DEPARTAMENTO
DE
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE OVIEDO
GRADO EN BIOLOGÍA
PRÁCTICAS DE ANÁLISIS Y EVALUACIÓN BIOSANITARIA
Curso /
APELLIDOS:
NOMBRE:
GRUPO:
Análisis y evaluación biosanitaria (Grado de Biología)
Práctica 1 (Bioquímica)
Determinación de proteinuria por el método de Bradford
INTRODUCCIÓN.
Se llama proteinuria a la condición en la que aparecen proteínas en la orina. La membrana
basal de la estructura de filtración glomerular está constituida por proteínas y proteoglicanos,
caracterizándose por la gran cantidad de cargas negativas que presenta, por lo que es un filtro que
impide el paso de moléculas mayores de 2 nm o de 40 kDa. Solo una pequeña parte de las
proteínas de bajo peso molecular se filtra en el glomérulo y la mayor parte de éstas se reabsorbe
en los túbulos por endocitosis. De esta forma, la excreción urinaria de proteínas en individuos
sanos es inferior a 50 mg/día, de los cuales unos 10 mg/día corresponden a albúmina. Esto hace
que la concentración de proteínas en orina en condiciones normales sea inferior a 0,1 mg/mL.
Puede presentarse proteinuria fisiológica tras el ejercicio físico, estrés o fiebre. Este tipo de
proteinuria desaparece una vez que ha pasado la situación que la ha originado. Existen diversos
tipos de proteinuria que ponen de manifiesto una situación patológica. Según su origen y el tipo
de proteínas que aparecen en la orina son: glomerular, tubular, prerrenal y posrenal.
En esta práctica se determinará la concentración de proteína total en muestras de orina para
contrastar las diferencias entre orinas normales y patológicas.
REACTIVOS:
1. Biorad Protein Assay Dye. Reactivo comercial. Almacenar a 4 ºC.
2. Albúmina sérica bovina (BSA); 1.00 mg/mL. Almacenar a -20 °C. Antes de empezar el
ensayo preparar 4 mL de una disolución que contenga 25 µg/mL por dilución con agua
destilada.
RECTA PATRÓN.
A partir del stock de BSA de concentración 25 µg/mL, preparar las muestras de
concentración variable (de 0 a 12,5 µg/mL) según se indica en la siguiente tabla:
Tubo Volumen de µg proteína H20 A595
BSA 25µg/mL
en ensayo (µL)
(µL)
1 0 0 1600
2 160 4 1440
3 320 8 1280
4 480 12 1120
5 640 16 960
6 800 20 800
PROBLEMAS.
Las muestras de orina que se proporcionan estarán 10 o 20 veces diluidas con agua
destilada, según se indique. Dispensar los volúmenes que se indican de cada orina diluida.
Completar con agua destilada hasta un volumen final de 1600 µL.
Tubo Identificación de Volumen de H20 A595
muestra
orina diluida (µL)
(µL)
7 Problema 1 50 1550
8 Problema 1 100 1500
9 Problema 2 50 1550
10 Problema 2 100 1500
PROCEDIMIENTO.
Preparar las mezclas de reacción con los patrones de BSA y los problemas en tubos de 5
mL de capacidad. Esperar 5 minutos y añadir a cada tubo 400 µL del reactivo de Bradford. Mezclar
bien con el agitador mecánico y esperar 15 minutos.
Determinar la A595 transfiriendo cada muestra a una cubeta de espectrofotómetro.
RESULTADOS.
a) Datos de la recta patrón:
Tubo Proteína ensayada A595
(µg)
1 0
2 4
3 8
4 12
5 16
6 20
b) Representar gráficamente los datos de la recta patrón (A595 frente a µg proteína).
c) Calcular la concentración de proteína de las orinas problema usando los datos de la
recta patrón.
Muestra Volumen Dilución A595 µg Concentración
usado (µL) proteína proteína en orina
(µg/µL)
d) Indique la normalidad o anormalidad de las orinas que se le han entregado como
problemas, así como una valoración de la gravedad de la proteinuria.
Análisis y evaluación biosanitaria (Grado de Biología)
Práctica 2 (Bioquímica)
Determinación de fosfatasa alcalina en suero sanguíneo
INTRODUCCIÓN.
La fosfatasa alcalina consta de cuatro genotipos estructurales en suero: el tipo hígado-
huesos-riñones, el tipo intestinal, el tipo placentario y la variante de las células germinales. La
fosfatasa alcalina se encuentra en los osteoblastos, los hepatocitos, los riñones, el bazo, la
placenta, la próstata, los leucocitos y en el intestino delgado. El tipo hígado-huesos-riñones es de
particular importancia.
La actividad de la fosfatasa alcalina aumenta en todas las formas de la colestasis, sobre
todo en la ictericia obstructiva. Su actividad también se incrementa por enfermedades del
esqueleto tales como la enfermedad de Paget, el hiperparatiroidismo, el raquitismo y la
osteomalacia, en fracturas y tumores malignos. En niños y adolescentes se observa
frecuentemente un fuerte incremento de la actividad de la fosfatasa alcalina, pues cuando el
crecimiento óseo se acelera, la actividad de los osteoblastos aumenta.
La siguiente tabla indica el rango de valores normales de fosfatasa alcalina en suero
medidos a 37 ºC.
Individuo Fosfatasa
(UI/L)
Hombres 40-130
Mujeres 35-104
Niños (7-12 años) < 300
REACTIVOS.
Reactivo de trabajo: se prepara mezclando los reactivos R1 (tampón dietanolamina 1,25
mol/L, pH 10,2; cloruro de magnesio 0,6 mmol/L) y R2 (p-nitrofenilfosfato: 50 mmol/L) en
proporción 4:1 (ya mezclados en el reactivo de trabajo proporcionado para la práctica).
Principio del ensayo. En presencia de iones de magnesio y de zinc, las fosfatasas
hidrolizan el p-nitrofenilfosfato a fosfato y p-nitrofenol según la siguiente reacción:
p-nitrofenilfosfato + H20 fosfato + p-nitrofenol
En disolución alcalina, el p-nitrofenol posee un color amarillo que puede ser determinado
espectrofotométricamente, de forma que el p-nitrofenol liberado (absorbancia medida a 430 nm)
será proporcional a la actividad de la fosfatasa presente.
PROCEDIMIENTO.
Se usarán los espectrofotómetros analíticos Beckman DU 800, Shimadzu UV-199i y
Kontron UVIKON 930.
a) Preparación de la reacción.
- Las mezclas de reacción se prepararán en cubetas de 1 mL de capacidad pipeteando los
volúmenes que se indican a continuación:
Cubeta 1 Cubeta 2 Cubeta 3 Cubeta 4(*)
Reactivo/muestra
(Blanco) Suero problema Suero problema Calibrador
Reactivo de trabajo 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL
Suero o calibrador - 20 µL 20 µL 20 µL
Agua destilada 20 µL - - -
- Mezclar por inversión usando un Parafilm e incubar 5 minutos a 37 ºC en la cámara
termostatizada del espectrofotómetro. Usando la cubeta Blanco, ajustar la absorbancia a 0
durante esta incubación.
La cubeta 1 actuará como blanco de la reacción y las cubetas 2, 3 y 4 servirán para medir
la velocidad de la reacción enzimática. (*) En la cubeta 4 se medirá la velocidad de reacción con
el estándar interno o calibrador en lugar de suero problema. Este estándar interno tiene una
actividad conocida de fosfatasa alcalina, que se usará como referencia.
b) Reacción enzimática.
- Transcurridos estos 5 minutos, añadir 20 µL de agua (cubeta 1), suero problema
(cubetas 2 y 3) o calibrador (cubetas 4), mezclar por inversión usando un Parafilm y colocar en la
cámara del espectrofotómetro. Iniciar la toma de datos para registrar la A430 a intervalos de 1 min
durante 10 minutos.
RESULTADOS.
a) Recoger los datos suministrados por los espectrofotómetros
[representación gráfica (A430 vs. t) y tabla de datos de A430].
b) Determinar la pendiente (Incremento de A430/min) de cada reacción.
c) Calcular las unidades enzimáticas en cada suero (UI/L) comparando la
pendiente de cada problema con la del estándar interno:
∆A430 suero problema/∆t
--------------------------------- x UI/L estándar interno (calibrador)
∆A430 estándar interno/∆t
d) Determinar cuáles de los sueros ensayados tienen niveles normales y
cuáles niveles patológicos de fosfatasa alcalina.
e) A partir de la pendiente de cada reacción, determinar la velocidad de la
misma (µM de producto generado por minuto de reacción) a partir de la ecuación
de Lambert-Beer: A=ε. c. l (ε430 del p-nitrofenol es 10.000 M-1. cm-1).
Definición de unidad internacional (UI) de actividad enzimática: aquella cantidad de
enzima capaz de catalizar la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto de reacción.
Análisis y evaluación biosanitaria (Grado de Biología)
Práctica 3 (Bioquímica)
Electroforesis de proteínas del suero sanguíneo
INTRODUCCIÓN.
Muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica cuya magnitud depende de la
naturaleza de las mismas, del pH y de la composición del medio en el que se encuentren. Si a una
disolución que contiene moléculas cargadas se le aplica un campo eléctrico, las moléculas
emigran hacia el polo de carga opuesta. Este principio se usa en la electroforesis para separar
moléculas que posean cargas diferentes.
Las proteínas, que son moléculas anfóteras, adquieren en medio alcalino una carga global
negativa que hace que emigren desde el polo negativo (cátodo) hacia el polo positivo (ánodo).
Debido a ello, la electroforesis de zona es una técnica muy empleada para separar proteínas.
La velocidad de migración electroforética depende del equilibrio entre la fuerza impulsora
del campo eléctrico sobre los iones cargados de la muestra y las fuerzas de fricción entre las
moléculas que se mueven y el medio circundante. Manteniendo constante el voltaje, la velocidad
de migración electroforética es directamente proporcional a la carga de la molécula e
inversamente proporcional a su tamaño.
Para que tenga lugar la electroforesis es necesario que la muestra esté disuelta en una
disolución tampón y que sea colocada sobre un medio de soporte que debe de estar saturado con
tampón para conducir la corriente.
Como medio de soporte se emplean materiales relativamente inertes, tales como el papel,
acetato de celulosa, geles de almidón, geles de poliacrilamida, etc. La práctica se realizará usando
un soporte de gel de agarosa (HYDRAGEL K20©) que permite una nítida separación de las bandas
proteicas, de necesitarse cantidades mínimas de muestra y de permitir una separación muy rápida.
En esta práctica se pretende llevar a cabo la separación electroforética de las proteínas del
suero, obteniéndose habitualmente 5 fracciones con cargas negativas decrecientes: albúmina, α1-
globulinas, α2-globulinas, β-globulinas y γ-globulinas. Esta técnica es muy utilizada en
bioquímica clínica para medir cambios en las proteínas séricas causados por diversas
enfermedades (ver esquema siguiente)
1. Suero normal. 2. Suero con bisalbuminemia 3. Síndrome inflamatorio agudo.
4. Síndrome nefrótico. 5. Cirrosis alcohólica con bloqueo β−γ. 6. Suero con hiper
gamma globulina monoclonal.
VALORES NORMALES: Albúmina: 55-69%; Alfa-1: 1.5-4%; Alfa-2:8-13%.
Beta:7-15%; Gamma: 9-18%.
PROCEDIMIENTO.
a) Preparación del tampón de electroforesis.
El tampón para la electroforesis es un tampón barbital de pH= 8,6. Se prepararán 300 ml por
dilución de un stock 10x que se repartirán entre los dos receptáculos (+ : rojo; - : negro) del tanque
de electroforesis.
b) Preparación y aplicación de la muestra.
1. Muestras: usar muestras de suero frescas sin diluir. No usar muestras hemolizadas (la
hemólisis aumenta las fracciones α2 y β). No usar muestras de plasma.
2. Dispensar 120 µL de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco impreso
en el soporte del aplicador K 20.
3. Sacar el gel de agarosa de su envoltorio y secar el exceso de tampón con un papel de filtro
fino.
4. Colocar el soporte hydragel apoyando su base contra el tope situado en la base del marco
impreso. Hacer que el gel contacte con el agua de forma que quede colocado en la base.
5. Aplicar las muestras: se aplican 10 µL de suero sin diluir en los pocillos del aplicador.
MUESTRA
Una vez se han cargado las muestras, dejar transcurrir 3 minutos antes de poner en contacto
el aplicador con el gel
Colocar el aplicador en la posición n º 7 de su soporte.
Bajar el soporte para que el aplicador contacte con el gel y dejarlo en esta posición durante
40 segundos. Cuando haya pasado ese tiempo, girar la rueda para elevar el aplicador.
d) Electroforesis.
1. Colocar el gel en el tanque de electroforesis. La agarosa debe estar orientada hacia
abajo (cara cóncava del montaje)
2. Migración: condiciones de migración.
Voltaje: 90 V
Tiempo: 22 minutos
Corriente inicial (1 gel): 12 ± 3 Ma
e) Fijación y coloración.
1. Fijación:
Fijar el gel con aire caliente o con solución fijadora. Se recomienda secar con aire caliente.
IMPORTANTE: Asegurarse de que el gel está completamente seco y dejar que se enfríe
antes de teñirlo.
2. Tinción y decoloración:
a) TINCIÓN durante 4 minutos. Para preparar el colorante, diluir 1 vial de 20 mL de
colorante en solución diluyente (60 mL) y añadir 200 mL de agua.
b) DECOLORACIÓN. La solución de decoloración se prepara diluyendo 1 mL de stock
en 1 L de agua. Repartir en 3 baños de decolorante. Pasar el gel sucesivamente por los tres baños
hasta que las bandas queden nítidas.
c) SECADO del gel con aire caliente.
d) Limpiar de cualquier partícula de polvo o colorante la cara opuesta a aquella en la
que está el gel en el montaje.
f) Densitometría.
Leer el gel a 570 nm en el escáner Epson 700. Colocar el gel boca abajo en el marco que
se provee al respecto y aplicar el programa Phoresis diseñado para cuantificar las bandas que
aparecen en el gel.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
Ponga como anexo al cuaderno el original o una fotocopia del gel y, al menos, dos
densitogramas de los obtenidos. Indique en la siguiente tabla las características de todos los sueros
analizados.
Número de suero Características del suero
