UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA

FACULTAD DE VETERINARIA

RELEVAMIENTO DE LABORATORIOS DE PROCESAMIENTO

DE SEMEN BOVINO EN URUGUAY

Por

Br. CURBELO CURBELO Miguel

Br. RODRíGUEZ RODRíGUEZ Zelmar

TESIS DE GRADO presentada como uno de

los requisitos para obtener el título de Doctor
en Ciencias Veterinarias
Orientación: Medicina Veterinaria y
Producción Animal

MODALIDAD: Estudio de caso

MONTEVIDEO
URUGUAY
2013
PAGINA DE APROBACIÓN

TESIS DE GRADO aprobada por:

Presidente: ______________________________
Dr. Daniel Cavestany

Segundo Miembro: _____________________________

Dr. Daniel Elhordoy
(Tutor)

Tercer Miembro: _____________________________

Dr. Álvaro López

Cuarto Miembro: _____________________________

Dr. Pedro Bañales
(Co- Tutor)

Fecha: _____________________________

Autores: ________________________________
Br. Miguel Curbelo

________________________________
Br. Zelmar Rodríguez

2
AGRADECIMIENTOS

En primer lugar queremos agradecerle a nuestro tutor, Dr. Daniel Elhordoy, por su
apoyo y confianza, quien nos orientó en este trabajo, nos brindó su tiempo,
experiencia y sus conocimientos.

Al Dr. Pedro Bañales quien fue nuestro co-tutor que también nos ayudó en el
armado de los cuestionarios y nos permitió acceder a los laboratorios.
A los veterinarios de libre ejercicio y veterinarios responsables de los centros,
quienes con su colaboración fueron fundamentales para la realización de esta tesis.
A las funcionarias de la biblioteca de Facultada de Veterinaria por su asesoramiento,
especialmente a Ruth por el tiempo y dedicación que nos brindó.
Y especialmente a nuestras familias quienes nos apoyaron en todo momento.

3
TABLA DE CONTENIDO
Página

PÁGINA DE APROBACIÓN.................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS.............................................................................. 3
TABLA DE CONTENIDO……………………………………..………......... 7
LISTA DE CUADROS Y FIGURAS.......................................................... 7
RESUMEN............................................................................................ 8
SUMMARY………………………………………………………………….. 9
INTRODUCCIÓN.................................................................................. 10
REVISIÓN BIBLIOGRAFICA................................................................ 13
Reseña histórica.............................................................................. 13
Congelación e inseminación artificial a nivel mundial................. 13
Congelación e inseminación artificial en Uruguay……............... 14
Espermatozoides……………………………..…..…..……..………… 16
Colección de semen bovino……………………………….…………. 18
Vagina artificial……………………………………….……………... 18
Masaje transrectal………………………………………………….. 19
Electroeyaculador….……………………………………….………. 20
Técnicas de evaluación de semen fresco……………………....…… 23
Pruebas macroscópicas………………………………………….… 24
- Volumen……………………………………………….…...……… 24
- Aspecto…………………………………………………….………. 24
- Olor………………………………………………………..……….. 24
- Color………………………………………………………….…….. 24
- Densidad………………………………………………..…………. 25
- Motilidad en masa macroscópica……………………………….. 25
- pH…………………………………………………………..………. 26
- Cuerpos extraños………………………………………..……….. 26
- Schalm test………………………………………………..…….… 26
Pruebas microscópicas………………………………….......….….. 26

4
 - Motilidad en masa microscópica……………………….......…… 26
- Motilidad individual………………………………………….….... 27
- Vigor……………………………………………………………….. 30
- Concentración……………………………………………..……... 30
- Coloración post vital……………………………………......……. 33
- Morfología y acrosomía...………………………………………... 35
- Test de fertilización in vitro………………………...……………. 39
- Citometría de flujo………………………………………………… 39
- Valores de calidad aceptables.…………………....................... 39
- Sanidad del toro donante. ……………………...…...…..……… 40
Criopreservación……………………………………………….......….. 43
Crioprotectores…………………………………………………...…. 43
Mecanismo de acción……………………………….……...…….... 43
- Crioprotectores intracelulares…………………..……..…………. 44
- Crioprotectores extracelulares…………………………….…..…. 45
Principios de la preservación de semen…………….…….…….… 46
Eventos físicos de la criopreservación………………..….….…….. 47
Almacenamiento de semen…………………………………….……. 48
Acción de ROS en células espermáticas…………………….....…. 50
Peroxidación lipídica…………………………………………...…….. 50
Adición de antioxidantes a diluyentes…………………….............. 51
Congelación y descongelación………………………………...…….... 52
Fundamentos de la congelación……………………………..……… 52
Consecuencias físicas y químicas………………………………....… 53
Proceso de congelación……………..………………………………... 54
- Diluyentes…………………………..……………………………..…. 54
- Funciones de un diluyente…………..…………………….….....…. 54
- Tipos de diluyentes…………………….……….……..……….……. 55
- Componentes básicos de los diluyentes para congelación…….. 55

5
 - Calculo de dilución………………………………………………...... 56
- Enfriado ………………………………………..…………….….…… 57
- Glicerolización……………………………………………….…….… 57
- Equilibración……………………………………………..………….. 58
- Envasado en pajuelas ……………………………………….......... 58
- Congelación………………………………..………………………... 58
Proceso de descongelación…………………………………………... 59
Evaluación post descongelado……………………………………..…… 60
Pruebas microscópicas…………………………….………….….…… 60
- Motilidad individual…………………………………….…………….. 60
- Vigor………………………………..………………………….……… 61
- Acrosomía…………………………..………………………………... 61
- Morfología………………………...….....………………………….… 61
- Concentración…………………………..……………………………. 61
- Test de termorresistencia…………………….……..………….…… 61
- Estabilidad e integridad de membrana…………….………………. 62
- Sanidad...………………………………………….…………............. 64
- Valores de aceptabilidad ……………………………….…….…….. 64
HIPOTESIS…………………………………………………………………….. 65
OBJETIVOS…………………………………………………..……………...… 65
MATERIALES Y METODOS..................................................................... 66
RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................. 67
CONCLUSIONES....................................................................................... 76
BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................... 77
ANEXO I………………............................................................................... 91
ANEXO II………………………..…………………………..………………..…. 96

6
LISTA DE FIGURAS:

Figura 1. Vagina artificial bovina armada y lista para la colección del semen.

Figura 2. Arriba el colector agarra el pene a través de la vaina prepucial y lo dirige

hacia la abertura de la VA. Abajo el pene del toro penetra la VA antes del
salto eyaculatorio final.

Figura 3. Maniquí móvil diseñado para colección de semen con VA.

Figura 4. Colección de semen con un maniquí móvil. El colector con la VA está

sentado en el interior del maniquí.

Figura 5. Equipo completo de electroeyaculación.

Figura 6. Colección de semen por electroeyaculación.

Figura 7: Incremento de la fertilidad con valores crecientes de semen de toro hasta

que se alcanza el umbral de fertilidad óptima.

Figura 8: Relación entre la tasa de preñez y el número de espermatozoides

inseminados.

Figura 9: Arriba sistema CASA, abajo vista de un analisis de motilidad mediante sistema
CASA.

Figura 10: Comparación entre las concentraciones espermáticas viables en pajuelas pre y
post congelado de LPS en Uruguay.

LISTA DE TABLAS:

Tabla 1. Aspecto del eyaculado correlacionado a la concentración.

Tabla 2. Valoración de la motilidad masal macroscópica

Tabla 3. Escala de la motilidad en masa microscópica

Tabla 4. Correlación entre concentración y densidad.

Tabla 5. Escala basada en el porcentaje de células móviles

Tabla 6. Escala del vigor del movimiento ondulado de los espermatozoides

Tabla 7: Parámetros de aceptabilidad para congelación seminal.

Tabla 8: Nivel de riesgo de transmisión de enfermedades del bovino en IA

Tabla 9: Parámetros de aceptabilidad para evaluación de semen post descongelado.

Tabla 10. Métodos y régimen de colecta empleados por los LPS.

Tabla 11: Pruebas de evaluación y valores de referencia adoptados para semen fresco
por los centros que procesan semen en Uruguay.

Tabla 12: Pruebas realizadas por los centros para la evaluación del semen después de
descongelado.

7
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue conocer las principales técnicas laboratoriales
utilizadas y los patrones mínimos de calidad adoptados por los laboratorios
procesadores de semen (LPS) entre los que se incluyen centros de procesamiento
de semen (CPS) bovino registrados en el Ministerio de Ganadería Agricultura y
Pesca (MGAP) y profesionales veterinarios de libre ejercicio especializados en
reproducción, en referencia al análisis de calidad de las muestras disponibles en el
mercado. Esta investigación realizada en forma de encuesta y/o entrevista, recolectó
datos de siete de los quince encuestados, siendo observada una gran variabilidad en
los métodos y patrones adoptados. En base a los datos obtenidos fue posible
constatar la falta de estandarización en los análisis sobre la calidad biológica del
semen bovino, lo que permite plantear la discusión sobre la necesidad de
uniformizar técnicas y criterios de evaluación con la finalidad de lograr una mayor
calidad de las muestras comercializadas en el país y consecuentemente, mejores
resultados cuando son utilizadas en diferentes biotecnologías reproductivas. Se
describen las técnicas de recolección de semen, procesamiento, congelación y
evaluación de las muestras, luego de su descongelado para poder predecir la
fertilidad potencial de las mismas mediante su evaluación, a través de las pruebas
más comúnmente usadas en los laboratorios.

8
SUMMARY
The objective of this work was to know the main laboratory techniques used and the
minimum quality standards adopted by laboratories processing semen (LPS) among
including bovine semen processing centers (SPC) registered at the Ministry of
Livestock, Agriculture and Fisheries (MGAP) and veterinary professionals specialized
in reproduction, in reference to quality analysis of the samples available in the
market. This research in the form of survey and/or interview, collected data from
seven of the fifteen respondents, being observed a great variability in the methods
and standards adopted. Based on the data obtained it was possible to note the lack
of standardization in the analysis of the bovine semen biological quality, allowing to
focus the discussion on the need to standardize techniques and evaluation criteria in
order to achieve a higher quality of samples marketed in the country and
consequently better results when used in different reproductive biotechnologies. We
describe techniques for semen collection, processing, freezing and evaluation of
samples after thawing to predict their fertility potential by evaluating them through
tests commonly used in laboratories.

9
INTRODUCCIÓN
El mejoramiento genético de los animales de granja se ha beneficiado enormemente
del uso de la inseminación artificial (IA). El desarrollo, perfeccionamiento y aplicación
de la IA, lo que representa la primera generación de biotecnologías reproductivas, no
sólo ha hecho posible la distribución de material genético en todo el mundo a bajo
costo, sino que también ha contribuido en gran medida a frenar la propagación de
enfermedades venéreas (Gil, 1999).
La utilización de semen bovino congelado representa la principal biotecnología
reproductiva para el mejoramiento genético animal (Arruda et al., 2000; Freitas et al.,
2009). Este impacto no habría sido posible sin la congelación acertada de semen de
toro. Es posible ahora, a través de su uso, inseminar vacas con un toro superior en
cualquier parte del mundo, aun luego de su muerte (Bailey et al., 2000). Además, se
ha hecho posible el uso de semen de toro genéticamente superior en la
inseminación de varias miles de vacas, mucho más de lo que alguna vez se puedo
suponer con el uso de semen líquido.
El semen congelado en pajuelas de 0,25ml o 0,5ml se ha convertido en la unidad
universalmente aceptada de almacenamiento y transferencia de genética bovina a
los productores de ganado (Baracaldo et al., 2007).
La evaluación laboratorial de semen congelado bovino representa un componente
fundamental de los programas de reproducción animal, garantizando la calidad de
las muestras destinadas a trabajos de inseminación artificial, múltiples ovulaciones
transferencia de embriones (MOTE) y producción de embriones in vitro (PIV)
(Crespilho et al., 2009).
La evaluación de semen es un componente importante, complementaria a la
exploración clínica, para estimar la capacidad potencial de un toro como reproductor.
Esta evaluación tiene un valor diagnóstico para evaluar la función testicular y
epididimal, y/o la normalidad del tracto genital del macho, que nos ayuda a identificar
casos claros de infertilidad o incluso de potencial sub fertilidad. Además, la
evaluación de una muestra de semen puede determinar su potencial capacidad
fecundante antes de ser utilizado para inseminación artificial (AI) o en fertilización in
vitro (FIV) (Rodríguez-Martínez, 2006).

La valoración de la calidad seminal, es una de las herramientas de análisis más

empleadas en la clasificación de los machos para el servicio por monta directa o
programas de inseminación artificial, gracias al cual se forma una opinión del
potencial de fertilidad del toro de ese momento, ya que la calidad seminal puede
cambiar bastante y rápidamente, dependiendo de si un toro está pasando o
recuperándose de un proceso que afecte la espermatogénesis (Barth, 2001).
La preservación eficiente de las células espermáticas con su completa capacidad de
fertilizar es el objetivo principal del proceso de criopreservación de semen. Sin
embargo, hay una pérdida significativa en el potencial de fecundación de las
muestras congeladas usando las técnicas más corrientes (Watson, 2000; Cooter et
al., 2005).

10
El proceso de criopreservación representa una interrupción artificial del progreso del
espermatozoide post eyaculación hacia la maduración y la fertilización
(Januskauskas et al., 2002).
Son numerosos los efectos que la criopreservación puede inducir en los
espermatozoides, que van desde lesiones letales hasta aquellas que solo alteran la
función posterior. En los últimos años, el aumento considerable en la comprensión
tanto de la fisiología celular del espermatozoide y de las tensiones de la
criopreservación ha contribuido a un renovado interés en la mejora del rendimiento
de semen criopreservado. Hoy en día, las aplicaciones biotecnológicas de
criopreservación disfrutan de un interés que no tiene precedentes.
El proceso de criopreservación reduce la viabilidad del espermatozoide 50 a 60 %, y
causa varias alteraciones bioquímicas y estructurales que implican distintos
compartimentos de la célula espermática (Chaveiro et al., 2006). Según González
(2004), aproximadamente el 85 % de los espermatozoides bovinos presente en una
muestra seminal sufre algún tipo de daño durante la congelación o en el
procedimiento de descongelado.
La interrupción de la capacitación y/o la reacción del acrosoma comprometería
severamente el potencial de fertilización de los espermatozoides, lo cual tal vez
explique las tasas de fertilidad observadas en la práctica, de semen congelado, que
estarían correlacionadas con la habilidad de los espermatozoides para moderar los
niveles de calcio intracelulares (Bailey et al., 1994).
Durante la espermatogénesis, los espermatozoides pierden muchos de los
organelos que poseen la mayoría de las células somáticas (como el retículo
endoplásmico, los lisosomas, y la mayor parte del citoplasma) con el fin de reducir el
"equipaje" que necesitan para llevar en el camino al óvulo. La función principal de un
espermatozoide, fertilizar un ovocito, es un conjunto integrado de procesos, que
requieren múltiples atributos celulares. Por lo tanto, aunque el espermatozoide
contiene pocos organelos, sigue siendo una célula compleja, que tiene múltiples
compartimentos celulares, composiciones de membrana, y las estructuras
subcelulares, todas las cuales deben funcionar correctamente para que el
espermatozoide pueda fertilizar un ovocito (Graham, 2001).

Es de especial interés para el profesional, que en la espermatogénesis, el ADN de la

célula es condensado de tal manera que los genes no pueden ser expresados, por lo
tanto el espermatozoide no puede sintetizar proteínas. Esto significa que la célula no
puede repararse de daño celular que se produce naturalmente o debido a
intervenciones del hombre (manipulación de semen, refrigeración o
crioconservación). La manipulación indebida de los espermatozoides los puede
dañar permanentemente, tornándolos infértiles (Graham, 2001).
Las células espermáticas deben presentar motilidad, actividad mitocondrial, la
membrana celular y el acrosoma integridad total y el núcleo deberá estar
condensado, permitiendo la interacción con el tracto genital femenino y la
fertilización (Rodríguez-Martínez, 2000; Graham, 2001).
Debido a la naturaleza multicompartimental de las células espermáticas y el daño
que implica la criopreservación, las evaluaciones de laboratorio que con exactitud
pueden determinar la viabilidad de muestras de semen son vitales. La calidad de

11
semen bovino influye considerablemente en la tasa de no retorno y tasas de
fertilización, en programas de inseminación artificial (Santos, 2003; Phillips et al.,
2004b). Esto es uno de los factores más importantes para la correcta producción de
ganado; y justamente en esto se basa la fundamentación de la presente tesis.

Por ser una célula compleja, los espermatozoides se vuelven infértiles cuando uno
de sus factores bioquímicos o morfológicos está afectado. La evaluación de solo uno
de estos aspectos no garantiza la condición de normalidad del otro, por lo tanto la
combinación de varios factores es un análisis multifactorial más apropiado para el
diagnostico de funcionalidad e integridad del espermatozoide (Melo y Henry, 1999).

Actualmente los métodos de evaluación utilizados en centros de colecta y

procesamiento de semen consisten básicamente en el análisis subjetivo de motilidad
(antes y después del estrés térmico), concentración, morfología e integridad de las
membranas plasmáticas y acrosomal (Crespilho et al., 2009).
Trabajos preliminares realizados en otros países han mostrado grandes
discrepancias entre varios LPS en cuanto a técnicas de laboratorio empleadas para
la evaluación de calidad de semen (Phillips et al., 2004a; Crespilho et al., 2009). Sin
embargo, no mucho se sabe en cuanto a procedimientos y estándares adoptados
por los LPS en Uruguay.
En Uruguay existen importantes laboratorios que colectan, envasan y congelan
semen de los mejores ejemplares de cada raza bovina y para eso utilizan modernas
tecnologías de congelación, sin embargo no existen antecedentes de ningún estudio
con respecto a las evaluaciones de semen en LPS y los diferentes procedimientos
que se llevan a cabo. Tampoco existe ninguna normativa en la legislación en lo que
respecta a valores de referencia y técnicas empleadas para el análisis de las
muestras que son destinadas al comercio interno, a pesar de su importancia.
El Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca (MGAP) a través de la Sección de
Reproducción de la Dirección de Laboratorios Veterinarios (DILAVE) es quien regula
los centros de toros registrados y habilitados para la congelación de semen
destinada a la exportación.

12
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

RESEÑA HISTORICA
Congelación e inseminación artificial a nivel mundial
En 1677 Antón Van Leeuwenhoek y su pupilo John Hann, descubrieron los
espermatozoides con el uso de “lentes de aumento”, refiriéndose a una innumerable
cantidad de cuerpos minúsculos, a los que llamaron “animáculos“, los cuales se
movían con fuerza (Perry, 1960).
En 1782 el experimento de Spalanzani fue repetido por Rossi y evaluado por el
profesor Branchi (Perry, 1960). Spalanzani descubrió a su vez que cuando el semen
era filtrado, el líquido filtrado era infértil y el remanente que quedaba en el filtro era
altamente fértil. Spalanzani, contribuyó al conocimiento sobre el efecto del enfriado
sobre el semen, el cual prolongaba la vida de los espermas. Observó que el semen
del padrillo enfriado en la nieve o en el clima frío no necesariamente mataba los
“vermículos espermáticos“, pero el movimiento disminuía hasta que los mismos
fuesen expuestos al calor, luego del cual el movimiento continuaba por 7 horas y
media. Su descubrimiento dio inicio a intensas investigaciones de las células
sexuales y la fisiología de la fertilización, pero estos estudios no tuvieron el impacto
tan fuerte que se esperaba hasta largo tiempo después. En efecto, esto no fue hasta
bastante entrado en el siglo XIX que fueron retomados en Europa y América
(Roberts, 1979).
El investigador ruso y líder pionero en la inseminación artificial fue Ivanoff. En 1899
fue requerido por el jefe del Royal Russian Stud para determinar las posibilidades
del método para su uso en equinos. También intentó la técnica en pájaros.
Ivanoff fue el primero en tomar la iniciativa de realizar la inseminación en el ganado
vacuno y lanar. Ivanoff estuvo a la cabeza del Ministerio de Agricultura y durante el
año anterior a la primera guerra mundial entrenó entre 300 y 400 hombres, los
cuales muchos fueron enviados al exterior para practicar la inseminación (Perry,
1960).
El número de trabajadores en el campo de la inseminación artificial creció
rápidamente. Fueron desarrolladas varias técnicas que mejoraron los métodos y las
formas de colecta, así como el manejo del semen y de los animales de granja para
la inseminación. Por medios de estos avances, muchos factores fueron
desarrollados y tenidos en cuenta para la biología y la bioquímica del esperma, la
secreción de las glándulas reproductivas del macho, de la ovulación y del celo en la
hembra y su relación entre ambos (Perry, 1960).
Posteriormente, Milovanov en 1938 utilizó los reportes de Amantea en sus intentos
de desarrollo de la vagina artificial para toro, padrillo y carnero.

Walton junto con Prowochenski fueron los primeros en realizar experimentos a larga
distancia donde, en 1936, colectaron semen de un carnero Suffolk en Cambridge,
luego de enfriado a 10 grados fue transferido a termos conteniendo hielo picado y
enviado por vía aérea al Pulawy Zootecnical Institute en Polonia. Aquí, 5 ovejas
fueron inseminadas con semen de este carnero 2 días y 3 horas luego de su colecta;

13
2 ovejas quedaron preñadas y una parió un cordero macho que tenía las
características raciales del Suffolk.
En 1940 los americanos Phillips y Lardy desarrollaron un diluyente a base de citrato
de sodio y yema de huevo que permitió extender el volumen de semen y prolongar
su vida útil 48 a 72 hs.
Un nuevo descubrimiento en el campo de la inseminación fue desarrollado en 1949,
cuando Polge, Smith y Parker desarrollaron métodos prácticos para la preservación
del semen durante un largo tiempo, por medio de la congelación con hielo seco a –
70 ºC (Perry, 1960).
Polge y Rowson observaron que el glicerol protege el esperma frente a las bajas
temperaturas y además probaron la capacidad fertilizante del semen de toro, el cual
fue “bufferado” con yema de huevo, citrato de sodio, equilibrado con glicerol y diluido
por algunas horas antes del congelado. Los resultados de los niveles de concepción
fueron aceptables. Este descubrimiento permitió enviar semen de toro congelado en
ampollas de vidrio de un país a otro, transformándose en una práctica común. El
refrigerante fue por un lado el hielo seco y por otro el nitrógeno líquido (Perry, 1960).
En 1952, en nuestra facultad diserto el Dr. Polge y poco después el Dr. Parkes,
quienes ratificaron el éxito de sus investigaciones, anunciando que en Inglaterra ya
se inseminaba con semen congelado (Duran del Campo, 2001).
La Waterloo Cattle Breeding Association de Waterloo, Canadá, fue la primer
organización en el mundo que utilizó 100 % semen congelado en los inicios de 1954.
También éste mismo año, McEntee comunica que el agregado de antibiótico al
semen congelado evita la infección con Campylobacter fetus a las hembras
susceptibles (Perry, 1960).
En 1964 los japoneses Nagase y Niwa presentaron un método de congelación en
pellet o pastillas que básicamente consistía en que una gota de semen diluida en
diluyente glicoglicerolado y yema de huevo se depositaba sobre agujeritos hechos
en la superficie de piedras de hielo seco. Se congelaba en segundos conservando
intacta la movilidad de millones de espermatozoides.
Mientras tanto Cassou en Francia crea el método de envasado de las pajuelas y el
uso de la pistola de inseminación artificial (CIAVT, 1987).

El Ontario Veterinary College de Guelph, Canadá, fue quien realizó a gran escala el
procesado de semen congelado y el desarrollo de equipos para el almacenamiento y
uso en el campo (Perry, 1960).

Congelación e inseminación artificial en Uruguay

En Uruguay la inseminación artificial se conoce desde 1933, con el nacimiento de un

potrillo fruto de ésta técnica. En 1937 son exhibidos en la Exposición del Prado,
borregos Lincoln producto de la inseminación artificial (CIAVT, 1987).
Fue en los primeros años de la década del 40 el Dr. Juan C. Gutiérrez Fabre
realizaba los primeros trabajos de inseminación en ovinos. Y en 1943 el Dr. Jaunsolo
realiza los primeros trabajos en vacunos.

14
En 1956 surge la formación de una empresa de congelación -Banco de Semen
Congelado- BASEMCO.
Se comenzó a congelar semen en 1956. La operación comenzaba con la extracción
de semen, su evaluación, dilución en un medio glicoglicerolado, enfriamiento durante
4 horas (período de equilibración), pipeteado en ampollas de 2ml que se cerraban a
la lámpara y luego se disponían en canastos especiales donde eran inmersas en
alcohol rectificado al 95% a 5ºC el que con el agregado de pequeños trocitos de
hielo seco se iban enfriando hasta congelar el material seminal. Terminada la
operación, el semen congelado se conservaba en hielo seco en grandes heladeras.
Fue a partir de este mismo año que se habilito la importación de semen.

En 1964 fue que los japoneses Nagase y Niwa presentaron un método de

congelación en pellets o pastillas. Fue un año después que en Uruguay se puso en
práctica esta técnica. A partir de entonces la inseminación tomó nuevo impulso y
buenos resultados.

Por lo tanto se comenzó a utilizar nitrógeno liquido contenido en bioconservadores,

estos últimos se obtenían mediante importación de semen (a título de envase), ya
que no estaba habilitada la importación de termos para nitrógeno (recién alrededor
de 1968/70) aunque sí podían ingresar conteniendo semen.
En el año 1965 Duran del Campo congela pastillas de semen de toros de alta
calidad genética de esa época y treinta años después el semen es reevaluado in
vitro e in vivo obteniendo buenos resultados en cuanto a calidad y porcentaje de
preñez (Bonadonna, 1989).
El nitrógeno era obtenido como producto de desecho de la producción de oxigeno
por parte de la compañía CINOCA (Industrias Nacionales Oxigeno, Caños y Acero
S.A.) la que no siempre contaba con stock de N2 para la venta con los problemas
que ello conllevaba para el mantenimiento del semen. Posteriormente en 1977 la
Cía. sueca AGA (Aktiebolaget Gas Accumulatie) derivo su producción de oxigeno,
también a nitrógeno.

En 1977 los uruguayos Dr. Rafael Cash y Dr. Aníbal Durán del Campo encontraron
un método que permite congelar pellets en N2. Tras muchos ensayos llegaron a la
conclusión que el mejor resultado era dado con una superficie de acrílico y a una
altura de 5cm del N2. Este procedimiento se extendió rápidamente entre los colegas
ya que hace la congelación mucho más práctica y económica. Hasta el 2001 no se
había empadronado el invento ya que los creadores olvidaron hacerlo 24 años
antes. La técnica se mantiene hasta hoy con mínimas variaciones (Duran del
Campo, 2001).

15
ESPERMATOZOIDES

Los espermatozoides (gametos masculinos) forman parte de la suspensión celular

liquida llamada semen, que también se conforma por secreciones procedentes de
testículos, epidídimos y glándulas accesorias del aparato reproductor masculino
(plasma seminal).
Los espermatozoides se forman en los túbulos seminíferos de los testículos. En
dichos túbulos se encuentran las células germinales que finalmente se convertirán
en los gametos masculinos.
Los espermatozoides maduros se dividen según su estructura anatómica en cabeza
(conteniendo el núcleo) y cola (permite su motilidad).
Contiene un acrosoma, estructura de doble pared, que es una estructura ubicada
entre la membrana plasmática (que recubre al espermatozoide) y la porción anterior
de la cabeza. Un cuello une la cabeza con la cola (flagelo), la cual a su vez se
subdivide en los segmentos medio, principal y caudal.

Cabeza: Contiene al núcleo aplanado oval donde se aloja la cromatina compactada,

formada por ADN y protaminas (proteínas). El numero acrosómico del ADN es
haploide, o sea que posee la mitad de cromosomas que el núcleo de las células
somáticas de la misma especie.

Acrosoma: Es un delgado saco membranoso de doble capa, ubicado sobre el

núcleo. Contiene acrosina, hialuronidasa y otras enzimas hidrolíticas, que participan
en el proceso de fecundación fusionándose a la membrana del ovocito.

Cola: se subdivide en cuello y segmentos medio, principal y caudal.

Desde una placa basal ubicada en el cuello nacen nueve fibras gruesas que se
proyectan hasta el anillo citoplasmático (ubicado entre el segmento medio y el
principal). En el segmento medio nace el axonema que comprende nueve pares de
microtúbulos dispuestos radialmente alrededor de dos filamentos centrales. Esta
disposición (9+2) está rodeada por las nueve fibras gruesas antes mencionadas,
durante su paso por el segmento medio.
El axonema y las fibras gruesas están cubiertas por una vaina mitocondrial que es la
fuente de energía necesaria para la motilidad espermática.

Gota protoplásmica o citoplasmática: Está compuesta por citoplasma residual. Suele

desprenderse de los espermatozoides tras el eyaculado, aunque puede retenerse en
la región del cuello (gota proximal) o cerca del anillo citoplasmático (gota distal).

Los espermatozoides testiculares son transportados desde el testículo a través de

un conducto contorneado llamado epidídimo.
En su paso por éste, los espermatozoides experimentan un proceso de maduración,
adquiriendo capacidad potencial de fecundar óvulos. Estos cambios se asocian a
aspectos de la integridad funcional de los espermatozoides: a) desarrollo del
potencial para la motilidad progresiva sostenida, b) modificación de los patrones
metabólicos y el estado estructural de organelos específicos de la cola, c) cambios
en la cromatina nuclear, d) cambios en la naturaleza de la superficie de la membrana
plasmática, e) movimiento y perdida de la gota citoplasmática, f) modificación de la
forma del acrosoma (en algunas especies).

16
Para que no exista un metabolismo innecesario por parte de los espermatozoides
madurados, las células que recubren el epidídimo secretan “factores de inmovilidad”
prolongando así la supervivencia de los espermatozoides.

Estos son almacenados mayormente en la porción caudal del epidídimo siendo

éstos ya maduros los que pueden ser eyaculados. Si bien este ambiente les es
favorable para su supervivencia, no serán preservados por tiempo indefinido. Los
espermatozoides no eyaculados se eliminan de forma gradual por excreción en la
orina (Graves, 1978; Garner y Hafez, 2000).

17
COLECCIÓN DE SEMEN BOVINO

En general, para que un toro de una compañía de IA pueda ser autorizado para la
colección y congelamiento de semen, el animal debe ser aprobado mediante un
examen físico completo de salud general y reproductiva y debe pasar las pruebas
sanitarias locales obligatorias que buscan detectar posibles enfermedades
contagiosas.

A pesar de que existan gran cantidad de métodos para recolección de semen

bovino, nos referiremos a los tres métodos más utilizados en la práctica que son la
vagina artificial, el electroeyaculador y el masaje transrectal.

Vagina Artificial (VA)

Este método es casi el único utilizado en los centros de IA, por razones prácticas y
porque produce eyaculados más fisiológicamente parecidos a los naturales
(Baracaldo et al., 2007). Además de permitir una adecuada excitación sexual del
macho, lo que permite obtener semen de buen volumen y alta concentración
espermática. Con intervalos cortos de 10-15 minutos se pueden obtener hasta 4
eyaculados.

La vagina artificial es una construcción simple y simula la copula natural. La unidad

proporciona temperatura adecuada, presión y fricción que favorece la eyaculación
(Ax et al., 2000b).
Consta de un cilindro de goma dura exterior que contiene un revestimiento interior
de látex que se reinvierte en sus extremos. En una parte de la vagina artificial se
coloca una extensión de látex cónica que lleva un tubo de vidrio graduado (Arthur et
al., 1991).

Figura 1. Vagina artificial bovina armada y lista para la colección del

semen. (Cortesía de Minitube International). Disponible en:
www.ivis.org

La presión y temperatura adecuada de la vagina artificial se obtiene llenando con

agua de la mitad a dos terceras partes del espacio existente entre la camisa, siendo
la cantidad de agua necesaria, inversamente proporcional al tamaño del pene.
Durante la recolección, la temperatura interna de la vagina artificial debe estar entre
42 – 50 ºC que se cree la temperatura ideal. Puede también insuflarse aire para
aumentar la presión. Finalmente puede utilizarse algún gel estéril que no dañe a los
espermatozoides. Con respecto a la temperatura del agua, el operario debe tener en
cuenta el tiempo de espera entre el llenado con agua de la vagina artificial y la
colecta, así como la temperatura ambiente, ya que es normal que la vagina
comience a enfriarse (Arthur et al., 1991; Ax et al., 2000b; Barth, 2007).
Se recomienda una estimulación previa que consiste de 3 a 5 montas falsas y
restricción activa. Luego de esto se permite al toro montar a la hembra excitadora.

18
La persona a cargo de la recolección desvía el pene del toro a la vagina artificial la
cual se mantiene paralela al flanco de la hembra. Al tener contacto con la superficie
tibia y lubricada, el toro eyacula de inmediato en la vagina artificial. Al eyacular, la
VA debe ser inclinada de inmediato hacia abajo, en dirección al tubo de ensayo. El
semen drena al tubo de recolección, que entonces se retira y se coloca en baño de
agua que se ha mantenido a 34ºC, antes de medirse la concentración de
espermatozoides (Ax et al., 2000b).
Toros jóvenes o que no están acostumbrados a utilizar vagina artificial, tal vez
necesiten una hembra en estro para que el procedimiento sea exitoso (Barth, 2007).
Son muy importantes las prácticas higiénicas cuando se recoge semen de los toros.
El sitio donde se va a realizar la colección debe ser seco, libre de polvo, suciedad y
barro. El lavado de la cavidad prepucial con suero fisiológico caliente antes del
servicio tiene valor dudoso en lo que respecta a reducir las bacterias presentes en el
semen (Bonadonna, 1989).

Figura 2. Arriba: El colector agarra el pene a través de la vaina prepucial y lo

dirige hacia la abertura de la VA.
Abajo: El pene del toro penetra la VA antes del salto eyaculatorio final.
(Fotos cortesía de Gencor - The Genetics Corporation). Disponible en:
www.ivis.org

Figura 3. Maniquí móvil diseñado para colección de semen con VA

(Cortesía de Minitube International). Disponible en: www.ivis.org

Figura 4. Colección de semen con un maniquí móvil. El colector con la VA

está sentado en el interior del maniquí (Cortesía de Minitube International).
Disponible en: www.ivis.org

Masaje transrectal

Para realizar la técnica de masaje, el operador debe introducir su mano en el recto y

luego de la exanimación de las glándulas accesorias y los anillos inguinales, se
aplica un masaje longitudinal de atrás hacia adelante sobre la ampolla, la próstata y
periódicamente sobre la uretra. Estimular las glándulas vesiculares parecería tener
menor importancia. Cuando el músculo de la uretra comience las contracciones, el
operador debe tratar de masajear en sincronía con ellas y continuar el masaje hasta

19
producirse la eyaculación, pero si no se colecta luego de 2 a 3 minutos de masajes
usualmente el procedimiento será infructuoso (Morrow, 1986).
El semen recogido por este método puede estar contaminado con orina, tiene una
proporción demasiado elevada de secreción de la vesícula seminal o bien tiene sus
componentes menos equilibrados que el eyaculado normal (Salisbury et al., 1978).
El masaje transrectal, es una técnica que no puede usarse en todo tipo de toros,
sobre todo por su temperamento habiendo en algunos casos falta de protrusión del
pene que resulta en contaminación desde el prepucio, e irritación de la mucosa
rectal por la excesiva frotación manual. No es menor destacar que el número de
toros al cual se les puede aplicar este método es limitado, no solo por lo explicado
anteriormente, sino porque es un procedimiento extenuante para el operador que
realiza el masaje.

Ventajas:
1. No se requiere tener un equipo costoso.
2. Esta técnica evita el dolor potencial ocasionado por técnicas como la
electroeyaculación.

Desventajas:
1. Se requiere de un operador con gran destreza en palpación por vía rectal del
tracto reproductivo de los toros.
2. La libido, la capacidad de apareamiento, la función eréctil del pene y la capacidad
de eyaculación no son evaluadas con esta técnica
3. Las muestras de semen pueden contaminarse con células epiteliales, bacterias o
impurezas, especialmente cuando la muestra seminal gotea del prepucio o a lo largo
de los pelos prepuciales.
4. El volumen y la concentración del semen obtenido son muy variables.

Electroeyaculador

El electroeyaculador es un aparato eléctrico que provee una estimulación rectal que

desencadena la erección y eyaculación. Está formado esencialmente por:
transformador, reóstato electrodo bipolar, voltímetro.
Previo a su utilización debe realizarse un examen transrectal de los órganos internos
y anillo inguinal, la uretra pélvica debe ser masajeada por 30 a 60 segundos. El área
sobre la ampolla, próstata y uretra se debe masajear con movimientos de adelante
hacia atrás con dirección longitudinal. Dicha estimulación debería facilitar la
colección de semen mediante el electroeyaculador.

El recto debe estar vaciado de materia fecal, y debe prevenirse la introducción de

aire en el mismo. El desarrollo de la estimulación consiste en aumentar
gradualmente el voltaje; al principio debe de ser bajo, las glándulas bulbouretrales
descargan, a esto le siguen unas descargas más grandes de las vesículas
seminales y próstata, y finalmente después de 18 a 20 estimulaciones y
normalmente a un voltaje de 15 caen gotas de semen. La estimulación debe durar 1
o 2 segundos con 0,5 segundos sin estimulación entre medio. La descarga seminal

20
normalmente acontece de forma pasiva pero de manera ocasional existe una
erección del pene y orgasmo. La estimulación normalmente es continuada hasta
obtener 2 a 5 ml de semen (Arthur et al., 1991; Barth, 2007).
El electroeyaculador permite extraer semen a todos los toros sin previo
acostumbramiento especialmente en animales indómitos, con afecciones de los
miembros posteriores que le impiden cubrir la hembra o en el caso de examen de
infertilidad de varios animales (Arthur et al., 1991).
Algunos toros pueden segregar excesivo líquido seminal durante la
electroeyaculación, lo que da como resultado semen con una baja concentración de
espermatozoides (Bonadonna, 1989).
Los electroeyaculadores están diseñados para estimular los nervios pélvicos
simpáticos y parasimpáticos con impulsos de bajo voltaje y amperaje y de esta forma
pueden inducir erección peneana y eyaculación. Un sistema de electroeyaculación
está constituido por los siguientes componentes: la caja de transporte, la sonda
rectal, la unidad de control, el cargador de batería, el cable de energía, el cable de
conexión de la sonda, el mango, el cono y el envase de colección (fig. 5).

Figura 5. Equipo completo de electroeyaculación (Cortesía de Minitube

International). Disponible en: www.ivis.org

La mayoría de los toros eyaculan al recibir un estímulo eléctrico menor a 9 voltios. Si

un toro no ha eyaculado después de recibir el nivel más alto de estimulación con el
electroeyaculador, pueden efectuarse 3 a 4 estimulaciones con el nivel máximo,
seguidas por un período de descanso de 1 a 2 minutos manteniendo siempre la
sonda dentro del recto (Salisbury et al., 1978).

La situación ideal para restringir los movimientos de un toro que va a ser sometido a
electroeyaculación, es ubicar el animal en un cepo, pero sin necesidad de atrapar la
cabeza del toro en la compuerta anterior del mismo. El riesgo que existe es que
cuando la cabeza del toro se atrapa, existe una mayor tendencia a que el animal
caiga durante el procedimiento.
.

Figura 6. Colección de semen por electroeyaculación.

Cortesía del Dr. Albert Barth. Disponible en: www.ivis.org

Usando un equipo apropiado y una buena técnica, sólo alrededor del 2% de los toros
con fertilidad normal fallan en emitir semen por esta técnica. Se considera que la

21
electroeyaculación sin anestesia es dolorosa para los toros, y su uso es controversial
en algunos países.
Los mugidos durante la electroeyaculación, y la elevación de la progesterona y
cortisol de origen adrenal después de efectuar el procedimiento son considerados
como una evidencia del dolor ocasionado por la técnica. Por lo tanto, el
procedimiento debe realizarse sólo por personal con entrenamiento adecuado y
siempre en la forma más adecuada y con la menor estimulación posible (Salisbury et
al., 1978).

22
TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE SEMEN FRESCO

Desafortunadamente no se puede proporcionar una predicción precisa de la

fertilidad, aunque sí es cierto que probablemente muestras problemáticas se pueden
distinguir (Holt y Van Look, 2004).
Es generalmente aceptado que hay una conexión entre la fertilidad del semen y sus
propiedades mensurables. El objetivo de la evaluación de semen es de predecir la
capacidad fecundante del mismo lo más acertadamente posible. Muchos métodos
diferentes han sido evaluados a lo largo de las décadas pasadas, pero sólo pocos
métodos han sido adoptados para el trabajo práctico. La mayor parte de estos
estudios han usado las evaluaciones sencillas microscópicas de clásicos parámetros
espermáticos, incluyendo la concentración de esperma, motilidad, morfología y
viabilidad (Januskauskas y Zilinskas, 2002).

Tal como lo ha reportado Salisbury en 1978, una vez que se alcanza el valor óptimo
en la valoración del semen, el incremento posterior de los valores del carácter no
produce un incremento paralelo en la fertilidad (fig. 7).

Rango de
valores
Nivel de fertilidad.

satisfactorios
para resultados
óptimos.

Valor umbral para

resultados óptimos.

Valores crecientes de un semen característico que se

aproxima al valor máximo.

Figura 7: Incremento de la fertilidad con valores crecientes de semen de toro hasta que se alcanza el
umbral de fertilidad optima (Salisbury et al. 1978).

En definitiva el objetivo de todos estos intentos de medir la calidad del semen es

garantizar que la fertilidad de dicho semen se halla dentro del rango normal. A veces
se confunden los términos “calidad de semen” y “fertilidad”. No son sinónimos,
aunque se han realizado muchos esfuerzos a lo largo de los años, con cierto éxito,
para hacer que ambas coincidan más estrechamente (Salisbury et al., 1978).

Procesamiento:
Tener preparado baño maría con tubos de citrato de Na, eosina, platina térmica del
microscopio conectado y con portaobjeto. Es recomendable realizar dos extendidos
por muestra, e identificarlos correctamente. La técnica de evaluación de semen

23
fresco se divide en pruebas macroscópicas y microscópicas que se describen a
continuación.

Pruebas macroscópicas

Inmediatamente después de la extracción debe hacerse un examen macroscópico

del semen eyaculado en el tubo de colecta. Dicho examen comprende la anotación
del volumen, color, densidad, motilidad en masa macroscópica, pH, cuerpos
extraños y Schalm test (Elliot, 1978).

Volumen:
Normalmente tiene un amplio rango que va de 2-12ml. Se debe tener en cuenta que
para toros mayores de 2 años el mínimo esperable son 4ml. Los animales jóvenes y
los de menor talla dentro de una especie producen menor volumen de semen. La
elevada frecuencia de eyaculación reduce el volumen promedio y cuando se
obtienen dos eyaculados consecutivamente, el segundo suele tener menor volumen.
El que éste sea reducido no es perjudicial, pero si se acompaña de concentración
espermática baja, por lo que el resultado total disminuirá. Se le llama aspermia a la
ausencia de eyaculado, hipospermia a un volumen reducido e hiperespermia al
volumen aumentado (Ax et al., 2000a).

Aspecto:
El eyaculado como tal, es un líquido denso, cremoso, ligeramente amarillento, que
contiene una suspensión de espermatozoides en un medio llamado plasma seminal
(Ax et al., 2000a).

Tabla 1. Aspecto del eyaculado correlacionado a la concentración (Ax et al., 2000a).

3
Aspecto Valor descriptivo Número de spz estimado (spz/mm )
Cremoso espeso Muy buena > 750.000
Lechoso Buena 400-750.000
Leche aguachenta Regular 250-400.000
Traslucida Pobre <250.000

Olor
El olor natural es bastante característico de cada especie animal y en general no es
muy intenso. El semen puede tomar un olor urinoso si se mezcla con orina y un olor
más o menos intensamente alterado, de putrefacción, cuando se mezcla con
productos purulentos y trozos necróticos. Toma el mismo olor cuando el orificio
prepucial está lesionado y supura, por grietas descuidadas, y por escasa limpieza
(Bonadonna, 1989).

Color
En general el semen es de color blanco cremoso, que más o menos tiende al tono
marfil, en relación con la cantidad de espermatozoides contenidos. Puede ser blanco
grisáceo y al mismo tiempo normal.

24
Posee una coloración blanquecina o ligeramente amarillenta y su opacidad se halla
en función de la concentración espermática.
Los toros pueden producir semen de color amarillo debido a la presencia inocua de
riboflavina por las glándulas vesiculares y ampollas del conducto deferente, no
teniendo ningún tipo de significación clínica. Esto no debe confundirse con orina, la
cual tiene su olor característico (Ax et al., 2000a).
A veces el semen es de color verdoso, lo cual indica la existencia de procesos
necrotizántes, de carácter purulento, causados por algún órgano del aparato genital
masculino. El semen puede estar coloreado de rojo vivo por la presencia de sangre
cuando hay heridas recientes en el prepucio, el glande o la uretra, a menudo
producidas durante la recolección artificial (Bonadonna, 1989). Recordemos que la
presencia de pus indica inflamación, y que la orina es espermicida. Y que la sangre
contiene eosinófilos, que presentan una enzima (amilasa) que destruye los factores
de capacitación producidos en el epidídimo.

Motilidad en masa macroscópica

Es un dato subjetivo que se refiere a la motilidad de la masa como resultado del
movimiento conjunto de los espermatozoides.
Es particularmente evidente en el semen rico en elementos celulares vivos y activos
y se lo puede evaluar poniéndolo a contraluz. Sin embargo, la aparente escasez de
actividad masiva no es un elemento suficiente para juzgar que determinado semen
es menos bueno que otros (Bonadonna, 1989).

En el eyaculado de los rumiantes, dada su elevada concentración espermática, se

puede valorar la motilidad masal, definida como movimientos en ondas y remolinos
del total de espermatozoides de la muestra.

En la siguiente tabla se describe el sistema de clasificación donde normalmente se

valora de forma subjetiva en una escala de 0 a 5, con una puntuación de 5 cuando
se observan oleadas o remolinos con movientes rápido y vigoroso, y de 0 cuando no
se observa movimiento en ondas. También se puede clasificar mediante cruces.

Tabla 2. Valoración de la motilidad masal macroscópica (Bonadonna, 1989).

Movimiento en ondas
+++ 5/5 y 4/5 Movimientos masivos muy marcados y rápidos

++ 3/5 Movimientos en masa aparentes, pero moderados

+ 1/5 y 2/5 Ondas en movimientos apenas aceptables

- 0 No hay ondas, semen sin movimiento

pH:
El pH del semen de toro recientemente eyaculado depende las proporciones
variables de las diversas secreciones implicadas. La mayoría de las muestras
normales se hallan en el lado acido de la neutralidad, oscilando desde pH 6,5 al de
6,9, con una media de 6,75 (Derivaux, 1976). Este parámetro no varía mucho en las

25
distintas especies animales. Aunque el pH varía en un rango amplio, desde,
alrededor de 6,0 o más bajo a 8,0 o ligeramente mayor.
El semen de buena calidad es generalmente mas acido (pH inferior) que el semen
con concentraciones más bajas de células espermáticas. El semen de mala calidad
contiene una cantidad proporcionalmente mayor de liquido procedente de las
glándulas uretrales y accesorias.
Puesto que los espermatozoides descomponen la fructosa del semen en acido
láctico en las condiciones anaerobias que generalmente existen en los estrechos
tubos de recogida, el pH del semen disminuye con el tiempo transcurrido entre la
recogida y la determinación (Salisbury et al., 1978; Ax et al., 2000a).

Cuerpos extraños:
La muestra debe estar libre de polvo, tierra, pasto, heces, pelo y otros
contaminantes. Debe desecharse el semen con fragmentos de material extraño;
estos generalmente decantan al fondo del tubo. La presencia de alguno de éstos
contaminantes es indicadora de una mala técnica de extracción de semen (Ax et. al.,
2000a).

Schalm test
Se realiza para detectar la presencia de leucocitos, pero sólo en casos que se
sospeche la presencia de los mismos. No se hace de rutina en cada evaluación.
La prueba se basa en el mismo principio del California mastitis test.

Pruebas microscópicas

Motilidad en masa microscópica:

El movimiento en masa depende de tres factores: concentración, porcentaje de
células con movimiento progresivo y velocidad de movimiento de los
espermatozoides. Cuando uno de estos tres factores se encuentra disminuido, las
ondas rápidas en remolinos esperadas son severamente deprimidas o eliminadas.
Por ejemplo, una muestra con un 80% de motilidad individual puede no tener
prácticamente ondas por una baja concentración o por baja velocidad de
movimiento. O una muestra con una muy buena concentración y un alto porcentaje
de movimiento progresivo individual puede producir poco o nada de movimiento de
onda si la velocidad de los espermatozoides ha sido disminuida por temperaturas
frías o por haber transcurrido un largo intervalo entre la colecta y la evaluación. Por
lo tanto, la motilidad masal debe ser interpretada cuidadosamente.

La determinación de la motilidad masal se hace utilizando una gota de semen puro

de 5 a 10 mm de diámetro, colocada sobre un portaobjeto atemperado y sin
cubreobjetos. La observación se realiza bajo un campo luminoso con un aumento de
40X (lupa). Se evalúa la presencia de ondas cerca del borde de la gota.
(Bonadonna, 1989). Y se clasifica basándonos en el porcentaje de células móviles
según la siguiente escala:

Tabla 3. Escala de la motilidad en masa microscópica (Bonadonna, 1989).

26
 Movimiento en ondas Valor descriptivo

+++ 5/5 y 4/5 Corrientes turbulentas o vertiginosas que se mueven muy Muy buena
rápidamente
++ 3/5 Ondas lentas Buena

+ 1/5 y 2/5 Movimientos singulares o esporádicos y ninguna actividad Regular

de masa
- 0 Necrospermia o inmovilidad total. Mala

Se consideran aceptables para utilizar semen fresco un nivel de regular-bueno,

mientras que para su congelación el parámetro para ser aceptado sería de nivel
bueno - muy bueno (Tribulo et al., 2002).

Densidad
Este parámetro permite predecir de forma subjetiva mediante una escala (tabla 1) la
concentración espermática o sea el número de espermatozoides por mm3 o cm3. El
semen debe tener un aspecto opaco y relativamente uniforme, indicativo de alta
concentración de células espermáticas (Ax et al., 2000a).

Tabla 4. Correlación entre concentración y densidad (Dpto. Teriogenología, 2000).

Criterio Descripción Número de spz estimados
evaluativo
3
DD Densísimo Se observan los spz superpuestos > 1.500.000 spz/mm
3
D Denso El campo óptico está lleno de spz y entre 800 - 1.500.000 spz/mm
ellos no existen espacios.
3
SD Semidenso Campo visual con espacios intermedios 800 - 500spz/mm
entre los spz del tamaño de una cabeza.
3
R Ralo Espacios libres amplios. 500-200spz/mm
3
O Oligospermia Spz separados por grandes espacios. < 200spz/mm

A Azoospermia No se observan spz. Ausencia

Motilidad individual:
La estimación visual del porcentaje de espermatozoides móviles en una muestra de
semen es el análisis más comúnmente hecho de rutina. Su importancia es debida al
peso que tiene esta característica sobre la fertilidad (Graham y Mocé, 2005).

Por lo tanto la motilidad es un reflejo de la actividad flagelar, sin embargo no

necesariamente garantiza que esa célula sea fértil; según Roberts (1979), la
integridad del material genético en la cromatina del espermatozoide también debe
ser preservada para lograr un desarrollo embrionario normal luego de la fertilización.
Más allá de esta salvedad, mientras los espermatozoides con actividad flagelar
normal son capaces de cruzar la unión útero-tubárica y entrar en el oviducto, los
espermatozoides con función flagelar anormal son incapaces de hacerlo (Holt y Van
Look, 2004).

27
La motilidad es una manifestación de viabilidad espermática y de integridad celular.
Un eyaculado con un porcentaje bajo de espermatozoides móviles
(astenozoospermia), o ausencia de motilidad, debería ser automáticamente
descartado para su conservación. Esta puede no solo verse alterada sino también
suprimida como es el caso de espermatozoides muertos o en presencia de bajas
concentraciones de productos químicos tales como metales pesados (Roberts, 1979;
Den Daas, 1992; Holt y Van Look, 2004).

Para que un espermatozoide sea capaz de fecundar a un ovocito ha de reunir una

serie de requisitos, entre ellos, tener motilidad progresiva. Dicho parámetro ha sido y
sigue siendo el más utilizado para valorar la calidad de un eyaculado o de una dosis
seminal. El movimiento activo de los espermatozoides es imprescindible para la
colonización del oviducto durante la fase de trasporte espermático sostenido en el
tracto genital de la hembra, y para que tenga lugar la fecundación.

Cuando se diluye el eyaculado o se descongelan dosis de semen congelado, se

debe estima el porcentaje de espermatozoides individuales que están en movimiento
y el tipo de movimiento que realizan (progresivos o no progresivos). Las dosis
descongeladas con una motilidad progresiva inferior al 40 % se deberían descartar.

La valoración visual de la motilidad espermática es el método más simple, rápido y

barato. Sin embargo, es altamente subjetivo, puesto que los resultados obtenidos
dependen en gran parte de la habilidad y experiencia del técnico que evalúa la
muestra (Rodríguez- Martínez, 2000; Phillips et al., 2004a), y además, si se trabaja
con muestras muy concentradas se tiende a sobrestimar el porcentaje de
espermatozoides móviles. Por tanto, no es un método que, de forma fiable y
repetible, permita predecir la capacidad fecundante de una muestra de semen
(Saacke y White, 1972; Linford et al., 1976).

Es importante destacar el papel que cumplen los objetos que intervienen como el
aparato recolector, dado que agresiones tales como calor, frío o contaminación
química como residuos de jabón o sustancias químicas que son transportadas por
los dedos sobre el recolector o portaobjetos, pueden inmovilizar los
espermatozoides.
El método de colección, la condición corporal, la circunferencia escrotal y la edad
del toro hacen variar el porcentaje de espermatozoides móviles. Se ha reportado en
toros jóvenes, colectados por la técnica de masaje rectal y con circunferencias
escrotal mayores a 31 cm un porcentaje de motilidad espermática individual de
51.4+/-18% (Elhordoy et al., 2010).

El semen a su vez puede estar contaminado con orina durante la electroeyaculación

o contener pus. Eyaculaciones repetidas pueden resultar en una mejor motilidad
espermática en aquellos toros que no han eyaculado por un largo tiempo. Cuando el
semen es diluido para estimar la motilidad individual, se debe tener especial cuidado
en que tanto el diluyente como la temperatura del semen, del portaobjetos y
cubreobjetos deben estar a 37ºC (Morrow, 1986; Tribulo et al., 2002).
Según Morrow (1986) la prueba puede hacerse diluyendo el semen tanto en suero
fisiológico, como en solución de citrato de sodio. La prueba de rutina para esta
evaluación es con el semen diluido en Citrato de Na al 2.92%. Se coloca una gota
gruesa de semen, de aproximadamente 30 ó 40 microlitros en un tubo con unos 2ml.

28
de la solución de Citrato que debe estar a la misma temperatura del semen, ya en el
Baño María. Una vez diluido el semen se extrae una gota de la dilución y se la
coloca sobre un portaobjetos atemperado a 36-37ºC y se coloca sobre ésta un
cubreobjetos, también a la misma temperatura. Se observa al microscopio, siempre
sobre la platina térmica.

Debe ser observada a un aumento de 200 x – 500 x. Se debe observar un campo y

valorar subjetivamente los espermatozoides que se mueven en forma rectilínea
progresiva, siendo éstos los que atraviesan el campo de observación. Los
espermatozoides que giran en círculo o avanzan en forma oscilatoria se consideran
que tienen movimientos anormales. El porcentaje que se obtiene es el de los
espermatozoides con movimiento rectilíneo progresivo sobre el total de los
espermatozoides observados.
Generalmente basándonos en la escala del porcentaje de células móviles (tabla 4)
se aceptan como valor mínimo 50% de espermatozoides móviles para utilizar como
semen fresco y 70% si se desea congelar.

Tabla 5. Escala basada en el porcentaje de células móviles (Dpto. Teriogenología, 2000).

Porcentajes de motilidad individual.
5/5 80 y 100% de spz con movimiento rectilíneo uniforme
4/5 60 y 80% de spz con movimiento rectilíneo uniforme
3/5 40 y 60% de spz con movimiento rectilíneo uniforme
2/5 20 y 40% de spz con movimiento rectilíneo uniforme
1/5 20 % o menos de spz con movimiento rectilíneo uniforme

Es posible observar diversos patrones de movimiento. Los patrones generales de

motilidad espermática en el semen diluido se presentan en un patrón de semiarco
largo. El diluyente puede alterar un poco la motilidad, por lo general incrementando
la velocidad de medición. Después de la dilución inicial, un porcentaje elevado de los
espermatozoides puede mostrar un patrón de movimiento circular, que por lo general
se resuelve después de 5 a 10 minutos en el diluyente.

Si los espermatozoides nadan en movimiento circular estrecho, ello significa que tal
vez sufrieron choque por frío. El movimiento oscilatorio podría definirse como células
envejecidas o en proceso de secarse. Los patrones de motilidad también se
correlacionan con la fertilidad o subfertilidad en machos. La motilidad es
rutinariamente evaluada por estimación visual del porcentaje de células móviles, por
lo cual el resultado es subjetivo.
Para la evaluación objetiva (no sesgada) de la motilidad espermática se han
desarrollado varios procedimientos, como la fotomicrografía de tiempo, la
reproducción de videomicrografía cuadro por cuadro, la espectrofotometría y el
análisis computarizado. Los sistemas de análisis de semen asistido con
computadora (CASA) se utilizan en laboratorios de referencia como medio objetivo
para la valoración del movimiento espermático. Las descripciones de motilidad con
CASA incluyen:

1. Velocidad curvilínea
2. Velocidad promedio de recorrido
3. Velocidad en línea recta
4. Amplitud del desplazamiento cefálico lateral

29
5. Linealidad
6. Frecuencia de cruce
7. Desplazamiento angular medio
8. Área de recorrido de la cabeza espermática
9. Tiempo que cada espermatozoide es registrado

En general, el uso de sistemas automatizados proporciona al usuario de información

objetiva. Sin embargo actualmente los sistemas disponibles son caros y algunos
están sujetos a taras por ajustes subjetivos de los parámetros. Es sobre todo por su
elevado costo que su utilización de rutina en laboratorios comerciales se vea limitada
(Den Daas, 1992; Zavos et al., 1996; Ax et al., 2000a).

Vigor:
La velocidad de movimiento de los espermatozoides, denominado vigor, es la
velocidad con que éstos atraviesan el campo. Esta puede ser evaluada al mismo
tiempo que se hace la motilidad individual, y se clasifica bajo la siguiente escala.
Tabla 6. Escala del vigor del movimiento ondulado de los espermatozoides (Ax et al., 2000a).
Grado Nivel de movimiento

5 Movimiento progresivo muy rápido, cel. difícil de seguir visualmente

4 Movimiento progresivo rápido

3 Movimiento progresivo continuo a velocidad lenta

2 Lento movimiento de cola con algo de movimiento progresivo

1 Leve movimiento de cola sin desplazamiento progresivo

0 Sin movimiento

Normalmente se acepta un valor mínimo de 3, tanto para semen fresco como para
congelar.

Existen análisis por sistemas de computación que miden objetivamente % de

motilidad progresiva, vigor, concentración espermática y el número de spz/mm3.

Concentración:
La determinación exacta del número de espermatozoides y el volumen del
eyaculado define el número de hembras que pueden ser inseminadas. La
concentración del eyaculado es de 2x108 espermatozoides/ml en toros jóvenes, a
1,8x109 espermatozoides/ml en los maduros (Ax et al., 2000a).
Este parámetro no solo está influido por la edad, sino por el método de colección, la
condición corporal, desarrollo sexual, madurez del toro, régimen de alimentación,
estado de salud reproductiva, tamaño de los testículos y la época del año. Elhordoy
et al (2010), reportaron en toros Hereford de 18 meses con baja condición corporal,
una concentración promedio de 3,7 x108 espermatozoides/ml.

30
Saacke (2008) a través de una gráfica (fig. 10) muestra como el semen de toros
individuales varía en la máxima tasa de no retorno y en el tiempo al que se consigue
la máxima fertilidad con el aumento de la concentración de espermatozoides por
pajuela.

Figura 8: Relación entre la tasa de preñez y el número de espermatozoides inseminados (Saacke,

2008. Modificado de Sullivan y Elliott).

La concentración espermática se puede medir usando cámara de Neubauer,

turbimetría o espectrofotómetro. En el caso del hematocitómetro la cantidad de
espermatozoides por cámara se cuenta manualmente, lo cual, pese a tomar mucho
tiempo, es muy exacto (Elliot, 1978; Ax et al., 2000a). En la siguiente tabla se
muestra la denominación para diferentes concentraciones.

Opacimetría (turbimetría):
Con el fin de obtener una técnica que demuestra una mayor repetibilidad tanto para
la motilidad espermática y para la morfometría, diversos sistemas utilizando un
análisis de imagen computarizado se ha desarrollado y empleado. Programas
computarizados para la evaluación del esperma pueden ser más objetivos e imprimir
repetibilidad en las calificaciones con mayor capacidad que el ser humano para
identificar patrones de motilidad y espermatozoides normales. El poder de analizar
este tipo de prueba se da por la evaluación precisa y exacta de espermatozoides
con alto grado de objetividad, y por lo tanto puede mejorar el proceso de evaluación
seminal (Arruda, 2000; Verstegen et al, 2002.).

Método de la Cámara Cuentaglóbulos (espermatocitómetro):

Para evaluar la concentración, se deben matar previamente los espermatozoides y
así poder contarlos. Esto se logra preparando previamente una solución salina
formolada al 2%. Se colocan 10 microlitros de semen puro en 2ml. de solución salina
formolada (1/200) y se homogeniza invirtiendo. Luego se toman aproximadamente
14 microlitros y se carga la Cámara de Neubauer (portaobjetos de microscopio que
cuenta con cámaras numeradas de precisión) por capilaridad, (14ul por cada
retículo, llenar los 2 retículos).

31
Una vez cargada, se debe dejar reposar unos minutos para permitir que todos los
espermatozoides decanten y se ubiquen en un mismo plano para poder contarlos.
Luego se procede a ubicar el retículo de glóbulos rojos a 100 aumentos, y una vez
localizado, se pasa a 400 aumentos para realizar el conteo. Se cuentan todos los
espermatozoides que se encuentren en las 4 cuadrículas de las puntas y la central
(5 en total). Se cuentan los retículos de ambos lados de la cámara y se saca el
promedio. Al número de espermatozoides que conté, lo multiplico por 10.000(*) y así
obtengo la cantidad de espermatozoides por milímetro cúbico de semen.

(*) El factor de corrección se obtiene de multiplicar la inversa de la dilución por la

inversa de la profundidad de la cámara por el total de cuadrículas pequeñas que
posee el retículo, dividido el número de cuadrículas pequeñas que cuento en las 5
cuadrículas grandes.
10 x 200 x 400 / 80 = 10.000

Se consideran aceptables los siguientes valores:

Para congelación >o= 750.000spz/mm3
Para rodeo general 500.000spz/mm3 (fresco) (Tribulo et al. 2002).

Método de análisis de semen asistido con computadora (CASA):

En un intento de reducir esta incertidumbre, un gran variedad de biotécnicas han
sido desarrollado para crítica seminal, de los cuales uno de ellos es el sistemas
evaluación informatizada de las características seminales (CASA) (Arruda et al.,
2007). Desde hace varias décadas numerosos investigadores (Amann y
Hammerstedt, 1980; O´Connor et al., 1981; Arruda et. al. 2007) han dedicado mucho
trabajo y recursos para intentar eliminar la subjetividad inherente a la evaluación
microscópica de la calidad del semen. Fruto de estas investigaciones fue el
desarrollo de los sistemas computarizados para el análisis de la motilidad
espermática. Desde que se introdujeron en el mercado a principios de los años 80,
originalmente para la evaluación de semen humano, los sistemas CASA (Computer
Assisted Sperm Analysis) se han ido perfeccionando y modernizando, a la vez que
su precio se fue haciendo más asequible. En consecuencia, comenzaron a utilizarse
cada vez con más frecuencia en veterinaria, especialmente en la especie bovina,
tanto en el ámbito de la investigación como en el de la industria, en los centros de
IA.
Un sistema CASA consta de varias unidades interdependientes: un microscopio de
contraste de fases conectado a una cámara de vídeo, que envía la imagen desde el
microscopio a un monitor de TV. Posteriormente, la imagen es enviada desde el
monitor a un ordenador, donde un analizador digital de imagen captura varias
fotografías seriadas de cada campo microscópico seleccionado, normalmente en
menos de 1 segundo. El software discrimina a los espermatozoides de otras
partículas que puedan aparecer en la imagen por su tamaño, y analiza la trayectoria
recorrida por cada espermatozoide individual durante esa fracción de segundo.
Aunque los principios básicos utilizados para el análisis de las imágenes
digitalizadas son similares en los diferentes sistemas CASA que existen en el
mercado, hay diferencias apreciables en sus sistemas ópticos, técnicas de captura
de imagen y reconocimiento espermático, algoritmos utilizados para la
reconstrucción de trayectorias y determinación de las medidas cinéticas, y también
en el manejo y análisis de los datos, y consecuentemente, en los resultados finales
(Irving, 1995; Krause, 1995; Mortimer, 2000; Verstegen et al., 2002).
32
 Figura 9: Arriba sistema CASA, abajo vista de un analisis de motilidad
mediante sistema CASA. Disponible en: www.ivis.org

Coloración post vital:

Se ha reconocido durante las últimas décadas que una de las principales
características que discriminan células muertas de las vivas es la pérdida de la
función de transporte y la integridad física de la membrana plasmática. Sobre la
base de este fenómeno, un conjunto de ensayos de viabilidad celular han sido
desarrollados. Por ejemplo, la membrana de células vivas intactas excluye una
variedad de colorantes, tales como azul de tripano o yoduro de propidio.
La incubación con estos colorantes resulta en la tinción de las células
muertas, mientras que en las células vivas muestran una captación mínima del
colorante.
La combinación de colorantes para la tinción vital tales como azul de tripano-giemsa,
eosina-nigrosina o eosina-azul de anilina (el más clásico) y algunos otros son
ampliamente utilizados para diferenciar vivos de muertos (Januskauskas y Zilinskas,
2002).
Usando eosina y azul de anilina provee un fondo oscuro (azul de anilina) tiñéndose
las células de eosina. Esta ultima penetra la membrana de las células dañadas
tiñendo las lesiones y los espermatozoides no viables de rosa (células muertas), en
cambio las células viables repelen la eosina y aparecen blancas (células vivas).
Simplemente se aplica 10ul de semen en el portaobjetos y se mezcla por 20
segundos con 30ul de eosina, posteriormente se realiza el frotis y se lo observa a
400X. Se cuentan por lo menos 100 espermatozoides tomando la precaución de
observar varios campos diferentes. Un valor mínimo aceptable es de 70% de
espermatozoides vivos.

Las tinciones eosina-azul de anilina o de eosina-nigrosina poseen una osmolaridad

de 90-100 mosm/l. No se puede agregar un sistema buffer a estas porque sino las
sales precipitarían y oscurecerían los espermatozoides. Un shock hipotónico sobre
los espermatozoides vivos es fácilmente inducido con esta técnica y esto puede ser
minimizado secando los extendidos tan pronto como sea posible. El efecto producido
por el shock hipotónico es fácilmente reconocido por la apariencia de látigo de la

33
porción terminal de la parte principal de la cola del espermatozoide. Es menos
común que se curve la porción intermedia distal (Barth y Oko, 1989).

Morfología y acrosomía:
El estudio de la morfología espermática es muy importante a los fines de establecer
porcentajes de espermatozoides normales y poder clasificar las anormalidades.
Nuestro interés sobre la morfología espermática radica en que ésta tiene gran
impacto sobre la fertilidad del ganado. Lagerlof, en 1934, fue uno de los primeros en
mostrar que el incremento de la prevalencia de anormalidades espermáticas está
asociado con un decrecimiento en la fertilidad. El estrés por calor daña grandes
cantidades de espermatozoides, y los periodos de temperatura ambiental elevada,
combinados con índices altos de humedad, pueden hacer al macho estéril hasta por
seis semanas. Es posible que aparezcan cantidades grandes de espermatozoides
anormales en los eyaculados recolectados en el periodo de recuperación. Debe
proporcionarse sombra adecuada y agua fría limpia para ayudar a minimizar los
efectos del estrés por calor (Morrow, 1986; Ax et al., 2000a).

El acrosoma es un lisosoma esencial para la función de la célula espermática, que

cubre las dos terceras partes de la porción anterior de la cabeza espermática. La
reacción acrosómica tiene lugar en el sitio de la fertilización y es activada por
condiciones locales o por unión especifica de enzimas contenidas en el lisosoma. O
sea que las enzimas contenidas en el acrosoma permiten que el espermatozoide
capacitado penetre el óvulo. Por lo tanto un alto porcentaje de células que tienen
acrosoma intacto y por ende ser capaces de realizar la reacción acrosómica, es
considerado como una característica seminal importante (Sullivan, 1978; Den Daas,
1992; Ax et al., 2000a).

Metodología:
Se pueden usar técnicas de frotis secos o húmedos de un solo paso como la tinción
con Rosa Bengala donde todos los espermatozoides se ven rosas sobre un fondo
limpio, mientras que con Tinta China el fondo es oscuro y los espermatozoides
permanecen sin teñirse y aparecen blancos.

Otra técnica, recomendada por Saacke (1970) donde también podemos observar los
acrosomas, consiste en colocar una gota de aproximadamente 30 microlitros de
semen diluido sobre un portaobjetos limpio y desengrasado y se realiza el frotis en
forma firme y pareja. Se deja secar el frotis y se lo tiñe con una solución de Giemsa.
Se dejan incubar con el colorante por 4 horas, se lo retira y se enjuaga y se lo deja
secar. La evaluación de la morfología y la acrosomía se realiza bajo aceite de
inmersión a 1000 aumentos. Los espermatozoides se visualizan de color violáceo y
en el caso de tener presente su acrosoma se puede apreciar de un violáceo más
intenso, si éste se encuentra ausente, la cabeza del espermatozoide se observa de
un color homogéneo o con el tercio superior más claro.

Actualmente es generalizado el uso de la microscopia de contraste de fase con

formol salino bufferado o glutaraldehído al 0,2% que fija las membranas y evita su
posterior deterioro (Dpto. de Teriogenología, 1998).
Para morfología un conteo de 100 células es satisfactorio cuando no existen
problemas mayores. Cuando un gran número de defectos espermáticos está

34
presente, hasta 500 células deben ser contadas para obtener un espermiograma
preciso.

El “Análisis de asistencia de la morfología espermática” (ASMA), es otro método que

puede ser utilizado para determinar los efectos de la criopreservación en el esperma
de toros. Con el ASMA, es posible subdividir las muestras en tres sub muestras en
cuanto al tamaño de la cabeza espermática con una diferencia significativa de 0,001
entre cada categoría, clasificándolas en pequeñas, medianas y grandes.
Rubio-Guillén et al. (2009) concluyeron que existen diferencias entre tamaños
importantes en las muestras de semen, que a su vez varían con el tipo de proceso
de enfriado y/o congelado.
En la actualidad se utilizan las normas ISO 9002 de calidad para centros de
inseminación artificial a nivel mundial establecida por el Departamento de Medicina
del Rodeo y la Teriogenología de la Universidad de Saskatchewan, Canadá, creadas
por Barth (2000), las que establecen identificar la ubicación de la malformación y
tener en cuenta los siguientes parámetros:

Se estima como valor mínimo aceptable 75% de acrosomas normales y también

75% de espermatozoides normales (sin malformaciones). Pero este máximo de 25%
de malformaciones espermáticas permitido, debe contemplar un límite máximo de
defectos del núcleo (cabeza) del espermatozoide que se encuentre en el rango de
15-20%, mientras que defectos del acrosoma y la cola se pueden tolerar hasta 25%
(Saacke, 1970; Catena y Cabodevila, 1999; Tribulo et al., 2002).

Malformaciones espermáticas:
Primarias y secundarias:
Por definición se consideran anormalidades “primarias”, aquellas que ocurren y/o
tienen su origen durante la espermiogénesis dentro del testículo, mientras que las
anormalidades “secundarias”, se originan dentro del epidídimo o en el laboratorio.
Sin embargo los defectos tanto primarios o secundarios son igualmente importantes
como indicadores de un mal funcionamiento testicular. Por ende, esta clasificación
evalúa origen, no severidad.
Elhordoy y Haedo en 1983 consideran que la clasificación de las anormalidades en
primarias y secundarias además de obsoleta presenta algunas dificultades, tales
como la gota proximal que se clasifica como secundario porque se creía originada
en un disturbio de la función del epidídimo, aunque Rao en 1971 reporto que es
originado por defectos en la espermatogénesis en los testículos, por lo cual debería
ser primario. Lo mismo pasa con el defecto de cabezas sueltas, las que pueden
darse por una alteración de la base que conecta la cabeza del espermatozoide con
la porción media del capitullum (siendo por lo tanto un defecto primario), o se puede
dar por una función anormal del epidídimo (siendo un defecto secundario) (Elhordoy,
D. comunicación personal).

Blom en 1977 desarrolló un método nuevo de clasificación que consistía en separar

los defectos en “mayores” a aquellos que se encuentran directamente asociados a
infertilidad o malformaciones, y en “menores” a aquellos que no lo están (Salisbury,
1978).

35
En 1994 Saacke ideó un sistema de clasificación más complejo, llamándole
“defectos compensables” a aquellos espermatozoides anormales que no son
transportados al oviducto, y a aquellos que son transportados pero no son capaces
de penetrar la zona pelúcida, no evitando que otro fertilice, y entonces que pueden
ser compensados por un incremento de la dosis espermática. Un ejemplo de ello son
los espermatozoides con problemas de locomoción. Mientras que a aquellos otros
espermatozoides perfectamente capacitados para llegar al ovocito y realizar el
bloqueo de la polispermia, pero que no pueden continuar el proceso de fertilización
se los llamo “defecto no compensable”, ya que por más que aumente la
concentración, el % de espermatozoides con defecto es el mismo, no pudiendo
compensar. Ejemplo de esto son los espermatozoides con vacuolas nucleares
(defecto de diadema). La presencia de este tipo de defectos suele ser la causa de
baja fertilidad dado que, luego de la fertilización, se desarrollan embriones de mala
calidad que mueren durante los primeros días de gestación.

A continuación se destacan algunas características de los principales defectos

encontrados:
Cabezas piriformes y angostas:
Zona posacrosomal más angosta. Los espermatozoides con formas piriformes
obvias (de pera) son anormales. En la mayoría de los casos se encuentran estas
anomalías junto con otras e indican un defecto de espermatogénesis.

Microcefalia y macrocefalia:
Existe una gran variación de formas y tamaños. Aunque ésta es bastante común,
generalmente se encuentran en proporción muy pequeña. La mayoría de estas
células mueren o son fagocitadas por las células de Sertoli antes del llegar al estadío
de espermátide. Esta es la razón por la cual no se encuentran en altos porcentajes
en el extendido de semen.

Vacuolas nucleares:
Las vacuolas nucleares se encuentran primariamente como una línea en la región
ecuatorial de la cabeza del espermatozoide (defecto “diadema”).
Aparentemente los espermatozoides con este defecto pueden ser transportados
normalmente hacia el oviducto y pueden ser capaces de penetrar la zona pelúcida y
la membrana vitelina, y producir el bloqueo de la polidesmina. Sin embargo este
defecto es incompatible con el desarrollo embrionario.

Formas teratoides:
Variaciones de las formas teratoides que aparecen cuando existe una
espermatogénesis anormal. Estas formas anormales producidas por disturbios en la
espermatogénesis pueden ser confundidas con células inflamatorias. Estos
espermatozoides defectuosos tienen generalmente una condensación de ADN
anormal, un núcleo pequeño y deforme, y en la mayoría de los casos la pieza
principal enrollada alrededor del núcleo. Las formas teratoides son generalmente
encontradas con una incidencia de hasta 2% en semen normal. En muestras de
toros con disturbios en la espermatogénesis su incidencia está entre el 5 y 10%.

36
Defectos de acrosoma:
En este defecto nos encontramos con un acrosoma aumentado de tamaño
(generalmente conteniendo un quiste y un cuerpo de inclusión) que se pliega en la
región apical de la cabeza del espermatozoide. Con la tinción de eosina-nigrosina se
ve que la mayoría de los espermatozoides tienen la región apical chata o una
pequeña invaginación. Este defecto ha sido observado en animales Holando y fue
relacionado con un gen recesivo, por lo tanto es aparentemente heredable en esta
raza y tal vez en otras. Los espermatozoides con este defecto no pueden penetrar la
zona pelúcida.

Cabezas sueltas:
Se pueden encontrar espermatozoides decapitados en pequeño número en semen
normal. Este defecto puede ser producido por envejecimiento o por un defecto de
implantación de la cola en la placa basal. Cuando se encuentra en mayor cantidad,
están asociados con defectos en la termorregulación del testículo y en estos casos
es producido, aparentemente, por un defecto en la espermiogénesis. En los casos
de toros muy gordos el defecto se encuentra asociado con otros defectos
espermáticos.
Las cabezas sueltas y muchos espermatozoides muertos se encuentran en toros
con una acumulación del semen en la cola del epidídimo. Normalmente los
espermatozoides envejecidos son eliminados de la cola del epidídimo a través de un
movimiento peristáltico hacia la uretra. Toros con defecto en el mecanismo de
transporte tienen una gran acumulación de espermatozoides muertos y viejos en la
cola del epidídimo.

Aplasia segmentaria de la pieza intermedia y defectos de la vaina mitocondrial:

Estos pequeños defectos en las mitocondrias no afectan notablemente la motilidad
espermática pero representan un lugar frágil que pueden terminar en fracturas de la
pieza media. Raramente se encuentran en alta incidencia.

Colas abaxiales, accesorias y múltiples:

Algunas anormalidades de cola pueden tener su origen en los testículos de los toros
con o sin fertilidad disminuida, pero una mayor prevalencia de anormalidades de
cola, es generalmente el resultado de disfunción epididimal (Morrow, 1986).
Estas anormalidades están usualmente asociadas entre sí, sin embargo las colas
abaxiales son las más comunes, no produciendo reducción de la fertilidad.
El defecto de cola accesoria es poco común y aparentemente hereditaria. Las colas
accesorias están generalmente presentes junto con colas abaxiales y colas dobles.
No se sabe si espermatozoides con colas accesorias tienen reducida su capacidad
de fertilizar el óvulo.
La cola es un cilio especializado que se desarrolla del centriolo proximal y distal. El
caso de colas múltiples se produce cuando se forman más de un cilio a partir de una
replicación de los centriolos.

Defecto “Dag”:
Es la separación de la cubierta y de las fibras del axonema en la región de la pieza
media. La perdida de la cubierta que recubre estas fibras resulta en la fractura,
explosión, corte y torsión de la pieza media, típicas del defecto Dag. Éste puede ser

37
debido a disturbios de la espermatogénesis. No obstante, es un defecto hereditario
por un gen recesivo de la raza Jersey y posiblemente de la Hereford.

Espermatozoides de cola corta:

Este defecto no es común, es aparentemente heredable y asociado con un gen
recesivo.

Pieza principal doblada:

Se ve normalmente que la pieza doblada hace un rulo inmediatamente distal al
ángulo. En la mayoría de los casos se ve una gota citoplasmática distal en el centro
del rulo. Este defecto aparentemente se origina en el epidídimo y no hay que
confundirlo con el defecto producido por el shock hipotónico o por estrés por frío de
los espermatozoides (no del toro).

Piezas intermedias arqueadas:

Tienen forma de arcoíris o de U. Es producido por la tinción pero puede haber
algunos casos raros de toros. Cuando evaluamos la motilidad individual vemos una
gran cantidad de espermatozoides con movimientos en círculo.

Gota citoplasmática proximal:

Casi todos los espermatozoides que se encuentran en la cabeza del epidídimo
tienen una gota citoplasmática proximal. Luego, a medida que van descendiendo
hacia la cola del epidídimo vemos que el 90% de los espermatozoides tienen esta
gota citoplasmática en la parte distal. Este defecto se puede ver en animales jóvenes
que no han completado la pubertad. En toros adultos es causa de disturbio
epididimal o testicular. Se puede observar un aumento 7 a 10 días después del
estrés en toros adultos afectándose los espermatozoides que se encontraban
transitando el epidídimo. Algunas anomalías primarias como cabezas piriformes
están aparentemente predispuestas a retener la gota citoplasmática proximal. Se
considera un defecto mayor, por afectar directamente la fertilidad.

Gota citoplasmática distal:

Entre el 65 y 95% de los espermatozoides almacenados en la cola del epidídimo
tienen la gota citoplasmática en esta posición. Esta gota es liberada cuando los
espermatozoides se mezclan con los fluidos seminales en la eyaculación, a causa
de un factor hemolítico en las vesículas seminales. Aparentemente este defecto no
afecta la fertilidad.

Células medusa:
Éstas son células epiteliales ciliadas provenientes del conducto eferente y se pueden
encontrar en bajas cantidades en muestras de semen de toros con defectos graves
de la función testicular. Generalmente la muestra de semen es muy diluida y puede
ser necesario centrifugarla para concentrar los espermatozoides y poder verlos.
Denotan daño testicular grave.

Glóbulos blancos:
Su presencia está asociada con procesos inflamatorios en la ámpula, glándulas
accesorias o epidídimo. También puede deberse a infecciones de pene y de
prepucio. Generalmente los casos que aparecen son en toros jóvenes. También se
los puede identificar con contraste diferencial pero es preferible utilizar tinciones

38
como Hematoxilina y eosina, Wright-Giemsa u otras específicas para estas células
(Rao, 1971).

Barth en 2005 propone quitar importancia a los sistemas de clasificación, el aconseja

enumerar los defectos e interpretar las anormalidades a la luz del conocimiento
actual y como afecta la fertilidad (Elhordoy, D. comunicación personal)

Test de fertilización in vitro (FIV)

La fertilización in vitro de ovocitos homólogos es sin lugar a dudas el test más
completo para evaluar la funcionalidad espermática, ya que permite valorar todas las
fases del proceso de fecundación, desde el estado de capacitación espermática
hasta la fusión con la membrana vitelina del ovocito o el inicio del desarrollo
embrionario (Shamsuddin y Larsson; 1993; Ward et al., 2002).
Aunque en algunos estudios se ha encontrado una elevada correlación con la
fertilidad in vivo de los toros (Zhang et al., 1995), todavía se necesita una mayor
estandarización de los métodos a la hora de aplicar dicha técnica, puesto que existe
considerable variabilidad entre los resultados de FIV obtenidos para un mismo toro,
debido a factores de variación como por ejemplo el método de selección de los
espermatozoides (percoll o swim –up) (Parrish et al., 1995), de capacitación
espermática in vitro (Saeki et al., 1995) o el número de espermatozoides utilizados
para la inseminación de los ovocitos (Kroetsch y Stubbings, 1992).
Citometría de Flujo:
La citometría de flujo es una técnica que permite identificar, cuantificar y separar las
distintas subpoblaciones celulares presentes en una muestra de células en
suspensión, en función de los distintos patrones de tinción adquiridos tras el marcaje
con diferentes colorantes fluorescentes, que se unen a estructuras celulares
específicas o se acumulan selectivamente en compartimentos intracelulares.
A lo largo de las dos últimas décadas, la citometría de flujo se ha convertido en una
herramienta de gran utilidad para la investigación de poblaciones espermáticas. Se
han desarrollado muchos métodos de tinción y combinaciones de fluorocromos, se
han comercializado muchos fluorógenos nuevos, que permiten analizar una gran
variedad de funciones espermáticas, y como resultado, hoy en día, el uso de esta
técnica ofrece la posibilidad de analizar múltiples características espermáticas,
simultáneamente en la misma muestra de semen, de una forma rápida, precisa y
objetiva.
Debido al creciente número de parámetros analizables y al desarrollo de citómetros
a un coste accesible, se ha extendido su uso tanto en laboratorios de investigación
como en centros de IA. Entre las características espermáticas más frecuentemente
analizadas para el control de calidad del semen bovino se incluyen el estudio de la
viabilidad espermática, de la integridad acrosomal y de la funcionalidad mitocondrial,
así como la investigación del estado de capacitación de los espermatozoides.
Además, la citometría de flujo también permite obtener muestras de
espermatozoides sexados, bien para su uso en IA o en fecundación in vitro (Garner
et al., 1983; Pinkel et al., 1985; Johnson et al., 1989).

39
Valores aceptables:

Para que un eyaculado pueda ser considerado como de “Calidad Aceptable” y poder
ser congelado, debería cumplir con los siguientes requisitos especificados en la
siguiente tabla:
Tabla 7: Parámetros de aceptabilidad para congelación seminal (Derivaux, 1976; Bonadonna, 1989;
Barth y Oko, 1989; Ax et al., 2000; Dpto. Teriogenología; Elhordoy y Farías, 2003).

Pruebas macroscópicas Valores de referencia

Volumen >2 ml
Aspecto Lechoso a cremoso
Color Blanco cremoso
Motilidad en masa > o = 3 (0-5)
Ph 6,5 – 6,9
Cuerpos extraños Ausentes
Pruebas microscópicas
Motilidad en masa > o = 3 (0-5)
Motilidad individual > 70%
Vigor > o = 3 (0-5)
Concentración >o= 750.000.000spz/cm3
Coloración vital > 70%
Morfología y acrosomía:
Defectos cabeza < 15-20%
Defectos acrosoma y cola < 25%
Anormalidades totales < 25%

Sanidad del toro donante:

La IA además de mejorar la calidad genética, también busca prevenir o eliminar

enfermedades. Existe potencial riesgo de que la IA sea una vía de diseminación de
enfermedades infecciosas. Por esto se debe realizar controles por parte de los
centros de IA a los toros de forma periódica para tenerlos libres de enfermedades
infecciosas. De cualquier manera debería ser de rutina el control de la presencia de
patógenos de la reproducción en las muestras de semen mandando muestras al
laboratorio. A continuación se presenta una tabla con las enfermedades más
comunes y el riesgo de transmisión de éstas a través del semen.

40
Tabla 8: Nivel de riesgo de transmisión de enfermedades del bovino en IA (Catena y Cabodevila,
1999).
Lista de enfermedades
Categoría Enfermedad Presencia del agente de la OIE
1 Enfermedades con evidencia de riesgo alta o moderada
Brucelosis bovina + B
Campilobacteriosis genital + B
bovina
Diarrea vírica bovina + -
Estomatitis vesicular + A
Fiebre aftosa + A
Haemophilus somnus + -
Mycoplasmosis + -
Rinderpest + A
Rinotraqueítis infecciosa bovina + B
Trichomoniasis + B
Tuberculosis bovina + B
Ubicuitarios (ej. Pseudomona + -
aeruginosa, Escherichia coli)

Enfermedades de bajo riesgo de transmisión

Lengua azul + A
Leucemia bovina + B
Fiebre efímera bovina NR -
Virus Akabane + -
Leptospirosis + B

Enfermedades con pequeña o ninguna información de riesgo de transmisión

2
a) Transmisión probable a través de inseminación artificial
Inmunodeficiencia bovina + B
Pleuroneumonía contagiosa + A
bovina

b)Transmisión improbable a través de inseminación artificial

Lumpy skin disease + -
Fiebre del Valle del Rift NR A
Fiebre Q + B
Rabia NR -
Septicemia hemorrágica NR B
Fiebre catarral maligna NR B
Encefalopatía espongiforme NR B
bovina
Listeriosis + -
Anaplasmosis NR B
Babesiosis NR B
Chlamydia + -
Hongos, levadura + -

+: Presencia del agente infeccioso en semen; NR: No reportado

41
Dentro de los requisitos zoosanitarios impuestos por el reglamento del Mercosur
para los animales residentes dadores de semen bovino y bubalino, se establece el
control, mediante determinadas pruebas estipuladas, de la ausencia de las
siguientes enfermedades:
Brucelosis
Tuberculosis
Campilobacteriosis genital bovina
Trichomoniasis
Estas deben presentar resultado negativo cada 180 días.

Los animales residentes cuyo semen será destinado a exportación, serán sometidos
a demás a pruebas de diagnostico que deberán presentar resultado negativo a las
siguientes enfermedades:
Rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR)
Lengua azul
Leucosis bovina enzoótica (Para ampliar información véase Anexo I).

42
CRIOPRESERVACIÓN
La criopreservación de semen ha sido siempre vista como una forma de beneficiar a
la cría de animales de importancia agrícola, y ha sido reconocida como una
contribución a la conservación de especies en peligro de extinción y a la superación
de los aspectos de la infertilidad masculina en los seres humanos. Sin embargo es
generalmente aceptado que hay reducción de la fertilidad como una consecuencia
de la crioconservación.
El semen de toro criopreservado se ha utilizado comercialmente en el ganado
lechero durante décadas y los resultados de concepción son comparables o mejores
que con la monta natural. Sin embargo, este no es así para la mayoría de las
especies de mamíferos donde la fecundidad se ve mayormente afectada por la
crioconservación. De hecho, las pérdidas por la criopreservación son compensadas
por inseminación de un número más grandes de los espermatozoides; esto se da
para el semen de ganado así como de otras especies. La diferencia entre las
especies se explica por la mayor compensación que se puede lograr en el ganado,
en donde son necesarios relativamente pocos espermatozoides para obtener una
buena fertilidad. Una completa compensación se puede lograr mediante la
inseminación del orden de 20 millones de espermatozoides con capacidad
fecundante, y sigue permitiendo la dilución suficiente de semen para hacer el
proceso comercialmente viable.
Mientras que otras especies además de necesitar más espermatozoides para lograr
la fertilidad, tienen perdidas asociadas a la criopreservación tales que impiden que el
proceso sea comercialmente viable. Como generalización, 40-50% de la población
no sobreviven, incluso con protocolos optimizados de crioconservación. Cuando se
realizan comparaciones sobre el parámetro de motilidad individual progresiva, los
resultados siguen siendo generalmente más pobres que con semen fresco, lo que
indica que incluso la subpoblación viable después de la criopreservación se ve
comprometida. Para superar el problema en algunas especies han sido utilizadas
técnicas quirúrgicas que permiten la inseminación de un alto número de
espermatozoides en el tracto reproductivo, logrando una fertilidad más satisfactoria,
pero a un coste elevado debido a la cirugía (Watson, 2000).

Crioprotectores

Mecanismo de acción

El crioprotector se añade al medio para proteger a los espermatozoides durante la

congelación y descongelación (Squires et al., 1999). Estas sustancias son
importantes para evitar la formación de hielo intracelular, reducir el estrés osmótico
mediante la sustitución de agua necesaria para mantener el volumen celular,
interactuar con iones y macromoléculas, reducir punto congelación del agua, y servir
de tampón para ajustar los cambios de pH (Medeiros et al., 2002). Los sistemas
tampones deben ser uno de los constituyentes de los diluyentes, por el metabolismo
del esperma que resulta en la producción de catabolitos tóxicos que provocan el
aumento de ácido láctico en el medio extracelular, haciendo que el medio se torne
ácido y reduzca la longevidad y la fertilidad de los espermatozoides. El pH óptimo
para el esperma está cerca de la neutralidad, por lo tanto la mayoría de los
diluyentes está tamponada a pH entre 6,9 y 7,1 (Oliveira, 2003).

43
El mecanismo de acción de los crioprotectores no está completamente aclarado. Se
cree que estos reducen el punto de congelación de la solución, que se determina
como temperatura donde se produce la formación de los primeros cristales de hielo.
La estructura molecular es un parámetro importante para determinar la eficiencia de
los crioprotectores, ya que tienen afinidad por el agua lo que favorece la formación
de enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua (Baudot et al., 2002). Estas
conexiones alteran la orientación de las moléculas de agua de los cristales de hielo,
creando un ambiente menos dañino para las células (Dalimata y Graham, 1997).
Su acción interfiere con los cambios fisicoquímicos que sufren las células durante el
proceso de crioconservación. Aunque la concentración de crioprotector es alta en el
medio, su difusión es de 30 a 60 veces más baja que el agua (Graham, 1996). Por lo
tanto, estas moléculas atraviesan la membrana, para alcanzar el equilibrio, a tasa
más lenta que el agua, lo que provoca la crenación de la célula debido a la rápida
salida de agua para diluir la alta concentración fuera; posteriormente el crioprotector
penetra y equilibra las concentraciones intra y extracelular. En estas condiciones, el
agua vuelve a la célula para alcanzar el equilibrio lo que permite a la célula volver al
tamaño normal (Seidel, 1996). Si bien son esenciales para la supervivencia de los
espermatozoides en el proceso de congelación, los crioprotectores tienen efectos
tóxicos sobre el esperma (Watson, 2000). En alta concentración, los crioprotectores
pueden reducir la capacidad fertilizante del gameto, debido a daños por la presión
osmótica (Graham, 1996).

Crioprotectores intracelulares

Los crioprotectores intracelulares o permeables a través de sus propiedades

coligativas, reducen el grado crioscópico intracelular. Por lo tanto, la mayor cantidad
de agua permanecerá en el estado líquido cuando se somete a baja temperatura,
disminuyendo la concentración intracelular de solutos y proporcionando así un
menor perjuicio para las células espermáticas durante la congelación (Watson,
1995).
Se han usado varios crioprotectores tales como glicerol, sulfóxido de dimetilo,
etilenglicol y propilenglicol, y sus combinaciones. Sin embargo, el glicerol se usa con
mayor frecuencia, adicionándose a 37 °C o 5 ºC, fra ccionada o no (Leboeuf et al.,
2000). El glicerol se une a la molécula de agua y baja el punto de congelación de las
soluciones, por lo que en su presencia se forman menos hielo a cualquier
temperatura. De esta manera, se reduce la concentración de solutos en el líquido
residual. La influencia dañina de la concentración de solutos depende,
aparentemente, de la temperatura. Por lo tanto el glicerol, al reducir la temperatura a
la cual se llega a una determinada concentración de solutos, reduce estos efectos
dañinos. En soporte de este concepto, el nivel óptimo de glicerol de un diluyente
aumenta a medida que la tonicidad del diluyente aumenta. El glicerol probablemente
deshidrata las células y forma complejos con los iones metálicos.
El glicerol penetra rápidamente el espermatozoide vivo en suspensión, siendo
oxidado por éste, y se concentra en la parte posterior de la cabeza (Cavestany,
1994).
A demás de su efecto osmótico el glicerol parece actuar directamente sobre la
membrana plasmática, hay evidencia de que se une a la cabeza de los fosfolípidos,
reduce la fluidez de la membrana, y la interacción con las proteínas y enlaces de
glicoproteína de membrana (Parks y Graham, 1992).

44
Para ser más efectivo, el glicerol requiere una tasa de congelación relativamente
baja. Aunque el glicerol es esencial para el congelado del semen, también puede
afectar adversamente la membrana celular y volver al espermatozoide infértil,
aunque la motilidad al descongelado se mantenga (Cavestany, 1994). El efecto
tóxico del glicerol ha sido reportado por muchos autores, tales como la
desnaturalización de proteínas, alteración en interacciones con la actina en eventos
citoplasmáticos debido al aumento de la viscosidad del glicerol intracelular en
polimerización de la tubulina en los microtúbulos asociados, actuando directamente
sobre la membrana plasmática, y el glicocalix produciendo cambios en las proteínas
de superficie celular (Alvarenga et al., 2000b).
Al estudiar el efecto de diferentes crioprotectores (glicerol, etilenglicol,
dimetilformamida y sulfóxido de dimetilo) en eyaculados de sementales, Alvarenga et
al. (2000b) demostró similar efecto en la adición del etilenglicol y de glicerol, sin
embargo informó que cuando se utilizan juntos, permiten la reducción de la
concentración de glicerol y por lo tanto se disminuyen los daños causados por su
efecto tóxico. Del mismo modo, Alvarenga et al. (2000a) encontraron equivalencia en
los resultados del uso de crioprotectores (glicerol, etilenglicol glicol, dimetilformamida
y sulfóxido de dimetilo).

El sulfóxido de dimetilo es también ampliamente utilizado como crioprotector. Tanto

individualmente como en asociación con glicerol, el dimetilsulfoxido
aumenta la motilidad después de la descongelación de las muestras de semen
bovino. El dimetil sulfóxido es un solvente bipolar aprótico, hidrosoluble, de bajo
peso molecular; desde el descubrimiento de sus propiedades crioprotectoras por
Lovelock en 1959, el DMSO se ha usado como un crioprotector. Su acción
crioprotectora se atribuye principalmente a su habilidad de prevenir acumulación
excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelamiento, y la
formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo
peso molecular permite la entrada rápida través de la membrana celular, modula la
estabilidad y fases de la bicapa de los fosfolípidos, así como también afecta los
procesos de solvatación de agua. Se han sugerido las interacciones electrostáticas
de DMSO con fosfolípidos lo cual parece ser crítico para la crioprotección de la
membrana (Ávila-Portillo et al., 2006).

Crioprotectores extracelulares
Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas de congelación,
son importantes por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida
deshidratación celular y suelen usarse asociados a los agentes penetrantes, y los
más utilizados son: sacarosa, glucosa, dextrosa y dextrano. Estos compuestos
generalmente son polímeros que forman puentes hidrógeno con el agua, reduciendo
la actividad de agua a una magnitud mucho mayor que la que se predeciría por su
concentración molar (ellos no obedecen la ley de Raoult).
Algunas sustancias, tales como lípidos, proteínas y macromoléculas, son eficaces en
la protección de la célula espermática durante el proceso de congelación, sin la
necesidad de que penetren en su interior. Estas sustancias se pueden encontrar en
la yema de huevo, leche, en algunos azúcares y albúmina sérica bovina. Yema
huevo contiene lecitina (fosfatidilcolina), que parece proteger la membrana mediante
la restauración de fosfolípidos celulares perdidos por espermatozoides durante el
45
choque térmico (Watson, 1995). Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se
adhieren a la membrana celular durante el proceso de crioconservación,
preservando la membrana de los espermatozoides (Moussa et al., 2002). Los
fosfolípidos que componen la fracción LDL de la yema de huevo protege a los
espermatozoides durante la refrigeración (5ºC). Por lo tanto, el uso de fosfatidilserina
purificada ha demostrado proteger el esperma de los toros contra el choque térmico
(Wilhelm et al., 1996). Los liposomas que comprenden fosfatidilserina y colesterol
protegen el esperma de toros, y los daños causados por el proceso de congelación,
posiblemente mediante la prevención de los cambios deletéreos durante la
crioconservación. La prevención conferida por daño a los lípidos por choque térmico
parece estar relacionada a la quelación ion de Ca del medio, impidiendo su entrada
en el espermatozoide. (Wilhelm et al. 1996). Los azúcares actúan por la presión
osmótica al deshidratar la célula, reduciendo el agua que puede estar congelada en
la célula a fin de reducir la lesión causada por la cristalización del hielo (Aisen et al.,
2002). Más allá de actuar como crioprotectores, el azúcar actúa como un sustrato
para la energía de los espermatozoides durante la incubación (Yildiz et al., 2000), lo
que confiere protección a la membrana plasmática durante la congelación y
descongelación a través de la interacción directa con la membrana, la cual implican
enlaces de hidrógeno de los grupos hidroxilo de azúcares con grupos fosfato situado
en la cabeza de fosfolípidos.

Por la restauración porcentual de agua en torno al grupo de las cabezas de los

fosfolípidos, los azúcares pueden prevenir el daño causado por la deshidratación
que puede ocurrir en la congelación.
Generalmente disacáridos (sacarosa y trehalosa) son más eficaces en la
estabilización de la bicapa de la membrana que los monosacáridos (De Leeuw et al.,
1993), manteniendo al mismo tiempo su capacidad de transportar calcio, inhibiendo
la fusión de la membrana y manteniendo los lípidos en una fase de fluido ante la
ausencia de agua (Anchordoguy et al., 1987; Crowe et al., 1987).

Principios de Preservación de Semen

El estado de la membrana plasmática de los espermatozoides es de suma
importancia debido a su función, no sólo como límite de la célula, sino también para
las interacciones célula a célula, por ejemplo entre el espermatozoide y el epitelio del
tracto genital femenino y entre el espermatozoide y el ovocito. La relación entre el
grado de daño de los espermatozoides después de la descongelación y la fertilidad
no siempre es clara (Januskauskas et al., 1996; Garner et al., 1997), pero tiende a
aumentar cuando el daño es extenso (Januskauskas et al., 2001).

La reducción de la fertilidad asociada a la inseminación artificial (IA) con semen

criopreservado, ha sido atribuidas a los procesos que se producen durante la
congelación de semen, donde aproximadamente 10 a 50% de los espermatozoides
de un eyaculados no resistir este proceso y mueren (Watson, 2000). Los
procedimientos de congelación y descongelación causan daño celular debido al
cambio de temperatura, la formación de cristales de hielo, las injurias oxidativas en
la membrana del espermatozoide, daños del ADN, estrés osmótico, además de la
toxicidad de los crioprotectores (Ball y Vo, 2001c). El espermatozoide parece

46
sensible al estrés osmótico y a la adición y eliminación de crioprotectores (Watson,
2000; Ball y Vo, 2001c). El enfriamiento, cuando se realiza de manera incorrecta,
provoca un choque térmico que induce la aparición de daños parcialmente
irreversible, lo cual es caracterizado por un patrón anormal de movimiento de
esperma (movimiento circular o retrógrado) con rápida pérdida de la motilidad,
lesiones del acrosoma, daño a la membrana plasmática, disminución de la actividad
metabólica y pérdida de componentes intracelulares. Muchas de estas lesiones son
causadas por cambios de membrana, que se dan mientras que los espermatozoides
avanzan en el cambio de fase y durante el proceso de enfriamiento (Graham, 1996).

Eventos físicos de la criopreservación

Durante el proceso de criopreservación, el semen debe ser refrigerado, sin causar

daño a los espermatozoides. Para esto es necesario diluir el semen en el medio
adecuado.

La tensión inicial se produce cuando el esperma es sometido a la temperatura de

refrigeración a 5 ºC (Squires et al., 1999). El desafío celular durante la congelación y
descongelación esta dado por la capacidad de la célula de soportar temperaturas
mucho más bajas, sobre todo al pasar una fase crítica del proceso (-15 a -60 º C).
Las células normalmente resisten la reducción de la temperatura, sin embargo no
soportan la formación de cristales de hielo que determina deshidratación, dando
lugar a un desequilibrio osmótica con consecuente deshidratación celular (Holt,
2000). La formación de cristales de hielo se forma en el espacio extracelular
generando un gradiente osmótico entre la solución intracelular inicialmente isotónica
y una solución congelada extracelular que se encuentra concentrada. Dependiendo
de la velocidad de refrigeración el agua se mueve a través de la membrana y se une
a la fase congelada del medio extracelular o se congela formando hielo dentro de la
célula. En la mayoría de los casos, las células sometidas a la formación de cristales
de hielo intracelular se tornan osmóticamente inactivas o son lisadas debido a la
pérdida de integridad de la membrana (Denvireddy et al., 2002). La célula
espermática es también sensibles a los efectos tóxicos de los crioprotectores,
porque se tornan inviables por el uso de determinados componentes comúnmente
utilizados para otras células (Watson, 2000).

Durante el proceso de crioconservación la suspensión de espermatozoides llega a

temperaturas por debajo del punto de congelación del medio (súper enfriamiento),
antes de que haya una formación de cristales. Cuando los cristales de hielo
empiezan a formarse, ocurre un incremento de la temperatura necesaria para la
cristalización, lo que puede ser perjudicial para los espermatozoides, siendo
minimizado mediante el uso de curvas apropiadas de congelación (Squires, 1999).
Cuando el proceso de congelación es muy lento ocurre la congelación de agua
extracelular con consecuente concentración del soluto, colocando a la célula
momentáneamente en un medio hipertónico, y determinando la perdida rápida de
agua, lo que conduce a la deshidratación celular y al aumento de la concentración
de soluto extracelular. Por otra parte, cuando la célula es congelada rápidamente, no
hay pérdida de agua, promoviendo por lo tanto, la formación de cristales de hielo
intracelulares (Mazur, 1985).

47
Debajo de la temperatura de 5 º C, el agua intra y extracelular permanecen súper
enfriadas y no cristalizadas. Sin embargo, temperaturas de entre -5 y -10ºC, se
empiezan a formar cristales de hielo en el medio extracelular que permanece súper
enfriado, ocurriendo intercambio de agua para mantener el equilibrio entre el medio
intra y extracelular, dando lugar a deshidratación celular. En este momento, la curva
de congelación debe ser lenta para evitar la congelación del agua intracelular, y lo
suficientemente rápida para evitar el contacto de la célula deshidratada con el medio
hiperosmótico. La deshidratación severa promueve la desnaturalización de las
macromoléculas y un encogimiento excesivo de las células determinando un colapso
de la membrana celular (Medeiros, 2002). La pérdida de agua y la deshidratación
celular son eventos deseables debido a que reducen la posibilidad de formar
grandes cristales de hielo dentro de la célula, lo que podría causar daños a
estructuras interna y/o a la membrana plasmática (Squires, 1999).

El proceso de descongelación depende de cómo el semen se congeló. Los

espermatozoides congelados en curvas moderadas exigen curvas adecuadas para
descongelarse. En este caso, como el hielo extracelular descongela lentamente,
diluye lentamente el soluto de las fracciones de agua sin congelar, lo que permite
que el agua difunda lentamente hacia adentro de la célula, diluyendo el soluto
intracelular hasta llegar a la concentración inicial. Si los espermatozoides se
descongelan rápidamente, el hielo se derrite rápidamente diluyendo el soluto y el
agua se introducirá rápidamente al espermatozoide, con lo cual se encontrara
altamente concentrado y dañado (Graham, 1996).

Es esencial que la muestra de semen sea diluida adecuadamente de forma que

contenga cantidad suficiente del diluyente para acomodar las células espermáticas
en una pajuela de inseminación, de modo que una tasa de fertilidad mayor pueda
ser alcanzada logrando un número menor de espermatozoides por inseminación y
de inseminaciones. Sin embargo, esto debe ser correctamente medido con base en
el conocimiento de la concentración de espermatozoides (Evans y Maxwell, 1987;
Ritar et al., 1990). Según Chemineau et al. (1991), el tamaño de la pajuela debe
determinar la altura sobre el nitrógeno líquido. Fue sugerido que para pajuelas de
0,5ml deben ser refrigeradas a 4 cm del nivel de nitrógeno líquido durante 5 min. y
luego sumergido en nitrógeno líquido, mientras que las pajuelas de 0,25ml debe ser
colocadas a 16 cm por encima del nitrógeno líquido durante 2 min., luego bajarlas a
4 cm por 3 min. Para posteriormente sumergir en nitrógeno líquido y
almacenamiento. Los congeladores programables son convenientes para la
congelación de grandes cantidades de pajuelas de semen, a demás de controlar la
tasa de congelación. El beneficio de muchos congeladores programables es que la
curva de refrigeración puede ser programada, por ejemplo, de 4 a -5°C durante 4
min., de -5 a -110 °C durante 25 min. y -110 a -140 º C durante 35 min. y, sólo
entonces, las pajuelas de semen se sumergen en nitrógeno líquido (Purdy, 2006).

Almacenamiento de Semen

El almacenamiento a largo plazo facilita el transporte del semen a través de grandes

distancias, permite la cuarentena de semen, y permite ampliar el uso de genética
superior, incluso después de muerto. Para los animales de importancia agrícola, la
criopreservación de semen es una industria mundialmente establecida, en particular

48
para el ganado lechero. También es un recurso para preservar la biodiversidad de
especies en peligro de extinción, o líneas transgénicas de valor, también se
benefician de la criopreservación de espermatozoides (Bailey et al., 2000).
El almacenamiento de esperma, en particular en estado congelado, causa daño
ultraestructural, bioquímico y funcional de los espermatozoides, con una reducción
de la motilidad, viabilidad, transporte y problemas de fertilidad. Muchas
investigaciones se han dedicado a estos problemas, pero la fertilidad del semen
almacenado es generalmente menor que la de semen fresco (Leboeuf et al., 2000).
El hecho de que la concentración de oxígeno en fluidos o células del sistema
reproductor femenino se reduzca en el momento de la ovulación, indica la relevancia
fisiológica del oxígeno y sus metabolitos en las funciones espermáticas (De
Lamirande et al., 1997). Así, las bajas concentraciones de sustancias reactivas de
oxígeno (ROS) son necesarias para adquirir capacidad fecundante de
espermatozoides (Baumber et al., 2003). Sin embargo, la generación de altas
concentraciones de ROS en el semen pueden afectar el metabolismo energético, la
motilidad, viabilidad e integridad de ADN de esperma de varias especies (Bilodeau et
al., 2002).

En la actualidad, el conocimiento limitado de la acción de los oxidantes y

antioxidantes que se encuentran en el semen de animales domésticos puede ser
responsable de ineficiencia en los resultados obtenidos siguiendo los procedimientos
de crioconservación en algunas especies y posterior uso en las técnicas de
reproducción asistida como la inseminación artificial o la fecundación in vitro.
Se sabe, sin embargo, que una variedad de mecanismos de defensa llamados
antioxidantes, están involucrados a sistemas biológicos, y en el equilibrio entre los
beneficios y los riesgos de los ROS in vivo e in vitro. Los antioxidantes parecen ser
necesarios para la operación reproductiva normal. Así, estudios que implican
análisis del estrés oxidativo originado durante la ejecución de algunos
procedimientos de laboratorio pueden contribuir a una posible intervención
terapéutica con antioxidantes que ayuden en la optimización de las biotecnologías
reproductivas (Guerra et al., 2004). Por lo tanto, el desarrollo de protocolos para la
congelación deben considerar la cuantificación de ROS generados, y también la
identificación de sustancias que pueden actuar sobre la protección de células
espermáticas de los efectos oxidativos ocurridos en la criopreservación de semen
(Valencia y Guerra, 2007). Además, la generación de ROS por espermatozoides
dañados tienen un importante impacto sobre las células viables restantes, ya que
representan un daño acumulativo para los espermatozoides almacenados (Ball et
al., 2001b). Existe un estrés asociado a la congelación causado por los cambios de
temperatura a que los espermatozoides son sometidos durante el proceso de
enfriamiento, los efectos de los componentes del medio y los mismos crioprotectores
durante el proceso y, finalmente, por los efectos de la descongelación (Vishwanath y
Shannon, 2000). El daño oxidativo a los espermatozoides durante el
almacenamiento es una causa potencial de la disminución de la motilidad y la
fertilidad durante el almacenamiento hipotérmico de semen líquido.
Particularmente el almacenamiento de semen, en estado congelado, causa cambios
bioquímicos y funcionales en los espermatozoides, resultando en una reducción de
la movilidad y la viabilidad, con el obvio perjuicio posterior durante el transporte y la
fertilidad (Leboeuf et al., 2000). La fertilidad se ve reducida debido a que los
espermatozoides dañados o defectuosos generan grandes cantidades de especies

49
reactivas de oxígeno y éstas son responsables del daño oxidativo (Ball et al.,
2001a).

Acción de ROS en células espermáticas

Los ROS actúan directamente sobre la fertilidad del macho, ya que son los
responsables de procesos como la hiperactivación, capacitación y reacción
acrosómica de los espermatozoides, así como la fecundación.
Durante el paso por la cola del epidídimo, los espermatozoides se encuentran en
estado inmóvil, caracterizados por la bajo concentración intracelular de AMPc y
calcio, así como suprimida su capacidad de producir ROS (White y Aitken, 1989).
Esta condición es revertida durante las primeras etapas de capacitación, en donde
se constata un aumento en la concentración de calcio intracelular y AMPc, teniendo
inicio la producción de ROS, en consecuencia, los espermatozoides desarrollan gran
motilidad conocido como hiperexcitación. Por otra parte, el ROS también puede
causar graves daños a espermatozoides cuando sus mecanismos de defensa están
limitados. Las ROS cumplen una importante función en la fisiología espermática
normal, pero el desequilibrio entre su producción y degradación causa efectos
adversos sobre el espermatozoide (Ball et al., 2002).

Como se mencionó, la pobre supervivencia espermática es uno de los principales

problemas, por lo que el conocimiento de las características biofísicas de la
membrana plasmática espermática es fundamental para proponer una solución
(Holt, 2000).

Peroxidación Lipídica
La dinámica de la membrana plasmática del espermatozoide cumple un papel
importante en los procesos de maduración, capacitación y fecundación (Wolfe et al.,
1998; Müller et al., 1999); sin embargo, el aumento de las ROS puede dañarla
(Clarkson y Thompson, 2000) y una de las principales causas del deterioro
espermático es el estrés oxidante que causa peroxidación de los lípidos de la
membrana plasmática, modifica su fluidez y altera la permeabilidad, lo que puede
conducir a la célula a un proceso de muerte celular (Batellier et al., 2001).

La peroxidación lipídica (LPO) parece ser una causa particularmente importante para
la disfunción de esperma. Los lípidos de la membrana espermática son ricos en
ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), que en alta concentración, determina la
fluidez de membrana que permite participar en los eventos de fusión de membrana
espermática durante la fertilización. Así, los espermatozoides con LPO presentan
reducción de la fluidez de membrana y su capacidad de fertilización (Aitken, 1995).
Bajo condiciones oxidativas extremas, todos los componentes celulares (lípidos,
proteínas, ácidos nucleicos y azúcares) son potencialmente afectados por el estrés
oxidativo, cuya extensión de los daños depende no sólo de la naturaleza y cantidad
de ROS, sino también del tiempo y la duración de la exposición, asociados a
factores extracelulares como temperatura y ambiente que pueden resultar en la
muerte celular (Sharma et al., 1999).

50
Durante el proceso de crioconservación, la célula espermática sufre lesiones del
acrosoma que disminuyen su viabilidad debido a la manipulación, exposición al
oxígeno y muchos otros procedimientos que pueden aumentar la producción de
ROS. Los sistemas de defensa antioxidantes de los espermatozoides es el plasma
seminal que juega un role importante para la viabilidad espermática. Sin embargo,
en condiciones naturales de apareamiento, el espermatozoide es expuesto,
principalmente a condiciones anaeróbicas, reduciendo los potenciales daños
causados por ROS. Sin embargo, cuando son manipulados para su uso en IA, el
semen se expone al oxígeno, así como diversos procedimientos de laboratorio.
Durante el procesamiento pueden aumentar la producción de ROS, así como la
reducción de las defensas antioxidantes. El lavado de muestras de semen, por
ejemplo, retira una protección antioxidante proporcionada por el plasma seminal.
Todos estos factores pueden contribuir para aumentar la ocurrencia de daños
oxidativos en los espermatozoides observados en el semen manipulado (Maia,
2003).

Según Aitken (1995), la capacidad de biosíntesis del espermatozoide es limitado, lo

que hace difícil para éste, sustituir cualquier molécula que haya sido dañada.
Además, las enzimas antioxidantes pueden estar concentradas en la pieza
intermedia, dejando menos protegida gran parte de la membrana que cubre la
cabeza y cola espermática. Por lo tanto, el plasma seminal es particularmente
importante en la protección de los espermatozoides contra el daño causado por ROS
generados por los fagocitos y por los espermatozoides presentes en el eyaculado.

Adición de antioxidantes a diluyentes

Las propiedades antioxidantes de los diluyentes utilizados rutinariamente para la

criopreservación de semen son pocos conocidos, y los efectos del exceso de
producción de ROS en esos diluyentes tampoco están bien caracterizados. Sin
embargo ese conocimiento es fundamental para que se pueda entender como la
motilidad espermática es afectada cuando se utiliza determinado diluyente después
de la aparición de estrés oxidativo resultante de la crioconservación, ayudando en la
formulación de diluyentes de acuerdo con sus propiedades antioxidantes. Con el
objetivo de reducir el daño oxidativo causado por la alta concentración de ROS,
están siendo realizados algunos estudios como la utilización de sustancias
antioxidantes en muestras de semen de pequeños rumiantes (Maxwell y Stojanov,
1996; Sinha et al., 1996).
Para combatir el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica, los espermatozoides
constan de un sistema antioxidante que consiste en glutatión reductasa (GSH)
glutatión peroxidasa (GSH-Px), catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), ácido
ascórbico y tocoferol (Aitken, 1995). Extracelularmente los espermatozoides son
protegidos por plasma seminal, que contienen diversos reductores de ROS
(enzimática y no enzimática), tales como ácido ascórbico, ácido úrico, albúmina y
otras proteínas, catalasa, SOD, glutatión y otros tioles, taurina, hipotaurina y
vitamina E (Zini et al., 2000).
La elaboración de protocolos de congelación debe considerar la cuantificación de
ROS generado y la identificación de sustancias que pueden actuar sobre la
protección de las células de esperma de los efectos oxidativos ocurridos en el
semen criopreservado (Valencia y Guerra 2007).

51
La vitamina E (tocoferol y sus derivados), predominante antioxidante soluble en
grasa, protege a las células de radicales de oxígeno in vivo e in vitro, y se cree que
es el inhibidor principal de ROS, que se encuentran en pequeñas cantidades en las
membranas celulares de mamíferos y en el plasma seminal (Sikka, 2004),
protegiendo las células del estrés oxidativo (Kagan et al., 1992).
La vitamina C también actúa sinérgicamente con la vitamina E, a través de la
generación de tocoferol a partir de radicales de tocoferoxil, producto de la interacción
de tocoferol y ROS (Buettner, 1993).
Sin embargo, es de destacar que los efectos de la vitamina E pueden variar con la
dosis utilizada, ya que, según la cantidad de radicales de hidroxilo a ser inactivados,
la vitamina E puede tener efectos antioxidantes o estimular la oxidación (Cao y
Cutler, 1997, citado por Valencia y Guerra, 2007).
Sánchez et al., (1997), evaluaron el efecto de los compuestos de epidídimo (taurina
e hipotaurina inositol) y antioxidantes (carnosina y ácido ascórbico), en la motilidad y
la fertilidad de los espermatozoides. Observaron que sólo la taurina ejerció un efecto
positivo sobre la motilidad del esperma, tanto en presencia como en ausencia de
glicerol. Sin embargo, a pesar de la mejora en la motilidad del esperma, la fertilidad
del semen congelado en presencia de taurina (50 mM) no difirió de la observada en
el semen congelado sin taurina. Esto indica que otros factores además de la
motilidad están relacionados a la capacidad fertilizante de los espermatozoides
criopreservados. No hay consenso en la literatura sobre el efecto preventivo de las
sustancias antioxidantes agregadas al diluyente. Mientras que algunos estudios han
reportado efectos positivos de la adición de estas sustancias, otros no han
observado ningún beneficio. La divergencia en los resultados observados dentro de
la misma especie sin duda se debe a las variaciones en edad y raza de los animales
utilizados, en la composición de diluyente, en la forma de conservación de dosis de
semen y en las combinaciones de antioxidantes, entre otros.

CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN

Fundamentos de la congelación
La congelación de semen presenta varios problemas, incluyendo el shock de frío, el
daño por la fracción de cristales de hielo, y los cambios intracelulares provocados
por la deshidratación asociada a la formación de cristales de agua. El congelado es
esencialmente un proceso de desecación.
Cuando una suspensión de espermatozoides es enfriada por debajo de 0ºC, el
primer paso es la formación de cristales de hielo extracelular; la concentración de
solutos en el agua extracelular aumenta. Inicialmente, el agua intracelular no se
congela, pero es “superenfriada” por debajo del punto de congelación.
Debido al aumento de concentraciones de solutos extracelulares, el agua pasa de la
célula al espacio extracelular. A medida que el agua sale de la célula para
congelarse, la célula se deshidrata. Si el agua no puede abandonar la célula lo
suficientemente rápido, se forman cristales de hielo intracelulares. Estos cristales
dañan al espermatozoide, mientras que los cristales extracelulares no causan daño
irreversible. Si el proceso de enfriado es muy lento, la concentración de solutos
intracelulares, deshidratación, precipitación de solutos y cambio de pH., pueden

52
ocasionar daños. La tasa (velocidad) óptima de congelado es un compromiso entre
estos dos puntos (Cavestany, 1994).
El agua pura se congela y forma cristales a 0ºC, mientras que el agua que contiene
iones y otras sustancias en solución lo hace a temperaturas más bajas, dependiendo
de la concentración de tales sustancias. Conforme el agua de una solución se
congela, los cristales de agua pura que se forman van dejando en pos mayores
concentraciones líquidas de aquellas sustancias que están en solución. Este hecho
aumenta la presión osmótica del resto del soluto, lo que puede determinar la lesión
de las células.
Los espermatozoides pueden actualmente conservarse en nitrógeno líquido, a
temperaturas tan bajas como -196ºC y sobrevivir con fertilidad relativamente alta
después de descongelados. Sin embargo muchos de los espermatozoides
existentes mueren o se convierten en inmóviles por la congelación y descongelación.
De aquí que, para una óptima fertilidad, se utilice un número mayor de
espermatozoides congelados que para las técnicas de semen no congelado. La
fertilidad del semen congelado depende principalmente del cuidado ejercido en la
dilución inicial del semen antes de la congelación, y tras la conservación, la fertilidad
depende del cuidado y método de calentar el semen diluido antes de la
inseminación.

Consecuencias físicas y químicas:

Un 50% al menos de los espermatozoides mueren o se hacen inmóviles durante la

congelación y descongelación. La lesión está causada por 1) la formación de
cristales de hielo internos que afectan a la estructura del espermatozoide, 2) por la
concentración del soluto que se produce conforme el agua pura se quita del medio
de suspensión del interior y del exterior de las células, y 3) por las interacciones de
esos dos factores físicos.
Las principales consecuencias físicas y químicas de la congelación son la
separación del agua pura de la solución para formar hielo y la mayor concentración
de solutos resultante en el líquido residual. Estos hechos y sus efectos sobre las
células de hallan influidos por el nivel, los tipos de agentes crioprotectores, la
osmolaridad, el pH del diluyente y por la rapidez de congelación. Las mayores
concentraciones de soluto que se forman conforme el agua se congela, parecen ser
la causa principal de la lesión celular (Salisbury et al., 1978).

El punto de congelación de una solución está dado por la concentración de

partículas que contiene como solutos. Cuando la solución se enfría, pasado el punto
en el cual se forman cristales de hielo, tiene lugar una continua serie de eventos.
La tasa de enfriado depende de la diferencia de temperatura entre la solución y su
líquido refrigerante, su masa relativa. Dependiendo de la concentración de solutos y
la tasa de enfriamiento, la temperatura de la solución cae por debajo del verdadero
punto de congelación del agua hasta que se forma un cristal de hielo alrededor de la
célula. A ese punto, el calor de fusión requerido para formar hielo debe ser removido
de la solución de modo que la temperatura sufre elevación. Mientras que cada
molécula de agua pura de la solución se congela, la concentración de partículas en
la que permanece aumenta, resultando en una constante caída del punto de
congelación de la solución. Estos cambios interrelacionados continúan hasta que

53
todo el solvente, con sus solutos y otros compuestos, hayan completado el proceso
a través del “punto eutéctico” (mezcla de cuerpos sólidos cuya fusión se realiza a
una temperatura constante como la de los cuerpos puros).
Debido a una larga exposición de las células, los efectos dañinos de la alta
concentración de solutos son más críticos con bajas tasas de congelación.
Similarmente, debido a que las células deben ser expuestas a concentraciones de
solutos dañinas durante el descongelado, éste debe ser rápido.
La formación de cristales extracelulares no es una causa primaria de daño
espermático durante la congelación. La formación de cristales intracelulares, sin
embargo, es letal.
El aumento de concentración de solutos, ocasionado cuando el agua se congela,
parece ser la principal causa de daño celular. La concentración de solutos, la
velocidad de cambio, y los efectos dañinos en el espermatozoide dependen de la
temperatura y su tasa de cambio. Durante el congelado lento, las células están
expuestas por períodos prolongados a concentraciones de solutos que están
aumentando relativamente despacio, y puede ocurrir deshidratación celular.
Durante un congelado rápido, la duración de la exposición a una aumentada
concentración de congelación de solutos se reduce, y la deshidratación celular se
puede evitar.
El aumento de presión osmótica del medio de suspensión que acompaña el
congelamiento, saca agua de dentro de la célula, aumentando la concentración
intracelular de electrolitos. En contraste, el congelamiento rápido, como el obtenido
por inmersión directa en nitrógeno líquido, resulta en la formación de un número
relativamente grandes de pequeños cristales, tanto dentro del espermatozoide como
en el medio de suspensión. El hielo intracelular se puede formar durante el
congelamiento rápido porque hay un tiempo suficiente para que toda el agua
congelable difunda de la célula. Tanto el congelamiento rápido como el lento causan
daño celular, aunque por diferentes mecanismos (Cavestany, 1994).

Proceso de congelación
Diluyentes:
Los diluyentes son compuestos químicos, o conjunto de sustancias que preservan la
viabilidad y fertilidad del semen, a la vez que posibilitan el procesamiento de un
número previamente establecido de espermatozoides, acondicionados en envases
adecuados, de un tamaño conveniente para la inseminación (Cavestany, 1994).
Funciones de un diluyente:
a) Proveer nutrientes a los espermatozoides, como fuente de energía.
b) Proteger los espermatozoides contra los efectos dañinos de un enfriado rápido.
c) Proveer un buffer para prevenir efectos nocivos de cambios de pH al formarse
ácido láctico, resultante del metabolismo de la glucosa por los espermatozoides.
d) Mantener una presión osmótica y un balance electrolítico adecuado.
e) Inhibir el crecimiento bacteriano.

54
f) Aumentar el volumen de semen de modo que pueda ser utilizado para múltiples
inseminaciones.
g) Proteger los espermatozoides del congelado.

Tipos de diluyentes

Hay incontables medios que preservan los espermatozoides:

- soluciones salinas fisiológicas
- glucosa
- sulfatos
- lecitinas y peptonas que también pueden proteger la membrana lipídica del
espermatozoide.

Ninguno de estos medios, sin embargo, extiende la vida de los espermatozoides. El

mayor avance en diluyentes de semen surgió con el descubrimiento de la yema de
huevo (1939), así como el mayor avance en la congelación de semen surgió con el
descubrimiento del glicerol (1949). En la fórmula original, el diluyente contenía
volúmenes iguales de yema de huevo y fosfato bufferado. Luego se descubrió que si
se reemplazaba el fosfato por citrato de sodio se mantenía la misma fertilidad, a la
vez que mejoraba la motilidad y la visibilidad (lo que hacía posible una mejor
evaluación microscópica) (Cavestany, 1994).
Dada la gran variedad de diluyentes existentes, cada laboratorio (o cada profesional
especializado) debe determinar que diluyente, bajo sus condiciones, provee un
máximo de eficiencia reproductiva (Cavestany, 1994).

Componentes básicos de los diluyentes para congelación:

1) Agua, que se comporta como solvente de los componentes seminales y del

diluyente; 2) sustancias disueltas iónicas y no iónicas, para mantener la osmolaridad
y tamponar el pH del medio (generalmente citrato de sodio, Tris amino metano o
glutamato monosódico); 3) sustancias orgánicas con capacidad de impedir el choque
de frío (por lo general yema de huevo o leche); 4) agentes crioprotectores, como
glicerina o DMSO (dimetil sulfóxido); 5) azúcares simples como fuente de energía o
di- y tri-sacáridos como crioprotectores adicionados; 6) aditivos tales como enzimas
que puedan mejorar la fertilidad; 7) antibióticos para el controlar el crecimiento
microbiano.
La ventaja del diluyente Yema - Tris sobre el Citrato - Yema común es que se puede
trabajar a temperatura ambiente, y se puede agregar el glicerol al comienzo, sin
dañar el espermatozoide. Permite hacer la dilución y envasado a temperatura
ambiente y el enfriado y equilibrado posteriormente. Es práctico cuando no se
cuenta con cámara de frío o vitrina refrigeradora para trabajar. La desventaja es el
costo más elevado, sobretodo del TRIS.

Hoy en día las compañías de IA a nivel mundial preparan su propio diluyente

adaptados a sus requerimientos. En los últimos años ha habido una fuerte movida

55
para eliminar la yema de huevo del sistema ya que al ser un material biológico se lo
ha percibido como un riesgo para la salud. Sin embargo las alternativas no han sido
tan exitosas como la leche o la yema de huevo.
Algunos de los nuevos diluyentes presentan doble propósito, sirviendo tanto para
utilizar de forma líquida como para congelar semen. Los más comúnmente citados
en la literatura son los siguientes:

• Biladyl: suministrada por Minitub Germany y se usa para semen congelado.

Consiste en dos fracciones que se diluyen en el semen por etapas, con adición de
yema de huevo, agua y ATB.

• Triladyl: suministrada por Minitub Germany y se usa para semen congelado.

Este es similar al Biladyl pero es un medio de dilución de un solo paso.

• Biociphos: suministrada por IMV, Laigle. France. Medio de dilución de un solo

paso, contiene extracto de soya en sustitución de la yema de huevo.

• Laciphos: suministrada por IMV. Este medio es de leche descremada en

polvo, por lo que necesita la adición de agua. Tanto éste como el anterior se les
adiciona ATB.

• Tris concentrate: Gibco, Holland Genetics. Este es el común medio a base de

Tris pero 5 veces más concentrado. Es el diluyente más común para congelación de
semen. El diluyente Tris también ha sido usado como diluyente líquido.

• Caprogen concentrado: Creado para almacenamiento a temperatura ambiente

(18 a 24ºC). Suministrado por Livestock Improvement, New Zealand. Permite el
almacenamiento de semen líquido hasta por 4 días sin afectar su fertilidad
(Vishwanath y Shannon, 2000).

• Andromed: suministrada por Minitub Germany. Para congelación de semen

bovino, también apto para preservación de semen fresco.

Cálculo de Dilución
Relación de la dilución inicial: El eyaculado normal de la mayoría de los animales
domésticos contiene mayor cantidad de espermatozoides de los necesarios para
que se produzca la concepción. Por lo tanto es una práctica corriente diluir
parcialmente el semen inmediatamente después de su recogida hasta un número
constante de espermatozoides o hasta un volumen estándar para su enfriamiento a
4-5ºC. Posteriormente se llenan las pajuelas con el semen diluido y se sellan (Pickett
y Berndtson, 1978; Parkinson, 2001).

1. Determinación de la Concentración
Se realizan las pruebas para cálculo de concentración.

2. Determinar el Número de Dosis que se Puede Obtener

Información necesaria:
a) Total de espermatozoides del eyaculado (volumen * concentración)

56
b) Número de espermatozoides deseados por dosis.
c) Dividiendo a/b, se obtiene el número de dosis.
Información necesaria:
A) numero de dosis
B) volumen de dosis
C) volumen de semen
Multiplicando A*B se obtienen el volumen de semen diluido.
Restando a ese total el volumen de semen, se obtiene el volumen de diluyente
necesario (Cavestany, 1994).
Ejemplo:
1.- concentración: 1.200 millones de espermatozoides por cm3.
2.- volumen: 5 cm3 de semen.
3.- total de espermatozoides por eyaculado: 1.200 * 5 = 6.000 millones.
4.- número de espermatozoides por dosis: 30 * 10 millones
5.- número de dosis: 6.000 dividido 30 = 200
6.- volumen de diluyente: número de dosis por volumen de dosis:
200* 0.5 = 100 cm3 de semen diluido
100 - 5 = 95 cm3 de diluyente.

Ejemplo de congelación en dos tiempos:

Este tipo de procesamiento consiste en agregar la mitad del diluyente sin glicerol
(fracción a) antes del enfriado, y agregar la segunda mitad, ésta con glicerol
(fracción b) en algún momento durante la equilibración (esta fracción debe contener
el doble de la concentración final deseada de glicerol) (Cavestany, 1994).

Enfriado:
Durante la colección o la dilución inicial, el semen debe mantenerse a 35-37ºC. El
diluyente también debe mantenerse a la misma temperatura (hay quienes aconsejan
bajar la temperatura del semen y diluyente a 27-30º C).
Luego de la primera dilución, el semen se enfría lentamente, durante 3-4 horas hasta
llegar a 5º C (la primera dilución consiste en agregar la mitad del diluyente necesario
usualmente “fracción A”, o fracción sin glicerol).
El enfriado lento se puede conseguir colocando el tubo o frasco de semen dentro de
un recipiente de unos 600 cm3 con agua a 37º C.

Glicerolización (adición de glicerol):

Si se utiliza la dilución en un paso, el total del diluyente necesario (junto con el
glicerol) se agrega antes del enfriado, por lo que esta etapa no se realiza.

57
Con una dilución en dos etapas, la “fracción B”, o fracción con glicerol, se agrega
cuando el semen llega a 5º C.
La adición de glicerol se puede realizar de varias maneras:
A) agregando esta fracción de una vez.
B) separado en 3 o 4 etapas cada 15-20 minutos.
C) agregándola por goteo lentamente (Cavestany, 1994).

Equilibración:
El intervalo entre se denomina equilibración.
Clásicamente, el semen de toro diluido es enfriado a 5 ºC, se le agrega glicerol y
luego se deja un intervalo de 1-10 horas para “equilibración”, osea que es el
intervalo entre la adición de la fracción de diluyente con glicerol y el congelado. En
un comienzo se pensó que esta etapa era necesaria para permitir la entrada de
glicerol a la célula, y completar así su acción protectora. En la actualidad se puede
comprobar que el glicerol penetra rápidamente la célula, y que este intervalo se debe
más a un acostumbramiento de la célula a temperaturas bajas previo al congelado.
En la práctica, el período de equilibración es generalmente de 4-18 horas, y la
duración del mismo está determinada por razones prácticas principalmente.
Normalmente, con un período de enfriado de 4 horas, 1-2 horas de equilibración
suelen ser suficientes para asegurarse una buena fertilidad.
Durante la equilibración, el semen es envasado en las pajuelas previamente
identificadas.

Envasado en Pajuelas (Paillettes):

Existen básicamente tres tipos de pajuelas:
-La pajuela francesa, de 113mm de largo y un volumen de 0,5 cm3 (es la más
común).
-La “mini pajuela”, de igual largo que la anterior pero de 0,25 cm3 de volumen.
-El “minitub”, de origen alemán, es una pajuela de aproximadamente la mitad largo
que las anteriores y un volumen de 0,25 cm3.
Las pajuelas tienen un tapón de algodón y alcohol polivinílico en una punta. Luego
del llenado, el otro extremo se sella con ultrasonido (si se usa la envasadora
automática de Cassou) o sumergiendo el extremo de la pajuela en alcohol
polivinílico (esta droga viene en polvo, y al contacto con el líquido se humedece,
sellando la pajuela).

Congelación:
Después de enfriar el semen diluido a 4-5 º C y posterior equilibración, se realiza la
congelación de las pajuelas. Estas se suspenden horizontalmente en vapor de
nitrógeno líquido (NL) a 4-5 cm por encima del NL durante 4-5 min, luego al llegar a
los – 100º C, las pajuelas son sumergidas en el nitrógeno.

58
La velocidad de enfriamiento puede ser regulada por la distancia de las pajuelas
desde el nivel de NL y el tamaño de la pajuela (0,25 o 0,50 cm3) (Leboeuf et al.,
2000).

Proceso de descongelado:
Es difícil, sino imposible, separar los efectos del congelado de los del descongelado.
Teóricamente, cuanto más rápido es el congelado, más rápido debe ser el
descongelado. Sin embargo, el descongelado puede estar influenciado por otros
eventos. Existen interrelaciones entre las tasas de congelado y descongelado y los
diluyentes, así como factores como concentración de glicerol, tamaño y forma del
envase del semen, composición del contenido, medio de descongelado (agua, aire,
etc.), temperatura y método de descongelación.
No hay una receta especifica en cuanto a la mejor técnica de descongelado, sino
que el técnico debe seleccionar el método más conveniente a lo expresado en el
párrafo anterior, y a las condiciones particulares de cada trabajo. En términos
generales, la principal norma a tener en cuenta es que el semen, desde el momento
en que es retirado del termo de inseminación, no debe ser sometido a oscilación de
temperatura.
Dentro de los métodos de descongelado están los siguientes (sin que el orden en
que se enumeren signifique necesariamente una jerarquización de los mismos):
1) Descongelado al aire a temperatura ambiente.
Este método consiste en sacar la pajuela del termo y mantenerla en el bolsillo hasta
la inseminación.
2) Descongelado en agua a 40º C por 1 minuto.
La pajuela se coloca en baño María a esa temperatura, y luego se traspasa a la
pistola de inseminación.
3) Descongelado a 75º C por 12 segundos.
4) Descongelado en agua a 37º C (Cavestany, 1994).

59
EVALUACIÓN POST DESCONGELADO
Debido a la relación entre la calidad del material genético y la fertilidad seminal, se
realiza a menudo la determinación de la calidad del semen para ser utilizado en IA
(Bicudo et al., 2007). Normalmente los laboratorios con el objetivo de estimar el
potencial de fertilidad de una muestra de semen realizan determinadas pruebas:
Motilidad espermática (%), vigor (0-5), concentración espermática (millones/ml),
morfología (%) y prueba de termorresistencia (lenta o rápida) (Arruda et al., 1992).

Lo que se busca es evaluar si el semen fue capaz de superar el proceso de

congelación y de descongelación. Se evalúan factores intrínsecos (semen) y
extrínsecos (manejo de N2 liquido en termo, etc.).

La evaluación post descongelación consiste en descongelar dos pajuelas de 0,5 ml o

0,25 ml en baño de agua a 36ªC. A los 45 segundos se extrae una de las pajuelas y
se seca con toalla de papel, debido a que el agua puede ser nociva para los
espermatozoides. El contenido de la pajuela se agita hacia el extremo con tapón de
algodón, en tanto que el extremo opuesto de la pajuela se corta, para liberar el
semen en un tubo de ensayo pequeño, limpio y desechable, cortando la abertura
pequeña que se encuentra justamente por debajo del tapón de algodón. Se coloca
una gota pequeña del semen sobre el portaobjetos tibio con cubreobjetos (Hafez,
2000).

Según Barth y Oko (1989) para evaluar semen congelado se deben tener en cuenta
al menos 3 parámetros básicos:

• Viabilidad post-descongelación (% de motilidad progresiva, vigor y acrosomía)

• Morfología
• Concentración de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis
inseminante

Estas tres pruebas si bien deben hacerse inmediatamente post-descongelación,

debido a que el daño de membrana puede no ser completamente expresado en este
momento, se deberían hacer la evaluación conocida como prueba de
termorresistencia o de incubación, donde el semen se incuba a 37ºC durante 2
horas.

Pruebas microscópicas:

Motilidad individual (valores aceptables):

0hs valor mín. 40% de spz móviles (según ISO 9002 25%)
2hs valor mín. 30% de spz móviles (según ISO 9002 15%)

Vigor (valores aceptables):

0hr valor mín. 3
2hs valor mín. 2

60
Acrosomía (valores aceptables):
0hr valor mín. 60% acrosomas intactos
2hs valor mín. 40% acrosomas intactos

Morfología (valores aceptables):

Los valores se mantienen igual que para semen fresco.
Se estima como valor mínimo aceptable 75% de acrosomas normales y también
75% de espermatozoides normales (sin malformaciones). Pero este máximo de 25%
de malformaciones espermáticas permitido, debe contemplar un límite máximo de
defectos del núcleo (cabeza) del espermatozoide que se encuentre en el rango de
15-20%, mientras que defectos del acrosoma y la cola se pueden tolerar hasta en un
25%. (Saacke, 1970; Catena y Cabodevila, 1999; Tribulo et al., 2002).

Concentración (valores aceptables):

Al descongelar valor mínimo 10 x 106 spz móviles /pajuela. Una vez hallada la
concentración de espermatozoides/mm3 se multiplica por el % de spz móviles (ya
hallados) obteniéndose el numero de spz móviles por dosis.

Test de Termorresistencia
Existen varias pruebas a las que puede ser sometido el semen luego del
descongelado para ser considerado apto, desde las más simples como la estimación
del porcentaje de motilidad, hasta más complejas que incluyen tinción y observación
de acrosomas.
La prueba de termorresistencia (o incubación) es la más comúnmente utilizada para
determinar la vitalidad del semen luego de descongelado.
Fue creada por Dimitropoulos en 1967 para la evaluación de la fertilidad potencial de
partidas de semen congelado de bovino.
La prueba consiste en la incubación de una muestra de semen a 38ºC durante 5
horas, luego se verifica el porcentaje de motilidad espermática progresiva,
presentando una correlación positiva altamente significativa con la fertilidad real,
medida como el tasa de no retorno a los 60-90 días. El mismo autor procuro obtener
mayor rapidez en la evaluación del poder fecundante del semen congelado,
estudiando una nueva prueba complementaria, denominada test de
termorresistencia rápida, colocando la muestra a baño maría a 46ºC, durante media
hora.
La pruebas de termorresistencia adquirieron gran aceptación ya que permiten mayor
seguridad que las anteriormente utilizadas, una vez que el semen es sometido a
condiciones semejantes a las que se expone en el tracto genital femenino de la
hembra en celo (Dimitropoulos citado por Arruda et al., 1992).
Si bien hoy día existen variaciones de ambas pruebas, no habiendo “recetas”,
normalmente una muestra de semen puede ser considerada “apta” si luego de 2
horas de incubación mantiene por lo menos un 50% de la motilidad inicial. Hay
laboratorios que incuban el semen 4-5 horas y lo consideran aceptables si luego de
ese período mantiene entre un 5-10% de espermatozoides con motilidad
(Cavestany, 1994).

61
La motilidad puede ser evaluada mediante dos maneras, de forma subjetiva post
descongelado utilizando el microscopio de contraste de fase (400 x) con platina
térmica (Gil, 1999), o de forma objetiva mediante la utilización de sistemas
computarizados como el CASA (Gil, 1999).

Estabilidad e Integridad de Membrana:

La membrana plasmática del espermatozoide es el principal sitio de lesión

que ocurren durante la congelación y descongelación de semen (Hammerstedt et
al., 1990; Krogenaes et al., 1994).
La membrana intacta y un funcionamiento activo es esencial para que el
espermatozoide pueda mantener el metabolismo, someterse a la capacitación y
reacción acrosómica y además, para unir y penetrar en el ovocito a través de la zona
pelúcida (Jeyendran et al., 1984; Burks y Sailing, 1992).
La integridad de membrana puede ser evaluada de las siguientes maneras:
1) Test de resistencia osmótica (ORT) o el test de valoración de la funcionalidad
acrosomal, es una prueba denominada que permite valorar la integridad del
acrosoma al someter los espermatozoides a un medio hiposmótico, de forma que
aquellos funcionales no mostrarán alteraciones estructurales evidentes a nivel
acrosómico (Correa y Zavos, 1994; Gil et al., 2000; Pérez-Llano et al., 2001).
La evaluación del estado de los acrosomas permite comparar la resistencia osmótica
de las membranas de distintos eyaculados, así como medir de manera indirecta la
capacidad para soportar la criopreservación (Prathalingam et al., 2005, Schilling,
1995) y predecir el potencial reproductivo del toro (Schiling, 1985, Schiling, 1986).
Los resultados se reflejan de manera porcentual, luego de sumar los porcentajes de
acrosomas intactos en las muestras evaluadas de ambos grupos y dividirlos entre
dos, para obtener así un cociente que representa el porcentaje de resistencia
acrosomal al medio hiposmótico (%ORT) (Revell y Mrode, 1994; Pérez-Llano et al.,
1998; Gil et al., 2000).

2) una prueba sencilla y rápida es el test de Endosmosis o también llamado HOST

(Hypoosmotic Swelling Test), se basa en el concepto fisiológico de la
semipermeabilidad de las membranas plasmáticas intactas y bioquímicamente
activas de los espermatozoides vivos, las cuales absorben agua cuando son
expuestas a una solución hipoosmótica (Vera, 2003; Rota et al., 2000).
Esta puede ser una prueba muy fácil de realizar y evaluar a campo con un solo
microscopio óptico disponible. Se proporciona información acerca de la funcionalidad
espermática para el análisis de rutina de semen (Pérez-Llano, 1998).
En esta prueba, la membrana de los espermatozoides intactos teóricamente permite
la entrada excesiva de agua en el citoplasma, lo que resulta en una variedad de
cambios morfológicos del flagelo asociado con la hinchazón citoplasmática. Por el
contrario, los espermatozoides que no puedan osmoregular bien, no experimentarán
cambios en la forma del flagelo.
Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmática del espermatozoide
debe estar íntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando

62
correctamente. En los espermatozoides funcionalmente alterados no se produce la
captación selectiva de agua de forma adecuada, alcanzándose así un equilibrio
pasivo entre los medios intra y extracelular que no provoca cambios morfológicos
apreciables (Madrid-Bury, 2004; Vera, 2003).
Metodología: El semen es incubado 2 horas a 37ªC en una solución hiposomótica de
fructosa y citrato de sodio. Se realizan observaciones seriadas (horas 0, 1 y 2) entre
porta y cubreobjetos, determinándose el % de espermatozoides vivos. Estos
reaccionan al shock osmótico enrollando la cola. Debe haber como mínimo un 40%
de espermatozoides reaccionantes.
De acuerdo a Correa y Zavos (1994) tras la evaluación de espermatozoides bovinos
reactivos al HOST se produce su máxima hinchazón en el nivel de 100 mosm/L.
Generalmente aparece comprometida la integridad de membrana en aquellos casos
donde se ha producido algún inconveniente en la conservación del semen como por
ejemplo un bajo nivel de nitrógeno liquido en el termo por algún tiempo.
También se han observado casos de alteración de membrana, donde naturalmente
la viabilidad post-descongelación se ve afectada, a causa de elevados grados de
contaminación con microorganismos inespecíficos que si bien son incapaces de
provocar una enfermedad reproductiva, pueden afectar la viabilidad de los
espermatozoides al competir con ellos por el oxigeno y los nutrientes (Catena y
Cabodevila, 1999).

3) Hoy día un pool de fluorocromos ha sido desarrollado para evaluar la integridad

de la membrana, permitiendo así la diferenciación de células vivas y muertas al
mismo tiempo (Garner et al., 1997). De Leeuw et al. (1991) ha aplicado este
concepto con éxito para discriminar entre células de la membrana intactas y
dañadas.
El estudio de la viabilidad espermática normalmente se basa en el análisis de la
integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides, mediante el uso de
dos fluorocromos combinados: uno de ellos solo es capaz de atravesar las
membranas plasmáticas dañadas o degeneradas, y por lo tanto permite identificar
las células muerta o en proceso de degeneración, mientras que el otro no es capaz
de atravesar las membranas celulares intactas y por lo tanto permite identificar la
población de células viables (Garner et al., 1997).

Uno de los fluorocromos más utilizados para identificar células muertas es el ioduro
de propidio (PI). Este compuesto entra en el espermatozoide con la membrana
plasmática dañada, se une al núcleo y al ser de excitado por la longitud de onda
apropiada, emite fluorescencia roja. Además del PI existen otros marcadores
fluorescentes específicos para células muertas cuyo mecanismo de acción es
similar.

Entre los fluorocromos más utilizados para identificar la población de células vivas se
encuentra el grupo de las carboxifluoresceínas, que son compuestos no
fluorescentes capaces de atravesar membranas celulares intactas. En el interior de
las células, debido a la acción de esterasas intracelulares, se convierten en
carboxifluoresceinas, molécula que al ser excitada a una longitud de onda adecuada,
emite fluorescencia verde, quedando retenida intracelularmente por membranas
celulares intactas.

63
Gil et al. (2000) en su estudio propone dos combinaciones de fluorocromos Calcin
AM con etidio, y SYBR-14 con ioduro de propideo, para la rutina de laboratorio. La
primera combinación es evaluada por microscopio fluorescente y la segunda es
evaluada usando microscopio fluorescente y citometría de flujo.

Sanidad

Hay quienes aconsejan realizar controles bacteriológicos y virológicos a espacio de

tiempo variables. Barth recomienda determinar la presencia de microorganismos
patógenos únicamente cuando hembras fértiles fracasan en ser preñadas con
semen de buena viabilidad y morfología, en dosis adecuada o cuando una historia
de infertilidad implica una posible causa infecciosa.

Para que una muestra post descongelado pueda ser considerada como de “Calidad
Aceptable” y poder ser utilizado para IA, debería cumplir con los siguientes requisitos
especificados en la siguiente tabla:

Tabla 9: Parámetros de aceptabilidad para evaluación de semen post descongelado (Derivaux, 1976;
Morrow, 1986; Bonadonna, 1989; Barth y Oko, 1989; Ax et al., 2000; Elhordoy y Farías, 2003).
Pruebas Valores de referencia
Motilidad individual 0hs > 30% de spz móviles
(Según ISO 9002 > o = 25%)
2hs > 20% de spz móviles
(Según ISO 9002 > o = 15%)
Vigor (0-5) 0hr > o = 3
2hs > o = 2
Acrosomía 0hr > 60% acrosomas intactos
2hs > 40% acrosomas intactos
HOST > 40% de spz reaccionantes
Morfología y acrosomía*
Defectos cabeza < 5-15%
Defectos acrosoma y cola < 20%
Anormalidades totales < 25%
Concentración (spz/pajuela) > 10 millones (muy variable)
Termorresistencia (2hs) > 50%

( )
* El valor asignado para Malformaciones totales por la Facultad de Veterinaria de Uruguay
basándose en la escuela sueca es de 20% como máximo Aceptable (Elhordoy, D.
Comunicación personal).

64
HIPOTESIS
Existe una gran variabilidad de métodos utilizados por los laboratorios procesadores
de semen bovino (LPS) para conocer la calidad del semen destinado a la
comercialización.

OBJETIVOS
1. Identificar las principales técnicas de evaluación de semen que utilizan los
laboratorios previo a la comercialización.

2. Conocer los valores mínimos de calidad que se adoptan para semen fresco y
congelado.

65
MATERIALES Y METODOS

La población de estudio fueron los centros de procesamiento de semen (CPS)

bovinos y profesionales veterinarios de libre ejercicio especializados en reproducción
los cuales fueron identificados a través del la Sección de Reproducción de la
DILAVE del MGAP. Estos fueron englobados como laboratorios de procesamiento
de semen (LPS). Estos fueron mantenidos bajo anonimato.

Los datos para la investigación fueron obtenidos por una encuesta técnica abierta
(Anexo II) completada de forma voluntaria y enviada vía e-mail, durante el período
de diciembre del 2011 a noviembre del 2012.
El contenido de la encuesta fue formulado para obtener la siguiente información:
Datos generales sobre el centro; los animales; la colecta y el procesamiento de
semen (1- pruebas empleadas para evaluar la calidad de muestras de semen, 2-
valores de referencia adoptados para cada análisis en particular, 3- tecnologías que
LPS tienen la intención de adoptar, 4- existencia potencial de estandarización de las
técnicas); evaluación de semen descongelado.
Los resultados se analizaron y fueron compartidos con los participantes en el
estudio.

Los resultados son presentados en tablas y graficas, y se elaboraron medidas de

resumen, promedios y desvío estándar.
Para los análisis estadístico descriptivos fue utilizado Excel® (programa estadístico
de Microsoft, Windows Office 2007). También fueron analizados y discutidos en
función de los resultados.

66
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De un total de quince cuestionarios enviados, fueron contestados completamente

46,7% (7/15), entre los cuales se encuentran 3 veterinarios de ejercicio liberal y 4
centros procesadores de semen. Los resultados se exponen a continuación.

Tabla 10. Métodos y régimen de colecta empleados por los LPS (los LPS del 1 al 3 corresponden a
veterinarios de libre ejercicio, mientras que los LPS del 4 al 7 son centros de colecta y procesamiento
de semen bovino) (2012).

La forma de colecta de semen que utilizan todos los LPS (7/7) es por vagina artificial
y uno de ellos también utiliza el electroeyaculador.
La cantidad de saltos a los que se somete a los toros donantes de semen, varía de 4
a 6 saltos por semana según el LPS; el promedio es de 5 (± 1,1) saltos a la semana.
De los 7 LPS 5 hace saltar a los toros 2 días a la semana y los 2 restantes
distribuyen los saltos en 3 días a la semana.
Tabla 11. Pruebas de evaluación y valores de referencia adoptados para semen fresco por los
laboratorios que procesan semen en Uruguay (2012).

67
Tabla 12. Parámetros evaluados por los laboratorios para la evaluación del semen después de
descongelado en Uruguay (2012).

La medición del volumen, motilidad de masa macro y microscópica, vigor,

concentración, y morfología fueron las pruebas adoptadas por 7/7 de los LPS para
evaluar la calidad del semen fresco.
Los laboratorios adoptan como valor mínimo de volumen del eyaculado 4 a 5 ml de
semen. Según Salisbury (1978) el volumen aumenta con la edad y el tamaño
corporal del toro, y se modifica con su salud, vigor reproductivo y con la frecuencia
de los servicios.

El valor mínimo de la motilidad en masa macroscópica, es mayor o igual a 3 y 4

según el laboratorio. La escala utilizada para esta medición es del 0 (no hay ondas,
semen sin movimiento) al 5 (Movimientos masivos muy marcado y rápidos 70-
100%).

Para la motilidad en masa microscópica se observaron los mismos resultados,

utilizando una escala similar, 0 (Escaso o ningún movimiento) al 5 (Movimiento en
ondas vigoroso y en remolinos).

La prueba de la evaluación del vigor usada por 7/7 de los LPS constituye un signo
importante de vitalidad y calidad del esperma. Tomaron como valor mínimo promedio
para semen fresco 3,2 y para semen descongelado 2,8.
Sin embargo Derivaux (1976) indico que no se trata de un valor absoluto, ya que
este test puede variar dentro de amplias proporciones por ejemplo al variar la
temperatura durante la técnica, siendo por lo tanto un valor muy subjetivo.
De acuerdo a Folhadella et al. (2006) existe alta correlación entre la motilidad y el
vigor, y puede ser explicada por ser variables del metabolismo espermático.
La motilidad progresiva individual, que es uno de los principales parámetros
asociado a la fertilidad de las muestras (Rodríguez-Martínez, 2005) fue evaluada por
6/7 tanto sobre semen fresco como descongelado; por lo tanto fue reportado por la
mayoría de los laboratorios.

68
Un estudio similar realizado por Phillips et al. (2004a) en Australia sobre semen
descongelado revelo que el 100% de los laboratorios evalúan motilidad progresiva
individual y el 94% morfología normal.
Crespilho et al. (2009) también realizo un estudio de similares características en
Brasil, y reporto que el 85.7% de los laboratorios encuestados adoptan como los
parámetros mas evaluados para semen descongelado la motilidad progresiva
individual y concentración de espermatozoides/pajuela.
Ambos autores obtuvieron resultados concordantes con nuestros hallazgos.

Estos resultados coinciden con el trabajo de Rodríguez-Martínez (2006), quien

afirma que cuanto mayor sea el número de espermatozoides con movimiento
rectilíneo uniforme, es mejor, ya que éste se asocia a la capacidad de migración a
través del aparato reproductivo femenino
Sin embargo la valoración de la motilidad como único parámetro de calidad seminal
no es suficiente para predecir la capacidad fecundante del semen (Liu y Foote,
1998), es sólo uno de los requisitos que ha de cumplirse; de ahí que la correlación
existente entre la motilidad de una muestra de semen y su fertilidad real, sea
significativamente baja (Kjaestad et al., 1993).
De acuerdo a Holt y Van Look (2004) los espermatozoides con actividad flagelar
normal son capaces de cruzar la unión útero tubárica y entrar en el oviducto, pero
los espermatozoides que posean una función anormal flagelar son incapaces de
hacerlo.
Según el relevamiento efectuado, los porcentajes mínimos aceptados para motilidad
progresiva individual de los espermatozoides, fue promedialmente de 63% (± 5,16) y
34,5% (± 4,39), para semen fresco y descongelado respectivamente.
En el trabajo de Phillips et al. (2004a) antes mencionado, los valores de aceptación
utilizados para motilidad progresiva individual post descongelado oscilan entre 20-
50% (promedio 37% de espermatozoides móviles).
Para inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), Bó et al. (2005) recomendaron el uso
de dosis que tengan más de 30% de motilidad progresiva individual al descongelado.
Una buena motilidad progresiva individual de los espermatozoides está asociada a
un correcto metabolismo e integridad de membrana (Den Daas, 1992; Holt y Van
Look, 2004), así como a una baja incidencia de acrosomas anormales (Barnanbé,
1981).
La resolución Nº 46/96 del Mercosur (1996), considera 30% de motilidad progresiva
como el valor de referencia mínimo aceptable para las muestras después de la
descongelación de semen bovino. En la tabla 12 se muestra que en promedio los
laboratorios adoptaron valores 4,5% superiores a lo establecido en la mencionada
resolución, y existe concordancia en relación a los límites mínimos adoptados (de
30% a 40%, media 34.5%) para el parámetro motilidad individual.
De la encuesta surge que la prueba de integridad de acrosoma la realiza un solo
LPS, tomando un máximo de 10% de acrosomas defectuosos como límite.
Un acrosoma intacto post descongelado es crucial para la fertilización
(Januskauskas y Zilinskas, 2002).
69
La integridad de membrana es evaluada por 3/7 a través de la prueba de coloración
post vital, tomando como aceptable un mínimo de 70% de espermatozoides vivos.
Para ello 2/7 utilizan Eosina-Nigrosina, y un tercer laboratorio utiliza Eosina-
Nigrosina o Azul de Anilina de forma indistinta.
Y 2/7 realizan HOST sobre semen descongelado. Ha sido recientemente
demostrado que la prueba HOST, resulta ser útil en la detección de cambios sutiles
de las membranas de los espermatozoides de toro y carnero (Nur et al., 2003). Se
puede decir que la prueba HOST es complementaria a la prueba de coloración post
vital, ya que la primera es usada para evaluar la actividad bioquímica de la
membrana, mientras que la prueba post vital evalúa el daño físico de la membrana
plasmática (Brito et al., 2003).
Según lo expresado por los encuestados estas pruebas no se realizan de rutina, se
hacen únicamente cuando existe viabilidad cuestionable de los espermatozoides.
Para que el espermatozoide sea considerado cualitativamente viable y
potencialmente fértil es necesario que posea morfología, actividad metabólica y
membranas plasmáticas normales. La presencia de membranas integras es un pre
requisito para que los eventos relacionados a procesos de fertilización, como la
capacitación espermática, penetración de los revestimientos del ovocito, unión con
la zona pelúcida y fusión de la membrana puedan ocurrir (Rodríguez- Martínez et al.,
1997). Una vez dañado, los espermatozoides no son capaces de volver a sellar el
plasmalema comprometido (Woelders, 1991), y por lo tanto, no puede mantener las
concentraciones de iones y co-factores esenciales para la supervivencia de los
mismos (Januskauskas y Zilinskas, 2002).
El éxito de la criopreservación de semen de toro depende de numerosos factores,
como los crioprotectores, velocidad de refrigeración/congelación y descongelación, y
los medios para minimizar los efectos perjudiciales de la criopreservación (Andrabi,
2007).
La membrana plasmática es el sitio primario de lesión en los espermatozoides
criopreservados y su principal daño se produce durante la congelación y
descongelación (Graham y Parkes, 1992). Resultando en la pérdida sustancial de
espermatozoides viables (Bailey et al., 2003). Esta vulnerabilidad se debe a lípidos y
proteínas en la membrana que no están unidos covalentemente y pueden moverse
fácilmente.
Habitualmente, la coloración con eosina o la prueba de endosmosis (HOST) se
utilizan para evaluar membranas espermáticas. Woelders (1991) sugiere un
marcador fluorocromico para eludir los problemas de una concentración tóxica del
colorante y una evaluación microscópica subjetiva
La criopreservación optimiza la técnica de IA proporcionando un sistema de
almacenamiento de semen a largo plazo. Pero la reducción de la fertilidad asociada
a la IA con semen congelado es atribuida a técnicas de congelación que producen
daños ultraestructurales, físicos, bioquímicos o funcionales en los espermatozoides
(Watson, 1995). Los daños irreversibles a la membrana plasmática y acrosomal
causan muerte e infertilidad celular (Rubio-Guillén, 2009).
Según Gonzales (2004), el 85% de los espermatozoides bovinos presentes en una
muestra de semen, sufren algún tipo de daño durante el procedimiento de
congelación y descongelación.

70
Para el cálculo de la concentración, 4/7 utilizo cámara de Neubauer, 2/7
espectrofotómetro y 1/7 cámara Makler.
Según lo expresado por los encuestados y en concordancia con lo manifestado por
otros autores, la concentración espermática mínima por dosis para congelar semen
bovino oscila entre 400 y 1000 x 106 spz/cm3 y en promedio fue de 600 x 106 spz/cm3
(± 270,80) sobre el eyaculado.
Por otro lado el número de espermatozoides para congelar por pajuela de
inseminación presento gran variación, los resultados indicaron una media de 34 x
106 spz/pajuela y un desvío de 9,62 x 106 spz/pajuela; el rango fue de 25 a 50 x 106
spz/pajuela.
El número de espermatozoides por pajuela post descongelado presento un rango
que va de 10 a 20 x 106 spz/pajuela, con un promedio de 14 x 106 y un desvío de
4,18 x 106 spz/pajuela.
A continuación se grafican las concentraciones para congelar pajuelas y al
descongelado para cada caso individual.
En la figura 10 se exponen el número de espermatozoides viables por los LPS
encuestados para congelar en pajuelas y aceptables al descongelado para cada
caso individual.

60
Concentración en (millones spz/pajuela)

50

40
Concentración de spz viables
30 para congelar (sobre semen
fresco)
20 Concentración mínima aceptada
de spz viables para semen
10 descongelado

0
1 2 3 4 5 6 7
LPS

Figura 10: Comparación entre las concentraciones espermáticas viables en pajuelas pre y post
congelado de LPS en Uruguay En el eje de las abscisas se encuentran los LPS numerados
individualmente del 1 al 7 (Curbelo y Rodríguez, 2013).

De cualquier manera un mismo lote contiene variaciones del número de spz debido
a fallas en la homogenización antes de diluir o luego del llenado de las pajuelas,
resultando en muestras con altos y bajos números de células espermáticas
(Crespilho et al., 2009).
Salisbury (1978) propone que a medida que aumenta la concentración espermática
por dosis inseminante hasta llegar a un umbral óptimo, la correlación entre la

71
concentración espermática y la tasa de fertilidad cesan, por lo que ya no existiría
relación entre ambas.
Por el contrario con una relativamente baja concentración espermática pequeños
cambios producen importante variación en la fertilidad.

Dosis de inseminación con alto número de espermatozoides, tal vez influyan en el

número de estos que accedan al ovocito bovino, resultando en una alta fertilidad y
tasas de embriones de calidad. De acuerdo a Dalton (1999), una de las alternativas
para mejorar las eficiencias de la IA es aumentar el número de espermatozoides por
dosis inseminante.
Saacke (2008) propone que el número de espermatozoides viables para obtener una
buena fertilidad varía en cada toro. Se observa en la grafica 8.
Altas tasas de concepción de vacas en IATF con incremento de la concentración han
sido reportadas por Albretch et al (2005) y Crespilho (2007), sugiriendo el uso de un
alto número de espermatozoides por pajuela para IA.
Hay que tener en cuenta que alrededor del 40-50% de la población de
espermatozoides de los mamíferos no sobrevive a la criopreservación, incluso con
los protocolos optimizados (Watson, 2000).
Para la inseminación artificial, una dosis mínima de 10 x 106 de espermatozoides
con movimiento progresivo por pajuela al descongelado debe garantizar máxima
fertilidad de los toros individuales (Christensen et al., 1999), incluso algunos autores
afirman que bajo buenas condiciones de recolección, procesamiento e inseminación,
la tasa de fecundidad se mantiene con 5 x 106 de espermatozoides con movimiento
progresivo (Foote y Kaproth, 1997).
Gerard y Humblot (1991) encontraron que se reduce la fertilidad cuando se llega a 7
x 106 espermatozoides con movimiento progresivo por pajuela al descongelado.

Foote y Kaproth (1997) publicaron un trabajo donde se evidencia la falta de

diferencias significativas para la fertilidad, cuando se utilizaron valores de 16 x 106 y
de 12 x 106 espermatozoides con movimiento individual. En el mismo trabajo,
tampoco hubo diferencias significativas al usar 16 x 106 y 10 x 106 espermatozoides
con movimiento individual.
Según Elliott (1978) y Saacke et al. (1991), la inseminación de 10 x 106
espermatozoides móviles (descongelado) permite suficiente colonización del
oviducto y cualquier incremento en la dosis es probable que tenga poco efectos
sobre la fertilidad observada. De acuerdo a estos investigadores es el número de
espermatozoides móviles inseminados, y no el porcentaje de espermatozoides
móviles, el que probablemente esté más relacionado con la fertilidad.
Saacke et al. (1994) y Den Daas (1997) han postulado que las diferencias en la
motilidad del esperma se compensa completamente con la inseminación de más de
10 x 106 células móviles y que las diferencias en la fecundidad es probable que sea
causada por factores no compensables.
Crespilho (2007) enfatiza la influencia negativa de altas concentraciones por pajuela
para la evaluación objetiva de motilidad espermática debido a superposición y

72
colisión entre las células. Esto sugiere que para la evaluación subjetiva de la
motilidad puede haber un defecto similar.
Las anormalidades morfológicas de los espermatozoides pueden tener un impacto
perjudicial sobre la fertilización y el desarrollo embrionario (Saacke, 2008). La
determinación de estos parámetros posee un alto valor diagnóstico, pues se ha
comprobado que la incidencia de espermatozoides anormales en el eyaculado tiene
una relación directa con la fertilidad bovina (Söderquist et al., 1991).
Con respecto a la evaluación morfológica, los resultados indicaron que se realiza la
prueba en 7/7 para semen fresco, mientras que 6/7 en el semen descongelado. El
límite de referencia o nivel de aceptación es en promedio de 25%, con un rango que
va de 20 a 30% de malformaciones totales.
La pruebas utilizadas fueron la de contraste de fase realizada por 5/7 y la de tinción
por los 2/7 restantes.
Algunos LPS señalaron que no realizan de rutina la evaluación morfológica,
solamente en casos puntuales como para algunos toros de importante valor genético
o ante la existencia de algún problema o duda.
Son 5 de los 7 laboratorios que clasifican a las anormalidades espermáticas. 2/5
clasifican en defectos compensables y no compensables, 1/5 en primarios y
secundarios, 1/5 en mayores y menores, y 1/5 por la ubicación del defecto en el
espermatozoide.

En la actualidad, quizás lo más adecuado sea identificar cada una de las

anormalidades por su ubicación dentro de la estructura del espermatozoide y la
relación de cada una de ellas con la fertilidad, para lo cual aún se requieren muchos
estudios para poderlo dilucidar fehacientemente en todos los casos (Barth, 2005).

Para una interacción normal del espermatozoide con las envolturas del ovocito,
además de tener motilidad progresiva, los espermatozoides deben ser
morfológicamente normales. Cualquier anomalía que afecte alguna de las
características del espermatozoide puede dificultar su migración por el tracto genital
de la hembra e impedir su unión con el ovocito (Rodríguez-Martínez, 1999).
A medida que aumenta la proporción de espermatozoides anormales en el
eyaculado, desciende la capacidad fecundante del mismo (Morrow, 1986).
De acuerdo a Barth y Oko (1989) y Saake (2008), las muestras de semen deben
presentar un mínimo de 75 % de espermatozoide morfológicamente normales.
Ante la pregunta planteada a los técnicos de si piensan incorporar nuevas
tecnologías, 2 sí planean hacerlo. Entre estas se incluyen espectrofotómetro (2/7 ya
cuentan con éste) y microscopio de contraste de fase (5/7 ya lo utilizan).
Según expresan los laboratorios, la negativa a realizar pruebas más complejas como
son HOST, fluorocromos, FIV (fertilización in vitro), CASA (sistemas de análisis de
semen asistido con computadora) y otras se debe a la relación costo beneficio.
Generalmente este tipo de pruebas se hacen de rutina en países cuyos toros, tienen
mayor demanda, lo que amerita una tasa máxima de dilución y por ende las pruebas
de calidad biológica a que hay que someterla son múltiples para asegurar su
fertilidad.

73
Los tests de inseminación artificial o de FIV representan técnicas de mayor
sensibilidad para la predicción de la fertilidad potencial de las muestras seminales
(Barth y Oko, 1989; Crespilho et al., 2009) y permiten la evaluación simultanea de
los requisitos más importantes de la célula espermática para el proceso de
fertilización (Rodríguez- Martínez, 2005). Sin embargo, el alto costo y pérdida de
tiempo, agregando la complejidad y la dependencia de estabilidad laboratorial
impuesta por los FIV (Hallap et al., 2004; Rodríguez Martínez, 2005), tornan
impracticables la adopción de estos métodos en la rutina de análisis de semen
bovino. En nuestro relevamiento ninguno de los LPS lo realiza.
De acuerdo a Barth y Oko (1989), no debería ser pasado por alto en casos
especiales en los que los métodos de evaluación de laboratorio no son
suficientemente concluyentes para determinar el potencial de un toro o semen
conservado.
El uso del test de termorresistencia para el semen descongelado, de acuerdo a los
datos obtenidos es empleado por 4/7 de los laboratorios.
Estos LPS toman como limite aceptable entre 30 y 40% (33 ± 5,59) de
espermatozoides móviles, el tiempo que tienen la muestra espermática en baño
María es de 2 horas y el rango de temperatura es de 30 a 37ºC (35 ± 3,30).
Uno de ellos calcula el porcentaje de espermatozoides móviles a la hora, 2 horas y 3
horas; exigiendo valores mínimos de 40%, 30 a 35% y 10% respectivamente.
Se nos transmitió que en el caso de utilizarse diluyentes sintéticos las exigencias
son menores o directamente no se realiza el test de termorresistencia, debido a la
falta de elementos orgánicos por parte de dichos diluyentes, el metabolismo celular
es tan intenso que los espermatozoides se agotan antes de las 2 horas.
Estimamos que la causa por la que este test no es realizado por todos los
laboratorios, es el tiempo requerido para ello.
Vianna et al. (2009) observo que hay baja correlación entre el % de motilidad de
espermatozoides bovinos tras el test de termorresistencia rápida o lenta, y la tasa de
concepción después de IA en vacas.
Sin embargo Arruda et al. (1992), obtuvo resultados favorables con respecto a la
correlación entre las tasas de preñes y la prueba de termorresistencia. Este también
obtuvo resultados satisfactorios en la correlación existente entre los test de
termorresistencia rápida y lenta, por lo que el test de termorresistencia rápida podría
sustituir al lento ya que no hay diferencias significativas en la tasa de preñes de las
hembras inseminadas. Barnabé et al. (1981) considera que el más adecuado es el
test rápido (46ºC durante 30min.) porque el semen de determinados toros puede
presentar buena tasa de fertilidad a pesar que muestren valores bajos en la prueba
lenta.
Por lo tanto creemos que sería una buena opción para los laboratorios utilizar la
prueba rápida
Cuando realizamos la pregunta de si existe necesidad de establecer un protocolo de
evaluación estándar, 2/7 de los encuestados, respondió afirmativamente, mientras
que el 2/7 restante respondió que no. Estos últimos fundamentan su respuesta en su
satisfacción con los criterios actuales de evaluación y en la subjetividad de muchas
de las pruebas ejecutadas debido a la variación entre los técnicos, laboratorios y
equipos.

74
Según algunos autores hay pocos parámetros individuales indicadores de viabilidad
espermática que tiene una correlación positiva significativa con la fertilidad de la
muestra de semen (Amann y Hammerstedt, 1993).
Según Bó et al. (2005), todavía no existe ninguna prueba suficientemente objetiva y
precisa para determinar el potencial de fertilidad de una muestra de semen
congelado. Sin embargo el uso de un conjunto de pruebas, puede acercarnos más al
potencial real de fertilidad de una muestra espermática.
No se observaron variaciones entre los centros y los veterinarios de libre ejercicio,
en las pruebas y valores empleados.
De acuerdo a nuestro estudio observamos que la prueba de evaluación de la
integridad de la membrana plasmática que monitorea los daños que se producen
durante la criopreservación y descongelación solo la realizan 3/7 del total de LPS.

75
CONCLUSIONES
Los datos sugieren que se utiliza un protocolo de evaluación de semen diferente
dentro de cada laboratorio, ya sea para pruebas de evaluación de calidad seminal,
metodologías de las mismas y que existe variación en los valores límites en los
distintos parámetros evaluados.

76
 BIBLIOGRAFÍA

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90
ANEXO I

Marco legal

Si bien a nivel nacional no existe reglamentación, en la región la comercialización de

semen se basa en las resoluciones del Mercosur.
Para comercializar dentro de éste, hay que estar registrado y habilitado, como
Centros de colecta y procesamiento de semen de toros, por el Ministerio de
Ganadería, Agricultura y Pesca (MGAP) a través de la Sección Reproducción de la
Dirección de Laboratorios Veterinarios DILAVE “Miguel C. Rubino”
A continuación se amplía la reglamentación antes mencionada:

A) Marco regulatorio para el tratamiento de la genética animal de bovinos,

caprinos, ovinos, équidos y porcinos en el MERCOSUR

Estándares biotecnológicos mínimos para la comercialización de material seminal en

el ámbito del Mercosur:

1) Volumen de la dosis: 0,25 ml

2) Porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales con movimiento

progresivo al descongelado mayor al 30%.

3) Vigor mayor a 3

4) Numero de espermatozoides morfológicamente normales con movimiento

progresivo al descongelado mayor a 6 millones, sugiriéndose un mínimo de 10
millones. Para las dosis con 6 a 10 millones de espermatozoides, el número total de
anormalidades espermáticas no será superior al 20% y los defectos mayores, no
mayor al 10%. Para dosis superiores a 10 millones de espermatozoides normales
con motilidad progresiva, el número total de espermatozoides anormales no será
mayor al 30%, defectos mayores y menores del 20%.

B) Requisitos zoosanitarios para el intercambio entre los estados partes de

semen bovino y bubalino

SOBRE EL ESTADO PARTE DE ORIGEN:

Artículo 21.- El Estado Parte exportador deberá estar libre de Peste Bovina,
Pleuroneumonía Contagiosa Bovina, Dermatosis Nodular Contagiosa y Fiebre del
Valle del Rift, de acuerdo con lo establecido en el Código Sanitario de los Animales
Terrestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE).

Artículo 22.- El Estado Parte libre de Fiebre Aftosa con o sin vacunación, en todo su
territorio o en una región del mismo, reconocido por la OIE o por el Estado Parte
importador, certificará esta condición.

91
El Estado Parte exportador, que no sea libre de Fiebre Aftosa, en todo su territorio o
en una región del mismo, podrá acordar con el Estado Parte importador garantías
adicionales compatibles con las recomendaciones del Código Sanitario de los
Animales Terrestres de la OIE.

LOS ANIMALES

Artículo 23.- Sólo podrán ingresar al CCPS animales nacidos y criados

ininterrumpidamente en el Estado Parte exportador, o animales que hayan ingresado
al Estado Parte exportador cumpliendo lo establecido en las normas del
MERCOSUR relativas a los requisitos zoosanitarios para el intercambio de bovinos y
bubalinos. En este caso, deberán haber permanecido en el Estado Parte exportador
como mínimo 60 (sesenta) días antes de la fecha de la primera colecta.

Los animales importados desde terceros Estados deberán haber permanecido en el

Estado Parte exportador como mínimo 60 (sesenta) días antes de la fecha de la
primera colecta.

Artículo 24.- El CCPS deberá comunicar inmediatamente al Servicio Veterinario

Oficial del respectivo Estado Parte las bajas de todo animal, informando el motivo de
la baja, el número de registro del animal, el número de dosis de semen en existencia
y la fecha de colecta.

Todo animal bajo sospecha de enfermedad infecciosa transmisible por el semen

deberá ser aislado. El hecho deberá ser comunicado inmediatamente al Servicio
Veterinario Oficial. Las dosis de semen del referido animal, no podrán ser
comercializadas hasta la confirmación de su diagnóstico por un Laboratorio Oficial.
El destino del semen almacenado será determinado por el Servicio Veterinario
Oficial.

Artículo 25.- Los animales residentes, que por cualquier motivo salieran del CCPS,
deberán cumplir con la cuarentena de ingreso para reingresar al mismo.

PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO

Artículo 26.- Además de las pruebas mencionadas en la presente Resolución,

podrán ser acordados, entre el Estado Parte importador y el Estado Parte
exportador, otros procedimientos y pruebas de diagnóstico que presenten garantías
equivalentes para el intercambio de semen bovino y bubalino.

PROCEDIMIENTOS ZOOSANITARIOS PREVIOS AL INGRESO A LA

CUARENTENA

Artículo 27.- Para ingresar al CCPS los animales deberán estar acompañados de un
certificado zoosanitario, expedido por el Veterinario Oficial o responsable del CCPS,
donde conste que en el establecimiento de origen no hubo ocurrencia de
enfermedades transmisibles por el semen que afecten a la especie en los últimos 90
(noventa) días y que las pruebas de diagnóstico realizadas a los animales obtuvieran
resultados negativos para las siguientes enfermedades:

92
a. TUBERCULOSIS - Prueba intradérmica simple con PPD bovina o comparada con
PPD bovina y aviar.

b. BRUCELOSIS – Antígeno Acidificado Tamponado (BBAT/BPA) / Rosa de

Bengala. Los animales positivos serán sometidos a Fijación de Complemento (FC) o
2-mercaptoetanol o Test de ELISA.

PROCEDIMIENTOS ZOOSANITARIOS EN LA CUARENTENA

Artículo 28.- Con respecto a la Estomatitis Vesicular los animales que ingresen al
centro deberán cumplir con lo establecido en los capítulos correspondientes del
Código Sanitario de los Animales Terrestres de la OIE.

Artículo 29.- Los animales deberán ser mantenidos en cuarentena durante un

período mínimo de treinta (30) días, pudiendo ingresar al rebaño residente después
de haber obtenido resultado negativo a las siguientes pruebas:

1. BRUCELOSIS – Antígeno Acidificado Tamponado (BBAT/BPA) / Rosa de

Bengala. Los animales positivos serán sometidos a Fijación de Complemento (FC) o
2-mercaptoetanol o Test de ELISA.

2. TUBERCULOSIS: prueba intradérmica simple con PPD bovina o comparada con

PPD bovina y aviar. Esta prueba solamente podrá ser realizada después de los 60
(sesenta) días de la última prueba realizada.

3. CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA: 4 (cuatro) pruebas negativas de

cultivo de material prepucial, realizadas a intervalos de 7 (siete) días, o una prueba
de imunofluorescencia.

4. TRICHOMONIASIS: 4 (cuatro) pruebas negativas de cultivo de material prepucial,

realizadas a intervalos de 7 (siete) días.

5. DIARREA VIRAL BOVINA (BVD): prueba de aislamiento e identificación por

técnica de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa en muestras de sangre total. Se
realizarán 2 (dos) pruebas. Si la primera arrojara resultado positivo se repetirá la
prueba con un intervalo mínimo de 14 (catorce) días. Si el resultado de la segunda
prueba fuera negativo dicho animal será autorizado para ingresar al CCPS.

PROCEDIMIENTOS ZOOSANITARIOS PARA EL RODEO RESIDENTE

Artículo 30.- Los animales residentes serán sometidos a pruebas de diagnóstico

cada 180 (ciento ochenta) días, que deberán presentar resultado negativo, a las
siguientes enfermedades:

1. BRUCELOSIS – Antígeno Acidificado Tamponado (BBAT/BPA) / Rosa de

Bengala. Los animales positivos serán sometidos a Fijación de Complemento (FC) o
2-mercaptoetanol o Test de ELISA.

2. TUBERCULOSIS: prueba intradérmica simple con PPD bovina o comparada con

PPD bovina y aviar.

93
3. CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA: un cultivo de material prepucial o
una prueba de imunofluorescencia (IF).

4. TRICOMONIASIS: un cultivo de material prepucial.

Artículo 31.- Los animales residentes, cuyo semen va a ser destinado a exportación,
serán sometidos además a pruebas de diagnóstico que deberán presentar resultado
negativo a las siguientes enfermedades:

a. RINOTRAQUEITIS INFECCIOSA BOVINA (IBR): prueba de seroneutralización o

Test de ELISA realizada como mínimo 21 (veintiún) días después de la colecta; o
someter una muestra de 0,5 ml de semen procesado de cada partida a una prueba
de aislamiento viral o prueba de PCR.

b. LENGUA AZUL (LA): una prueba de inmunodifusión en gel de agar o Test de

ELISA, realizada 40 (cuarenta) días después de la última colecta; o muestras de
sangre total del animal dador colectadas cada 14 (catorce) días sometidas al test de
aislamiento viral en huevos embrionados o a la prueba de PCR de semen, o someter
una muestra de 0,5 ml de semen procesado de cada partida a una prueba de PCR.

c. LEUCOSIS BOVINA ENZOOTICA (LBE): prueba de inmunodifusión en gel de

agar o Test de ELISA en una muestra de suero obtenida como mínimo 30 (treinta)
días después de la última colecta de semen; o someter una muestra de 0,5 ml de
semen procesado de cada partida a una prueba de PCR.

d. DIARREA VIRAL BOVINA (DVB): se exige prueba de ELISA captura de

antígenos.

Artículo 32.- Los animales residentes que obtuvieran resultados positivos para las
enfermedades mencionadas en este capítulo, deberán ser aislados y reevaluados
por el Servicio Veterinario Oficial del respectivo Estado Parte, que determinará el
destino de los animales.

Artículo 33.- No será necesaria la realización de las pruebas de diagnóstico

correspondiente a las enfermedades mencionadas en el artículo 31, cuando el
Estado Parte exportador se encuentre libre de alguna de ellas, en todo su territorio o
en una región del mismo, en virtud de un reconocimiento de la OIE o del Estado
Parte importador.

En este caso, el Estado Parte exportador deberá certificar dicha condición y además
que el CCPS cuenta con certificación oficial de establecimiento libre, emitido por el
Servicio Veterinario Oficial del Estado Parte respectivo, en el marco de un programa
nacional de erradicación.

SEMEN

Artículo 34.- El semen deberá ser colectado y procesado de acuerdo a lo establecido

en el Código Sanitario de los Animales Terrestres de la OIE.

94
Artículo 35.- El semen será almacenado por un período de 45 (cuarenta y cinco) días
a partir de la colecta en las instalaciones del CCPS.

Artículo 36.- Para el intercambio entre los Estados Partes, el semen bovino y
bubalino deberá estar acompañado del “Certificado Zoosanitario para el intercambio
entre los Estados Partes de semen bovino y bubalino”, conforme al modelo que
consta como anexo II de la presente Resolución.

Dicho certificado deberá estar firmado por el Veterinario responsable del CCPS y
refrendado por el Veterinario del Servicio Oficial del Estado Parte exportador.

Todas las hojas del certificado deberán estar numeradas secuencialmente, sellada y
rubricadas por el Veterinario del Servicio Oficial del Estado Parte exportador.

95
ANEXO II

Encuesta a LABORATORIOS DE PROCESAMIENTO DE SEMEN (LPS) BOVINO

EN URUGUAY

En caso que se pregunte sobre algo que usted no realiza, puede optar según crea
conveniente por responder con un NO o simplemente no lo conteste. En caso de
querer realizar observaciones o especificaciones sobre algún punto, siéntase libre de
hacerlo donde lo crea conveniente.

1) Sobre la colecta

a) Régimen de colecta ¿Cuantos días por semana y saltos por día se realizan?

b) ¿Método de colecta más frecuente?: Ej. vagina artificial, electroeyaculador o

masaje rectal.

2) Evaluación del semen fresco

Contestar en caso que se haga extracción de toros donantes y se realicen pruebas

sobre el semen previo a la congelación. Si quiere realizar observaciones o
especificaciones sobre algún punto, siéntase libre de hacerlo donde lo crea
conveniente.

a) ¿Cuáles de las siguientes pruebas macroscópicas realiza y sobre éstas que

parámetros considera aceptable? (Especificar escala utilizada)

Volumen: ______
Color: ______
Densidad: ______
Motilidad en masa: ______
pH: ______
Cuerpos extraños: ______
Schalm test (CMT): ______

b) Sobre las siguientes pruebas microscópicas, ¿en caso de realizarlas que valor
o porcentaje según el caso considera aceptable para congelar? (Especificar escala
utilizada)

Motilidad en masa microscópica:

Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________

Motilidad individual:
Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________
¿Cual/es diluyentes utiliza? __________
¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Microscopio óptico, Fotomicrografía o
Videomicrografía, Contraste de fase, CASA): __________

96
 Vigor:
Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________

Concentración:
Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________
¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Hematocitómetro, Colorímetro,
Espectrofotómetro o CASA): __________

Coloración post vital:

Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________
¿Cuál es la tinción que utilizan? (ej.: Eosina-nigrosina o Fluorocromos): __________

Morfología:
Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________
¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Giemsa, Contraste fase, Tinción vital o
Glutaraldehído): __________

Integridad del Acrosoma:

Valor / % mínimo de acrosoma aceptado para congelación: ___________
¿Cuál es la metodología empleada?: ____________

Otras pruebas sobre semen fresco? ¿Cuáles?: ___________

Valor / % mínimo aceptado para congelación: __________

3) Evaluación del semen al descongelado

En caso de querer realizar observaciones o especificaciones sobre algún punto,
siéntase libre de hacerlo donde lo crea conveniente.

Pruebas microscópicas:

Test de termorresistencia:
Temperatura: __________
Tiempo: __________
Valor / % mínimo aceptado para la prueba de morfología aplicando el tiempo y
temperatura indicados: __________

Motilidad individual:
Valor / % mínimo aceptado: __________
¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Citrato de Na, suero fisiológico,
fotomicrografía, videomicrografía, espectrofotometría o CASA): __________

Vigor:
Valor / % mínimo aceptable: __________

Morfología:
¿Cuál es el sistema que utiliza para clasificar las malformaciones?: __________
Valor / % máximo aceptable de spz anormales: __________
Valor / % máximo de acrosomas alterados: __________

97
 Concentración:
Valor / % mínimo aceptado: __________
¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Hematocitómetro, colorímetro o
espectrofotómetro): __________

Test de integridad de membrana:

¿Cuál es la metodología empleada? (ej.: Test de resistencia osmótica): __________

Otras pruebas sobre semen congelado ¿Cuáles?: ___________

Valor / % mínimo aceptado para utilización: __________

¿Evalúan rutinariamente todas las partidas congeladas?

4) A futuro

a) ¿Considera que hay necesidad de estandarizar las pruebas de evaluación de la

calidad de semen fresco y congelado?

b) ¿Tiene pensado incorporar a futuro, alguna técnica o equipo para evaluar el

semen?

98