliferación de los virus recombinantes se consigue en un cultivo de las células anfitrionas respectivas, en
las que el virus se reproduce. El uso de virus es especialmente adecuado para la clonación en células de
mamífero, por su elevada eficacia de introducción del ADNr, pero dada su complejidad y por razones de
extensión no se tratará en este capítulo. Los virus empleados más comúnmente como vectores son los
parásitos bacterianos fago M13 y fago λ (lambda). El tamaño del vector recombinante se ve limitado por
la necesidad de que pueda empaquetarse dentro de la cápside. El inserto se puede introducir de la misma
forma que para los vectores plasmídicos, es decir, cortando inserto y ADN del fago con las mismas

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enzimas de restricción y ligando para obtener un ADNr; esto se denomina técnica de inserción y existen
vectores específicos para ella. Cuando el tamaño del ADN de interés que se quiere clonar es mayor, se
puede incorporar eliminando previamente la parte del genoma vírico que no se requiere para la infección y
replicación; se habla entonces de técnica de sustitución o reemplazamiento.

Bacteriófagos como vectores

¿Qué son los Bacteriófagos?

En la década de 1940, Max Delbrück y el “grupo fago” que creo, sentaron las bases de la biología
molecular moderna mediante el estudio de los bacteriófagos. Estos son literalmente “comedores de
bacterias”.

Los bacteriófagos o fagos como se conocen comúnmente son virus que infectan específicamente bacterias
y que depende de las bacterias que infectan para su propagación. El termino bacteriófago a menudo se
abrevia como “Fago” y se puede emplear para describir una o varias partículas del mismo tipo. Los fagos
son similares a otros virus, son de estructura muy simple, su genoma consiste en ADN o de forma
ocasional de ARN, contienen genes que son importantes para su replicación, su genoma está rodeado por
una cubierta proteica o cápside de moléculas proteicas. Los bacteriófagos depende de la maquinaria de la
célula anfitriona para su replicación y propagación, no existen en organismos de vida libre.

Estructuralmente, los fagos se dividen en tres grupos principales: (1) sin cola; (2) cabeza con cola; (3)
filamentoso. Su genoma puede ser de ADN o ARN mono- o bi- catenario, siendo más frecuente el genoma
de ADNdc. En los fagos con cola y sin cola, el genoma esta encapsulado en una cubierta de proteína
icosahédrica llamada cápside (a veces conocidas como cubierta o cabeza del fago). En los fagos típicos de
ADNdc el genoma constituye el 50% de la masa de la partícula del fago. Por lo tanto, los fagos
representan sistemas relativamente simples en comparación con las bacterias y, por esta razón, se han
empleado ampliamente como modelos para el estudio de expresión genética.

Los fagos pueden clasificarse como virulentos (líticos) o templados (lisogénicos-no virulentos). El ciclo
infeccioso de los fagos se inicia con el ataque del fago a la superficie de la célula blanco, posteriormente
el fago inyecta su genoma dentro de la célula infectado, cuando el fago entre en la célula hospedadora y
durante su ciclo replicativo mata a la célula para la liberación de los fagos es llamado ciclo lítico del fago,
este por lo general ocurre en unos 20 min y el genoma del fago no se mantienen de manera estable en el
interior de la célula infectada, pero si por el contrario el genoma del fago se inserta en el genoma de la
bacteria anfitrión o célula anfitriona sin producir su muerte se llama ciclo lisogénico, este tipo de ciclo se
caracteriza por retención del genoma del fago en la célula infectada, donde el genoma del fago se integra

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en el cromosoma de la bacteria infectada, posiblemente para mantenerse de manera estable por cientos de
divisiones celulares, de manera similar que hacen o que ocurren con la inserción episomal. La inserción
del genoma del fago en el cromosoma de la célula infectada se conoce como profago, esta forma esta
inactiva y una bacteria que porta profago (llamada lisógeno) suele ser fisiológicamente indistinguible de
una célula no infectada. El profago se libera finalmente del cromosoma de la célula anfitriona y vuelve al
modo lítico de su ciclo replicativo y se produce la lisis de la célula. Los fagos virulentos exhiben un ciclo
lítico únicamente, mientras que los fagos temperados o no virulentos exhiben un ciclo de vida lisogénico.
Uno de los fagos más estudiados son los fagos lambda, el cual ha sido ampliamente investigado u
caracterizado en términos de sus estructura y modo de acción.

Un número limitado de fagos lisogénicos siguen un ciclo de infección bastante diferente, un ejemplo es el
fago M13. Cuando M13 infecta a E. coli, se ensambla continuamente nuevas partículas del fago y se
liberan de la célula. El ADN de M13 no se integra en el genoma de la célula anfitriona y no se vuelve
inactivo. Con estos fagos la lisis celular nunca ocurre y la bacteria infectada puede continuar creciendo y
dividiéndose, aunque a un ritmo más lento que las bacterias no infectadas.

Imagen tomada de (Desmond, 2008)

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Figura tomada de (Brawn T.A, 2016)

Los vectores basados en fagos son más especializados que los vectores de plásmidos, ellos cumplen
esencialmente las mismas funciones. Hay dos tipos de bacteriófagos, lambda y los M13, que han sido
ampliamente desarrollados para clonamiento. Los fagos se replican mediante la introducción de su
genoma en células procariotas y eucariotas (infección). Esta propiedad biológica es muy útil para
conseguir una alta eficiencia de clonación, empleando como vectores virus modificados. Cada especie de
virus infecta a una célula específica y dependiendo del tamaño del genoma vírico, admite insertos más o
menos grandes, pero en general mayo que los insertos que pueden colocarse en los plásmidos.

Se han empleado los bacteriófagos/vectores para clonar en: (i) bacterias: baculovirus para células de
insectos; (ii) Retrovirus: virus animal, es decir virus que infectan células animales como SV40.

El uso especialmente de los bacteriófagos en clonamiento en células de mamíferos, son adecuados por su
elevada eficiencia de introducir ADNr.

Los bacteriófagos/vectores más comúnmente empleados son los fagos bacterianos M13 y fago λ. El
tamaño del vector recombinante se ve limitado por la necesidad de que pueda empaquetar dentro de la
cápside. El inserto se puede introducir de la misma forma que para los vectores plasmídicos, es decir,
cortando inserto y ADN de fago con la misma enzima de restricción y ligando para obtener una ADNr,
esto se denomina técnica de inserción y existen vectores específicos para ellos. Si el tamaño del inserto
que se desee introducir en el fago se puede usar la técnica de sustitución o remplazamiento, la cual
consiste en eliminar toda región del fado que no es necesaria.

Organización de los genes en los fagos

La molécula de ADN de los fagos tiene un tamaño de 49kb y codifica 46 genes, y ha sido ampliamente
estudiada por las técnicas de mapeo de genes y secuenciación de ADN. Como resultado se conocen las
posiciones e identidades de todos los genes en la molécula de ADN. El genoma del fago lambda contiene
en su extremo del genoma lineal una secuencia corta de simple cadena de 12pb que son extremos
pegajosos o cohesivos, estos extremos son empleados para la circularización del genoma durante su ciclo
infeccioso. La región del genoma que se genera por la asociación de los extremos cohesivos son conocidos
como sitios COS. Los sitios COS juegan dos roles distintos durante el proceso de infección del fago
lambda. Primero, permiten circularizar la molécula de ADN lineal que se inyecta en la célula, lo cual es un
requisito previo necesario para la inserción en el genoma bacteriano. El segundo rol de los sitios COS es
bastante diferente y entra en juego después de que el profago se ha eliminado del genoma de la bacteria
anfitriona. El resultado es un catenano que consta de una serie de genomas de fago lambda lineales unidos
en los sitios COS. En esta etapa, se produce un gran número de nuevas moléculas de ADN del fago

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lambda mediante el mecanismo de circulo rodante de replicación, en el que una hebra continua de ADN se
“desprende” de la molécula molde el rol de los sitios COS es actuar como secuencia de reconocimiento
para una endonucleasa que corta el catenano en los sitios COS, produciendo genomas individuales. Esta
endonucleasa crea los extremos cohesivos monocatenarios y también actúa junto con otras proteínas para
empaquetar cada genoma en una estructura de cabeza de fago. Los procesos de clivaje y empaque
reconocen solo COS y la secuencia de ADN.

Imagen tomada (Patil & Sivaram, 2022)

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Figura tomada de (Brawn T.A, 2016)

Vectores basados en bacteriófagos λ

La utilidad del fago λ como vector de clonación depende del hecho de que no todo el genoma es esencial
para que funcione el fago. Por lo tanto, existe margen para introducir un ADN exógeno, aunque debe
cumplir varios requisitos para ser vector:

[1] Disposición de los genes en el genoma del fago λ determinara que parte puede ser eliminadas,
remplazándolas con el ADN exógeno. La región central del genoma del fago (entre las posiciones
20 y 35) son en gran parte prescindibles, por lo que no se requiere un reordenamiento del genoma
in vitro, ya que la región central controla principalmente las propiedades lisogénico del fago y
gran parte de esta región puede eliminarse sin que se vean afectadas las funciones requeridas para
el ciclo de replicación lítica.
[2] El fago λ silvestre generalmente tiene múltiples sitios de reconocimientos para la enzima de
restricción comúnmente utilizadas en los procedimientos de clonación. Esto puede ser importante
ya que limita la elección de sitios para la inserción del ADN. Se puede usar la técnica de
mutagénesis en vitro puede usarse para modificar los sitios de restricción que son necesarios. Por
los tanto, es posible construir fagos que tengan la combinación deseada de sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción.
Una de las mayores restricciones que se presenta usar fagos λ como vectores de clonamiento es la
cápside que impone una restricción física sobre la cantidad de ADN exógeno que se puede
incorporar durante el ensamblaje del fago, lo que limita el tamaño del inserto que se puede clonar.
Durante el empaquetamiento, se puede producir partículas de fago viable a partir del ADN que
tiene de aproximadamente 38 y 51kb de longitud. De esta forma, el genoma del fago λ silvestre
puede albergar aproximadamente 2,5kb de inserto. Esta limitación ha sido minimizada la
construcción cuidadosa de vectores para aceptar fragmentos del inserto que están cerca del
máximo teórico para la construcción particular. Dichos vectores se dividen en 2 clases: (a)
vectores de inserción y (b) vectores de reemplazo o sustitución.

Vector de Inserción: estos son los tipos básicos de vectores de clonación lambda y, teniendo en
cuanta las limitaciones de tamaño, puede alojar entre 5 y 11 kb de inserto de ADN exógeno. Sin embrago,
para evitar la escisión no especifica, se modifican mediante mutagénesis para que contengan un sitio de
restricción único donde se clona el gen objetivo. Sin embargo, la principal limitación de este vector es su
pequeña capacidad de tamaño de inserción. Estos vectores contienen un solo sitio de reconocimiento para
1 o más enzimas de restricción, lo que permita insertar fragmentos de ADN en el genoma del fago.

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Ejemplos de vector de inserción: λT10 (tiene un genoma de 43,3kb, tiene un brazo izquierdo de 32,7kb y
uno derecho de 10,6kb, que en teoría pueden aceptar insertos de 7,6kb. El sitio EcoRI se ubica dentro del
gen CI, represo de λ, y esto forma la base de un método de selección/detección basado en la formación y
morfología en placa) y Charon16A (genoma de 41,8kb, la digestión con EcoRI forma 2 brazos uno
izquierdo de 19,9kb y derecho de 21,9kb, se puede clonar fragmentos de hasta 9kb. El sitio EcoRI se
encuentran dentro del gen-galactosidasa-lacZ-, que permite la detección del recombinante utilizando X-
gal), este último pertenece a una serie de vectores que se podrían llamar cultivo de bacteriófagos. Cada
uno de estos vectores presentan un único sitio de restricción EcoRI en el que se puede insertar el ADN
exógeno. Los vectores de inserción ofrecen un alcance limitado para el tamaño de los insertos a clonar.

Imagen tomada de (Desmond, 2008)

Vector de sustitución: para sortear los problemas del tamaño pequeño del inserto se desarrolló una
versión modificada del vector lambda en la que el 40% del genoma del vector se compone de una
secuencia de relleno introducida artificialmente, dejando intacto el 60% restante del ADN del plásmido de
tipo salvaje. Este método permite una fácil inserción del fragmento de ADN a clonar mediante reemplazo.
tiene los sitios de restricción flanqueando una región no esencial para el fago que puede ser removida y
reemplazada por el inserto. Dos ejemplos de este tipo de vector son EMBLA ( vector de 41,9kb, tiene una
región central remplazable de 13,2kb, flanqueada por secuencias polylinkers invertida que contiene los
sitios de restricción para las enzimas EcoRi, BamHI y SalI) y CHaron40 (vector de remplazamiento en
cual la región central es reemplazable está compuesta de múltiples repeticiones de cortos fragmentos de

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ADN, esta zona está flanqueada por polylinkers con un mayor rango de sitios de restricción, lo cual
incrementa la cantidad de tipos de enzimas de restricción que puede ser usadas para remplazar esta región
por el inserto de ADN. El rango de tamaño de inserto es similar al que se emplea en EMBL4).

Figura toma de (Desmond, 2008)

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Figura tomada de (Herráez, 2012)

Fago filamentoso M13

El M13 es un ejemplo de fago filamentoso, su estructura es diferente del fago lambda y su genoma es más
pequeño, siendo solo de 6407 nucleótidos de longitud. Es circular y es inusual porque consiste
completamente en ADN monocatenarios. El pequeño tamaño de la molécula de ADN del M13 significa
que tiene espacio para menos genes que el fago λ. Esto es posible porque la cápside M13 está construida a
partir de múltiples copias de 3 proteínas (que requieren solo tres genes), mientras que la síntesis de λ. La
estructura de cabeza y cola involucra más de 15 proteínas diferentes. Además, M13 sigue un ciclo de
infección más simple que λ, y no necesita genes para la inserción del genoma de la célula anfitriona.

La inserción de la molécula de ADN del M13 en una célula de E. coli se produce a través del pilus, la
estructura que conecta dos células durante la conjugación sexual. Una vez dentro de la celula , la molécula
monocatenaria actuar como molde para la síntesis de una cadena complementaria, lo que da como
resultado un ADNdc normal. Esta molécula no se inserta en el genoma bacteriano, sino que se replica
hasta que hay más de 100 copias presente en la célula. Cuando la bacteria se divide cada célula hija recibe
copias del genoma del M13, que continúa replicándose, manteniendo así su número total de células, es
decir, el fago M13 se ensambla y libera continuamente nuevas partículas de fago, y se producen alrededor
de 1000 nuevos fagos M13 durante cada generación de una célula infectada.

Varias características del fago M13 lo hacen atractivo como vector de clonamiento: su genoma tiene un
tamaño de 10kb, muy dentro del rango deseable para un vector potencial. Además, la forma de replicación
de doble cadena del genoma M13 se comporta de manera muy parecida a un plásmido y puede tratarse
como tal con fines experimentales. Se prepara fácilmente a partir de in cultivo de células de E. coli
infectada y se puede reintroducir por transfección. Lo que es más importante, los genes clonados con un
vector basado en M13 se puede obtener en la forma de ADN monocatenario. Las versiones
monocatenarias de genes clonados son útiles para varias técnicas, como la mutagénesis in vitro. La
clonación en un vector M13 es una forma fácil y fiable de obtener ADN monocatenario para este tipo de
trabajos. Los vectores M13 también se utilizan en la presentación de fagos, una técnica para identificar
pares de genes cuyo producto proteico interactúa entre sí.

PÁGINA 55
Figura toma de (Brawn T.A, 2016)

Figura tomada de (Desmond, 2008)

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Imagen tomada de (Patil & Sivaram, 2022)

Tabla tomada de (Desmond, 2008)

Virus como vectores de clonamiento de otros organismos

La mayoría de los organismos vivos están infectadas por virus, y no sorprende que haya habido un gran
interés en la posibilidad de que los virus puedan usarse como vectores de clonación para organismos

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superiores. Esto es especialmente importante cuando se recuerda que los plásmidos no se encuentran
comúnmente en organismos que nos en bacterias y levaduras. Se han empleado varios virus eucarióticos
como vectores de clonación para aplicaciones especializadas. Por ejemplo, los adenovirus humanos se
usan en terapia génica, los baculovirus se usan para sintetizar proteínas farmacéuticas importantes en
células de insectos, los caulimovirus y geminivirus se han usado para la clonación en plantas.

Cósmidos
Son vectores sintéticos, quimeras o híbridos que combinan características de los plásmidos y fagos
adquiriendo ventajas de cada uno de los tipos de vectores que lo conforman. Estos vectores contienen una
secuencia del bacteriófago con un sitio final cohesivo (cos), que tiene elementos para incorporar el ADN
en el vector del fago lambda. Los cósmidos generalmente, se eligen para clonar insertos de genes grandes
(aproximadamente 28-45kb). Estos vectores luego se empaquetan en partículas virales que posteriormente
infectan E.coli donde el vector cósmido se autorreplica utilizando el origen de replicación ColEI.

Fragmento del plásmido: proporciona  (i) pequeño tamaño de 5 a 7kb, (ii) genoma circular, (iii)
ORI, (iv) algunos sitios de restricción donde se puede insertar el ADN exógeno, (v) 1 o más marcadores
seleccionables, (vi) capacidad de poder propagarse en bacterias como cualquier plásmido.

Fragmento del fago: λ: proporciona las secuencias COS (sitios cohesivos), lo que le brinda la
capacidad del ADN del fago, de empaquetarse en cápside víricas in vitro.

Los cósmidos son útiles para clonar segmentos de gran tamaño de más de 47kb de longitud. Son
especialmente útiles en la preparación de genotecas genómicas de organismos superiores, que son set de
clones recombinantes de todas el ADN presente en 1 organismos individual, representado en la genoteca,
luego estosgenes pueden ser aisldaos, propagaos y estudiandos. Las librerías genómicas pueden ser
mantenidas por muchos años. Dependiendo de la longitud del inserto será seleccionado el método para
introducir el Cósmido recombinante en la célula anfitriona competente. Si el inserto es muy grande el
método de transformación se complica y se debe realizar un empaquetamiento previo en forma de fago
aprovechando las secuencias COS.

Como regla general, la longitud total del cósmido + el inserto debe ser del 75 al 105% del tamaño del
ADN del fago para un empaquetamiento eficiente. Las partículas del fago con el cósmido recombinante
empaquetado se usa para infectar células de E coli., el cósmido recombinante se circulariza una vez dentro
de la bacteria y se replica como un plásmido.

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Los cósmidos también necesitan marcadores seleccionables y el ORI ya que el cósmido carece de todos
los genes del fago, y por lo tanto no producen placas, en su lugar las colonias se forman en medios
selectivos, igual que ocurre con los plásmidos/vectores.

¿Cuántos genes se requiere para producir una librería genómica?: esto puede ser calculado:

N= [Ln(1-p)] / [Ln (1- (a7b))]; N: número de clones que se requieren; P la probabilidad que tenga un gen
de interés; a: average del tamaño del fragmento del ADN insertado; b: total del tamaño del genoma.

Imagen tomada de (Patil & Sivaram, 2022)

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Imagen tomada de (Bose, 2022)

En un experimento de clonación típico:

1) Se abre el cósmido en su sitio único de restricción

2) Se integra el nuevo fragmento de ADN exógeno, estos fragmentos se producen por digestión
parcial con un endonucleasa de restricción, ya que la restricción total casi siempre dará como
resultado fragmentos que son muy pequeños para ser clonados con un cósmido.
3) Se forma el cósmido recombinante, formándose el ADN catenano.
4) Se empaque en fago lambda: siempre que los cósmidos recombinantes tenga el tamaño correcto.
Los cósmidos recombinantes con fragmentos muy pequeños para ser empaquetados se consideran
no viables y no se empaquetan.

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 5) Los fagos luego se utilizan para infectar la célula anfitriona, se colocan las células infectadas en
medio selectivo, se evidencia crecimiento de aquellas células anfitrionas que portan el cósmido
recombinante.

Fagémidos

Son vectores híbridos fago/plásmido donde algunas funciones del fago se expresan. Este vector se
desarrolló por combinación del fago M13 con el plásmido, una de las ventajas es que admite fragmentos
más grandes el fago M13. Estos vectores permiten la propagación del ADNr como plásmidos
convencionales y el fragmento del fago ayuda en el proceso de transfección a la célula hospedadora.
Cuando las células que contienen el vector se infectan con el fago auxiliar el modo de replicación cambia
al de un fago en el que se producen copias de ADN simple cadena (ADNsc), es decir, el sistema de
copiado del ADN es como el que ocurre en el fago M13, se producen copias del ADNsc.

Los fagémido contiene un ORI, un marcador seleccionable de las células anfitriona del fagémido
recombinante, también contiene un ORI del fago esto permite la producción del ADN simple cadena en la
infección de la célula con ayuda del fago. El gen proteína II se expresa por la ayuda de promotores
presente en el fragmento del fago M13 durante la replicación del ADNsc de los clones. El ADNsc
posteriormente es circularizado, empaquetado y liberado. Este vectores presenta múltiples sitios de
restricción insertado en lacZ -péptido, lo que permite la selección por color azul/blanco método
seleccionado como screening para la selección de células que tengan los recombinantes de interés.

Aunque los vectores M13 son muy útiles para la producción de ADN monocatenario, presentan una gran
desventaja en el tamaño del fragmento que se puede clonar. Normalmente, se considera que 1500pb es la
capacidad máxima, aunque ocasionalmente se han clonado fragmentos de 3kb. Los Fagémidos superan
este inconveniente.

Un ejemplo seria el vector Fagémidos pEMBL8 elaborado por la transferencia en el plásmido pUC8 con
el fago M13.

Vectores para otras Bacterias

Se han desarrollado diferentes vectores para otras bacterias incluyendo Streptomyce, Bacillus y
Pseudomonas. Estos vectores son usados para estudios básicos de la función de los genes y la actividad en
estas especies, por la producción de proteínas recombinantes. Una proteína recombinante sintetizada de un
gen clonado, esto permite obtener grandes cantidades de una proteína importante, por ejemplo: insulina,

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usada en el área farmacéutica para tratar desordenes humanos. Estas proteínas recombinantes no pueden
ser sintetizadas eficientemente en E. coli, otras especies de bacterias o células eucariotas solo pueden ser
usadas para la síntesis de la proteína recombinante.

Algunos vectores de clonamiento que se usan en estas bacterias hospedadora, aunque algunos en algunos
casos emplean plásmidos/vectores con un amplio rango que es capaz de replicarse en una gran variedad de
bacterias. El origen de replicación del plásmido, por ejemplo: el RK2, funciona para la mayoría de las
bacterias Gram-negativas, y es usado en el vector de clonación que se pueden replicar en Pseudomona.

El bacteriófagos SV1 es un fago Streptomyce Venezuela, el cual ha sido desarrollado en un set de vectores
de clonamiento para la especie Streptomyces. Este fago permite o tiene la función de replicar su genoma
dentro del cromosoma de la bacteria Streptomyces y esta función la mantiene el vector, esto permite que el
inserto tenga mayor estabilidad es decir es un transformante más estable.

Cromosomas Artificiales
El desarrollo de vectores para la clonación de fragmentos muy grandes de ADN fue esencial para permitir
que los grandes proyectos de secuenciación del genoma avanzasen a un ritmo razonable. Aunque, el
genoma de S cerevicesia se han secuenciado principalmente mediante el uso de vectores cósmidos para
construir las librerías genómicas requeridas. Sin embargo, los tamaños de inserto de 40 -50 kb son
demasiado pequeños para hacer frente a proyectos como “el Proyecto del Genoma Humano”.

Los cromosomas artificiales son vectores elegantemente simples que imitan la constricción natural del
ADN cromosómico con telómeros, un centrómero y un ORI, además, de características diseñadas para
facilitar su uso como los marcadores seleccionables.

Los vectores de cromosomas artificiales están altamente capacitados como vector de clonación con la
capacidad para transportar fragmentos grandes y estables de ADN. Se emplean para clonar en células
eucariotas. Uno de los propósitos principales de los cromosomas artificiales es la introducción de insertos
de gran tamaño para la constricción de librerías genómicas y mapas de células eucariotas y cromosomas
de mamíferos.

Tipos de cromosomas artificiales

Cromosoma Artificial de Levadura (YACs)

❀ Descritos por primera vez en 1983, por Murray y Szostak, donde demostraron el transporte de
ADN de gran tamaño y esto lo demostró David Burk en 1987.

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❀ Vectores adaptados para fragmentos de gran tamaño de humano y otros mamíferos, y para la
clonación de células eucariotas. Son vectores que aceptan fragmentos de 100kb y hasta de 1Mb, lo
que constituye su característica fundamental, estos ADN exógenos de gran tamaño pueden ser
insertados y mantenidos en los vectores YACs como un cromosoma de levadura lineal. Aunque,
se han presentado problemas de inestabilidad del inserto, estos son vectores sofisticados y, hasta
la fecha representan los vectores de mayor capacidad disponibles.
❀ Estos vectores derivados de ADN de la levadura Saccharomyces cereviseae.

❀ Son de gran importancia en biotecnología principalmente en el área farmacéutica.

❀ Se emplean para estudiar diversos aspectos y el comportamiento de los cromosomas. Pore

ejemplo, para examinar la segregación de los cromosomas durante la meiosis. También, se usan
en la producción de librerías de genes.
❀ Los YACs son similares a los plásmidos, estos son capaces de replicarse en bacterias usando el
sitio ORI. Poseen marcadores de selección.
❀ Los vectores YACs están formado por:
o 3 regiones relacionadas con la funcionalidad de su cromosoma: (las regiones teloméricas
y centroméricas , permite que el ADNr se mantenga esencialmente como un cromosoma
de levadura.
 Secuencias constituyentes de un centrómero: esta secuencia permite la
segregación correcta de las copias hijas del cromosoma durante la división de la
célula.
 Secuencias constituyentes de dos telómeros: estabilizan los cromosomas a lo
largo de las sucesivas divisiones y además, impiden que las exonucleasas actúen
sobre el cromosoma.
 Secuencias constituyentes de una ORI: secuencian de replicación autónoma
(ARS: Autonomously Replicating Sequence) permite la formación de copias del
cromosoma artificial de forma independiente a la del genoma propia de la célula
artificial.
o Genes marcadores seleccionables
o Son de clonado múltiple, en el que admite un inserto de gran tamaño, que puede alcanzar
1MB, esto constituye una característica fundamental.

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 figura toma de (Desmond, 2008)

Cromosoma Artificial de Bacteria (BACs)

Son vectores sintéticos derivados de plásmidos F o fago P1. Se caracterizan, en primer lugar por aceptar
grandes insertos de ADN, entre 100.- 300kb. Los BACs tienen genes que reducen su capacidad de copias,
es decir de replicación en la célula anfitriona del ADNr formado, esto permite conseguir una mayor
estabilidad de los insertos de ADN de origen eucariótico, que en el caso de los cósmidos sufren con
frecuencia reordenamientos internos.

Los BACs son vectores adecuados para librerías genómicas eucarióticas. Estos vectores están equipados
con genes de resistencia a antibióticos y el gen LacZ con sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción permite la selección Azul-blanco.

Los BACs no inestabilidad del inserto que presentan los YACs, es decir el inserto es estable y no so pierde
informaciñn. Esto se debe a que el inserto permanece como parte del genoma y no como una entidad
extracromosomica. Gran parte de la secuencia del genoma humano y de raton se ha logrado utilizando los
cromosomas BACs.

El primer vector BAC creado fue pBAC108L, se han construido otros derivados de este primer vector
BAC, tales como: pBeloBAC11 y pECBAC1, estos vectores el sitio de clonación ha sido reemplazado por
el gen lacZ con múltiples sitios de clonación.

Cromosoma Artificial derivado de Bacteriófago P (PAC)

Este es un vector derivado de bacteriófago P1 y BAC. Los PACs contienen un bajo número de ORI del
fago P1 y se mantiene alrededor de 1 copia/célula anfitriona. Estos vectores pueden transportar de
100.300kb de longitud de inserto. Además, el vector posee genes de resistencia a antibióticos como
marcador seleccionable de los transformantes. La circularización de los PACs depende de la recombinasa
Cre (cause recombination: causa de recombinación) del fago y el sitio LoxP (Locus of Crossover) sitio

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presente en el extremo del genoma del fago P1, las secuencias Cre y LoxP son complementarias y es lo
que permite la circularización del genoma del fago.

Los PACs son utilizados ampliamente para construir librerías genómicas, clonar fragmentos de genes y
génicos.

Cromosoma Artificial Humano (HAC)

Construido por primera vez en 1990s, para identificar sescuncias esenciales mínimamente involucrados en
el ensamblaje y funciones de la región de los centrómeros del cromosoma humano. Los HACs son
microsomas tienen un tamaño de 6-10Mb. Estos vectores trabajan como un cromosoma extra similar en
estructura y composición al cromosoma humano, actuando como un transportador idel de genes para
células humanas.

Vectores de levadura y otros hongos

Muchos experimentos de clonación son realizados sin emplear a E coli como célula anfitriona, y se han
desarrollado una variedad de vectores que son viables para estos organismos o células hospedadoras. E
coli es particularmente popular para experimentos de clonación en estudios básicos de biología molecular
tales como estructura de genes y su función. Sin embargo, en algunas circunstancias puede ser deseable
uso de células hospedadoras eucarióticas para experimentos de clonación. Esto es especialmente necesario
en biotecnología, para la obtención de proteínas recombinantes o para cambiar las propiedades de un
organismo (por ejemplo, introducir en plantas de maíz resistencia a herbicidas)

La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos más importantes en biotecnología, son
empleada como un organismo de hospedador importante para la producción de farmacéuticos importantes
de genes clonados. El desarrollo de vectores de clonamiento de levadura inicialmente descubierto de un
plásmido presente en Saccharomice cerevisiae. El plásmido 2µm, como es llamado, es uno de los pocos
plásmidos presentes en células eucarióticas.

Plásmido circular 2µm

Plásmido circular presente en levadura, de un tamaño de 6318pb, está presente en el núcleo de

Saccharomyces en un rango de 60-100 copias o 70-200 copias (generalmente, 60-200 copias). Durante la
replicación normal Saccharomyces hace uso del ORI de este plásmido, de varias enzimas sintetizadas por
el plásmido que requiere la levadura y proteínas que deben ser codificadas por los genes REP1 y REP2
son transportados por el plásmido circular 2µm

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Imagen tomada de (Brawn T.A, 2016)

Cromosoma basado en el plásmido 2µm: plásmido episomal de levadura

Los vectores derivados de plásmido 2µm se denomina plásmido episomal de levadura (YE ps). Algunos
YEps contienen el plásmido 2µm completo, mientras que otros solo tienen el ORI. Un ejemplo de este
tipo de plásmido YEps es el YEp13, además, del ORI también posee el gen LEU2 seleccionable y
secuencia completa del plásmido pBR322, esto hace que los vectores sean denominados vector lanzadera,
una forma de vector de transportación que viaja regularmente de un lugar a otro, y puede replicarse y
seleccionarse tanto en levadura como en E coli. En la mayoría de los vectores lanzadera es difícil la
recuperación del ADN exógeno de una colonia de levadura transformada, ya que se integran a uno de los
cromosomas de la levadura. Esto no es un problema importante con los vectores YEps, ya que están
presente en la levadura como un plásmido. Sin embargo, en algunos casos los YEps pueden integrarse en
el cromosoma de la levadura, ya que puede ocurrir una recombinación homóloga entre el gen marcador
LEU2 del plásmido y el gen del cromosoma LEU2 de la levadura, lo que resulta en la inserción del
plásmido en el cromosoma de la levadura, el plásmido puede mantenerse integrado o puede ocurrir que en
un evento de recombinación posterior a su integración ser eliminado del cromosoma nuevamente.

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Figura tomada de (Brawn T.A, 2016)

Imagen tomada de (Brawn T.A, 2016)

Imgfenes tomdas de (Brawn T.A, 2016)

Plásmidos integrados de levadura (YIps)

Son plasmidos bacterianos que portan un gen de levadura. Un ejemplo de este tipo de vector es pBR322
que porta un gen URA3 insertado, gen que codifica para la orotidina-5’ fosfato descarboxilaza (un enzima
que cataliza uno de los pasos den la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina) y se utiliza como un
marcador seleccionable exactamente de la misma manera que LEU2. Estos vectores YIps no se replican
independientemente, ya que no contienen ninguna parte del plásmido 2µm, y en cambio, su supervivencia
depende de la integración en el cromosoma de levadura, la recombinación ocurre igual que con LEU2.

Plásmido replicativo de levadura (YRps)

Son plásmidos que pueden multiplicarse de forma independiente, porque llevan una secuencia de ADN
cromosómico que incluyen en origen de replicación. Se sabe que los orígenes de replicación están
ubicados muy cerca de varuis genes de levadura, incluidos 1 0 2 que pueden usarse como marcadores
seleccionables. Ejemplo: YRp7 está compuesto por pBR322 con el gen TRP1 (gen implicado en la

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biosíntesis del triptófano) situado junto a un cromosoma de replicación. El fragmento de ADN de levadura
presente en YRp7 contiene TRP1 como ORI.

Factores claves para la selección de vectores de levadura

❀ Frecuencia de transportación: se necesita una gran cantidad de recombinantes, YEPs tiene la
frecuencia de recombinación más alta, entre 10 mil y 100mil células transformadas por miligramos. Los
YRps son capaz de tener una frecuencia de 1000 a 10 mil transformantes/mg, pero los YIps producen
menos de 1000 transformante/mg. El bajo número de transformante por mg de los YIps demuestra que es
importante el evento de integración cromosómica que ocurre en YEps y YRps antes de que el vector
pueda ser retenido en las células de levadura.
❀ Número de copias: los YEps y los YRps tienen los números de copias más altos 20-50 y 5-1000
respectivamente. Mientras que YIps suelen estar presente en 1 sola copia por célula. Un mayor número de
copias de un gen produce mayor cantidad de la proteína que codifica, y esto indica que el rendimiento será
mayor del producto clonado. Sin embargo, muchos prefieren usar los YIps ya que son más estables. Por el
contrario, los YRps son extremadamente inestables y los YEps tiene problemas similares, los vectores
YEps y YRps se congregan en la célula madre cuando brota una célula hija, por lo que la célula hija no es
recombinante. Un vector YIps es el vector de elección si lo que se requiere es que la célula de levadura
recombinante retenga el gen clonado durante largos periodos de cultivo.

Vectores de clonamiento para plantas

Fueron desarrollados en 1980s’ y son usados para la modificación genética en plantas (GM) que son
ampliamente usados hoy en día.

Hay 3 tipos de vectores o sistemas de vectores:

Vectores basados en plásmidos naturales de Agrobacterium tumefaciens (Ti)

También denominado sistema natural de ingeniería genética.

Los plásmidos o Vectores Ti son de gran importancia son utilizados para introducir el ADN en plantas.
Este plásmido es aislado de A tumefaciens, bacterias presentes en el suelo que cusan infección en muchas
especies de plantas dicotiledóneas, esta bacteria naturalmente invade las plantas a la que infecta, después

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de la infección la bacteria causa una proliferación cancerosa del tejado del tallo en la región de la
infección causando la formación de temores.

La habilidad para casar tumores en los tejidos de las plantas está asociada con la presencia del plásmido TI
en la bacteria A tumefaciens. Este plásmido es de gran tamaño (mayor a 200kb) que transporta numerosos
genes involucrados en el proceso de infección. Una característica importante del plásmido TI es que,
después de la infección, parte de la molécula es integrada en el cromosoma del ADN de la planta. Este
segmento se llama T-DNA es de un tamaño de 15 a 30 kb, dependiendo del tipo. El T-DNA es mantenido
en una forma estable en la célula de la planta, y es pasado a las células hijas como una parte integral del
cromosoma. El segmento de T-DNA contiene 8 o más genes que son expresados en las plantas y son
responsables de las propiedades cancerosas de las células transformadas. Estos genes involucrados
directamente en la síntesis de componentes inusuales, llamados “opines”, que la bacteria usa como
nutrientes.

El proceso de infección el segmento que se inserta en el cromosoma de la célula vegetal ocurre con el
control con el gen de virulencia (vir) localizado en el plásmido Ti.

Usando el plásmido Ti para introducir nuevos genes en una célula de la planta, para esto se requiere del
segmento T-DNA y en este segmento se insertan los genes de interés, luego la bacteria integra el
segmento T-DNA + nuevos genes en el cromosoma de la planta en la practica el plásmido adquiere un
tamaño muy grande lo que dificulta su manipulación, por ello se han desarrollado nuevas estrategias para
logra introducir el nuevo ADN en el plásmido.

Usando el plásmido Ti para introducir nuevos genes en la célula de planas

El plásmido Ti puede usarse para transportar nuevos genes a las células vegetales. Todo lo que se requiere
es insertar los nuevos genes en el T-DNA, después de los cual la bacteria podría hacer el arduo trabajo de
integrarlo en el DNA cromosómicos de las plantas. In embargo, el gran tamaño del plásmido ti hace que la
manipulación de la molécula sea muy difícil. El problema, es que es muy poco probable que haya sitios de
restricción únicos en un plásmido de 200 kb de tamaño, y modificar el plasmido para cambiar todos
menors los sitios BamHI, por ejemplo: seria impracticable. Por lo tanto, se tuvo que desarrollar nuevas
estrategias para insertar nuevo DNA en el plasmido

Se emplean dos estrategias generales:

ESTRATEGIA DE VECTOR BINARIO: esta estrategia se basa en el hecho que el vector Ti en su forma
natural no es un vector sustentable para clonación, es decir se basa en que T-DNA no necesita estar unido
físicamente al resto del plásmido Ti, por su gran tamaño que lo hacen difícil de manipular. Esta estrategia

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consiste en el uso de 2 plásmidos, se denomina sistema Binario, consiste en un plásmido ayuda o
cooperador y un plásmido donar. El plásmido ayuda es un plásmido “desarme” del plásmido Ti con el
segmento T-DNA entero eliminado. El plásmido donador es un plásmido pequeño de E. coli, el cual
transporta un T-DNA más pequeño “truncated” (25pb de secuencias borde intacto de la región T-DNA)
que contiene el sitio de corte “Excisión”, sitio de restricción único y para su manipulación se emplean
técnicas estandar. La inserción del gen se realiza en la región truncada T-DNA. Los dos plásmidos
funcionan de manera complementaria. El plásmido donador transporta el inserto flanqueado por los genes
de la secuencia borde de T-DNA por escisión. El plásmido ayuda provee las enzimas (codificadas por el
gen vir y otro) para transferencia directa del T-DAN recombinante.

En la práctica los Agrobacterium transporta el plásmido ayuda (Ti). El plásmido donador llamado vector
clonamiento primario, es un vector bacterial que contiene:

❀ ORI de E coli y Agrobacterium, tales como Col E1 en E coli, Ri ORI en Agrobacterium

❀ 1 promotor para expresión de los genes blanco tal como virus mosaico del colifrlor, CaMV35S
promotor
❀ Marcador seleccionable para bacteria y para plantas tal como: gen neo que confiere a kanamicina.

❀ Secuencias bordes T-DNA del plásmido Ti

❀ Sitio de inserción para clonamiento.

ESTRATEGIA DE CO-INTEGRACIÓN: utiliza un plásmido completamente nuevo, basado en el vector E

coli, pero que lleva una pequeña porción del T-DNA. La homología entre la nueva molécula y plásmido Ti
significa que, si ambos están presentes en la misma célula A tumefaciens, la recombinación puede ocurrir,
integrando el plásmido de E coli en la región T-DNA. Por lo tanto, el gen a clonar se inserta en un sitio de
restricción único ene l plásmido pequeño de E coli, se introduce en la célula A tumefacciones que porta un
plásmido Ti y se deja el proceso de recombinación natural para integrar el nuevo gen en el t-DNA la
infección de la plana conduce a la inserción del nuevo gen, junto con el resto del T-DNA, en los
cromosomas de la planta, En un sistema de vector c-integrativo, el gen ha sido introducido en el genoma
de la planta esta insertado en el plásmido-vector. El vector clonamiento intermediario contiene:

❀ ORI de E coli (pero no posee el ORI de Agrobacterium)

❀ Marcador seleccionable plantas

❀ Marcador seleccionable bacteria

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 ❀ Secuencia borde T-DNA de un plásmido Ti

❀ Secuencia del plásmido Ti DNA homologa a un segmento de DNA en el plásmido desarmado Ti

❀ Sitio de inserción de clonamiento de la secuencia gen.

El clonamiento, E coli transformante son seleccionados basados en su gen de resistencia a antibiótico. El

vector de clonamiento transporta el gen transferido de E coli o Agrobacterium conteniendo el plásmido Ti
desarmado por apareamiento. Una vez en el agrobacterium, la secuencia del gen es integrada en el
plásmido Ti desarmado por recombinación, pero el vector y Ti contienen secuencias cortas homologas. El
recombinante es identificado por el marcador seleccionable y usado para infectar a las células de la planta.

Los métodos de vector binario y vector integrativo necesitan 2 tipos de marcador genéticos. Un marcador
seleccionable para la selección de E coli transformante en la manipulación de construcción de genes. Un
segundo marcador es requerido para seleccionar transformación en las células de la planta.

Los marcadores seleccionables usados para plantas pueden ser usados para células de plantas puede ser
agrupado por su función natural en 2 categorías:

❀ Marcador seleccionable dominante: son codificados por genes en un producto que la célula
transporta para crecer en condiciones específicas en la célula transformante puede ser seleccionada.
Marcadores que confieren resistencia de a antibióticos. Ej: herbicidas.
❀ Marcadores Proyectables (“scrrnable”): son genes que codifican un producto que puede ser
rápidamente detectado. Estos marcadores presentan variación e interactúan con los cambios ambientales.

Algunos promotores son localizados en varias partes de la planta esto a veces es deseable para un análisis
rápido de funciones regulatorias del promotor por incorporación de marcadores genéticos para ser capaz
de detección de actividad enzimática en el tejido de la planta. Estos marcadores a veces se llaman genes
reporteros, porque ellos reportan actividad bioquímica de ciertos elementos genéticos blancos en la célula
transformante por sobrevivir a condiciones específicas.

El gen reportero sirve con el propósito de investigar la expresión de genes transcendente o para establecer
transformación y plantas transgénicas.

Los vectores Ti presentan problemas para ser clonados en plantas adultas, pero se ha observado que el
vector puede ser modificado y el vector clonado como se hace con las bacterias E coli en placas de
cultivo.

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En la actualidad, se encuentra disponible varios vectores de clonamiento Ti desarmado, siendo un ejemplo
típico el vector binario pBIN19, los bordes izquierdo y derecho del T-DNA presentes en el vector
flanquean una copia del gen Lac, contiene sitios de clonación y un gen de resistencia a la kanamicina que
funciona luego de la integración de las secuencias del vector en el cristisoma de la planta. Al igual que un
vector lanzadera de levadura, las manipulaciones iniciales de la inserción en pBIN19 son transportado en
E coli, transferido luego a la molécula pBIN19 que se transfiere a A tumefaciens y de allí a la planta. Las
células vegetales transformadas se seleccionan sembrando en un medio de agar que contiene kanamicina.

Vectores para células de mamífero

Se emplean principalmente para la producción de proteínas de terapia humana, y provee un sistema
conveniente para estudiar la regulación de genes y control de procesos eucarióticos.

Hay dos tipos de métodos para transferir DNA dentro de células de mamífero

❀ Mediante infección viral

❀ Transfección con vectores de expresión de proteínas en mamíferos.

El clonamiento en células de mamífero hoy en día presenta una amplia gama de aplicaciones: terapia
génica, para la activación de genes, producción de proteínas recombinantes, producción de proteínas
sintéticas como los fármacos.

El primer experimento de clonación con cellas de mamífero se llevó a cabo en 1979 con un vector basado
en virus de simio 40 (SV40). Este virus es capaz de infectar a varias especies de mamífero, siguiendo un
ciclo lítico en algunos hospedadores y un ciclo lisogénico en otros. El genoma de este virus tiene un
tamaño de 5,2 kb y contiene dos conjuntos de genes, los genes temprano que se expresan solo en el ciclo
de infección y codifican proteínas involucradas en la replicación del ADN viral, y los genes tardíos que
codifican para proteínas de la cápside viral. Este virus SV40 presenta la limitación de empaquetamiento de
la cantidad de ADN nuevo que se puede insertar en el genoma. En los primeros experimentos se insertaba
y remplazaba los genes tardíos por el ADN exógeno que se desea clonar, aunque, se puede hacer en los
genes tempranos.

Virus usados como vectores para clonar en células de mamífero

Virus Adenoasociado (AAV): no está relacionado con los adenovirus, pero a menudo se encuentra en el
mismo tejido infectado, principalmente porque el AAV utiliza algunas proteínas sintetizadas por el
adenovirus para completar si ciclo de replicación. Los AAV se pueden insertar en el genoma de la célula

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hospedera, pero, aunque este evento es aleatorio, el AAV tiene la particularidad de insertarse siempre en la
misma posición, dentro del cromosoma 19 humano, esto es importante en clonamiento, ya que se puede
saber con exactitud dónde se inserta el gen a clona sobre todo si se está realizando terapia génica donde se
debe comprobar rigurosamente la ubicación del gen que se está clonando. Por esto, se considera a los
vectores AAV como un gran potencial en esta área.

Adenovirus: son vectores basados en virus de adenovirus, estos son virus no envueltos que contienen
genoma doble cadena lineal. Los serotipos 1 y 5 son los más comunes. Los componentes estructurales del
virus esta compuesto por 3 proteínas: fiber, penton y hexon, los primeros 2 forman parte de la unión con
receptores (Coxakie Adenoviral receptor o CAP) en la célula blanco e internaliza en la célula
hospedadora, mientras la proteína Hexon son las que forman el núcleo cápside, que provee estructura al
virus. El vector de primera generación fue creado por remplazamiento del gen viral E1A con promotores
como CMV y removiendo los genes E3. Sin embargo, esto vectores presentan una considerable
citotoxicidad. Los vectores de segunda generación son creados por remoción de los genes E2 y E4 del
vector de la primera generación, esto redujo la toxicidad, pero se requiere una línea celular especifica con
expresión estable. Este vector de adenovirus es capaz de clonar fragmentos de ADN mayor a 8kb, más
grande que los que se pueden con el vector SV40, aunque los adenovirus son más difíciles de manipular
porque su genoma es muy grande.

Papilomavirus: presenta una capacidad relativamente alta para insertar el ADN. El papilomavirus de
bovino (BPV) es particularmente atractivo porque este virus infecta célula de ratón, formándose un
plásmido multicopia con aproximadamente 100 moléculas por célula. Esto no causa la muerte del ratón y
las moléculas BPV son pasada a las células hijas durante la división, usado para la transformación
permanente de una línea celular. Se usa para la producción de proteínas recombinantes en línea celular de
ratón.

Rotavirus: son virus que contienen genoma de ARN encerrado en una cápside. El genoma presenta LTR
en los extremos 5’ y 3’, transporta inicio de transicional y de terminación, respectivamente entre las
regiones 5’ y 3’, se encuentra 3 regiones que codifican proteínas virales (gag: para proteínas de cápside,
pol: para la enzima transcriptasa reversa, y env: para la envoltura), y una región psi que transporta señales
para el ensamblaje directo del ARN en partículas virales. Los vectores de retrovirus no se pueden usar
directamente como vectores porque ellos son infecciosos. Estos vectores son construidos usando un
sistema que consiste en 2 componentes: (i) vector retrovirus y (ii) empaquetamiento celular. El vectores
retroviral es un plásmido recombinante que transporte una secuencia del genoma viral. En la construcción
del vector viral, mucha de los genes estructurales del virus son eliminados, perol LTR y psi son
mantenidos. La secuencia viral es construida con marcadores selectivos, tales como el gen neo (resistencia

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a kanamicina), o el hyg (resistencia higromicina). Los LRT generalmente se usan para la expresión de los
genes insertados. Otros promotores similares al SV40 pueden ser usados como marcadores seleccionables.
Un único sitio de restricción es construido para insertar el ADN exógeno. Son comúnmente usados para
terapia génica.

Vectores de Expresión
En muchas ocasiones no solo es necesario clonar el gen, sino que se requiere expresar la proteína que
codifican. Los vectores de expresión contienen secuencias regulatorias apropiadas para la transcripción y
traducción del gen insertado.

Un vector de expresión contiene:

❀ Secuencia regulatoria para transcripción y traducción del gen insertado.

❀ ORI

❀ Multiples sitio de clonamiento

❀ Marcador selectivo

❀ Tag para la separación y purificación de la proteína expresada usando cromatografía de afinidad.

Los vectores de expresión provee elementos regulatorios similares a los promotores para la expresión del
inserto de ADN. Los promotores usualmente están bajo el control de un indicador, es una molécula que
cuando se añade al sistema de cultivo ayuda en la expresión del gen insertado. En ausencia de un inductor,
el gen no se expresa. Cuando el promotor necesita un inductor para la expresión del gen insertado son
llamados promotor inducible. El uso de promotores inducibles es recomendado porque de la expresión
constitutiva del gen insertado puede interferir con el crecimiento bacterial ya que la proteína expresada
puede dañar la célula anfitriona por efecto toxico. Un ejemplo común de inductor es el isopropil--D- 1-
thioglicolatopiranosido (IPTG).

Los vectores de expresión tienen diferentes Tag o etiquetas, estas etiquetas están orientadas de tal manera
dentro del vector que, cuando se produce la proteína de interés, las Tag se unen y se expresan como una
extensión de fusión, a menudo una proteína. Por lo tanto, la Tag y el inserto del ADN están unidos al lado
del otro en la misma orientación dentro del vector. Las Tag se pueden unir al extremo N o C terminal de la
proteína expresada. Estos Tag son necesarias para la purificación de la proteína expresada mediante
cromatografía de afinidad usando una resina apropiada que tenga afinidad hacia las Tag. Algunos de las
Tag más comunes utilizadas incluyen la proteína de unión a la maltosa (MBP) y la Tag de glutationato-S-
Transferase (GST).

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Algunos vectores de expresión:

PET: uno de los sistemas más poderosos desarrollados con el propósito de clonar genes de interés y
expresión de proteínas recombinante en E coli. Este vector es un derivado de a serie del plásmido
pBR322. Se ha diseñado para aprovechar al máximo el bacteriófago T7 y sus características. El gen
exógeno que se clona y expresa en este vector está bajo el control transcripcional y tradicional de las
señales de expresión de la ARN polimerasa del bacteriófago T7, esta polimerasa tiene la ventaja de su
elevada especificidad, un alto nivel de actividad y eficiencia de traducción a través de las señales de
iniciación de la traducción. La expresión se controla añadiendo convenientemente el inductor IPTG. Hay
dos variantes del sistema pET posibles: (i) trancripcionales (los ges que portan su propio sitio de unión al
ribosoma y el codón de iniciación ATG a menudo se clonan en estos vectores transcripcionales . este tipo
de vector se usa para la clonación y expresión de genes) y (ii) transduccionales (tienen un sitio de unión al
ribosoma del fago T7. En general estos vectores se utilizan para la clonación y expresión de genes
eucariotas). Ciertos vectores pueden modificarse de modo que tenga 2 etiquetas diferentes en ambos lados
del inserto. Esto es importante cuando la etiqueta más grande, debe ser separada de la proteína después de
la primera ronda de purificación. Por los tanto, la proteína pura se puede obtener en una segunda ronda de
purificación usando la Tag más pequeña.

PBAD: sistema de expresión controlada que se basa en el operón uraBAD, que se encarga de controlar el
metabolismo de la arabinosa en E coli este operón se induce con la adición de L-arabinosa. En este vector,
el gen de interés se clona corriente abajo del promotor araBAD para que su expresión pueda ser inducida
por la adición de T-arabinosa en el medio de cultivo. Este vector presenta algunas ventajas: (i) control
estricto de la expresión: la proteína basa en ausencia del inductor es extremadamente baja en un sistema de
expresión en comparación con la de los plásmidos pET. Por lo tanto, podría ser útil para la expresión de
proteínas que son toxicas para el sistema E coli.; (ii) promotor fuertemente inducible: la expresión del
inserto se multiplica en cuanto se añade el inductor L-arabinosa al medio de cultivo; (iii) producción
económica de proteína: la L-arabinosa es económica, por lo que, la producción de proteínas a gran escala
es posible a un bajo costo y de manera efectiva.

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Estrategias de clonación- formación del ADNr
Ligación: unión de moléculas de ADN

El paso final en la formación o la construcción de una molécula de ADN recombinante es la unión de la

molécula vector al ADN exógeno (el ADN que se desea clonar). Este proceso se conoce como ligadura, y
la enzima que cataliza la reacción se llama ADN ligasa.

Figura del libro: Gene Clonining an DNA lanalysis an In (TA Browb)

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Tabla toma de (Kurnaz, 2015)

Modo de acción del ADN ligasa

Todas las células vivas producen la enzima ADN ligasa, pero la enzima utilizada en ingeniería genética es
generalmente purificada de bacteria E coli que ha sido infectada por el bacteriófago T4. Dentro de la
célula la enzima lleva a cabo la función muy importante de reparar cualquier discontinuidad que pueda
surgir en una cadena de una molécula de doble cadena. Una discontinuidad es simplemente una posición
en la que falta un enlace fosfodiéster entre los nucleótidos adyacentes (en contraste con una mella, en la
que faltaba uno o más nucleótidos). Aunque la discontinuidad puede surgir por una rotura fortuita de las
moléculas de ADN de la célula, también son el resultado natural de procesos como replicación y la
recombinación del ADN, por lo tanto, la ligasa desempeñan varias funciones vitales en la célula.

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En el tubo de ensayo, las ligasa de ADN purificada no solo reparan las discontinuidades de una sola hebra,
sino que también une moléculas de ADN de individuos o los dos extremos de la misma molécula. La
reacción química involucrada en la unión de dos moléculas es exactamente la misma que la reparación de
discontinuidades, excepto que se debe formar dos enlaces fosfodiéster, uno para cada hebra.

Figura del libro: Gene Clonining an DNA lanalysis an In (TA Browb)

Los extremos cohesivos aumentan la eficiencia de la ligadura

Las reacciones de ligadura entre dos moléculas de ADN con extremos romos muestran la unión de dos
fragmentos de extremos romos. Aunque esta reacción se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo, no es
muy eficiente por la ligasa no puede “agarrar” la molécula que se va a ligar y, por lo tanto, debe esperar a
que las asociaciones fortuitas junten los extremos. Si es posible, la ligadura de extremos romos se debe
realizar a altas concentraciones de ADN, para aumentar las posibilidades de que los extremos de las
moléculas se unan de la manera correcta.

Por el contrario, la ligadura de extremos cohesivos complementarios es mucho más eficiente. Esto se debe
a que los extremos cohesivos compatibles pueden aparearse entre sí mediante enlaces de hidrogeno,
formando estructura relativamente estable para que actué la enzima. Si los enlaces fosfodiéster no se
sintetizan con bastante rapidez, los extremos cohesivos se dehesarán de nuevo. No obstante, estas
estructuras transitorias de pares de bases aumentan la eficiencia de la ligadura al aumentar el periodo de
tiempo en que los extremos están en contacto entre sí.

Colocación de extremos adhesivos en una molécula de extremos romos

Los extremos cohesivos compatibles son deseados en las moléculas de ADN que se van a unir en un
experimento de clonación de genes. A menudo, estos extremos cohesivos pueden obtenerse dirigiendo
tanto el vector como el ADN que se va a clonar con la misma endonucleasas de restricción, o con

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diferentes enzimas que producen el mismo extremo cohesivo, aunque no siempre es posible hacerlo. Una
situación común es cuando la molécula del vector tiene extremos cohesivos per los fragmentos de ADN
que se clonarán tienen los extremos romos. Bajo estas circunstancias, se puede usar uno de los tres
métodos para colocar los extremos adhesivos correctos en los fragmentos de ADN.

Figura del libro: Gene Clonining an DNA lanalysis an In (TA Browb)

Linkers (enlazadores): los enlazadores son secuencias cortas de ADN doble cadena conocida que se
sintetizan en el tubo de ensayo. la importancia del pUC y vectores similares se debe en gran medida a la
presencia de la clonación múltiple, con su capacidad para aceptar una amplia gama de fragmentos
diferentes. Una característica similar es lo que hace las moléculas LINKERS. Estas son moléculas cortas
sintetizadas químicamente que contienen en sitios de reconocimientos de enzimas de restricción particular
dentro de su secuencia. El ADN ligasa puede unir conectores a los extremos de la molécula de ADN de
extremos romos más grandes. Aunque se trata de una ligadura de extremos romos, esta reacción en
particular se puede realizar de manera muy eficiente porque los oligonucleótidos sintéticos como los
enlazadores, se pueden producir en cantidades muy grandes y se puede agregar a la mezcla de ligadura a
una concentración alta. Ejemplo: un linkers de E coli el ECORI, es posible clonar una molécula de
inserción de extremos romos en un vector que lleva in sitio de clonación EcoRI. Los linkers son moléculas
de extremos romos y se pueden unir a la molécula insertada de externos romos usando ADN ligasa T4.
Aunque, la reacción de ligadura de extremos romos, es relativamente ineficaz, el uso de un exceso de
enlazadores (linkers) en la reacción ayuda a garantizar que una gran proporción de las moléculas
insertadas tengan enlazadores en los extremos. Algunas moléculas pueden presentar más de un enlazador
unido a cada extremo, pero esto no representa un problema. El siguiente paso es tratar la molécula inserto

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- enlazador con la enzima de restricción adecuada, que corta dentro de los enlazadores para dejar un solo
enlazador de corte único a cada extremo del inserto, esto permite que ahora los inserto tengan extremos
adhesivos o cohesivos, que se pueden usar para insertar en sitio de restricción en los cetres de manera
habitual. Sin embargo, esto puede presentar el problema de que el propio inserto tiene sitio de
reconocimiento para la enzima de restricción enlazado (en el ejemplo es EcoRI) esto podría ocasionar el
corte del inserto lo que no es deseable, para evitar esto se debe realizar un tratamiento del inserto, antes de
añadir los conectores con la metilasa adecuando (para el ejemplo se debe usar la EcoRI metilasa). Esto
hace que el inserto no pueda ser cortado cuando se use la enzima de restricción, pero aun la enzima podrá
cortar los enlazadores. Más de un enlazador se unirá a cada extremo de la molécula de ADN, produciendo
la estructura de cadena. La digestión realizada con una enzima de digestión determinada (ejemplo BamHI)
escinde las cadenas en las secuencias de reconocimiento, produciendo una gran cantidad de enlazadores
escindidos y el fragmento de ADN original, que ahora lleva extremos cohesivos de la enzima utilizada
(ejemplo BamHI). Este fragmento resultante está listo para ligarse en un vector restringido con la misma
enzima que se produjo el corte (ejemplo BamHI).

Hay 3 ventajas principales de usar enlazadores: (i) mejor uso del inserto y del vector: cuando usa extremos
romos en el inserto y el vector se pierde gran parte de las moléculas, por ello, el uso de los enlazadores
mejora esto sobre todo si se usan los enlazadores en exceso. (ii) el exceso de enlazadores evita la
formación de recombinantes inserto-inserto. (iii) el corte con enzima de restricción con etapa posterior a
que se unan los enlazadores es que se pueden reestablecer o regenerarse los sitios de restricción, lo que
hace difícil extirpar el inserto con precisión del vector. Existen enlazadores que tienen más de un (1) sitio
de restricción y estos son llamados POLICONECTORES.

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Figura: linkers (enlazadores) y su aplicación: a) estructura de un enlazador típico. B) uso de los
enlazadores los extremos de las moléculas de ADN cortada. (imagen tomada de [T.A Brown. Gene
cloning and DNA Analysis an Introduction.]

Adaptadores: los usos de enlazadores tienen un inconveniente potencial. Si la molécula de extremos

romos contiene una o más secuencias de reconocimiento para la enzima que se utilizar para hacer la
escisión, entonces el paso de restricción necesario para escindir los enlazadores y producir los extremos
cohesivos también escindiría la molécula de extremos romos. Los extremos resultantes tendían correcto
los extremos cohesivos, pero también se produciría el corte del gen que se desea clonar, por lo que se
encontraría en trozos luego de la digestión. El segundo método empleado para unir la molécula de
extremos romos está diseñado para evitar este problema. Un adaptador, como un enlazador, es un
oligonucleótido sintético corto, pero se sintetiza de manera que una tiene unos extremos cohesivos. La
idea es, por su puesto, logar extremos romos del adaptador a los extremos romos del fragmento de ADN,
para producir una nueva molécula con extremos adhesivos. Aunque puede parecer un método simple, este
método en la práctica surge un nuevo problema. Los extremos cohesivos de las moléculas adaptadores
individuales podrían aparearse entre sí para formar dímeros. De modo que la nueva molécula de ADN aun
tenga extremos romos. Aunque los extremos cohesivos podían crearse mediante digestión con un
endonucleasas de restricción, eso frustraría el propósito de usar adaptadores en primer lugar.

La respuesta a este problema radica en la estructura química precisa de los extremos de la molécula
adaptadora. Normalmente, los dos extremos de una cadena de polinucleotídico son químicamente
distintos, un hecho que queda claro a partir de un examen cuidadoso de la estructura polimérica del ADN.

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Un extremo denominado 5’ terminal, lleva un grupo fosfato (5’-p), mientras que el otro, 3’ terminal, tiene
un grupo hidroxilo (3’-OH). En la doble hélice, las dos moléculas constan de un extremo 5’-P y un
extremo 3’-OH. Entonces, tiene lugar la ligadura entre los extremos 50-P y 3’-OH. Las moléculas
adaptadoras se sintetizan de manera que el extremo romo es el mismo que el ADN “natural”, pero el
extremo 5’-P esta modificado: carece del grupo fosfato y, de hecho, es un 5’-OH. El ADN ligasa no puede
formar un puente fosfodiéster entre los extremos 5’-P y 3’-OH. El resultado es que, aunque el
apareamiento de bases siempre ocurre entre los extremos cohesivos de las moléculas adaptadoras, la
asociación nunca se estabiliza por ligamiento.

Por lo tanto, los adaptadores se pueden ligar a una molécula de ADN de extremos romos, pero no a ellos
mismos. Después de conectar los adaptadores, el 5’-OH normal se convierte a la forma 5’-P natural por
tratamiento con la enzima polinucleótido quinasa produciendo un fragmento de extremos pegajoso que se
puede insertar en un vector pegajoso.

Colas de homopolímeros: la técnica de colas de homopolímeros ofrece un enfoque radicalmente diferente

para la producción de extremos cohesivos en una molécula de ADN de extremos romo. Un
homopolímeros es simplemente un polímero en el que todas las subunidades son iguales. Una hebra de
ADN compuesta completamente de desoxiguanosina es un ejemplo de homopolímeros y se denomina
polidesoxiguanosina o poli(G)

Los adaptadores tienen la ventaja que no requieren el paso posterior de digestión, los adaptadores pueden
ser uno con extremo romo y otro con extremo pegajoso, pueden ser los dos pegajosos. Los adaptadores
pueden tener diferentes sitios de restricción adicionales dentro de la secuencia.

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La cola involucra el uso de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para agregar una serie de
nucleótidos en el extremo 3’-OH de una molécula de ADN de doble cadena. Si una reacción se lleva a
cabo en presencia de un solo desxirribonulcotido se produce una cola de homopolímeros. Por supuesto,
para que las moléculas de dos colas puedan ligarse entre si, los homopolímeros puede ser
complementarios. Con frecuencia, las colas de polidesoxicitosina (poli(dC)) se une al vector y poli(dG) al
ADN que se va a clonar. El emparejamiento de bases entre los dos ocurre cuando las moléculas de ADN
se mezclan.

En la práctica, las colas poli(dG) y poli(dC) no suelen tener exactamente la misma longitud, y las
moléculas recombinantes con pares de bases resultantes tienen muescas y discontinuidad. Por lo tanto, la
reparación es un proceso de dos pasos, que utiliza la polimerasa klenow para rellenar las mellas, seguida
de ADN ligasa para sintetizar los enlaces fosfodiéster finales. Si la cola del homopolímeros
complementario tiene una longitud superior a unos 20 nucleótidos, se forman asociaciones de pares de
bases bastante estables. Una molécula de ADN recombinante, que se mantiene unida por emparejamiento
de bases, aunque no esté completamente ligada, a menudo es lo suficientemente estable como para
introducirse en la célula hospedera en la siguiente etapa del experimento de clonación. Una vez dentro del
hospedero, la propia ADN polimerasa y la ADN ligasa de la célula repara la molécula de ADN
recombinante, completando la construcción iniciada en el tubo de ensayo.

Cassettes o cartuchos de clonación: son una combinación de enlazadores, con otras características, como
marcadores seleccionables. En su forma más simple sería un gen de resistencia a antibióticos flanqueado
por ADN que contiene múltiples sitios de clonación, por lo que, se puede usar como una forma sencilla de
incorporar marcadores seleccionables u otra característica en la molécula de ADN. Esto puede ser útil
cuando se desea inactivar un gen clonado mediante la técnica de alteración de genes. Los casetes pueden
tener señales de gen de expresión, como promotores, terminadores, etc., como marcadores seleccionables.

MÉTODOS QUE NO USAN ADN LIGASA

En experimentos básicos, se usan enzimas de restricción para cortar el ADN y posteriormente se emplea la
ligasa para formar el vector recombinante (vector + ADN exógenos). En embargo, existen otros sistemas
disponibles que tienen diferentes formas de cortar ligar molecular de ADN, estos métodos suelen ser más
rápidos que los enfoques que usan ligasa, pero son más nuevos y menos empleados.

LIGADURA DE EXTREMOS ROMOS CON UNA TOPOISOMERASA DE ADN

Una forma más sofisticada, más fácil y generalmente más eficiente de llevar a cabo la ligadura de
extremos romos, es usar un tipo especial de enzima llamada topoisomerasa de ADN. En la célula, la

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topoisomerasa de ADN están involucrada en procesos que requieren giros de la doble hélice para ser
removidos o agregados a una molécula de ADN de doble cadena. Los giros se eliminan durante la
replicación del ADN para desenrollar la hélice y permitir que cada polinucleótido se replique, y se
agreguen a las molecular circular recién sintetizada para introducir el superenrrollamiento. Las
topoisomerasas de ADN pueden separar las dos hebras de una molécula de ADN si girar realmente la
doble hélice. Logran esta hazaña al causar de manera transitoria una ruptura simple o doble cadena en el
esqueleto de ADN. Por lo tanto, las topoisomerasas de ADN tienen actividades tantas nucleasas como de
ligas. Para llevar a cabo la ligadura de extremos romos con una topoisomerasa, se necesita un tipo especial
de vector de clonación que ha sido linealizado por la actividad nucleasas de la enzima topoisomerasa de
ADN del virus Vaccina. La topoisomerasa I del virus Vaccine corte el ADN en la secuencia CTCTT, que
está presente sólo una vez en el vector. Después de cortar el plásmido, las enzimas topoisomerasas I de
vaccine permanecen unidad covalentemente a los extremos romos resultantes. La reacción se puede
detener en este punto, lo que permite almacenar el vector hasta que sea necesario. El superenrrollamiento
que se puede presentar en la plantilla de ADN se puede alterar girando alrededor de la hebra no escindida
y la enzima vuelve a sellar la hebra original y se disocia de ADN. Los vectores basados en
TOPOISOMERASA disponibles comercialmente, llamadas TOPO “cloning system”, se suministran en
forma lineal (no circularizado), junto con la enzima topoisomerasa unidad. La topoisomerasa une
rápidamente el vector con el ADN exógeno. Para clonar producto del PCR con cadena poliA sobresaliente
(cola poli A), el sector tiene un residuo simpe de Timina sobresaliendo (cola poliT) unido a la
topoisomerasa, el producto de PCR puede hibridar con el vector y rápidamente ligarlas dos moléculas.

La escisión por la topoisomerasa I de vaccine puede dar como resultado en los extremos 5’-OH y 3’-P, si
las moléculas de extremos romos que se va a clonar se han producido a partir de una molécula más grande
al cortar con un enzima de restricción, obteniéndose extremos 5’-P y 3’-OH. Antes de mezclar estas
moléculas con el vector, se debe eliminar sus fosfatos terminales para tener extremos 5’-OH que puedan
ligar a los extremos 3’-P del vector. Por lo tanto, las moléculas se tratan con fosfatasa alcalina. La adición
de las moléculas tratas con fosfatasa al vector reactiva el enlace topoisomerasas, que pasan a la fase de
ligadura de s reacción. La ligadura se produce entre los extremos 3’-P del vector y los extremos 5’-OH de
una molécula tratada con fosfatasa. Por lo tanto, la molécula de extremos romos se inserta en el vector.
Solo se liga una hebra en cada punto de unión, pero esto no es un problema porque las enzimas celulares
repararan las discontinuidades después de que las moléculas recombinantes se hayan introducido en la
bacteria hospedadora.

CLONACIÓN RECOMBINANTE- USANDO LA RECOMBINASA

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Lo método tradicionales de clonación permiten manejar solo unos pocos genes de interés a la vez. La
clonación recombinante brinda flexibilidad para insertar múltiples genes utilizando la recombinación sitio
especifica en múltiples expresiones y sistemas de clonación simultáneamente. Estas enzimas son capaces
de intercambiar y desplazar secuencias de ADN en un solo vector de expresión al mismo tiempo, con
colecciones de marcos abiertos de lectura (ORF) ampliamente disponibles. Hay una serie de sistema de
recombinasa basados en fago que catalizan la ruptura y la unión de moléculas en sitio-específicos. Por
ejemplo: el bacteriófago lambda tiene un sistema de este tipo para dirigir la recombinación entre del
genoma del fago y el cromosoma de la bacteria infectada para catalizar la inserción de su genoma en el
cromosoma bacteriano. La integración tiene lugar entre un sitio especifico en el genoma del fago (attP) y
un sitio en el cromosoma bacteriano (attB) para generar una quimera de ADN bacteriano y ADN del fago.

Las reacciones de recombinase sitio-especifica se puede usar para clonar productos de PCR o transferir
fragmentos de ADN insertados rápidamente de un vector a otro. Esta es la base del sistema Gateway
(invitrogen) y el sistema Creator (BD clontech) es el sistema más utilizado en esta categoría. Se basan en
un sistema de clonación especifico que utilizan los fagos para integrar su genoma en el genoma de la
célula infectada (como se explicó anteriormente). Esta técnica se basa en una mezcla de enzimas
patentadas BP y LR clonasa para transferir fragmentos de ADN a través de los sitios de recombinación.
Inicialmente, la secuencia de interés apropiada se clona en una vector, llamado Vector de entrada (sistema
Gateway) utilizando métodos de clonación tradicionales. Una vez creado el nuevo clon, este se puede
transferir fácilmente a una variedad de vectores “destino” o aceptadores que incluyen secuencias que
pueden ser identificadas mediante la recombinasa. Este sistema in vitro de las reacciones de integración y
escisión se vuelve direccional mediante el desarrollo de sitios de recombinación que reconoce las
secuencias att1 y att2. Este sistema presenta las ventajas: (1) robusto y de alta eficiencia de clonación; (2)
permite mantener el marco de lectura y orientación deseada (es direccional) y (3) los genes de entrada
única se pueden subclonar fácilmente en una variedad de vectores destinos. Pero también presenta
desventajas, tales como: (1) es difícil cambiar a otro sistema de recombinación (falta de sitios de
reconocimiento para las endonucleasas de restricciones convenientes, y remueve los codones de parada y
de inicio); (2) las enzimas de restricción son costosas cuando los conjuntos de vectores son definidos por
el proveedor y, a menudos, requiere el uso de enzimas patentadas; 3)

Ejemplo: El sistema Gateway está basado en el bacteriófago lambda, este bacteriófago puede integrar su
propio genoma o su ADN por recombinación sitio especifica entre un sitio en el fago (attP) y en un sitio
en el genoma del anfitrión (attB). La recombinación entre los sitios att es en lo que se basa el sistema
Gateway para transferir insertos directamente entre vectores que llevan sitios att. Para clonar productos de
PCR los cebadores llevan el sitio attB. El vector receptor, llamado vector de entrada, contiene la secuencia
attP que flanquea el sitio de inserción. La adición de la proteína recombinasa cataliza la recombinación

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entre los sitios attB y attP, integrando el producto de PCR al vector. El inserto puede transferirse, se es
necesario, a diferentes vectores que tengan sitios att adecuados mediante una recombinasa especifica de
sitio similar. Alternativamente, los fragmentos pueden insertarse en un vector de entrada mediante
ligación convencional y luego transferirse a otro vector mediante recombinación.

Imagen tomada de (Patil & Sivaram, 2022)

CLONACIÓN GENÉTICAMENTE INTEGRADA ASISTIDA POR APAREAMIENTO (MAGIC)

Métodos de introducción del ADNr en las células anfitriona

Electroporación:

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Imagen tomada de: (Bose, 2022)

Tipo de célula anfitriona

Incorporación del ADNr en la célula anfitriona:

TRANSFORMACIÓN: la clonación requiere inevitablemente de introducir la molécula recombinante en una

célula anfitriona. El método empleado dependerá de la eficiencia requerida. Los métodos más complejos
para inducir competencia pueden generar hasta 10 copias transformantes por microorganismo de un ADN
plásmido con hasta 5% de células viables competentes para la transformación. Existen muchos métodos
de transformación o transfección:

✿ MÉTODOS NATURALES: muchas especies bacterianas tienen una capacidad natural para absorber
molecuals de ADN exógenas, esto a veces de denomina competencia y puede estar limitada a una
fase de crecimiento en particular de un cultivo bacteriano y estar asociado con la inducción de un

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 conjunto especifico de proteínas bacterianas, esto permite que las bacterias mediante la
competencia adquieran nuevas habilidades bioquímicas en condiciones de privación de nutrientes
o de otros factores, que permitan a la célula bacteriana usar los recursos disponibles o sobrevivir a
ambientes y condiciones que este presentes. Al trabajas con este tipo de células que son
naturalmente transformables se puede usar esta habilidad para introducir el ADN creado in vitro
simplemente incubándolos (en una fase de crecimiento especifica) con el ADN. Existen células
que no pueden admitir el ADN foráneo de forma natural, pero si por otros mecanismos como
conjugación.

✿ La conjugación es un proceso por el cual los plásmidos pueden pasar de una célula a otra a través
del contacto físico directo, la maquinaria para esto a menudo esta codificada por el plásmido que
se traslada, por ejemplo, el factor F de fertilidad de E coli. Puede transferirse de una célula a otra,
a través del pili sexual que esta codificado por el plásmido F. en muchas ocasiones no es necesario
que las células involucradas sean de la misma especie, ya que los plásmidos de amplia gama
pueden estar presentes en diferentes especies y moverse entre ellas.

✿ Los plásmidos que contienen los genes para movilizarse o dirigir su propia movilización de una
célula a otra se llaman plásmidos automovilizables. Existen otros plásmidos que no tienen estos
genes, pero si los genes que están en otra parte de la célula anfitriona pueden usar para
movilizarse y estos plásmidos son conocidos como plásmidos movilizables.

✿ La infección viral es un tercer método natural mediante el cual las células pueden absorber ADN
exógeno. El método se basa simplemente en usar el mecanismo natural de infección viral de los
bacteriófagos, este conocimiento ha permitido manipular el ADN introduciendo ADN exógeno en
el genoma viral y este ADNr en la cabeza del bacteriófago, luego permite que se del proceso de
infección natural por el bacteriófago a la célula blanco. Este método es conocido como
Transfección.

✿ QUÍMICA: la eficiencia de la captación de ADN exógeno puede aumentarse mediante una serie de
tratamientos químicos. Por ejemplo, en condiciones normales E. coli (célula mas empleada) no es
fácilmente transformable, pero el tratamiento con solución de cloruro de calcio frio seguida de un
choque térmico (aplicando alta temperatura) la captación del ADN exógeno. También se puede
usar otras sustancias como dimetilsulfoxido, entre otros. Esto puede generar una mayor eficiencia
en la captación del ADN exógeno. Se han empleado una variedad de tratamientos químicos para
inducir a la célula anfitriona a captar el ADNr con lípidos para forma vesículas. Estas vesicular
luego se fusionan con la membrana celular, permitiendo la entrada del ADNr a la célula. Los
lípidos son grupos de cabeza de espermina que se utilizan para mejorar la interacción con el ADN.

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 La mezcla de ADN con polisacáridos modificados como el dietilaminoetilo (DEA)- dextrano
también se usa para la trasformación química, al igual que la co-precipitación del ADN en la
superficie de la célula con fosfato de calcio.

✿ FISICO: se emplean microproyectiles que se disparan directamente a la célula receptora cargado

con el ADN exógeno estas pequeñas perlas o microproyectiles son a menudo de oro o tungteno de
1µm de diámetro. Otro método físico es agitar las células con filamentos de carburo de silicio o
perla de vidrio y el ADN blanco, esto forma pequeños agujeros transitorios en la membrana
celular a través de las cuales puede pasar el ADNr. Otra forma es por microinyección de ADNr a
traces de una jeringa diminuta (una femtosiring) con diámetro de 0,1µm. Electroporación, es un
método que se aplica tanto a células eucariotas como procariotas, donde se induce a las células
para aceptar el ADNr mediante descarga eléctrica, con este método las células se colocan en una
cubeta entre dos electrodos y se aplica una diferencia de potencial (es decir un choque) entre los
electrodos. La diferencia de potencial generalmente se genera al cargar un capacitor y luego
permitir que se descargue a traces de los electrodos. Los parámetros que se modifican con este
método son: 1) intensidad del campo de choque (diferencia de potencial máxima dividida por la
separación entre los electrodos); 2) velocidad de decaimiento del campo (esta será exponencial y
está determinada por el producto de la resistencia del circuito total y la capacitancia. Debe
variarse de acuerdo a las celdas particulares utilizadas). Puede ocurrir que le choque eléctrico
altere la estructura de la membrana, haciéndola brevemente permeable. El tratamiento
generalmente, conduce a la muerte de una fracción de células hospedadora. Establecer las
condiciones óptimas para la electroporación generalmente requiere un equilibrio entre la muerte
celular y la fracción de células que se inducen para absorber el ADNr, las células aumentan a
medida que aumenta la gravedad de las condiciones.

Tipo de célula anfitriona

Las células anfitrionas u hospedadoras es donde la molécula recombinante se propaga. Elegir la células
anfitriona correcta es tan importante como elegir el vector correcto.

CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS ANFITRIONAS:

 Transformación eficiente: esto depende de la capacidad de introducir el ADNr en la célula

anfitriona, lo que difiere de una especie de célula a otra, es decir diferentes genotipos responden
de manera diferente a diferentes sistemas de transformación. Algunas mutaciones parecen mejorar
la eficiencia de la transformación en sí. Esto incluye la mutación deoR, que parece ayudar
particularmente en la captación de la molécula de ADN de mayor tamaño. Deo R es regulado

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 transcripcional con actividad de unión al ADN que controla la expresión de un conjunto de genes
implicados en el catabolismo de desoxirribonucleosidos. La característica principal que determina
la eficiencia de la transformación es la presencia o ausencia de sistemas endógenos de
degradación del ADN. Muchas células anfitrionas tienen mutaciones en el gen hsdr (o una
deleción más grande) para evitar la escisión del ADN recombinante desprotegido, ya que este gen
hsdr sin estar mutado codifica una endonucleasa que escinde el ADN extraño.
 Mantenimiento estable del vector: el vector recombinante una vez dentro de la célula anfitriona,
no garantiza su replicación de forma indefinida y estable, incluso si tienen su propio origen de
replicación adecuado ya que puede ocurrir un reordenamiento del recombinante, lo más frecuente
que ocurra es una deleción parcial (es decir, la perdida de parte de moléculas). La recombinación
al mismo tiempo, por lo que la recombinación a través de un par de secuencia repetidas
directamente en un plásmido/ vector produce 3 tipos de moléculas en la célula anfitriona: i) es el
vector recombinante intacto; ii) no recombinante, es vector sin el ADN exógeno; y iii) producción
de 2 vectores recombinantes incompletos, es decir, de menor tamaño por falta segmentos de ADN,
alguno de los vectores puede carecer del ORI y el vector no podrá replicarse y se perderá la
población. Mientras que el otro, se podrá replicar, peo lo hará más rápido que la molécula
original, ya que es más pequeña, al ocurrir esto en varias rondas de replicación, puede resultar en
una gran diferencia en la cantidad de moléculas presentes en la célula anfitriona. Por ejemplo:
ganar 1ug de ADN a partir de una única copia de un plásmido de 4kpb requiere unos 40 ciclos de
replicación, por lo que un plásmido que pudiera replicarse un 10% más rápido generaría, durante
este período, aproximadamente 16 veces más de ADNr, por lo tanto, sería la molécula más
abundante de la población total. La recombinación no siempre tiene que dar como resultado una
eliminación, también puede producirse una inversión, si tiene lugar a través de repeticiones
invertidas. Dado que las deleciones e inversiones generalmente dependen de la recombinación, las
mutaciones en la célula anfitriona que suprimen la recombinación ayudaran a asegurar la
estabilidad de las moléculas transformantes. Hay 3 sistemas recombinantes en E. coli que utilizan
los productos de los genes recBCD, reck, recf. Sin embargo, estos genes, dependen en gran
medida del gen recA, por lo que las cepas mutantes tendrán una frecuencia de recombinación
reducida.
 Inhabilidad: al igual que los vectores, durante el proceso de clonación se debe garantizar que la
célula anfitriona que porta al vector recombinante no se propaguen fuera del laboratorio, por ello
las cepas que comúnmente se usan para esto presentan mutaciones que le confieren carácter
auxotrófico (requisito metabólico que requiere un metabolito especifico en el medio de cultivo
para que pueda crecer, lo que indica que en ausencia de este no crecen).

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  Marcadores: se requieren cepas que tengan genes marcadores que puedan a detectar cual tiene al
vector recombinante. La recombinación y la deficiencia nutricional son útiles, también es
conveniente otros marcadores que permitan una selección más simple. Por ejemplo: resistencia a
los antibióticos, puede ser útil, aunque este debe ser diferente de cualquiera de los genes de
resistencia a antibiótico presente en el vector recombinante. También, hay otros genes que se
pueden mutar y que faciliten la detección de las células con el vector recombinante. Ejemplo:
mutación en el operón Lac, se mutan un gen que afecta la biosíntesis de la arginina, lo que, se
requiere para la selección de colonias azul-blanca.

Métodos de incorporación del ADNr en la célula anfitriona

La transferencia de genes (movimiento de material genético entre organismos) a la célula anfitriona, tanto
in vitro como in vivo, es fundamental para estudiar funciones de los genes y realizar terapia génica. Este
proceso de transferencia de genes puede ocurrir por diferentes mecanismos: conjugación, transformación y
transducción.

Un descubrimiento innovador que revoluciono el campo de la biología molecular es la capacidad de

modificar el material genético de las células. La alteración genética requiere de las células receptoras
permitan la entrada de material genético extraño, su incorporación exitosa y expresión estale para producir
cambios en el comportamiento celular.

Históricamente, el descubrimiento de la transformación genética natural fue uno de los eventos claves en
biológica que se deriva del trabajo realizado por Frederick Griffith en 1928, sobre Streptococcus
pneumanae. Este trabajo explica el Principio de transformación Bacteriana. Este trabajo sentó las bases
para la identificación del ADN como material genético en la mayoría de los organismos vivos. A medida
que avanzaban las investigaciones, se demostró que la transformación genética era un proceso natural
frecuente y pronto se aceptó como un mecanismo común para generar y mantener la diversidad genética
en las bacterias.

En los últimos 30 años ha ganado popularidad debido a su amplia aplicación para estudiar procesos
celulares y mecanismos celulares de enfermedades.

Se clasifican en

❀ Transfección estable: se refiere a mantener la expresión a largo plazo de un transgén mediante la

integración de ADN exógeno en el genoma nuclear de la célula hospedadora o el mantenimiento de un
vector episomal en el núcleo como un elemento extracromosómico. El transgén puede entonces expresarse

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constitutivamente incluso con la replicación de las células. Se aplica en estudios genéticos y
farmacológicos a largo plazo donde se requiere producir proteínas
❀ Transfección transitoria: no requiere la integración de los ácidos nucleicos en el genoma de la
célula hospedadora. La expresión del transgén eventualmente, se perderá a medida que la célula anfitriona
se replique. Los ácidos nucleicos se pueden transfectar empleando plásmido/vector o usando
oligonucleótidos. Generalmente, se aplica en estudios de corto plazo para investigar los efectos de la
activación/desactivación de un gen en particular.

Células competentes: se refiere a la capacidad de una célula de absorber el ADN exógeno de su entorno.
En algunos casos, el ADN exógeno se incorpora al cromosoma de la propia célula esto se conoce como
transferencia horizontal (HGT) o transferencia genética lateral. Las células pueden ser competentes por
métodos químicos, electro componentes

En el proceso de clonación uno de los pasos más importantes es la introducción derivada de ADN exógeno
en la célula hospedadora. El proceso para introducir el ADN exógeno en la célula hospedadora eucariota,
se llama transfección.

El mecanismo o proceso de trasferir el ADNr en una célula hospedadora depende de varios factores:

❀ Tipo, tamaño y pureza del ADN exógeno.

❀ Tipo de célula hospedadora seleccionada.

❀ Objetivo de la clonación (de esto depende el tipo de célula hospedera que se seleccione)

❀ Método seleccionado para hacer la transferencia.

La transformación es un paso muy importante en el proceso de RDT permite la transferencia de material

genético dentro de la célula. A menudo, esta transferencia acompaña a un cambio en las características de
la célula según el material genético utilizado. Juntos, la transferencia de material genético el cambio en el
rasgo de la célula se define como transformación. Desde su descubrimiento, a esta técnica se le atribuyen
innumerables hallazgos profundos en biología y ocupa la posición importante en la caja de herramientas
de un biólogo para manipular el ADN y las células.

El éxito del método de transferencia en células eucariotas depende de la capacidad para que el ADNr
acceda y penetre la membrana celular, pase a través del citoplasma, llegue al núcleo. Antes de iniciar y
pasar el ADNr por la membrana este debe ser estabilizado, para protegerlo de degradación y/o
deformación.

Los métodos para transferir el ADNr en células anfitrionas vivas pueden ser clasificados en:

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 ❀ Físicas: método que incluyen electroporación, inyección de genes, sonoporación, Beam laser,
nanopartículas magnéticas.
❀ Químicas: transfección por lípidos, péptidos, cationes, cloruro de calcio (CaCl 2), etc.

❀ Biológica: involucra el uso de vectores.

El método a utilizar depende de varios factores:

❀ Tamaño y pureza del ADNr

❀ Célula anfitriona

El proceso de clonación tiene 2 funciones importantes:

Producir una gran cantidad de ADN exógeno de interés (ADNr) esto dependerá del material de partida, se
sabe que se requiere una mínima cantidad de nanogramos de ADNr viable, ya que cada célula bacteriana
que porta el ADNr de interés se reproduce obteniéndose colonias puras de estas células idénticas a la
original que contenía el ADNr de interés, por ende, se obtiene gran cantidad de este ADNr.

Naturalmente, las cellas no permiten el paso de ADN exógeno al interior celular, son pocas las especies
que pueden hacerlo como es el caso de Bacillus y Streptococcus, estas células bacterianas presentan
mecanismo sofisticados para introducir el ADN.

Puesto que lo normal, es que la membrana de las células presente permeabilidad selectiva y no permite el
ingreso del ADNr, se acude a mecanismos para facilitar su captación por alteración transitoria de la
permeabilidad celular (métodos pasivos) o introduciendo directamente el ADNr (métodos activos).

Los métodos resultan eficaces dependiendo del vector y de la célula anfitriona. El proceso de introducir el
ADNr en la célula anfitriona es llamado transfección o transformación, aunque estrictamente el primer
término corresponde a la introducción en caerías anfitrionas y el segundo término al uso de virus como
vectores. La competencia de la mayoría de los organismos transformables naturalmente está regulada
genéticamente por proteínas competencias-específicas para provocar la captación y procesamiento del
ADN, estas proteínas son una colección de proteínas embebidas en la membrana celular de unión al ADN,
varias nucleasas, enzimas importadas de ADN, metilasas y recombinasa. Esta maquinaria molecular
involucrada en la regulación de “competencias” quizás no sea constitutivamente activa dentro de las
bacterias. Sino que pueden responder a señales extracelulares o intracelulares específicas para desarrollar
competencias, esta forma de competencia se denomina transformación espontanea. Por otro lado, algunas
especies bacterianas pueden carecer de genes de procesamiento y captación del ADN exógeno, por lo que
no pueden ser transformables naturalmente. Sin embargo, tanto las células bacterianas como las eucariotas
pueden ser frazadas artificialmente a entrar en un estado transitorio de competencia junto con la

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introducción del ADNr en el medio de crecimiento para permitir la transformación genética in vitro. La
competencia es, por lo tanto, una oportunidad transitoria ara transferir genes. Para garantizar, una
transformación natural en la naturaleza depende de las barreras naturales como: absorción de ADNr por
partículas den el suelo, temperatura subóptima, pH, osmolaridad. En contraste, la optimización de los
parámetros anteriores en laboratorios proporciona eficiencia de transformación mucho más alta.

Preparación de las Células Competentes:

En clonación la especie más utilizada para la transformación es E coli. La historia de la transformación

bacteriana inicia buscando que E coli que no transforma de manera natural, fuese capaz de transformar. En
1970 Mendel e Higa demostraron que luego de tratar las células con CaCl 2 pueden inducir a E coli a tomar
ADN de bacteriófago con el uso de un fago auxiliar.

Los métodos empleados se pueden dividir en métodos físicos, químicos y biológicos como ya se comentó
anteriormente. La elección del método depende de:

❀ Objetivo de la clonación

❀ Vector a utilizar

❀ Célula anfitriona

❀ Tamaño, pureza y tipo de ácido nucleico.

Métodos Físicos:

❀ desarrollado a principio de 1980.

❀ se emplea en procariotas y eucariotas.

❀ Involucra la transferencia directa del ADN en el citoplasma o el núcleo de la célula anfitriona.

❀ Más simples que los métodos biológicos.

❀ Consume poco tiempo y esfuerzo.

❀ Pueden ser costosos, ya que requiere instrumentos especializados que llevan al ADNr al interior
de la célula anfitriona.
❀ Entre los métodos físicos más comunes están: electroporación, biolisticas, magnetofección,
ultrasonido, microinyección, microhaces, microlaser, ondas de choque, presión mecánica,
choque eléctrico, fuerza hidrodinámicas.

PÁGINA 95
 Propagación en medios de cultivo
Detección y clones recombinantes

Producción de genotecas: utilidad, construcción y análisis

Aplicación de RDT y su impacto social

Conocimiento de las principales aplicaciones de RDT y de los microorganismos en

procesos de interés biotecnológicos

Referencias
Bose, K. (2022). Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinat Proteins. Singapore:
Springer. doi:https://doi.org/10.1007/978-981-16-4987-5

Brawn T.A. (2016). Gene Cloningn&DNA Analysis: An Introduction (Seven ed.). (B. T. A, Ed.) New
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