UT 9

REACCIÓN EN
CADENA DE LA
POLIMERASA
PCR
 BASES DE LA
01 PCR

PCR
02 CONVENCIONAL
PCR A
03 TIEMPO REAL
 01 BASES DE LA PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

permite amplificar in vitro, de forma exponencial
una muestra de ADN, obteniendo millones de copias
de un fragmento concreto (amplicones).
Para ello es necesario conocer una porción de la
secuencia que queremos amplificar, de modo que
podemos realizar sucesivas replicaciones.
 La PCR permite:

→ Amplificar varios fragmentos en un proceso → PCR múltiple

→ Amplificar ARN utilizando la transcriptasa inversa → RT-PCR

→ Cuantificar la cantidad presente en una muestra de una

molécula concreta → qPCR o PCR real time
 La PCR permite:

→ Ahorrar tiempo al amplificar un fragmento (es más rápido que

el uso de un vector de ADN recombinante, que requiere
cultivo)
→ A la hora de detectar la presencia de una muestra, necesita
menores cantidades que otras técnicas.
Al ser una técnica tan sensible, es muy fácil
que se produzca contaminación.

Por ello debe tenerse muy en cuenta:

► El diseño del laboratorio

► El flujo del trabajo
► Los procedimientos de trabajo
 APLICACIONES

PRONÓSTICO
DIAGNÓSTICO MUTAGÉNESIS
De enfermedades

EVOLUCIÓN MEDICINA
FORENSE
GENOTIPADO
 EN QUÉ
CONSISTE
 PROCESO
Está realizado por una ADN polimerasa (Taq polimerasa), que realiza
un proceso de replicación del ADN.

Se trabaja por ciclos

Las copias obtenidas en cada ciclo, sirven de molde para ciclos

posteriores. Por ello, se produce un aumento exponencial de las
moléculas replicadas.
PROBLEMAS Y SU SOLUCIÓN

SE DISEÑAN
CEBADORES
ESPECÍFICOS
PARA EL
DEBEMOS FRAGMENTO
ASEGURARNOS QUE SE QUIERE
DE QUE SE AMPLIAR
REPLICA
ÚNICAMENTE EL
FRAGMENTO DE
INTERÉS
PROBLEMAS Y SU SOLUCIÓN

SE UTILIZAN ADN
POLIMERASAS
OBTENIDAS DE
MICROORGANISMOS
QUE VIVEN EN
DEBIDO AL CONDICIONES
AUMENTO DE Tª EXTREMAS
PARA
DESNATURALIZAR
EL ADN, LA ADN
POLIMERASA SE
INACTIVA
 QUÉ NECESITAMOS

CADENA ADN POLIMERASA

AND MOLDE TERMOESTABLE

OLIGONUCLEÓTIDOS DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS
(PRIMERS o
CEBADORES)
OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS o CEBADORES)
Son oligonucléotidos ( monocatenarios) de cadena conocida y
COMPLEMENTARIA a secuencias de inicio ( o fin) del fragmento que se
quiere amplificar.
Se crean por parejas y complementan en cadenas opuestas

5´ 3´

CEBADOR R
FRAGMENTOS A AMPLIFICAR 3´ 5´
5´ 3´
CEBADOR F
3´ 5´
El cebador F (Forward) se una a la hebra molde que se encuentra en sentido 3´→5 ´
El cebador R (Reverse) se una a la hebra molde que se encuentra sentido 5 ´→ 3´

RECORDAMOS: La ADN polimerasa NO ES CAPAZ DE INICIAR DE NUEVO

UNA CADENA, sino que alarga una ya existente.

Para que esta amplificación se circunscriba a la zona que deseamos, esta

debe ser una secuencia única en el ADN
Lo ideal es que la secuencia de bases de los cebadores sea de entre 18-30
bases ( recordemos que menos de 15 hibridan de forma inespecífica).

CUANTO MAYOR ES EL
TAMAÑO DEL PRIMER, CUANTO MAYOR ES EL
MÁS DIFICL SERÁ QUE PRIMER, MENOR
ENCUENTRE UNA POSIBILIDAD HAY DE
ZONA QUE HIBRIDE EN UN
COMPLEMENTARIA LUGAR EQUIVOCADO

Se debe tener cuidado de que los cebadores no puedan

hibridar entre sí.
 ACTIVIDAD a 70º-75ºC
ADN POLIMERASA TERMOESTABLE ESTABLES a 95ºC

Para que el cebador se pueda unir, es necesario que la cadena sea

monocatenaria, por lo que al inicio de cada ciclo, debe producirse la
desnaturalización de las cadenas previamente creadas.
Al principio se añadían nuevas ADN polimerasas al inicio de cada ciclo
(lo que lo hacía más lento y costoso). Posteriormente se encontraron
ADN polimerasas termoestables, que no se degradaban con la
temperatura.
Catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5´→3´, siempre
en presencia de iones Magnesio ( cofactor de la reacción)
ADN POLIMERASA TERMOESTABLE

Tipos de ADN polimerasa:

• Exonucleasa 5´→3´ SIN actividad exonucleasa 3´ →5´: No tienen

capacidad de corrección de errores
• Exonucleasas 5´→3´ CON actividad exonucleasa 3´ →5´: CON
capacidad para corregir errores. MUY ÚTILES EN PCR
• Actividad trancriptasa inversa: Utilizan ARN como molde. Permiten
sintetizar ADNc a partir de ARN
 02 PCR CONVENCIONAL

Es la PCR más simple. En ella se amplifica un único

fragmento de ADN, utilizando sólo 2 cebadores y en un solo
proceso de amplificación

¿Qué elementos tiene la mezcla de la reacción?

¿cómo se programa el termociclador?
¿cómo se interpretan los resultados?
 02 PCR CONVENCIONAL
Mezcla de la reacción

Tampón TRIS que 𝑀𝑔𝐶𝐿2 dNTP

tampona entre 7-9
( pH fisiológico de
la mayoría de los
seres vivos) en el cebadores
que se disuelven
5 elementos ADN ADN
polimerasa
molde
 02 PCR CONVENCIONAL
Mezcla de la reacción
Iones Magnesio: necesarios para el funcionamiento de la ADN
polimerasa termoestable. Si ↓ se inactiva y si ↑ el proceso es
𝑀𝑔𝐶𝐿2 menos fiable

ADN Debe elegirse en función del tipo de fragmento ( su longitud) y

polimerasa de la fidelidad requerida
 02 PCR CONVENCIONAL
Mezcla de la reacción
La concentración de cada elemento de la pareja es la misma
Cebadores

Mezcla de los 4 desoxirribonucleótidos en forma trifosfato.

Todos en la misma concentración.
dNTP

ADN Debe tener la calidad necesaria, de alto grado de integridad (sin

fragmentar y sin mellas), cociente 𝐴260 / 𝐴280 entre 1,7 y 2,0 y
molde sin contaminantes
02 PCR CONVENCIONAL
Mezcla de la reacción
En ocasiones es necesario añadir
aditivos o potenciadores, si el
Otros rendimiento de la PCR no es el
elementos
adecuado (por la presencia de
contaminantes por ejemplo) ya sea
para Disminuir la Tm, o para
estabilizar la polimerasa o para
bloquear inhibidores.
02 PCR CONVENCIONAL
Preparación de las muestras

Ajustar el
Mezcla
volumen de
Master
reacción

Controles
positivo y
negativo
 02 PCR CONVENCIONAL
Preparación de las muestras

Ajustar el Se debe determinar el volumen final de la reacción y en

volumen de consecuencia, calcular los componentes que
necesitaremos. El volumen final suele ser de 25 o 50 μl.
reacción

Para no cometer errores de pipeteo en cada reacción,

Mezcla
se crea una mezcla con todos los componentes (excepto
Máster el ADN molde), a partir de la cual se tomará la cantidad
necesaria para cada tubo de reacción y después se
añade el ADN molde para realizar la PCR.
 02 PCR CONVENCIONAL
Preparación de las muestras

CONTROL POSITIVO: Tubo con mezcla máster al que

Controles se añade el fragmento que se quiere amplificar
positivo y
negativo CONTROL NEGATIVO: Tubo con mezcla máster al que
se añade agua destilada grado PCR en lugar de ADN.
02 PCR CONVENCIONAL
Preparación de las muestras
Ejemplo de Mezcla Master

Reactivo Volumen/tubo
Si utilizamos 11 tubos
Tampón 10x 5 µl 55 µl
MgCl2 50mM 1,5 µl 16,5 µl
dNTPs 10mM 4 µl 44 µl
Cebador F (20pmol/ µl) 1 µl 11 µl
Cebador R (20pmol/ µl) 1 µl 11 µl
Tap Polimerasa 2,5 U/ µl 0,5 µl 5,5 µl
Agua estéril mQ 36 µl 396 µl

Se calcula un tubo más, para asegurar que no falte (10+1). EL volumen total de la
mezcla es de 49 µl, por lo que solo faltará añadir 1µl de ADN
 02 PCR CONVENCIONAL
Programación del termociclador
El termociclador es el aparato en el que tiene lugar la PCR. Se pueden programar
diferentes ciclos con temperaturas y tiempos de incubación determinados. la
programación incluye 3 pasos:
→ Desnaturalización inicial: Se calienta la preparación a 95 °C varios minutos, para
que se produzca la desnaturalización del ADN
→ Ciclos de replicación: En las que se llevan a cabo las fases de desnaturalización e
hibridación de cebadores (annealing) y extensión (replicación). Se programa el nº de
veces que se va realizar este paso (nº de ciclos)
→ Extensión final: Termina la PCR . durante unos minutos (5-10) se incuba para
asegurar que todos los productos están completos y en forma de doble hélice
→ Mantenimiento: Sin límite de tiempo y a 4ºC. para mantener las muestras hasta que
se retiren para ser analizadas
 02 PCR CONVENCIONAL
Programación del termociclador
→ Ciclos de replicación: Van a depender del fragmento a amplificar. Cuanto más
abundante sea, menos ciclos serán necesarios. Si se realizan más de 40 ciclos, se
aumentan las posibilidades de productos no deseados.
 VIDEOS

[Link]

[Link]

[Link]
 02 PCR CONVENCIONAL
Análisis de los productos amplificados
Para valorar los resultados obtenidos en la PCR se
realiza una electroforesis en gel de agarosa. Si el
proceso ha sido correcto, se mostrará solo una banda
amplificada; si aparecen más bandas querrá decir que se
han amplificado productos no deseados o que se ha
realizado de manera inespecífica. Por tanto deberá
repetirse la reacción cambiando la composición de la
mezcla o la programación del termociclador, hasta lograr
una sola banda en la electroforesis.
 02 PCR CONVENCIONAL
Análisis de los productos amplificados
Resultado positivo de la PCR
Si se ha realizado la PCR para detectar una secuencia, el
hecho de que aparezca una banda específica ya permite
confirmar la presencia de la secuencia diana. Siempre debe
aparecer limpio el carril del control negativo, para
asegurar que esa banda positiva no es contaminante.
 02 PCR CONVENCIONAL
Análisis de los productos amplificados
Resultado negativo de la PCR

El hecho de que no aparezca una banda específica indica,

en principio, que la muestra no tiene ese ADN. No
obstante siempre se realiza un control positivo de la
técnica, dado que la ausencia de una banda puede deberse
a que haya fallado la técnica (por alteración en la mezcla
máster por ejemplo). Por tanto siempre debe verse una
banda del control positivo.
02 PCR CONVENCIONAL
Variantes

La PCR convencional se utiliza con fines diagnósticos; existen

variantes de la PCR convencional con diferentes particularidades

02.1 PCR Con inicio en caliente – Hot start PCR

02.2 PCR de grandes fragmentos
02.3 PCR de alta fidelidad
02.4 PCR anidada –Nested PCR
02.5 PCR múltiple –Multiplex PCR
02.6 PCR con transcripción inversa – RT PCR
 02.1 PCR con inicio en caliente
Hot start PCR
Cuando se está procesando la
muestra, hasta que se alcanza la
temperatura de desnaturalización
la primera vez, se pueden formar
productos no deseados debido a
uniones de los cebadores.
Para evitar esto existe la PCR
con inicio en caliente, que evita
que la ADN polimerasa trabaje a
bajas temperaturas.
 02.1 PCR con inicio en caliente
Hot start PCR
Se realizaron varios modelos previos pero en la actualidad
el método más especializado consiste en unir la ADN
polimerasa a un anticuerpo o algún elemento químico
que la inactive. este anticuerpo (o el elemento químico) es
termolábil, es decir, se destruyen por el calor. Por lo que
hasta que no se produce un ciclo a alta temperatura no
desaparecen y la ADN polimerasa no puede trabajar .
 02.2 PCR De grandes fragmentos

La PCR convencional está optimizada para fragmentos de 3,5 kb. Si se

trabaja con fragmentos más grandes de 5 kb es menos eficaz,
apareciendo polímeros erróneos o incluso deteniéndose la
polimerización.
Con esta PCR de grandes fragmentos, se pueden amplificar fragmentos
de hasta 35 kb, mediante una modificación de la mezcla máster y la
programación del termociclador.
La parte más importante es la modificación de la mezcla máster en la
que se incluyen dos polimerasas: una en una mayor concentración, que
no tiene actividad exonucleasa, y otra minoritaria con actividad
exonucleasa 3´→ 5´.
 02.3 PCR de alta fidelidad

Se utiliza en casos de expresión génica o clonación.

Se realizan en condiciones especiales para evitar que se produzcan
mutaciones en los amplicones.

Se utilizan Se ajusta la
ADN concentración de Se ajusta el pH
de la mezcla
polimerasas iones magnesio (Algunas enzimas funcionan
(niveles elevados disminuyen mejor a pH alto y otras a pH
con actividad la efectividad y fidelidad de bajo)
las polimerasas)
correctora
 02.4 PCR anidada-Nested PCR

En esta técnica se realizan dos PCR . De modo que la segunda PCR

utiliza los productos que ha amplificado la primera. Así se aumenta la
sensibilidad y la especificidad del proceso.

➢ En la primera PCR se amplifica un fragmento de mayor longitud que

la región que nos interesa amplificar, Para ello se diseñan unos
cebadores denominados externos, dado que están fuera de la
región de interés .

➢ En la segunda PCR se diseñan cebadores que se denominan

internos porque hibridan en el interior del fragmento que se ha
amplificado en la primera vez.
 02.4 PCR anidada-Nested PCR

Por tanto la muestra

que se amplifica en la
segunda PCR ha sido
obtenida en la
primera PCR .
 02.5 PCR múltiple- Multiplex PCR

En este caso se amplifican de forma simultánea varias secuencias diana

en un mismo ciclo de PCR. Para ello deben crearse diferentes juegos de
cebadores para las diferentes regiones. Estos de cebadores deben
cumplir unas características:
❑ Deben hibridar a la misma temperatura, dado que se programa una
temperatura concreta para el ciclo.
❑ No pueden hibridar unos con otros ( formando dímeros u otras
formaciones )
❑ Los resultados generados (o amplicones) deben tener un tamaño que
permita diferenciarlos por electroforesis y visualizarse de forma
individual (tamaños diferentes)
 02.6 PCR con transcripción
inversa- RT PCR

Con este tipo de PCR se pueden

amplificar secuencias de ARNm. En
primer lugar se debe sintetizar un
ADNc, mediante la transcriptasa
inversa. A continuación se utilizará
una ADN polimerasa que utilizará
ese ADNc como molde y lo
amplificará.
 03 PCR a tiempo real- (QTR PCR)

▪ En las PCR que hemos visto hasta ahora no

se conoce el resultado hasta que ha
terminado el proceso. Sin embargo en la PCR
a tiempo real se utilizan productos
fluorescentes que permiten detectar en cada
ciclo los amplicones.
▪ El termociclador incorpora un lector de
fluorescencia.
 03 PCR a tiempo real- ventajas
Se pueden detectar las secuencias diana más rápidamente

Los resultados son más fiables, dado que el material

fluorescente es más sensible que el bromuro de etidio.

Es menos probable que se contamine la muestra dado que,

tanto la amplificación como la detección, se realizan en el
mismo tubo.

Como la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la

cantidad de ADN sintetizado, se puede cuantificar los
amplicones producidos
 03 PCR a tiempo real- cinética de
amplificación

En esta PCR también se

produce una curva sigmoide,
que representa la emisión de
fluorescencia en cada ciclo.
Tiene 3 fases

CT (punto en el que se detecta

por primera vez fluorescencia)
[Link]
 03 PCR a tiempo real- cinética de
amplificación
Fases:

Fase de ruido: serán los primeros ciclos de PCR. El

número de amplicones es muy pequeño y el aparato no los
puede detectar correctamente. La señal aumenta en
proporción a la cantidad de producto de la PCR.
Fase de crecimiento exponencial: abarca 3 o 4 ciclos y es
la fase de creación de amplicones.
Fase de meseta: se reduce el rendimiento en los en los
últimos ciclos de la PCR
 03 PCR a tiempo real- cinética de
amplificación
Comparando el CT con una curva estándar de valores
conocidos podemos determinar la cantidad de ADN en la
muestra del paciente.

Por ejemplo en el caso de una mutación por deleción la

cantidad de ADN sería del 50%

En el caso de una duplicación el ADN presente sería del

150% respecto al control normal
03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
Sistemas de sistemas de
sondas de
detección detección
hidrólisis
independientes específicos de
(TaqMan)
de secuencia secuencia

balizas
moleculares o
Sondas FRET
molecular
beacons
03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones

[Link]
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
Sistemas de Se utiliza un agente fluorescente (SYBR
detección Green I) que se intercala en el ADN de
independientes
de secuencia doble hélice. Por lo tanto, cuando
aumenta la cantidad de ADN aumenta la
fluorescencia.
Inconveniente: baja especificidad, dado
que se une a cualquier molécula de ADN
en doble hélice
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
sistemas de Se utilizan sondas que hibridan de
detección forma específica en una región central
específicos de del amplicón. De este modo la
secuencia fluorescencia solo se corresponde con
productos deseados, por lo que es
más específico.
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
sondas de Estas sondas tienen un fluorocromo que se
hidrólisis denomina notificador (que emite
(TaqMan) fluorescencia), en el extremo 5´ y un
quencher (o bloqueante) en el extremo 3´ que
absorbe la fluorescencia. Esta sonda hibridará
con el ADN monocatenario, de forma
específica en la región central del fragmento a
amplificar al comienzo del proceso. (antes de
realizar la replicación)
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
sondas de Cuando la sonda está entera, el bloqueante
hidrólisis impide la detección de fluorescencia. Cuando la
(TaqMan) ADN polimerasa (con actividad exonucleasa) la
degrada, se puede medir la fluorescencia.
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de amplicones

sondas de
hidrólisis
(TaqMan)
Video explicando 3:

[Link]
ch?v=tWIk6HsbM_8

[Link]
ch?v=ob3teCrpgxY
 03 PCR a tiempo real -sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
balizas Tienen el mismo fundamento que las
moleculares o Taqman, al tener un notificador-emisor en
molecular
beacons posición 5´ y un quencher en posición 3´.
Pero en este caso ambos extremos son
secuencias cortas invertidas, lo que hace
que sean complementarias. La parte central
de la sonda solo complementa con el
fragmento que se amplifica .
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
balizas
moleculares o
molecular
beacons

[Link]
[Link]
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
balizas
Cuando está en forma de bucle no se emite
moleculares o fluorescencia, dado que el quencher bloquea
molecular el fluorocromo. Cuando se une ADN molde y
beacons los extremos quedan suficientemente
separados, se inhibe el bloqueo y se detecta
fluorescencia.
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
Las balizas
balizas moleculares son
moleculares o
capaces de activarse y
molecular
beacons emitir fluorescencia en
presencia del ácido
nucleico diana, lo cual
permitiría detectarlo en
la muestra
[Link]
[Link]
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
En este caso se trata de sondas que hibridan
Sondas en la zona central del amplicon, en regiones
FRET que se encuentran adyacentes. Una sonda
tiene un notificador en la posición 3´y la otra
un quencher en la posición 5´ ( que en este
caso es capaz de emitir fluorescencia)
cuando hibridan, los fluorocromos quedan
muy próximos, se traspasa energía de uno a
otro, y se puede medir la fluorescencia)
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
Sondas
FRET
 03 PCR a tiempo real- sistemas
fluorescentes de detección de
amplicones
Sondas
FRET
 APLICACIONES
DE LA
PCR EN TIEMPO REAL
 PCR
CUANTITATIVA
(qPCR)
Permite cuantificar la cantidad inicial de
una molécula de ácido nucleico en la
muestra .
En el termociclador a tiempo real se puede
detectar en qué ciclo de la PCR comienza
a aparecer fluorescencia por encima de el
límite de detección ( CT).
Hay 2 tipos
 CUANTIFICACIÓN
ABSOLUTA
Expresan la cantidad de
secuencia diana en unidades
de concentración (μl/ml) o en
número de copias por unidad
de volumen.
Se determina en base a una
curva de calibración
 CUANTIFICACIÓN
RELATIVA
En este caso se expresa la concentración
de la secuencia diana relacionándola
con la concentración de un gen de
referencia , que se encuentra presente en
todas las muestras, con un número
constante de copias.
Disminuye los errores que se hayan podido
cometer al purificar muestras, al pipetear o
al sintetizar ADNc a partir de ARNm
 DETECCIÓN DE
MUTACIONES

[Link]
com/es/es/home/life-
science/pcr/real-time-
pcr/real-time-pcr-
assays/taqman-mutation-
[Link]
 REPASAMOS
PRIMERA PARTE

[Link]
pcr_primera_parte.html

SEGUNDA PARTE

[Link]
repaso_pcr_segunda_parte.html