LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA E INMUNOLOGIA
MICROBIOLOGIA GENERAL
SEMESTRE 2023-I
PRACTICA N° 2
MATERIAL DE VIDRIO Y EQUI´POS DE USO FRECUENTE EN
LABORATORIO.
OBJETIVO.
Familiarizar al alumno con el uso y manejo de los diferentes materiales de vidrio y equipos que son utilizados
con mayor frecuencia en el laboratorio de Microbiología.
I. MATERIAL DE VIDRIO
GENERALIDADES
El material de vidrio, constituye una de las principales herramientas de trabajo en el Laboratorio de
Microbiología.
Existe una gran variedad de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio. Como requisito general el material
de vidrio debe ser:
• De buena calidad, preferentemente de vidrio neutro.
• Resistente a la acción mecánica y cambios de temperatura, ya que estas son sometidas a repetidas
esterilizaciones.
• Ser transparente, de superficie lisa, sin rayaduras.
• Contener una mínima cantidad de álcali libre.
• Tener bajo coeficiente de dilatación.
• Se conoce muchas marcas con estas propiedades, siendo Pirex y Kimax, las mas conocidas y de máxima
garantía.
TUBOS DE PRUEBA O ENSAYO
Se recomienda que sean de vidrio neutro, paredes gruesas y con reborde para facilitar el taponamiento, si son
con tapa de rosca, deben ser también de vidrio neutro. Se describe el material más indispensable y su uso
generalizado.
Medidas:
10 x 75mm (para estudios serológicos)
13 x 100mm (para estudios de diferenciación bioquímica, pruebas serológicas y cultivo de microorganismos).
16 x 150mm (para cultivo microbiano)
18 x 150mm (para cultivo microbiano)
Tubos de centrífuga: Las medidas son variadas desde 10 cc a 250cc graduadas en cm o mm. Pueden ser
cónicas y cilíndricas y siempre de paredes gruesas.
PLACAS PETRI
Compuesta de dos cristalizadores, de las cuales el más grande hace la tapa. Las más usadas son de 10, 15 ó
20mm x 100mm
Se emplean para el cultivo y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser reemplazada por material de
porcelana o metal sin esmalte en la superficie interna, para evitar acumulación de agua de condensación.
Se debe cuidar que las tapas y las bases de las placas sean las adecuadas para evitar que estén muy ajustadas o
muy sueltas.
Existen también con divisiones internas de dos y cuatro compartimentos.
PLACAS DE BREWER
Se utilizan para el almacenamiento y cultivos de microorganismos anaerobios. Son similares a las anteriores
con excepción de que la tapa es muy pesada, están adaptadas para crear anaerobiosis.
PIPETAS
Se utiliza de dos tipos: Serológicas y Volumétricas.
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• Serológicas o de medida: Con subdivisiones de su capacidad total, se calibran en ml a 20°C. Las mejor
aforadas son de las marcas Pyrex, Normax, Corning, IVA, Kimac, etc.
Estas pipetas son terminales y con capacidad de 0.2 a 25ml y las de mayor uso son:
Dispensar líquidos en pequeño volúmenes
• Pipetas de 25ml 2/10
• Pipetas de 10ml 1/10
• Pipetas de 5ml 1/10
• Pipetas de 2ml 1/10, 1/100
• Pipetas de 1ml 1/10, 1/100
• Pipetas de 0.1ml 1/10, 1/100
• Volumétricas: Solo tienen una graduación indicadora que su capacidad total y únicamente deben
emplearse para la transferencia a medida del volumen correspondiente.
Presentan una dilatación bulbosa central con una marca de aforamiento conocida, en el extremo proximal
angosto de la pipeta, se les llama también pipeta de bola.
Las medidas mas conocidas son de 10, 25, 50 y 100ml.
PIPETAS PASTEUR
Confeccionada de varillas de vidrio de diámetro de 4 x 20mm y de 30 ó 40cm de longitud.
La calidad de vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la acción directa de la llama de mechero, para
conseguir por estiramiento la capilaridad deseada. Se emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.
MATRACES Y ERLENMEYER
Recipiente volumétrico útiles para la preparación y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos,
medios de cultivo, etc., las más comunes son de 100, 250, 500 y 1000ml.
FIOLAS
Idénticas a los matraces, están calibradas a medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del
recipiente en el que indica la medida. Se emplea para la preparación de reactivos y de preferencia soluciones
buffer. Existen de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000ml.
KITASATO
Son matraces que además de la boca tienen una tubulación corta lateral para hacer el vacío. Se utiliza como
complemento del equipo de filtración (esterilización en frío). Las medidas son las mismas que de los matraces
comunes.
ESPATULA DE DRIGALSKI
Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fracción recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento
de bacterias por diseminación.
PROBETA
Recipientes cilíndricos con base para estabilidad, sus paredes son de un diámetro mayor que de los materiales
indicados anteriormente tienen graduaciones y pueden venir con o sin tapa. Se utiliza para realizar mediciones
volumétricas, su capacidad varia desde 10 a 2000ml. Las más utilizadas son de 100, 250, 500 y 1000ml.
BEAKERS O VASOS DE PRECIPITACION
Recipientes cilíndricos y cortos con una depresión en el margen de la bocadura (pico). Su utilidad es muy
amplia. Se fabrica de varias medidas desde 10 hasta 4000ml. Muy comunes para facilitar la mezcla de una
solución. El vidrio debe ser muy resistente al calor.
VARILLAS DE VIDRIO MACIZO
Fragmento de 30 a 60cm, que sirve para la confección de agitadores o baguetas.
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PERLAS DE VIDRIO
De 4 a 6mm, se emplean para desfibrinar sangre y para recoger cosechas microbianas en la preparación de
antígeno.
FRASCOS PARA ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS
Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color oscuro, algunos con tapas especiales para
facilitar su vaciado. Los hay pequeños o grandes. En los primeros se pueden almacenar por ej. Reactivos para
coloración Gram, HCl, etc. En los frascos grandes se puede almacenar reactivos, desinfectantes u otros
colorantes.
PORTA Y CUBRE OBJETOS
Los portaobjetos son láminas de vidrio transparente de forma rectangular y de pequeño grosor. Los
cubreobjetos son finísimas laminillas de menor tamaño que el portaobjeto y pueden ser de forma rectangular,
cuadrado o circular.
Ambos son material indispensable para las observaciones microscópicas de las bacterias u otros
microorganismos.
OTROS MATERIALES DE VIDRIO
Existen otros materiales de vidrio de uso microbiológico como: Embudos con cuellos cortos o largos, goteros,
lunas de reloj de diversos diámetros, termómetros clínicos y de ambiente, cápsulas de porcelanas con fondo
plano o redondo, cámara Neubauer, pipeta cuentaglóbulos jeringas y agujas hipodérmicas.
II. MATERIALES DE OTRA NATURALEZA
MANGO DE KOLLE
Vástago de metal con su cubierta de ebonita aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para
insertar el alambre de platino o micrón en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio.
ESTUCHES CILINDRICOS O CUBILARES
De cobre estañado, para esterilizar pipetas, hay cilíndricos solamente para la esterilización de placas petri.
MECHERO BUNSEN
Imprescindible en microbiología. Son de metal con una tuerca movediza para regular al intensidad de la
llama.
CANASTILLA O CESTO DE METAL.
Las mejores son de aluminio. Favorecen el mejor almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas,
sin riesgo de roturas.
ESPATURLA DE METAL
Las espátulas son de acero inoxidable y sirven para transferir sustancias deshidratadas o en polvo (medios de
cultivo, colorantes, etc.) cuando se pesan para su preparación. Estas espátulas vienen fijadas a un mango de
madera o pueden ser totalmente de material inoxidable.
GRADILLAS
Pueden ser de alambre metálico, madera, acero inoxidable o plastificadas, estas últimas son las más
recomiendas. Soportan tubos de diferentes medidas y cantidades.
SOPORTES UNIVERSALES
Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beakers, etc. Son de metal, de
preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento de variada altura y
diámetro
TRIPODE
Son de metal de preferencia de fierro, Muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento de
variada altura y diámetro.
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III. EQUIPOS DE LABORATORIO
MICROSCOPIO
El microscopio es uno de los instrumentos más frecuentemente usados en el laboratorio. Esta compuesto
básicamente por:
El sistema óptico.
El sistema de iluminación
El sistema de ajuste.
El sistema óptico
Consiste de:
• Los objetivos: Se encuentran entornillados al revolver. Son los lentes principales y están compuestos a
su vez de una serie de lentes. Se distinguen según sus equivalentes de distancia focal. Los microscopios
están provistas de 3 – 4 objetivos de bajo poder 5x, 10x, 40x y el objetivo de inmersión de 97x ó 100x.
La apertura numérica (AN) se encuentra grabada en el tubo del objetivo, a mayor AN mayor es el poder
de resolución (capacidad de hacer perceptible detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y
acercándolos).
• El ocular: Lente que amplifica la imagen formada por el objetivo. El microscopio debe estar provisto de
dos oculares de preferencia de 10x y 5x
• El condensador: Su misión es concentrar la luz sobre el objetivo colocado sobre la platina, consiguiendo
así una iluminación adecuada. Se construye generalmente con un sistema de dos lentes y tienen un
diafragma, el cual permite reducir o ampliar el ángulo y por lo tanto la cantidad de luz que entra en el
condensador. En los microscopios modernos se usan condensadores aplanáticos y acromáticos
El sistema de iluminación.
Se consigue mediante el espejo, el cual refleja la luz hacia el condensador. La fuente ideal de iluminación es
la luz natural del día, empleándose es este caso espejo plano, se embargo se obtiene con una iluminación con
una lámpara apropiada usando el espejo convexo. Los microscopios binoculares y modernos cuentan con un
sistema de iluminación incorporada.
El sistema de ajuste.
Este sistema comprende:
• El tornillo macrométrico: Se utiliza para lograr la aproximación del enfoque.
• El tornillo micrométrico: Permite que el objetivo se desplace lentamente. Se emplea para conseguir un
enfoque perfecto del objetivo.
• El tornillo del condensador: Se utiliza para elevar en condensador o aumentar la iluminación o
descenderlo y reducir la misma.
• Los tornillos de centrado del condensador: puede haber tres tornillos situados alrededor del condensador.
Se usa para centrar el condensador exactamente en relación con el objetivo.
• Reguladores de la platina: Se usan para mover la lámina portaobjeto hacia la derecha o izquierda, hacia
delante o atrás.
HORNO
El horno es un aparato de forma rectangular que posee paredes dobles revestidas de amianto o fibras de vidrio
para mantener el calor generado. En el interior y en la parte externa superior tiene orificios para la ventilación
y un dispositivo donde se encuentra fijo el termómetro graduado hasta 200°C.
Seutiliza para la esterilización de material de vidrio como placa petri¸ tubos, pipetas e instrumentos
metálicos.
En cualquier proceso de esterilización por el calor es absolutamente esencial que el objeto sea calentado por
todas partes por igual y que la temperatura de su “centro” sea sostenida a un grado bastante elevado para
matar y destruir las bacterias tanto la forma vegetativa y esporulada.
Funcionamiento
El material que se esteriliza en el horno debe estar completamente seco.
Se coloca en canastillas o recipientes y se deja durante 1 hora a 170 – 180°C
Transcurrido dicho tiempo, se deja enfriar el horno por si solo, ya que la apertura del aparato caliente produce
rotura o daño del material por el cambio brusco de temperatura.
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AUTOCLAVE
El autoclave provee un medio eficaz y practico de esterilización, por cuanto destruye tanto la forma vegetativa
como esporulada, en un tiempo comprendido entre 15 a 30 minutos. Como se sabe el agua hierve a 100°C
según la presión atmosférica, pero si se aumenta esta, la temperatura será mas alta, lo que se logra con el
autoclave.
Componentes del autoclave
• Caldera: Consiste en un cilindro amplio y profundo de paredes muy gruesas.
• Canasta: Es un cilindro de paredes delgadas donde se coloca el material a esterilizar.
• Soporte de canasta: Se encuentra en el fondo del autoclave, y sostiene la canasta por encima del nivel del
agua.
• Drenaje: Llave de paso colocado en la base de la caldera, por donde sale el exceso del agua.
• Tapa: Esta cubre y cierra herméticamente la caldera, se ajusta mediante una arandela de jebe.
• Sujetadores de la tapa: Se encuentran fijos a la caldera y conjuntamente con la arandela de jebe cierra
herméticamente la tapa e impide el escape de vapor.
• Válvula de salida del aire: Se encuentra en la parte superior de la tapa, se emplea para dejar que salga el
aire cuando empieza el agua a calentar.
• Válvula de seguridad: Esta válvula deja escapar el vapor cuando la presión de eleva demasiado, evitando
que ocurra una explosión.
• Manómetro: Se ubica en la parte superior de la tapa, indica las libras de presión de vapor de agua.
• Termómetro: Indica la temperatura en grados centígrados, se encuentra en la parte superior de la tapa.
Funcionamiento:
Llenar con agua el fondo del autoclave hasta el soporte de la canasta Estar seguro que el agua no sobrepase
ese nivel, si hay exceso eliminar a través del drenaje.
Introducir el material a esterilizar al autoclave, colocándolo sobre la canasta.
Cerrar la tapa del autoclave, atornillar los sujetadores a niveles iguales, con firmeza pero sin apretar
demasiado.
Abrir la válvula de salida de aire.
Encender el mechero de gas o conectar la llave de corriente, para calentar el autoclave.
Vigilar la válvula de salida del aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Dejar salir por 3 – 4 minutos
hasta que éste sea uniforme y continuo. Esto indicará que todo el aire ha sido reemplazado por vapor.
Cerrar la válvula de salida del aire, ajustar los sujetadores de la tapa y reducir la temperatura ligeramente.
Observar el manómetro (libras de presión) y el termómetro hasta ajustar a la temperatura deseada, regulando
el calor.
Una vez alcanzada la temperatura y presión deseada, empezar a medir el tiempo.
Apagar la fuente de calor cumpliendo el tiempo.
Cuando la temperatura descienda a menos de 100°C, abrir la salida del aire para igualar las presiones dentro
y fuera del autoclave.
Cuando cese el silbido, aflojar los sujetadores de la tapa. Abrir la tapa y, a continuación retirar el material
estéril cuidadosamente.
Si se han formado gotas de agua sobre o dentro del material esterilizado, sacarlos de una estufa a 37°C.
EQUIVALENCIAS DE LIBRAS DE PRESION Y GRADOS CENTIGRADOS.
Presión manométrica Temperatura
Libra/ pulg
5 ............................................................................................... 108°C
10 ............................................................................................... 116°C
15 ............................................................................................... 121°C
20.................................................................................................. 127°C
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FILTROS
El pase a través de filtros constituye el único proceso de esterilización para diversos productos o medios de
cultivo, que tendrían alteraciones en sus características por la acción del calor húmedo (autoclave),
principalmente suero sanguíneo, líquido ascítico, enzimas, toxinas y otros.
Existen varios tipos de filtros bacteriológicos:
• Chamberland – pasteur, fabricados de porcelana (caolín- cuarzo).
• Berkefeld, preparado con tierra de diatomeas.
• Seitz, elaborados de asbesto prensado en discos de reducido espesor con dos porosidades: Clarificante y
esterilizante.
• De vidrio poroso, preparado aglutinando vidrio finamente pulverizado.
• Ultrafiltros, fabricado de colodión.
• De éster de celulosa hay dos tipos: Millipore, en discos de 150u de espesor y con 11 diferentes
porosidades y el Polipore con poros desde 4 u hasta 100u.
El frasco de vidrio utilizado para filtrar se denomina Kitasato, el cual tiene una tubuladura lateral para ser
conectada a la manguera de la bomba de vacío. En la boca del Kitasato se coloca el conjunto Tapón –
Soporte dentro del cual se encuentra la membrana de filtro. Todo este conjunto debe esterilizarse al autoclave
(120°C por 15 minutos) antes de su uso.
Procedimientos de filtración
• Verter la sustancia a filtrar en el cilindro metálico que tiene en su base la membrana del filtro.
• La tubuladura lateral del Kitasato provista de un tapón de algodón, es conectada a la manguera de la
bomba de vacío.
• El vacío utilizado no debe ser muy fuerte para que la filtración no sea tan rápida
• El líquido filtra a través del filtro al frasco Kitasato, por acción de la presión de aire originada por
efecto del vacío.
• Terminada la filtración, apagar primero la bomba, luego retirar con mucho cuidado la manguera
conectada a la tubuladura del Kitasato, evitando de quitar el tapón de algodón.
APARATO DE ARNOLD-KOCH
Aparato para la esterilización por calor húmedo, consiste en un cilindro de doble pared con tapa; a una
distancia del fondo, una criba como apoyo a los objetos a esterilizar y agua suficiente por debajo de la placa
criba. Esta actúa al estado de vapor, por acción de una fuente calórica en la base del aparato.
Se esteriliza por este método, sustancias que se desnaturalizan a mayores temperaturas: Ej. Gelatina, bilis,
leche y otros.
BAÑO DE AGUA
Esta constituido de una bandeja que posee un dispositivo enrrollable que puede sumergirse en ella para
calentarla. Estos dispositivos están cubiertos por una rejilla que impide el contacto directo entre el
enrrollamiento y los objetos que van a incubarse y de promover una distribución más uniforme en las
corrientes de convección formadas. Un buen baño se agua es la incubadora más sensible que puede tenerse.
Para evitar la formación de precipitados o costras debe emplearse siempre agua destilada; para impedir la
contaminación con algas y bacterias puede agregarse 12ml. al 10% de Zofirán por cada galón (3.785lt) de
agua. Se debe comprobar a diario la temperatura y nivel de agua.
INCUBADORA
Se debe al mismo principio de calentamiento del horno. Son aparatos provistos de un calentador
interconstruido. La temperatura requerida puede controlarse mediante un termostato. El termostato se
compone de una tira bimetalica que opera como un conmutador o interruptor eléctrico, conectado a un aparato
de calentamiento.
CENTRIFUGA
Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas en líquidos. La velocidad a la
cual sedimentarán las partículas en un líquido depende de varios factores:
Tamaño de la partícula
Peso de la partícula.
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Viscosidad del líquido
Fuerza gravitacional.
La centrifugación es la aceleración del proceso de sedimentación, donde la célula o partícula a sedimentar se
ve sujeta a dos fuerzas de sentido opuesto: Una dirigida al fondo del tubo y la otra que se opone debido a la
viscosidad del medio.
ESPECTROFOTOMETRO
Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida; se utiliza mucho en análisis
bioquímicos. Comprende un espectrofotómetro y un fotómetro. Mediante una fuente de luz y un dispositivo
de monocromía; el espectrofotómetro puede emitir frecuencias luminosas conocidas que varían según el tipo
de aparto empleado pero que corresponden a la región del espectro visible entre 400 y 700nm, El fotómetro es
una célula fotoeléctrica sensible a la gama de longitudes de onda de luz emitida y un galvanómetro que
registro los potenciómetros originados por la célula fotoeléctrica. Estos potenciales son transcritos a una
escala donde figuran lecturas por 100 de transmitancia o de absorvancia.
Las sustancias disueltas tienen determinados colores por que absorben ciertas longitudes de onda de luz y
dejan pasar otras. Cada sustancia absorbe energía radiante de una a otra longitud de onda.
Ej. La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las
longitudes de onda más cortas del azul y del verde.
LIOFILIZADOR
Un liofilizador comprende una a dos bombas al vacío (la segunda bomba permite obtener presiones residuales
inferiores a 0.1 mm de Hg y de un sistema que permite obtener el vapor de agua).
La liofilización es un procedimiento de conservación que es acompañado de una transformación de sustancia
a conservar, la que contiene el principio una concentración elevada.
El principio de la liofilización consiste en congelar bruscamente a bajas temperaturas. El procedimiento
comprende varias etapas: Congelación, eliminación del agua (pasa directamente del estado sólido a vapor, sin
pasar por líquido). Este procedimiento permite conservar al estado seco un número de productos que pueden
constituirse por hidratación.
Para la congelación es necesario que el solvente sea acuoso, ya que la mayor parte de solventes disminuyen el
punto de congelación bajo el riesgo de desnaturalización sobre todo si el material es proteico.
POTENCIOMETRO
Se utiliza para medir el pH de las soluciones buffer y medio de cultivo. Constituido de un par de electrodos
sensibles a concentraciones de hidrogeniones, conectado a un potenciómetro que indica las mediciones. Los
potenciómetros emplean un electrodo de vidrio, unido a un electrodo de calomel como estándar.
El electrodo de vidrio varía con los cambios de pH de las soluciones problema. Debe tenerse extremo cuidado
con el manejo de electrodos, especialmente con la membrana del electrodo de vidrio que es muy delicado y se
rompe al menor contacto con material punzocortantes. El electrodo de Calomel debe estar siempre lleno con
solución adecuada de sal (usualmente cloruro potásico saturado).
Luego de cada medición deben lavarse los electrodos y sumergirlos en agua cuando no se usa el aparato.
REFRIGERADORAS Y CONGELADORAS
Son incubadoras de temperaturas frías. Se requiere para almacenar medios de cultivo, sueros, reactivos
perecederos.
Los congeladores se requieren para almacenamiento más prolongados de sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos del horno de aire caliente, de radiadores de tubería de agua caliente.
