Universidad Autónoma del Estado de
Hidalgo
Escuela Superior de Apan
Licenciatura en Ingeniería en
Nanotecnología
Catedrático: Dr. Aldo Christiaan Jardínez
Verá
“Microscopía Cryo-Sem”
Integrantes del equipo:
López García María Fernanda
Hernández Gomez Leonardo de Jesús
Hernández Vargas Ulises Sebastián
Fecha de entrega: 25/10/2023
INTRODUCCIÓN:
En este protocolo el tema que se llevará a cabo será la criomicroscopía y se
mencionara el que es, como funciona, cómo se logró llegar hasta ella, sus ventajas,
limitaciones, como se prepara la muestra, las partes del microscopio y las
conclusiones a las que llegamos.
Este método consiste en un microscopio electrónico que funciona a temperaturas
criogénicas (aproximadamente -180 °C) que nos permite conocer a fondo la
estructura de proteínas. Gracias a esto podemos saber el funcionamiento de estas y
así mismo también podemos alterar el funcionamiento de distintas drogas.
El Premio Nobel de Química 2017, fue otorgado a los tres científicos e
investigadores Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richar Henderson por
desarrollar la criomicroscopía electrónica para la determinación estructural en
resolución de biomoléculas en soluciones”.
Los investigadores desarrollaron un proceso que permite que las biomoléculas se
congelen de manera rápida sin afectar su forma natural y puedan ser estudiadas
con la microscopía electrónica. La Bioquímica fue llevada a una nueva era, ya que
se pueden conocer los detalles de las moléculas en las células y los fluidos
corporales.
Con este microscopio se quiere tratar de diseñar fármacos o trabajar la ingeniería de
proteínas para así modificarlas y obtener nuevas funciones, o estudiar proteínas
involucradas en enfermedades para que con la estructura y funcionamiento que se
obtiene, se puedan diseñar fármacos para curar o disminuir los padecimientos.
Solo hay 3 métodos que estudian las estructuras de las proteínas: la resonancia
magnética nuclear, la cristalografía y la criomicroscopía electrónica. En el caso de la
resonancia magnética tiene limitaciones como el tamaño de las proteínas que se
puede estudiar, pero también tiene la ventaja de que se puede conocer la estructura
en solución acuosa; en la cristalografía es que no siempre se pueden obtener
cristales de proteínas y no se permiten conocer todos los cambios que una proteína
puede experimentar en una solución acuosa, en cambio la criomicroscopía
electrónica permite obtener la estructura de las moléculas hidratadas sin importar su
tamaño, sin necesidad de cristalizarse y en un medio acuoso.
ANTECEDENTES:
La contribución del microscopio electrónico de transmisión en 1934 fue un hecho
excepcional gracias a ello se permitió estudiar y analizar materiales a escala
nanométrica pero había un un problema a la hora de estudiar biomoléculas en
medios acuosos es por ello que se iniciaron esfuerzos para corregir los problemas
asociados a la observación de biomoléculas en medio acuoso debidos al alto vacío
y daño por radiación electrónica. Una solución fue usar temperaturas criogénicas lo
cual condujo a la microscopía electrónica de baja temperatura para observar
biomoléculas congelado-hidratadas y a la invención del Crio-ME en 1966. El
desarrollo de la incipiente Crio-ME fue lento hasta el 2014 cuando el desarrollo de
las técnicas de reconstrucción 3D de partículas aisladas y de los detectores de
electrones directos revolucionaron el campo convirtiendo la Crio-ME de partículas
aisladas en la técnica que permite la determinación directa –sin requerir
cristalización- de la estructura atómica de biomoléculas en solución.
La invención del microscopio electrónico (ME) de transmisión fue en 1934 por
Ernest Ruska que le valió el Premio Nobel de Física en 1986. Pero Luego de que se
cuestionaran que dichos microscopios no podrían ser usados para el estudio de
especímenes biológicos ya que el intenso haz electrónico los destruiría, se dieron a
la tarea de proponer soluciones a dicho problema como enfriar muestras o usar
técnicas alternativas para preparar estas muestras.
En 1945 se introdujo la tinción negativa y fue desarrollada en los años siguientes,
resolvió el problema del daño por radiación y el bajo contraste de los especímenes
biológicos mediante el uso de sales de metales pesados como el acetato de uranilo.
En 1952 Fernández Morán introdujo la crio-ultramicrotomía, años después en 1966
construyó el primer criomicroscopio electrónico con lentes superconductoras a
temperatura de helio líquido en la Universidad de Chicago (EE.UU.).
La observación de biomoléculas a temperatura ambiente en el microscopio
electrónico intentando preservar intacta su hidratación condujo a Parson en 1972 al
desarrollo de cámaras ambientales con atmósfera húmeda mantenidas a
temperatura ambiente en el microscopio electrónico y a Unwin y Henderson en 1975
a reemplazar el agua de hidratación por una solución de glucosa, alcanzando una
sorprendente resolución de 7Å.
Un hito muy importante ocurrió en 1990 cuando Henderson y colaboradores
demostraron que podían determinar la estructura a 3,5 Å de resolución de
bacteriorodopsina mediante el uso de crio-ME promediando muchas imágenes del
mismo objeto, avance que disparó una secuela de varios estudios de similar alta
resolución.
Logrando en el 2014 la determinación de la estructura atómica de biomoléculas
(“partículas”) aisladas sin necesidad de cristalizarse como requiere la cristalografía
de rayos-X.
En 2017 La Academia Real Sueca de Ciencias decidió otorgarles el Premio Nobel
de Química a tres personajes importantes para la determinación de la estructura a
alta resolución de biomoléculas en solución:
Jacques Dubochet por desarrollar métodos para preparar especímenes congelados
hidratados, Joachim Frank por desarrollar métodos de partículas aisladas para
determinar la estructura de biomoléculas en solución y Richard Henderson por
lograr alcanzar resolución atómica en estructuras de biomoléculas por crio-ME
METODOLOGÍA:
El Microscopio Electrónico de Barrido Criogénico, como ya ha sido mencionado,
trabaja con muestras criogénicas, esto para resolver distintos problemas que se
daban al momento de estudiar muestras que estaban en otras condiciones que el
microscopio electrónico de barrido no podían trabajar correctamente las muestras.
¿Qué problemas se buscaba solventar?
● El bajo contraste de las imágenes.
● La destrucción del espécimen o la muestra por la radiación del haz
electrónico.
● Evaporación del agua del espécimen por el alto vacío.
● El espécimen o la muestra tenía que ser delgada para poder ser estudiada.
● El espécimen se mueve al interaccionar con los electrones del haz
electrónico y por variaciones térmicas.
● Estudio de biomoléculas en medio acuoso.
Se crea una reconstrucción en tres dimensiones a partir de imágenes
bidimensionales inclinadas a temperaturas criogénicas.
¿Cuáles son los componentes del microscopio electrónico de barrido criogénico?
Para hablar del Cryo-sem se divide en dos partes:
● El sistema criogénico para la muestras
● El sistema base del Microscopio Electrónico de Barrido
Iniciemos rápidamente con el mecanismo al cual hemos tenido algunos
conocimientos y bases para su entendimiento, el SEM.
(Scanning Electron Microscopy - Nanoscience instruments, s. f.)
Los electrones se producen en la parte superior de la columna del cañón de
electrones y se aceleran a través de la columna a un voltaje de aceleración
específico de entre 1 keV – 30 keV (1 keV = 1.602 177 x 10−19 J). Las lentes y
aperturas del condensador actúan para reducir el diámetro del haz. La última
lente de la columna es la lente objetivo, que enfoca el haz en la superficie de la
muestra. El diámetro del haz en un SEM puede variar desde <1 nanómetro hasta
20 nanómetros, dependiendo del tipo de cañón de electrones, el voltaje de
aceleración y la configuración de la lente.
La muestra en sí se monta en un escenario en el área de la cámara (con algunas
modificaciones pues ahora se visualizan muestras criogénicas y se necesita de
una preparación y estudio distinto) y tanto la columna como la cámara se
mantienen al vacío mediante una combinación de bombas. El nivel de vacío
dependerá del diseño del microscopio ,como se verá a continuación de explicar
el mecanismo “Cryo”. Algunos microscopios permiten un bombeo variable, lo que
permite mantener la cámara de muestra a un nivel de vacío más bajo que el
resto de la columna para admitir imágenes con bajo vacío.
La posición del haz de electrones sobre la muestra se controla mediante bobinas
de exploración situadas encima de la lente objetivo. Estas bobinas permiten
escanear el haz sobre la superficie de la muestra en el plano X-Y. El haz
escaneado incide en la muestra, generando una variedad de señales.
El generador de escaneo, junto con una computadora externa que contiene
software especializado, puede sincronizar la información del generador de
escaneo que contiene la posición X,Y del haz en cada período de tiempo, con la
intensidad adquirida por el detector, lo que permite generar una imagen
mostrarse y visualizarse en tiempo real píxel a píxel.
Ahora bien, esta es la primera parte del Cryo-sem (Cryogenic Scanning Electron
Microscope), ahora, se explicará cómo se trabaja en muestras criogénicas, un
mecanismo añadido al SEM como lo muestra la imagen siguiente:
(Introducing Cryo Scanning Electron Microscopy | Applications Notes | JEOL Ltd.,
s. f.
El sistema de la figura anterior integra la cámara criogénica y la etapa fría, lo que
permite que simplemente un tanque de nitrógeno enfríe la cámara y la etapa, las
cuales son señaladas en la imagen. La muestra se debe ingresar en este tanque
para que pueda congelarse y entrar en una temperatura de hasta -196° C, lo que
permite que las proteínas se movilicen en una capa delgada de hielo y se
coloquen en diferentes orientaciones, orientaciones que después se podrán
estudiar y recrear en sistemas 3d, más adelante se explicará cómo es el
proceso. En cuestión de milisegundos la muestra al ser sumergida en el
nitrógeno ya entrará en el estado adecuado para ser estudiada. La muestra se
carga en la etapa de proceso de muestra a través de un sistema que evita el
contacto con el aire y que conecta a la cámara criogénica. Pero claro, debe
mantenerse en su microambiente, puesto que si llega a disminuir la temperatura
en la muestra o aumenta ocasionará que no pueda ser estudiada de la misma
manera pues ahora las imágenes de la reconstrucción serán erróneas; es por
ello que es necesario, pues evitamos que se pierda agua de nuestra muestra
que ya sabremos que está en un medio acuoso, y evitar la formación de hielo
exógeno que dañara el estudio de la muestra.
También la muestra puede ser cortada con un cuchillo frío integrado a la cámara
para obtener imágenes de su estructura interna. Existen dos maneras de poder
ser estudiadas, una de ellas es que si se decide, puede añadirse un
recubrimiento de oro en la muestra pero lo más general sería trabajar la muestra
con el procedimiento de nitrógeno líquido.
La transferencia entre componentes del equipo se puede lograr manteniendo la
muestra bajo nitrógeno líquido o dentro de un recipiente sellado. A medida que la
muestra se congela se logra abrir las células, esto permite obtener imágenes de
su contenido, incluidas membranas/orgánulos, citoplasma y vacuolas. El tejido
criofracturado, es decir, el tejido que fue cortado por el cuchillo de frio,
generalmente tiene una topografía compleja y las líneas de fractura a veces
están influenciadas por propiedades estructurales/mecánicas que brindan
información útil sobre los límites naturales tanto a escala tisular como subcelular.
Como ya se mencionó se puede añadir una capa de algún metal conductor si se
desea imágenes más precisas o dependiendo de qué tipo de estudio se quiere
realizar en la muestra.
De igual manera, una recomendación muy importante a la hora de preparar
nuestra muestra esta necesita de una congelación preliminar antes de entrar a la
cámara criogénica o puede hacerlo sin pasar esta etapa; esto ocurre en muestra
que tienen humedad, ya que el agua dentro de la muestra si es sumergida en el
nitrógeno líquido podría ocasionar que al expandirse por entrar en contacto con
el nitrógeno pueda reventar la muestra y ocasionar imágenes que aún si se
aplica el procedimiento correcto de estudio y reconstrucción de imágenes
podremos notar imágenes pocas y borrosas. Para ello existe un paso adicional si
se trata de una muestra con cantidades grandes de agua:
Antes de añadirse directamente al nitrógeno, tenemos una placa metálica donde
reposará la muestra, esta placa es enfriada previamente con nitrógeno líquido, la
placa se presionará en la muestra y lograremos el proceso indicado para poder
tener la muestra acuosa en una base para su estudio.
De manera resumida: “Si nuestra muestra está en medio acuoso aplicamos
nitrógeno previamente a la base metálica y presionamos sobre nuestra muestra
y ahora si puede continuar con el proceso de añadirse a la cámara criogénica” o
bien “Si la muestra solo quiere estudiarse y no está en medio acuoso como un
tallo de hoja o una molécula se sumerge directamente la muestra en nitrógeno
líquido para su posterior ingreso a la cámara”. Ejemplo de ello es:
(Introducing Cryo Scanning Electron Microscopy | Applications Notes | JEOL Ltd.,
s. f.)
Otro uso del haz de iones es la obtención de imágenes. Los microscopios de
iones de He tienen una resolución de nivel Angstrom con buen contraste y mejor
compensación de carga. El uso de estos iones es de los más usados en este
método, pues tendremos un mejor estudio. El verdadero poder del uso de haz de
iones de He es para eliminar pequeñas cantidades definidas de material,
produciendo una nueva cara para la obtención de imágenes en el Cryo-SEM
posteriores de mejor calidad.
La interacción de los electrones con la muestra la calienta, ioniza y puede
destruirla en pocos segundos; para evitar esto se han diseñado protocolos en los
que en la zona en la que se toman los datos se ilumina el menor tiempo y con la
menor dosis posible.
Las siguientes imágenes detallan el procedimiento necesario para preparar
correctamente la muestra:
(Introducing Cryo Scanning Electron Microscopy | Applications Notes | JEOL Ltd.,
s. f.)
(Introducing Cryo Scanning Electron Microscopy | Applications Notes | JEOL Ltd.,
s. f.)
La posibilidad de tomar decenas de “fotogramas” por segundo permite corregir
las distorsiones producidas en la imagen por el movimiento de dilatación de la
muestra. Todo ello redunda en una calidad de imágenes muy superior a las
anteriormente existentes.
Para finalizar, se hablará de cómo se procesan las imágenes:
● Corrección de las imágenes generadas por el microscopio: En esta etapa
se procura eliminar todas las distorsiones presentes en las imágenes
tomadas por el microscopio.
● Extracción y selección de las partículas: Se realiza una clasificación
también automática de las imágenes que en la mayoría de los casos nos
permite separar las proyecciones reales de nuestra muestra de los falsos
positivos.
● Generación de un primer mapa: El procesamiento se basa en la
comparación de las imágenes obtenidas de la muestra con las
proyecciones de un modelo, esto permite asignar las direcciones de
proyección a los datos experimentales y realizar una reconstrucción.
● Determinación de la heterogeneidad presente en la muestra: Generando
una reconstrucción preliminar como se indica en el apartado anterior ésta
se puede usar como modelo para realizar una clasificación tridimensional
que separe los diferentes confórmeros de la muestra.
● Obtención de las estructuras finales: Los grupos de imágenes
pertenecientes a una única estructura tridimensional son refinados por
separado siguiendo un proceso iterativo en el que cada vez las
direcciones de proyección son calculadas con mayor precisión.
Así es como se logra un resultado correcto utilizando el Cryo-SEM. En la
siguiente imagen se explica de manera rápida el proceso de imágenes:
¿Qué tipo de muestras se pueden ver en el Cryo-SEM?
Podemos ver cualquier muestra, pero esto depende del enfoque que se requiere,
particularmente se ocupa para ver:
● Proteínas
● Aminoácidos
● Virus
● Bacterias
● Tejido de animales
● Macromoléculas
● Plantas
● Tejido celular
● Hongos
● Nanoestructuras
● Particularmente alguna muestra que esté en un medio acuoso y que no
puede ingresarse en cualquier otro tipo de microscopio pues dañaremos la
muestra y no se obtendrán las imágenes correctas.
Representación de la estructura del virus Zika por cryo-SEM
VENTAJAS
● Una de las mayores ventajas de la criomicroscopía electrónica es que las
imágenes son tomadas en condiciones cercanas al ambiente biológico real.
● Dado que el agua ocupa hasta el 90% de algunos tejidos animales y
vegetales, este método es esencial para la observación de muestras
biológicas, húmedas o sensibles al haz, mediante la inmovilización de agua y
materiales solubles por congelación.
● Elimina la necesidad de métodos de preparación convencionales como la
fijación química y secado de puntos críticos, permitiendo la observación de
muestras en su estado hidratado natural.
DESVENTAJAS:
● No debe haber modificación en la temperatura de la muestra ya que esta
puede arruinar la preparación.
● La protección que brinda la baja temperatura por radiación es limitada.
● La ausencia de un agente de tinción hace que el contraste de la muestra sea
muy pequeño y produce imágenes con una relación señal- ruido mucho
menos que las muestras teñidas.
CONCLUSIONES:
La criomicroscopía fue una nueva era que revolucionó a grandes rasgos como en la
bioquímica gracias a que con esta podemos observar de manera tridimensional la
estructura de ciertas proteínas y con ello llevar a cabo una investigación más
profunda de su funcionamiento de la modificación de estas mismas.
Tienen múltiples aplicaciones, gracias a estos métodos se han podido conocer cómo
son los tejidos celulares en base a la construcción de imágenes en 2d, algunas más,
es conocer como trabajan las proteínas; otras más es en producción de fármacos
gracias al conocimiento de las funciones que presentan algunos aminoácidos y
proteínas en otras moléculas. Matriz de diversos polisacáridos y proteínas que sufre
cambios dinámicos para facilitar la expansión celular.
Entre muchas otras más aplicaciones a niveles moleculares y en tejidos.
Podemos decir que el método de cryo-sem proporciona de una forma rápida,
confiable y efectiva resultados de muestras que se encuentran casi en su estado
natural en este caso las muestras hidratadas por lo tanto es útil para observar
morfología y anatomía de muestras biológicas sin necesidad de eliminar el agua sin
que sufra cambios mecánicos.
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