UT 11
SECUENCIACIÓN
DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
¿ Qué es la
secuenciación?
Determina la secuencia de bases
nitrogenadas ( A, T, C y G) en un fragmento
de ADN.
Se inicia en el extremo 5´ y termina en el 3´
¿ Qué es la
secuenciación?
Esto se ha concretado en el proyecto
Genoma Humano.
[Link]
abj6987
[Link]
Evolución
Secuenciación Secuenciación
Sanger.
Gracias a la PCR y
automática
electroforesis de 2ª Secuenciación de
Técnicas automatizada y generación una única molécula
manuales marcadores
(NGS) de ADN
fluorescentes
Reacciones
Secuenciación Nuevas Equipos de 3ª
metodologías
químicas o automática enzimáticas generación
enzimáticos (Maxam de 1ª [Link].
y Gilbert y Método Pirosecuenciación
Graham) generación
CONTENIDOS
1. 2. 3.
Método químico Métodos
Secuenciación a
de Maxam y enzimáticos
gran escala
Gilbert (Método Sanger)
4. 5.
NGS ( Next Secuenciación de
Generation tercera
Sequencing) generación
1.
Método químico de
Maxam y Gilbert
Fundamento
Permite secuenciar fragmentos cortos de ADN.
Para ello son necesarias grandes cantidades de
ADN purificado.
Mediante esta técnica, se marca con un
radioisótopo (𝑃32 ) el extremos que se va a
secuenciar (para poder revelarlo después).
Seguidamente se somete a reacciones químicas
que producen cambios en las bases
nitrogenadas, lo que permite su diferenciación
Fundamento
A continuación, se añade piperidina, que rompe
el fragmento de ácido nucleico justo después de
la base modificada químicamente.
En cada tubo se obtendrán múltiples fragmentos
de diferente longitud, pero todos con el mismo
tipo de base modificada en el extremo.
Con una electroforesis se ordenan los
fragmentos.
Se hará autorradiografía del gel
Fundamento
Fundamento
[Link]
_B5Dj8PL4E0
2.
Métodos
enzimaticos
Método Sánger
Utiliza una polimerasa y unos
inhibidores ddNTP( nucleótidos que al
incorporarse, finalizan la cadena que
se ha sintetizado en unos lugares
específicos)
Se utiliza para fragmentos cortos de
ADN monocatenario.
Método Sanger
Los ddNTP, carecen del grupo
3´-OH, por lo que la
polimerización se detendrá
en ellos, al no poder añadir la
polimerasa otro dNTP
a continuación.
Método Sanger
En cada tubo de trabajo habrá:
➢ Hebra molde de ADN
➢ Cebador
➢ ADN polimerasa
➢ Los 4 dNTP
➢ Uno de los 4 ddNTP
Pasos
1 3
Polimerización
Autoradiografía
En 4 alicuotas (una por
base) se realizan 4 en gel
polimerizaciones. Uno de Para visualizacion del
patron de bandas
4
los 4 ddNTP está en una
concentración 200 veces
menor
2 Análisis
De la autorradiografía
Electroforésis
Se desnaturaliza la doble
hélice y se separan por
tamaño
Fundamento
[Link]
FvHRio1yyhQ
[Link]
=oeJoTZCRrvU&t=237s
Fundamento
Fundamento
[Link]
oeJoTZCRrvU
[Link]
NEu0mO-2ras
Mejoras del método Sánger.
Secuenciación de 1ª generación
Se utilizan marcadores fluorescentes que
agilizan el revelado (solo hace falta luz UV)
Además, mediante los secuenciadores
automáticos de 1ª generación, se
automatiza la electroforesis y la detección
y análisis de las bandas.
Variación de la técnica
Cada ddNTP está marcado con una
molécula fluorescente diferente, por lo que
permite que la reacción se realice en un solo
tubo.
Se realiza una nested PCR, para aumentar la
sensibilidad del proceso.
Variación de la técnica
El análisis de resultados puede realizarse también
mediante una electroforesis capilar o en un gel
de poliacrilamida. Se utiliza un láser que excita el
fluoróforo. Resultando en un electroferograma
3 .
Secuenciación a gran
escala
En las secuenciaciones
a gran escala se
pueden incluso
secuenciar genomas
completos.
Para ello se utilizan
técnicas de
clonación.
La principal dificultad es ordenar los
fragmentos obtenidos y asignar su
posición en el genoma.
Para ello se pueden utilizar 2 técnicas.
3.1 3.2
Paseo cromosómico Shotgun
3.1 Paseo cromosómico
Con sondas de
hibridación, que
coinciden con n
extremo de un
En el interior de inserto y un extremo
plásmidos o del siguiente, de
Fragmentos cósmidos, que se Biblioteca modo que se
introducen en solapen
superponibles bacterias genómica
Clonado de Con los fragmentos Paseo
Digestión meidante los como insertos.
enzimas de Se secuencia cada cromosómico
restricción fragmentos inserto
3.1 Paseo cromosómico
Permite definir la posición del gen en un
fragmento largo de ADN.
En la actualidad no se realiza por su elevado
coste
3.2 Método Shotgun
Se secuencia varias veces la
molécula original.
Posteriormente se rompe el
genoma en fragmentos mas
pequeños de forma aleatoria
Se clonarán en bacterias
para obtener la librería genética.
Un programa busca coincidencias
en las secuencias que se solapen y
las ordena.
3.2 Método Shotgun
3.2 Método Shotgun
3.2 Método Shotgun
4. NGS ( Next Generation Sequencing)
o secuenciación de 2ª generación o
secuenciación masiva
[Link]
4. NGS ( Next Generation Sequencing)
Hasta hace unos 8 años, el método utilizado
era el Sanger.
Con las nuevas tecnologías se automatizan
los procesos.
Se prepara el ADN a clonar (molde)
Se secuencia
Se analizan los datos
4. NGS ( Next Generation Sequencing)
4. NGS ( Next Generation Sequencing)
Secuenciación por
PIROSECUENCIACIÓN
Terminación Reversible
-emPCR
Cíclica (CRT)
[Link]
Aah8QI3Q [Link]
m/watch?v=BimurK8vlY
[Link] cç
S1v6VL0Q
4.1 PIROSECUENCIACIÓN
Producción de bioluminiscencia, producida por
reacciones enzimáticas, simultaneas a la adición de
nucleótidos a una cadena en amplificación
Fragmentación Amplificación
Para su unión a
ADN las esferas en esferas
Añadir PCR Cargar la esfera en el
convencional
adaptadores en la
Pico Titer Plate
microesfera En cada pocillo cabe una esfera.
Se añaden enzimas para detectar
la incorporación del nucleótido
4.1 PIROSECUENCIACIÓN
Cada nucleótido incorporado libera
pirofosfato (PPi) que desencadena la
cascada de la sulfurilasa y luciferasa,
resultando en una emisión de luz
proporcional al número de nucleótidos
incorporado.
4.1 PIROSECUENCIACIÓN
ADICIÓN DE UN Se libera un ion pirofosfato
NUCLEÓTIDO
SULFURILASA Genera ATP, en presencia
del ion pirofosfato
LUCIFERASA Se transforma en
oxiluciferina en presencia
de ATP, emitiendo Luz
4.1 PIROSECUENCIACIÓN
[Link]
=wY8to-_zAEo
4.2 SECUENCIACIÓN POR TERMINACIÓN
REVERSIBLE CÍCLICA (CRT)
Es la mas extendida. Es capaz de secuenciar el genoma
humano en 30 horas.
Fragmentación
PCR puente
ADN
PCR en soporte Adición de nucleótidos
Añadir con primers fluorescentes
adaptadores complementarios a bloqueados
los adapatadores
Actúan como terminadores de
cadena, pero reversibles. Se mide
la fluorescencia emitida con cada
adición de un dNTP
Fundamento
[Link]
watch?v=womKfikWlxM
[Link]
watch?v=fCd6B5HRaZ8
4.3 Otras técnicas: Ion Torrent
Es similar a la técnica de
pirosecuenciación, pero utiliza un
medidor de pH para detectar la
incorporación de nucleótidos
[Link]
m/watch?v=zBPKj0mMc
Dg
5. Secuenciación de 3ª generación
Las secuenciaciones de NGS utilizan PCR.
En las secuenciaciones de 3ª generación,
eliminan la fase de amplificación, por lo que
secuencian sobre sola molécula.
Secuenciación Single Molecule Real
5.1 por nanoporos
5.2 Time Sequencing
(SMRT)
5.1 Secuenciación por nanoporos
Se utilizan biosensores. No se utiliza PCR
Cada biosensor, posee una membrana lipídica, que es atravesada por un
nanoporo. Se aplica una corriente iónica, que es detectada por un electrodo.
Cualquier alteración en el flujo será medida. La magnitud es característica de
cada sustancia, lo que permite su identificación.
[Link]
85JHLmnI
[Link]
Rm5AoZGw
5.2 Single Molecule Real Time Sequencing
(SMRT)
En este caso, cada dNTP posee un fluróforo específico, que es liberado cuando la
DNA polimerasa lo añade a la cadena de la doble hélice.
Esto se realiza mediane la Guia de ondas modo cero (ZMW); son unos
nanopocillos, son un software que permite la observación e interpretación de la
emisión de las distintas fluorescencias en función de la base añadida
[Link]
D8JyAbwEo
[Link]
[Link]
HCJ8PtYCFc
5.2 Single Molecule Real Time Sequencing
(SMRT)
Requiere de grandes cantidades de
ADNpara poder ofrecer un resultado
sólido, ya que no amplifica, por lo
que no es apto para un proyecto de
secuenciación del genoma
completo
