NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 5230
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2017-06-21

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTO

PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL DE TÉCNICAS DE
MUESTREO DE SUPERFICIES, AMBIENTES Y
MANOS

E: HORIZONTAL METHOD FOR MICROBIOLOGICAL

SAMPLING OF SURFACES, ENVIRONMENTS AND
OPERATOR´S HANDS

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES: microbiología ambiental; control de

calidad; microbiología alimentos.

I.C.S.: 07.100.30

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción Primera actualización

Editada 2017-06-28
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PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 1595 de 2015.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 5230 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2017-06-21.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.

3M COLOMBIA S.A. COOPERATIVA COLANTA

ALIMENTOS CÁRNICOS SAS GRUPO ÉXITO LTDA.
ALPINA S.A. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENU S.A.
ALQUERÍA S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
ASINAL LTDA. LABORATORIOS SFC LTDA.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA S.A. NULAB LTDA.
BERNIER GROUP SAS PAF LABORATORIOS LTDA.
BOLSA MERCANTIL DE COLOMBIA

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:

ALGARRA S.A. LA CAMPIÑA S.A.S.

BAVARIA S.A. LABORATORIO MICROBIOLÓGICO
BIOCONTROL LTDA. BARRANQUILLA LTDA.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES LABORATORIOS CALIFORNIA S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y LARKIN LTDA.
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ S.A. ESP MEALS DE COLOMBIA SAS
FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. MINISTERIO DE LA PROTECCIÓN SOCIAL
FRUGAL S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FUNDACIÓN LABORATORIO DE PRODUCTORA DE JUGOS SAS
FARMACOLOGÍA VEGETAL S.A. PRODUCTOS LÁCTEOS EL RECREO S.A.
GASEOSAS POSADA TOBON S.A. SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE
INGENIO PROVIDENCIA S.A. SENA
KOYOMAD S.A. VILASECA SAS
 ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
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normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
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CONTENIDO

Página

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ...................................................................... 1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS ................................................................................. 1

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES ................................................................................... 2

4. EQUIPOS Y MATERIALES........................................................................................ 3

5. MEDIOS DE CULTIVO Y LÍQUIDOS DE DILUCIÓN ................................................. 4

6. GENERALIDADES DE MUESTREO ......................................................................... 5

7. TOMA DE MUESTRAS EN SUPERFICIES................................................................ 6

7.1 USANDO EL MÉTODO DE PLACA DE CONTACTO

PARA EXAMINAR UN ÁREA .................................................................................... 6

7.2 USANDO EL MÉTODO DEL HISOPO PARA EXAMINAR UN ÁREA ....................... 6

7.3 USANDO EL MÉTODO DE LA ESPONJA PARA EXAMINAR UN ÁREA ................ 6

7.4 USANDO EL MÉTODO DE LÁMINA DE CONTACTO .............................................. 7

8. TOMA DE MUESTRAS DE MANOS .......................................................................... 7

9. TOMA DE MUESTRAS DE AIRE POR SEDIMENTACIÓN E IMPACTO ................... 7

10. TOMA DE MUESTRA DE AIRE POR TÉCNICA DE BURBUJEO ............................. 8

11. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS ........................................................................ 8

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Página

12. PROCEDIMIENTOS PARA EL ANÁLISIS ................................................................. 8

13. PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS ..................................... 9

13.1 CAJA DE CONTACTO O LÁMINAS DE CONTACTO ............................................... 9

13.2 HISOPO O ESPONJA.............................................................................................. 10

14. FILTRACIÓN POR MEMBRANA (ENJUAGUE DE ENVASES) .............................. 10

15 RECUENTO EN PLACA (ENJUAGUE DE ENVASES)............................................ 10

16. SELECCIÓN Y CONTEO DE COLONIAS ............................................................... 11

16.1 MÉTODO DE PLACA DE CONTACTO.................................................................... 11

16.2 MÉTODO DE HISOPO O ESPONJA ...................................................................... 11

16.3 MÉTODO DE GOTEO EN PLACA........................................................................... 11

17. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS........................................................ 11

17.1 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO ...................................................................... 11

17.2 MÉTODO DE HISOPO O ESPONJA ....................................................................... 12

17.3 EXPRESIÓN DE RESULTADOS PARA EL MÉTODO DE FROTIS

CON SIEMBRA DIRECTA ....................................................................................... 13

BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 15

ANEXO A (Informativo)
CAMBIOS ENTRE LA VERSIÓN ANTERIOR Y LA PRIMERA ACTUALIZACIÓN
DE LA NTC 5230................................................................................................................. 14

Tabla 1. Clasificación del nivel de resultado (aerobios mesofilos).

Mecanismo de verificación del programa de limpieza y desinfección........................... 11
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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
Y ALIMENTO PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL DE TÉCNICAS DE MUESTREO
DE SUPERFICIES, AMBIENTES Y MANOS

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma específica un método horizontal para las técnicas de muestreo utilizando
elementos y dispositivos diseñados para tal fin en superficies y ambientes en la industria de
alimentos, plantas de procesamiento de alimentos o materias primas y laboratorios de ensayo
con el fin de detectar y enumerar microorganismos viables.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de esta norma.
Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no
fechadas, se aplica la última edición del documento referenciado (incluida cualquier
corrección).

NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el
análisis microbiológico.

NTC 4458, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para el
recuento de coliformes o Escherichia coli o ambos. Técnica de recuento de colonias utilizando
medios fluorogenicos o cromogenicos.

NTC 4574, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para la
detección de Salmonella spp.

NTC 4666, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para la
detección de Listeria monocytogenes. Parte 1: método de detección.

NTC 4779, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para el
recuento de estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus aureus y otras especies).

NTC 4834, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para el
recuento de Clostridium sulfito reductores e identificación de Clostridium perfringes.

NTC 5652, Microbiologia de alimentos y alimentos para animales. Métodos horizontales para la
detección y enumeración de enterobacterias. Parte 1: detección y enumeración mediante la
técnica de NMP con pre-enriquecimiento

1 de 15
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NTC 5698-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para
la enumeración de mohos y levaduras. Parte 1: Técnica de recuento de colonias en productos
con actividad acuosa (AW) superior a 0,95.
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NTC 5698-2, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Método horizontal para
la enumeración de mohos y levaduras. Parte 2: Técnica de recuento de colonias en productos
con actividad acuosa (AW) menor o igual a 0,95.

NTC 5733, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Métodos horizontales

para la detección y enumeración de enterobacterias. Parte 2: Método de recuento de colonias.

ISO 4833:1991, Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Micro-Organisms.

Colony Count Technique at 30 °C.

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propósitos de este documento se aplican los términos y definiciones dados en la
NTC 4092 y los siguientes:

3.1 Nivel de acción. Nivel microbiológico establecido por el usuario en el contexto de espacios
controlados que cuando exceden, necesitan una intervención inmediata, incluyendo la
investigación de la causa, y una acción correctiva.

[TOMADO DE ISO 14698-2:2003, Numeral 3.1]

3.2 Nivel de alerta. Nivel microbiológico establecido por el usuario del espacio controlado,
dando una primera alerta en caso de variación de las condiciones normales.

NOTA Cuando los niveles de alerta están excedidos, esto debería tener como consecuencia un incremento en la
atención del proceso.

[TOMADO DE ISO 14698-2:2003, Numeral 3.2]

3.3 Biocontaminación. Contaminación de materiales, dispositivos, individuos, superficies,

líquidos, gases o aire con partículas viables.

[TOMADO DE ISO 14698-2:2003, Numeral 3.4]

3.4 Zona limpia. Espacio dedicado en el cual se controla la concentración de partículas

contenidas en el aire, y que se construye y utiliza de forma que se minimice la entrada,
producción y retención de partículas en el interior de la zona, y en la cual otros parámetros
importantes tales como la temperatura, humedad y la presión son controladas según
necesidades.

NOTA Esta zona puede ser abierta ó cerrada.

3.5 Dispositivo de contacto. Aparato especialmente diseñado conteniendo un medio de

cultivo adecuado estéril, con una superficie accesible utilizada para toma de muestras.

[TOMADO DE ISO 14698-1:2003, Numeral 3.1.6]

3.6 Contaminante. Cualquier partícula, molécula, sin partículas ó contaminación biológica

susceptible de producir un efecto no deseable sobre el producto o proceso.

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[TOMADO DE ISO 14644-4:2001, Numeral 3.5]

3.7 Zona controlada. Zona definida en la que las fuentes de contaminación se controlan por
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medios específicos.

[TOMADO DE ISO 14698-1:2003, Numeral 3.1.9]

3.8 Desinfección. Eliminación, destrucción o desactivación de microorganismos sobre objetos

o superficies.

[TOMADO DE ISO 14698-5:2004, Numeral 3.1.4]

3.9 Hisopo. Elemento utilizado para tomar muestras en superficies irregulares o regulares. El
hisopo está formado por una varilla con un extremo en material sintético y absorbente y se usa
para muestrear un área especificada sobre una superficie.

3.10 Muestreador de aire. Dispositivos o equipos utilizados para tomar muestras en una
cantidad medida de aire, en un tiempo especificado.

NOTA En la actualidad los equipos más usados son los muestreadores centrífugos y por impacto. El usuario de
acuerdo a la necesidad debe determinar la selección, conveniencia e idoneidad de cada muestreador.

3.11 Método de sedimentación. Procedimiento que se basa en la utilización de Cajas de petri

plásticas ó láminas preparadas con un volumen de agar específico expuesto durante un tiempo
determinado.

3.12 Láminas de contacto (Dipslide). Láminas sintéticas cubiertas con una capa de un medio
de crecimiento sólido, por uno o por ambos lados. Los medios de cultivo están disponibles
acorde al microorganismo buscado.

3.13 Esponjas. Material estéril con propiedad absorbente, libre de sustancias antimicrobianas,
empacada individualmente.

3.14 Placas de contacto. Recipiente o láminas estériles con medio de cultivo deshidratado ó
listo para usar en la toma de muestras por contacto directo con superficies.

3.15 Superficie. Parte externa e interna de un utensilio, equipo e instalaciones que entran en
contacto directo ó indirecto con productos destinados a consumo humano y animal en plantas
de procesamiento, insumos para alimentos y laboratorios de ensayo.

4. EQUIPOS Y MATERIALES

4.1 Para los requisitos generales véase la NTC 4092.

4.2 Equipo para esterilización en seco (horno) o esterilización húmeda (autoclave).

4.3 Incubadoras capaces de operar en la temperatura de incubación para los grupos de

microorganismos a ser investigados.

NOTA La temperatura de incubación depende directamente del tipo de microorganismo a investigar. Se

recomienda consultar el numeral 12 de esta norma.

4.4 Baños de agua o equipos similares que cuenten con termostato y que tengan capacidad
de operar entre 44 °C a 47 °C.
3
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4.5 Medidor de pH que permita la medición con una precisión de 0,1 Unidades de pH.

4.6 Homogeneizador para esponjas usando bolsas plásticas estériles y para preparar las
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suspensiones iniciales por movimiento peristáltico o vibración o equipo similar de movimiento

horizontal o agitador.

4.7 Mezclador de vórtice para la mezcla de líquidos en tubos de cultivo.

4.8 Pipetas graduadas con amplia capacidad de abertura y una capacidad nominal de 1 ml,
graduadas en divisiones de 0,1 ml o pipetas automáticas de volumen variable de 10 µl hasta
1 000 µl.

4.9 Contenedores como botellas, tubos, frascos, disponibles para esterilización y

almacenamiento de medios de cultivo.

4.10 Cajas de Petri en plástico estéril de 90 mm a 100 mm.

4.11 Láminas de contacto con el medio de cultivo de acuerdo con los microorganismos a
investigar.

4.12 Cajas petri de plástico para la prueba de contacto con medio de cultivo ya descrito.

4.13 Hisopos o esponjas estériles.

4.14 Plantilla de muestreo la cual debe ser de material esterilizable y resistente a la corrosión
(por ejemplo, un marco en acero inoxidable) estas plantillas pueden oscilar en un tamaño
de 20 cm2 a 100 cm2).

4.15 Recipiente térmico, nevera o caja con aislamiento térmico capaz de mantener las
muestras a una temperatura entre 0 °C a 4 °C durante el transporte al laboratorio, este
recipiente debe contar con un sistema de monitorización.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y LÍQUIDOS DE DILUCIÓN

5.1 Agar Plate Count, para recuentos de bacterias.

5.2 Agar Rojo Violeta Bilis Dextrosa para Enterobacterias.

5.3 Agar Rojo Bilis Violeta para Coliformes y para la determinación de Coliformes y E coli
medios cromogénicos u otros medios de cultivo disponibles para este fin.

5.4 Agar Oxitetraciclina Glucosa Extracto de Levadura (OGY), para Mohos y levaduras

5.5 Agar Baird Parker para Estafilococos Coagulasa (+)

5.6 Líquidos de dilución en laboratorio: agua peptonada al 0,1 % o solución salina 8,5 g/l.

5.7 Líquidos neutralizantes: Caldo Letheen como neutralizante general. Sin embargo se
puede seleccionar un compuesto específico al desinfectante aplicado a la superfície evaluada.

NOTA Según el agente desinfectante se debería utilizar el agente neutralizante, se recomienda considerar los
aspectos técnicos referentes a agentes neutralizantes definidos en las normas UNE 1275 y UNE 1276.

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6. GENERALIDADES DE MUESTREO

NOTA En esta norma técnica colombiana se encuentran descritos los procedimientos de análisis en laboratorio
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de microbiología, sin embargo, en la actualidad se encuentran disponibles técnicas analíticas internacionales que
permiten verificar la contaminación microbiológica en superficies (por ejemplo, luminometría), que pueden ser
utilizadas por la organización de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cualquiera de las técnicas
utilizadas es importante que se permita evidenciar la trazabilidad de la información.

6.1 Es importante que el laboratorio tome o reciba una muestra representativa de la

superficie a analizar, que no haya sido alterada durante la toma de muestra por la presencia de
residuos de desinfectantes o por condiciones de almacenamiento o transporte inadecuadas. La
muestra debe estar debidamente etiquetada con un sistema interno de trazabilidad que
garantice como mínimo la siguiente información:

a) sitio y punto de muestreo;

b) fecha y hora de toma de la muestra;

c) identificación del medio de cultivo;

d) responsable de la toma de muestra;

e) tipo de muestra.

6.2 Para muestras que evalúen la eficiencia del proceso de limpieza y desinfección es
conveniente esperar el tiempo de acción determinado por el fabricante del desinfectante

NOTA Los desinfectantes son generalmente formulados para una desinfección en un tiempo de contacto de 5
min a 15 min (Para otros tiempos de contacto del desinfectante es aconsejable verificar la ficha técnica del producto
aplicado).

6.3 Con el objeto de eliminar los residuos del desinfectante en la muestra, el líquido
diluyente utilizado debe contener un neutralizante apropiado.

6.4 Si se utilizan cajas de contacto añadir el neutralizante al medio de cultivo con el objeto
de prevenir cualquier efecto inhibitorio del desinfectante en el crecimiento del microorganismo.

6.5 Generalmente se utilizan como neutralizantes el Polisorbato 80 (30 g/l) y la Lecitina

(3 g/l) usados para neutralizar residuos de desinfectantes absorbidos, por ejemplo
(componentes de amonio cuaternario, anfotericidas). El tiosulfato de sodio (5 g/l) es un buen
neutralizante de productos con base halógena.

NOTA En el caso del peróxido usado en desinfectantes, la catalasa o peroxidasa puede ser usada como
neutralizante. Una unidad de estas enzimas cataliza la descomposición de 1 µmol de peróxido de hidrogeno por un
minuto a 25 °C y a un pH de 7.

La fórmula universal para neutralizantes es:

Polisorbato 80 30 g/l
Lecitina 3 g/l
Tiosulfato de sodio 5 g/l
L-histidina 1 g/l
Saponina 30 g/l

5
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NOTA Preparar en líquido de dilución (peptona 1g/l o solución salina al 8,5 g/l y agente neutralizante), distribuir
en tubos o botellas y esterilizar 15 min a 121 °C.
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7. TOMA DE MUESTRAS EN SUPERFICIES

NOTA Para los aspectos a continuación se deberían tener en cuenta las instrucciones del fabricante.

7.1 USANDO EL MÉTODO DE PLACA DE CONTACTO PARA EXAMINAR UN ÁREA

7.1.1 Una lámina o placa de contacto con el medio de agar específico debe ser presionada
contra la superficie a analizar. Después de la incubación se estima la contaminación de la
superficie por el conteo del número de colonias desarrolladas.

7.1.2 Como regla general se tiene que se remueve del contenedor de transporte y se
presione la superficie del agar firmemente contra la superficie a analizar, sin hacer movimientos
laterales.

7.1.3 La literatura reporta que resultados óptimos de las placas de contacto son obtenidos
con un tiempo de contacto de 10 s y una presión de 500 g. (por ejemplo, algunas placas de
contacto de un diámetro de 55 mm que tienen un aplicador comercialmente disponible). Cerrar
la placa de contacto inmediatamente después de la inoculación y poner en el contenedor de
transporte.

7.2 USANDO EL MÉTODO DEL HISOPO PARA EXAMINAR UN ÁREA

7.2.1 Remover el hisopo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ubicar la punta del
hisopo en la superficie para ser investigada.

7.2.2 En superficies regulares planas se debe analizar como mínimo 100 cm2

NOTA Se recomienda el uso de una cuadrícula de 10 cm x 10 cm como plantilla.

7.2.3 En superficies irregulares, cóncavas, de difícil acceso o menores a 100 cm2 se debe
estipular el área a muestrear y tomar la muestra haciendo un frotis en forma de malla (véase la
Figura 1). Las varillas de los hisopos se depositan dentro de un tubo que contiene un fluido
estéril o liquido neutralizante y se mezcla.

NOTA En el laboratorio, se utiliza la suspensión inicial y si es necesario, diluciones decimales (1 ml, 5 ml y 10 ml

de diluyente), para determinar el número de microorganismos, utilizando los procedimientos descritos en los
métodos para la enumeración de los microorganismos por siembras en placa o por filtración de membrana (enjuague
de envases).

7.3 USANDO EL MÉTODO DE LA ESPONJA PARA EXAMINAR UN ÁREA

7.3.1 Con el uso de guantes abrir la bolsa plástica que contiene la esponja hidratada, remover
la esponja con unas pinzas estériles (cuando la esponja no tiene mango) o guantes estériles
(cuando la esponja tiene mango). Deslizar la esponja sobre la superficie a muestrear. Colocar
nuevamente la esponja en la bolsa plástica fracturando el mango y cerrar la bolsa para que no
queden orificios de escape.

7.3.2 En el laboratorio adicionar el volumen de líquido sugerido por el proveedor, dentro de la

bolsa donde se transportó la esponja. Sobre la bolsa oprimir la esponja para que absorba el
caldo adicionado y libere los microorganismos tomados durante el muestreo. Sembrar el
volumen adecuado y adicionar en el medio de cultivo de acuerdo al microorganismo y proceder
con la incubación.
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7.4 USANDO EL MÉTODO DE LÁMINA DE CONTACTO

7.4.1 Desenroscar el tubo y sacar la lámina (Slide) que contiene los medios de cultivo
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procurando no tocar la superficie recubierta de agar. Luego introducir la lámina en el líquido del
depósito. Humedecer la probeta evitando que la superficie de agar se desprenda. Este
procedimiento es para evaluar aguas de enjuague de equipos y no se utiliza para superficies.

7.4.2 Tomar la muestra haciendo presión sobre el punto a muestrear. La superficie del agar
debe estar completamente humedecida. Incubar en posición vertical las láminas (slides) dentro
de la incubadora.

7.4.3 El tiempo y temperatura de incubación debe ser específico al tipo de microorganismo.

7.4.4 Las pruebas de confirmación se deben realizar en medios selectivos apropiados. La

contaminación se estima a partir de las instrucciones del fabricante respecto al método de
lectura de las pruebas utilizadas.

7.4.5 Luego de tomar la muestra de la superficie, se debe hacer la limpieza y desinfección del
área muestreada para prevenir el aumento de la contaminación cómo resultado del
procedimiento de muestreo.

7.4.6 La toma de muestras en superficies para búsqueda de microorganismos patógenos

debe realizarse utilizando la técnica del hisopado o esponjado o ambas.

NOTA Si el muestreo se realiza con hisopos se recomienda tomar como mínimo 5 hisopos del punto a
2
muestrear, podría ser preferiblemente de no menos de 1 000 cm . Si el muestreo se realiza con esponjas tomar las
esponjas necesarias según el microorganismo a identificar, por punto de muestreo.

8. TOMA DE MUESTRAS DE MANOS

8.1 El frotis de manos se debe realizar por hisopado el cual debe incluir la palma, dorso,
espacios interdigitales y uñas.

8.2 La técnica por impresión de la yema de los dedos se debe realizar utilizando una caja
de petri o laminas que contienen el agar especificado según el tipo de microorganismo a
investigar.

8.3 El plan de muestreo para análisis microbiológicos en las manos debe obedecer a un
análisis de riesgos en el cual la organización determine los factores críticos a evaluar.

9. TOMA DE MUESTRAS DE AIRE POR SEDIMENTACIÓN E IMPACTO

9.1 La toma de muestras de aire realizada mediante la técnica de sedimentación, debe

realizarse en un tiempo de exposición entre mínimo 15 min y máximo 30 min.

NOTA Los tiempos de exposición para la técnica de sedimentación pueden estar acordados entre el cliente y el
laboratorio que toma la muestra, basados en análisis de tendencias y análisis de riesgos en áreas críticas y no
criticas.

9.2 La toma de muestras de aire realizada mediante la técnica de impactación, debe

realizarse siguiendo las características de uso del equipo de acuerdo al fabricante.

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9.3 Los puntos de toma de muestra de aire deben ser seleccionados según el análisis de
riesgo determinado por la organización.
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10. TOMA DE MUESTRA DE AIRE POR TÉCNICA DE BURBUJEO

NOTA La toma de muestra de aire por la técnica de burbujeo se recomienda cuando se cuentan con los equipos
en su totalidad para la realización de la misma, los cuales se encuentran descritos a continuación. La técnica de
burbujeo se podrá utilizar para aires comprimidos del cual se requiere un análisis de calidad microbiológica.

10.1 La frecuencia de la toma de muestra de aire por técnica de burbujeo se debe realizar
con base en un análisis de tendencias y riesgos valorados por la organización.

10.2 Aplicar alcohol al 70 % al extremo de salida de aire de las mangueras o boquillas (salida
del aire comprimido). En el caso de las mangueras utilizar un escobillón estéril para retirar
partículas y limpiar el área de contacto de la manguera estéril.

10.3 Realizar una purga de salida de aire y regular la presión de salida (5 l/min) para la toma
de la muestra.

10.4 Retirar del empaque la manguera flexible previamente esterilizada y los tapones de
algodón de cada uno de los extremos.

10.5 Ubicar un extremo de la manguera esterilizada en el frasco estéril tapa rosca quedando
inmerso en la solución salina o solución amortiguadora.

10.6 Ubicar el otro extremo de la manguera estéril en la boquilla de expulsión de aire.

10.7 Proceder a muestrear el aire del área a evaluar durante mínimo 3 minutos.

10.8 Finalizado el tiempo, retirar la manguera estéril de la boquilla de salida de aire y del
frasco estéril tapa rosca. Tapar el frasco estéril tapa rosca y llevar a nevera portátil con pilas de
hielo o sistema de refrigeración adecuado.

11. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

11.1 Se debe transportar tanto los hisopos como las láminas de contacto, esponjas o cajas
de contacto en recipientes térmicos que aseguren una temperatura entre 0 °C a 4 °C. Examinar
en el laboratorio tan pronto como sea posible y no después de 24 h. Se debe contar con un
sistema que registre de manera permanente la temperatura a la cual se encuentra el
contenedor de transporte de muestras.

11.2 La siembra de las muestras obtenidas por el método de hisopo, cajas de contacto,
láminas de contacto y esponjas debe realizarse preferiblemente dentro de las 4 h siguientes a
la toma de muestra.

12. PROCEDIMIENTOS PARA EL ANÁLISIS

Una vez se haya realizado el procedimiento de toma de muestras correspondiente, en

laboratorio se debe proceder con lo siguiente:

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12.1 Para la detección de Salmonella sp: Se debe incubar la esponja (que tiene el líquido
de transporte), adicionar el caldo de pre enriquecimiento y continuar con el procedimiento
según lo descrito en la NTC 4574.
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NOTA 1 Para el transporte de muestras para la identificación de Salmonella se debería contar con agua peptonada
tamponada.

NOTA 2 Para la detección de Salmonella sp en aguas se debería utilizar el método descrito en la NTC 5021.

12.2 Para la detección de Listeria monocytogenes: Colocar el líquido de transporte en el

caldo apropiado para realizar el enriquecimiento primario y continuar con el procedimiento
según lo descrito en la NTC 4666.

12.3 Para la detección y enumeración de Enterobacterias: Hacer las diluciones

apropiadas en agua peptonada al 0,1 %. Sembrar el volumen determinado en placas de Petri
estériles y adicionar el medio de cultivo seleccionado. Continuar con el procedimiento según lo
descrito en la NTC 5652.

12.4 Para el recuento de Clostridium sulfito reductor: A partir del líquido de transporte
tomar un volumen apropiado, hacer diluciones y sembrar en placas de Petri estériles. Adicionar
el medio de cultivo apropiado y continuar con el procedimiento según lo descrito en la
NTC 4834.

12.5 Para el recuento de Estafilococos: Se debe realizar el método de ensayo según lo

descrito en la NTC 4779.

12.6 Para el recuento de coliformes o Escherichia coli o ambos: Se debe realizar el

método de ensayo según lo descrito en la NTC 4458.

12.7 Para el recuento de mohos y levaduras: Se debe realizar el método de ensayo según
lo descrito en la NTC 5698-1 y NTC 5698-2.

12.8 Para el recuento de mesofilos: Se debe realizar el método de ensayo según lo

descrito en la norma ISO 4833.

NOTA Para la búsqueda de otros microorganismos de interés, se debería utilizar el método de ensayo disponible
según norma técnica colombiana o internacional.

12.9 Para el análisis de aire tomado por técnica burbujeo: Se debe realizar por el método
de filtración por membrana.

NOTA Se recomienda consultar las normas técnicas colombianas disponibles para el análisis utilizando la
filtración por membrana según el microorganismo de interés.

13. PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS

13.1 CAJA DE CONTACTO O LÁMINAS DE CONTACTO

Incubar las cajas de contacto o láminas de contacto de acuerdo al tipo de microorganismo a ser
analizado.

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13.2 HISOPO O ESPONJA

13.2.1 Mezclar el contenido del tubo que tiene los hisopos en el mezclador tipo vórtice por
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30 s, ajustando la velocidad para que la pared del tubo quede humedecida arriba a una altura
de 2 cm a 3 cm debajo de la tapa. Esto representa la suspensión inicial.

13.2.2 Añadir a la bolsa plástica que contienen las esponjas, una cantidad de líquido de
dilución o líquido neutralizante, dependiendo del tamaño del área a investigar (100 ml x 100 cm2).
Después de esto, tratar al contenido de la bolsa en un agitador por 1 min o 30 s dependiendo
del equipo utilizado.

13.2.3 Inocular por duplicado en las cajas con medio de cultivo específico de acuerdo al
microorganismo a investigar la dilución inicial, usando un 1 ml de inoculo para servir las cajas y
0,1 ml de inoculo para técnicas de difusión.

13.2.4 Tratar cualquiera de las otras diluciones de la misma manera; Invertir las cajas e
incubarlas a una temperatura y tiempo adecuado para cada medio.

13.2.5 Si se presume de números elevados de microorganismos, preparar otras diluciones

decimales en diluyente agua peptonada para obtener un número de colonias contables.

NOTA De acuerdo al microorganismo a investigar consultar los métodos horizontales descritos en las Normas
NTC apropiadas.

14. FILTRACIÓN POR MEMBRANA (enjuague de envases)

14.1.1 Para superficies de envases adicionar 100 mL de agua peptonada 0,1 %. Mezclar
dentro del recipiente y filtrar sobre una membrana de poro indicado de acuerdo al objeto del
estudio (0,45 micras para bacterias y 0,6 micras para hongos).

14.1.2 Colocar la membrana sobre el medio de cultivo adecuado al microorganismo evaluado.

Incubar a tiempo y temperatura según el método empleado

15 RECUENTO EN PLACA (enjuague de envases)

15.1.1 Mossel propone adicionar al envase 10 mL de agua peptonada 0,1 %. Mezclar dentro
del recipiente y realizar diluciones si se sospecha de un conteo elevado. Sembrar el volumen
indicado y adicionar los medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a investigar. Incubar
por el tiempo y a la temperatura adecuado para cada medio.

15.2.2 Comenzando con la dilución más alta, usar pipetas estériles para transferir alícuotas de
0,05 ml de la suspensión inicial (Hisopos, esponjas) y de las otras diluciones a sectores
apropiados del medio de cultivo marcado en el centro de la placa de agar (por duplicado,
usando las mismas diluciones pero en diferente placa de agar) cada pre-secado de la placa de
agar puede ser usado por goteo de no más de 6 diluciones diferentes.

15.2.3 Cuando el goteo es aplicado, es conveniente tocar la punta de la pipeta en la superficie

del agar en orden de transferencia de una cantidad completa de la dilución al medio de cultivo.
Guardar las placas de agar horizontalmente (tapa arriba) bajo una superficie húmeda.

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16. SELECCIÓN Y CONTEO DE COLONIAS

16.1 MÉTODO DE PLACA DE CONTACTO

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El conteo de colonias se debe realizar de acuerdo al tipo de placa de contacto utilizado

(instrucciones del fabricante)

En general para recuento de bacterias totales Contar el número de colonias en las placas de
contacto o láminas de contacto directamente después del periodo de incubación especificado.

Se debe tener en cuenta que si el crecimiento bacteriano es muy elevado (superior a 300 UFC)
puede haber confluencia de las colonias y el crecimiento puede ser mal interpretado. Para el
caso de los mohos y levaduras, contar las colonias de mohos que aparecen blandas
filamentosas y aterciopeladas y las levaduras como colonias ligeramente hinchadas

Hacer confirmación o identificación de acuerdo al objetivo de la investigación

16.2 MÉTODO DE HISOPO O ESPONJA

Contar las colonias de cada caja y confirmar si es necesario, acorde al(os) microorganismo(s).

16.3 MÉTODO DE GOTEO EN PLACA

Contar el número de colonias (blanco) a las diluciones producidas de 5 colonias a 50 colonias.

En el caso de procedimientos de enriquecimiento, seguir las instrucciones después de pre-

enriquecimiento acorde al microorganismo(s).

17. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

NOTA A continuación (véase la Tabla 1) se recomiendan parámetros orientativos para clasificación de la eficacia
del programa de limpieza y desinfección en términos microbiológicos, sin embargo, la clasificación de las áreas
podrá estar definida por cada organización según la criticidad de la operación diaria y los puntos de control definidos
en el programa de muestreo.

Tabla 1. Clasificación del nivel de resultado (aerobios mesofilos).

Mecanismo de verificación del programa de limpieza y desinfección

Criterio clasificación Recuentos microbiológicos

2
Limpio 2 – 10 UFC/cm
2
Aceptable 11- 100 UFC /cm
2
Sucio Mayor a 100 UFC/cm
Fuera de control 101 -1 000 UFC

NOTA Para el cálculo y expresión de resultados se recomienda seguir las directrices propuestas en la
NTC 4092.

17.1 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO

Se deben seguir las instrucciones del fabricante según la técnica de análisis para la expresión
de los resultados.

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17.2 MÉTODO DE HISOPO O ESPONJA

17.2.1 Calcular el número de UFC x ml de suspensión inicial.

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17.2.2 Calcular el número de UFC por cm2 de superficie investigada con la fórmula:

N x F
x D
A

en donde

N es el número de UFC en 1 ml de líquido de dilución (líquido de inactivación)

F es la suma (ml) de líquido de dilución (liquido de inactivación) en el tubo o bolsa.

2
A es la superficie investigada (cm )

D es el reciproco de la dilución usada.

17.2.3 Para el método de goteo, calcular el número de N de UFC/ml del líquido de suspensión
usando la fórmula.

N 
C
V n1  0,1 x n2 d

en donde

C = es la suma de colonias contadas en todas las gotas retenidas de dos diluciones sucesivas de
1 de la menor que contenga cinco colonias.

V = volumen de inoculo aplicado en cada gota (en este caso 50 µl).

n1 = número de gotas retenidas en la primera dilución.

n2 = número de gotas retenidas en la segunda dilución.

d = factor de dilución correspondiente a la primera dilución.

Para obtener el conteo/cm2 de superficie, usar la fórmula:

N x F
A

en donde

F es el volumen del líquido de dilución ( o líquido neutralizante) en el tubo o bolsa.

2
A es el área de muestreo / cm

17.2.4 Si el área analizada no es definida, usar la fórmula N x F x D para calcular el número de

UFC / hisopo.

Cuando se utilizan métodos semicuantitativos el resultado obtenido en UFC/cm2 de superficie

puede ser llamado también número higiénico. Estos pueden variar dependiendo de las
superficies examinadas. Es recomendable que esta designación se haga entre las partes
interesadas.

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17.2.5 En el caso de procedimientos de enriquecimiento, reportar el organismo blanco tanto

detectado como no detectado en el área muestreada.
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17.3 EXPRESIÓN DE RESULTADOS PARA EL MÉTODO DE FROTIS CON SIEMBRA

DIRECTA

Se reporta como ausencia / presencia del microorganismo patógeno objeto de la búsqueda por
utensilio evaluado (por ejemplo, cuchara, cuchillo, etc.) o área de la superficie evaluada.

Cuando se presume de recuentos inferiores a 10 UFC para los casos de aislamiento de

microorganismos mesófilos, coliformes totales, mohos y levaduras, se debe reportar las
unidades encontradas por elemento o área de la superficie evaluada.

Si el objeto de la búsqueda lo requiere posteriormente realizar la identificación correspondiente.

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ANEXO A
(Informativo)
Se autoriza el documento a CONAMFI S.A.S., según pedido #129641. Prohibida su distribución y comercialización. 2019-05-22

CAMBIOS ENTRE LA VERSIÓN ANTERIOR Y LA PRIMERA ACTUALIZACIÓN

DE LA NTC 5230

Los siguientes son los cambios más relevantes entre la versión anterior de la NTC 5230 y la
primera actualización:

Se amplía el objeto y campo de aplicación del documento normativo incluyendo a industrias,

laboratorios y demás organizaciones interesadas en realizar análisis de ambientes y superficies
bajo esta norma técnica colombiana. Se actualizaron las referencias normativas.

Se actualizaron los términos y definiciones incluyendo los establecidos dentro de la NTC 4092
y la armonización con documentos internacionales que definen términos referentes a
ambientes y superficies con fines microbiológicos.

Se incluyeron requisitos para el muestreo de ambientes y superficies, considerando diferentes

métodos de toma de muestra con sus respectivas aclaraciones técnicas.

Se incluyó la toma de muestras para aire comprimido y su método de análisis con aceptación
internacional.

Se incluyeron criterios de clasificación a modo orientativo de ambientes y superficies

analizados bajo este documento normativo y los resultados obtenidos a partir de recuentos
microbiológicos.

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BIBLIOGRAFÍA
Se autoriza el documento a CONAMFI S.A.S., según pedido #129641. Prohibida su distribución y comercialización. 2019-05-22

SCHARLAB, Control microbiológico ambiental y de superficies. SCHARLAB, 2011.

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and

Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for Sampling Techniques from Surfaces Using
Contact Plates and Swab Methods. Ginebra: ISO, 2006 (ISO 18593).

Manual operativo de análisis microbiológicos para alimentos. Gilma Janeth Luna. Fondo
editorial Fundación Universidad Jorge Tadeo Lozano. Paginas de la 122 a 123. 1991.

Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. Ministerio de salud. INVIMA. Republica de Colombia. Paginas de la 59 a 61.
1997.

Methods of Analysis of AOAC International (OMA), AOAC. 17.6 Microbiological Methods for
Determining Commercial Sterility of Low Acid Canned Food. 17th Edition, Current Through 1st
Revision, ds. 2002.

FDA, Food and Drug Administration. “Policy”. Corn&we Policy Guides Manual. 2002.

APHA (American Public Health Association). Standard Methods for the Examination of Dairy
Products. Port City Press, Baltimore. 1993.

Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA-1-1995, Bienes y servicios. Alimentos envasados en

recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. Disposiciones y
especificaciones sanitarias.

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