INSTITUTO TECNOLÓGICO EL LLANO

AGUASCALIENTES

MANUAL DE
MICROBIOLOGÍA

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA Y AGRONOMÍA

Tercer semestre

Profesor:
Dra. Karla Yuritzi Amador Rodríguez
El Llano, Ags., Agosto-Diciembre de 2022

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 1

 MANUAL

Asignatura Microbiología
Año de Carrera 2 Semestre 3
Curso Académico Agosto-Diciembre 2022 Carga Docente Práctica
Horario
Karla Y. Amador Rodríguez
Profesores e-mail [Link]@[Link]

CRITERIOS DE EVALUACIÓN
 El alumno deberá seguir el reglamento interno de trabajo del laboratorio de
microbiología, haciendo énfasis en las normas de seguridad e higiene, para el
desarrollo del trabajo de laboratorio
 La calificación del laboratorio representa el rubro de actividades del curso de la
calificación final de la materia. Para aprobar el curso el alumno deberá acreditar
tanto la parte teórica como práctica.
 Se requiere contar con el 90% de las asistencias para que la calificación pueda
tomarse en cuenta. De contar con un porcentaje menor, automáticamente la
calificación sería reprobatoria.
 La falta a las sesiones prácticas se calificará con cero.
 No se permitirá la entrada al laboratorio 15 minutos después de iniciada la sesión.
 Los reportes por equipo y deberán elaborarse según las indicaciones expresas en
cada práctica. No se recibirán reportes de prácticas no realizadas.
 Para la evaluación del reporte se consideran los siguientes puntos:
o Presentación 5 %,
o Introducción 10%
o Resultados 20 %,
o Discusión de resultados 30 %
o Conclusiones 20 % y
o Bibliografía 15 %
 Los reportes se entregarán a los ocho días de verificada y/o concluida la práctica.
No se recibirán reportes fuera de la fecha programada para su entrega.
 El trabajo en el laboratorio se evaluará a criterio del profesor por la calidad del trabajo
que los alumnos realicen durante las sesiones.
 Las visitas se consideran como prácticas, por lo que deberá entregarse un reporte de
las mismas.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 2

 CALENDARIO TENTATIVO DE PRÁCTICAS

 Práctica introductoria al laboratorio

 Práctica 2. El microscopio

 Práctica 3. Preparación de medios de cultivo 1

 Práctica 3. Preparación de medios de cultivo 2

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 3

 INTRODUCCION AL LABORATORIO
PRACTICA 1 Seguridad en el laboratorio

UNIDAD Introductoria I

OBJETIVO

Realizar una práctica de familiarización al laboratorio para conocer las reglas, procedimientos y
algunas técnicas sencillas de determinación en alimentos.

INTRODUCCION

Desde hace tiempo la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en
particular, la seguridad biológica son importantes cuestiones de interés internacional. En 1983,
la OMS publicó la primera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio; en la que se
alentaba a los países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica,
así como elaborar códigos nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de
microorganismos patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras
nacionales.

La tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) proporciona

la información más actualizada para abordar los aspectos de la seguridad y la protección
biológica que se plantean en el nuevo milenio. Asimismo, subraya la importancia de la
responsabilidad personal. Además, hace reflexionar sobre los recientes acontecimientos
mundiales que hacen evidente los peligros para la salud pública derivados de la liberación o el
uso indebido de agentes y toxinas microbianos.

Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios básicos de

seguridad en el trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que implican
su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microorganismos para infectar al ser
Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 4
humano y los animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla
1.

La OMS y los National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las
bases para la jerarquización de los laboratorios en función del grupo de riesgo al que
pertenecen los microorganismos que manejan, indicando las condiciones de acceso, tipo de
personal, equipo especial y diseño específico de las instalaciones.

En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad física de las personas

involucradas; por ello, no podrá realizarse ninguna práctica o actividad experimental si el
ejecutante no cuenta con los elementos de protección indispensables para su desarrollo o no
cumple con las disposiciones normativas aplicables, para lo cual se deberán cumplir siempre las
siguientes reglas.
1. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es
recomendable vestir ropa sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de
algodón, zapatos cerrados, con suelas gruesas y sin tacones o plataformas, así como traer el
pelo recogido.
2. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o
los ojos con las manos.
3. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio,

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 5

incluso cuando salgan por breves periodos.
4. Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes, lentes
protectores y/o mascarillas. No se deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo
microbiano. Siempre se utilizarán propipetas adecuadas para este fin.
5. No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan
en riesgo la seguridad en el trabajo.
6. Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las
actividades de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes.
7. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.

Sobre los procedimientos

1. Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos limpiarán las mesas de trabajo con el
desinfectante que se le proporcionará.
2. Cuando se utilice el mechero, este será colocado en un lugar alejado del microscopio y otros
equipos.
3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de
conservar la calma, inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión.
b. Agregar abundante solución desinfectante sobre las toallas.
c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado
a la eliminación de materiales contaminados.
4. Al concluir cada sesión práctica, el estudiante se asegurará de que los materiales de desecho
u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, así como en
lugares apropiados. Deberán esterilizarse tal y como indique el profesor.

Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar
la ayuda del profesor, del ayudante o del técnico del laboratorio, para adquirir la destreza
necesaria.
2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado
para apagarlo, desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.
3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas
analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el
funcionamiento.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 6

4. Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estén bien cerradas. Dejar
limpias y secas las mesas de trabajo.

Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio

1. El Manual de laboratorio.
2. Cubre bocas y 1 par de guantes de látex.
3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar (masking-tape), marcador
indeleble o etiquetas pequeñas, jabón para manos.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Conocer el laboratorio, los equipos y materiales del laboratorio de microbiología.

RESULTADOS

Cuestionario
1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuántos niveles consta y qué características posee cada uno de
estos niveles?
2. Elabore una tabla que incluya nombre y foto con al menos 5 equipos que se utilizan en el
laboratorio de microbiología.
Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio convencional.
3. Elabore una tabla que incluya nombre y foto con al menos 10 materiales que se utilizan en el
laboratorio de microbiología.
4. Elabore una tabla que incluya nombre y foto con al menos 2 recipientes donde se realizan las
siembras de microorganismos.
5. ¿Cuáles son los riesgos y problemáticas que se pueden presentar en un laboratorio de
microbiología?

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 7

PRACTICA 2 MICROSCOPIO
UNIDAD I

OBJETIVO

Conocer las partes que integran un microscopio, así como el correcto manejo y cuidado del
mismo.

INTRODUCCION

La microbiología es el estudio de los microorganismos y sus actividades, su forma, estructura,

reproducción, fisiología, metabolismo e identificación, cómo están distribuidos en la naturaleza,
sus relaciones con otros seres, los efectos benéficos o perjudiciales que ejercen sobre los
humanos y las alteraciones físicas y químicas que provocan en su medio.

La microbiología empezó cuando el hombre aprendió a pulir piezas de vidrio y a combinarlas

para lograr ampliaciones lo bastante grandes para poder ver los microbios. Anthony van
Leeuwenhoek fue el primero en comunicar sus observaciones con descripciones y dibujos
precisos, Leeuwenhoek observó entre otras cosas, bacterias y protozoarios en el agua de lluvia,
en infusiones diversas y en su sarro dental. Leeuwenhoek registró cuidadosamente sus
observaciones en una serie de cartas dirigidas a la British Royay Society, sus cartas fueron
leídas con interés por científicos británicos, pero es claro que la importancia y trascendencia de
sus descubrimientos no fue debidamente valorada.

El estudio microscópico de los microorganismos proporciona datos fundamentales para su

identificación, determinar su forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y estructuras
celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos y permite establecer
características como la pureza, presencia de contaminantes, variedad o edad de una población,
entre otras cosas. Por ello, el microscopio es uno de los instrumentos de mayor importancia en
bacteriología, su descubrimiento y desarrollo fueron los acontecimientos más importantes en el

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 8

florecimiento de la microbiología.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Muestras
Microscopio

I. CUIDADO DEL MICROSCOPIO E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES

Recibir el microscopio, sujetándolo firmemente con ambas manos para trasladarlo, con una mano
tomarlo de su brazo y con la otra por debajo del soporte o pie, nunca tomarlo de lado o por la
platina porque se puede caer y dañarse irremediablemente. Depositarlo sobre la mesa con
suavidad.

Identificar cada uno de los componentes del microscopio.

Asegurarse de que se encuentren limpias las piezas ópticas, de no ser así, límpielas
cuidadosamente siguiendo el procedimiento para limpieza del microscopio. Los lentes por limpiar
son: oculares, objetivos y condensador; las cuales no deben quitarse de su lugar porque podría
introducirse polvo al interior del microscopio.

Observar los datos del microscopio e identificar:

En el ocular, el coeficiente de aumento.
En el objetivo: el coeficiente de aumento, la apertura numérica, la longitud mecánica del tubo y el
espesor del portaobjeto a emplear.
Calcular el total de amplificación que se puede obtener con los diferentes objetivos.
Alinear el objetivo de menor aumento con el tubo del microscopio.
Con el tornillo macrométrico, acercar al máximo la platina al objetivo, observando lateralmente para
que no lleguen a chocar.

II. ILUMINACIÓN
Encender la lámpara.
Abrir los diafragmas (de campo y de iris).
Subir el condensador.
Seleccionar el objetivo (5X o 10X).
Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre los ojos).
Enfocar con el macrométrico y micrométrico.
Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 9
Cerrar el diafragma de campo.
Descender ligeramente el condensador hasta ver nítido el borde del diafragma de campo.
De ser necesario, centrar el condensador con la ayuda de sus dos tornillos laterales; una vez
centrado el condensador, abrir el diafragma de campo, e intensificar un poco más la luz.

III. ENFOQUE DE LA PREPARACIÓN

Colocar la preparación en la platina.
Con el tornillo macrométrico llevar la platina lo más cercano posible al objetivo (observando
lateralmente).
Observar por el ocular, mover lentamente el tornillo macrométrico para separar el objetivo de la
preparación hasta que aparezca la imagen del objeto.
Para mejorar la nitidez de la imagen utilice el tornillo micrométrico, disminuya la intensidad de la luz
cerrando el diafragma de la lámpara o bajando ligeramente el voltaje de la misma.
Colocar el objeto de interés en el centro del campo microscópico, moviendo ligeramente la platina.
Girar el revólver y alinear el objetivo de 40X con el tubo microscópico.
Observar por el ocular y verificar que la imagen permanezca enfocada ajustar solamente si es
necesario con el tornillo micrométrico nunca con el macrométrico porque esto dañará el
microscopio.
Girar el revolver, colocar sobre la preparación un cubreobjetos y una gota de aceite de inmersión y
continuar girando hasta alinear el objetivo de 100X.
Observar por el ocular y verificar que la imagen permanezca enfocada ajustar si es necesario con
el tornillo micrométrico y para muestras tenidas aumentar la intensidad de la luz.
Después de retirar la preparación y Al terminar de hacer las observaciones, limpiar tanto el ocular
como los objetivos siguiendo el procedimiento para limpieza del microscopio. Dejar el microscopio
con el objetivo de menor aumento alineado con el tubo y lo más cercano posible a la platina.
aceite.

RESULTADOS

Reportar las observaciones de las preparaciones proporcionadas por el profesor, anotar los datos
importantes de la preparación y de la observación: muestra, tinción, aumento total y descripción de
lo observado.

Muestra Tinción Aumento total Descripción de la

observación
Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 10
1. Menciona brevemente como funciona cada uno de los siguientes tipos de microscopio: de
campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de luz ultravioleta, de fluorescencia y
electrónico.
2. ¿Cuál es la principal utilidad de cada uno de los microscopios antes mencionados?
3. Defina lo que es poder de resolución y discuta los factores que lo condicionan.
4. ¿Por qué es necesario el uso de aceite de inmersión cuando se realizan enfoques con el lente
objetivo de alto poder?
5. Describa la técnica correcta para enfocar un frotis bacteriano.
6. ¿Qué cuidados se deben tener en el uso y manejo del microscopio?
7. Defina el término apertura numérica.
8. ¿Por qué los objetivos están ubicados en un revolver?
9. ¿Qué es el índice de refracción?
10. ¿Qué es el índice de difracción

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA

MEDIOS DE CULTIVO 2
PRACTICA 3
UNIDAD Introductoria 2

OBJETIVO

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 11

Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización
de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de
las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

INTRODUCCIÓN
La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la
ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación
incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o
pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su
adecuado manejo.

La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia
en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación,
por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C
durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para
todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se
aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y
cultivos bacterianos que se desechan.

El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in2); con
esta presión el material alcanzauna temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos
se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más
resistentes al calor.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Material Reactivo
15 cajas Petri de vidrio
10 pipetas serológicas de 1.0 mL
5 pipetas serológicas de 10 mL Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 12

2 pipetas Pasteur HCl
4 matraces Erlenmeyer de 500 mL NaOH
1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL Para el agar :casero
4 g Hojuelas papa
1 matraz volumétrico de 100 mL 11.4 g Azucar
3 vasos de precipitados de 100 mL 1000 ml Agua
1 gradilla 14 g agar bacteriológico
3 propipetas mecánicas (1.0, 5.0, 10 mL)
3 espátulas
2 mecheros Fisher
1 piceta con agua destilada
1 piceta con alcohol al 70%
1 potenciómetro
Papel manila o estraza para envolver

Procedimientos

1. Disolver las hojuelas de papa y el azúcar en 500 ml y calentar hasta disolver

2. Agregar agua caliente al agar, y mezclar.
3. Para esterilizar, tapar con plástico y ligas los matraces a esterilizar
4. Colocar en la autoclave que contenga agua en la case, prender la estufe en lo más alto
5. Ya que alcance 15 psi, bajar la flama tratando de mantener la presión y contar 20 min.
6. Dejar enfriar
7. Ajustar el pH a 3.5 agregando HCl (1:100)

RESULTADOS
A. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (+
+) crecimiento regular y (+++)
crecimiento abundante.
B. Describir la morfología de las colonias en el Cuadro 1.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 13

Cuestionario
2. ¿Qué diferencias observó en los resultados obtenidos en tubos y en cajas de Petri? Explique.
3. Describa el tipo de contaminantes microbianos que se encuentran con mayor frecuencia en las
cajas de Petri. ¿Cómo explican estos resultados?
4. ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?
5. Describa los métodos de esterilización que se utilizan en microbiología.

Cuantificación de microorganismos
PRACTICA 4
UNIDAD Introductoria 2

OBJETIVO

Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 14

microorganismos viables y que compare sus resultados de la cuenta viable con los de cuenta
directa en el microscopio.

INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se define como el aumento del número de microorganismos o de

biomasa en un periodo de tiempo determinado. Existen diferentes métodos para detectar y medir
el crecimiento de microorganismos. La forma de cuantificar células viables más utilizada en
microbiología es la de recuento en placa con medios de cultivo específicos para la población de
interés. Consiste en inocular un volumen determinado de cultivo o muestra sobre un medio de
cultivo sólido adecuado para el crecimiento de colonias el crecimiento de colonias. Cada una de
estas deriva de una célula aislada; es decir, una unidad formadora de colonia (UFC).

Hay dos variaciones en la forma de realizar esta técnica: la siembra en superficie o vertido en
placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas y
cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles. Es recomendable homogenizar las diluciones
y hacer la adecuada inoculación de las muestras para evitar resultados erróneos. Si no se separan
bien las células, se obtendrán valores bajos y los valores serán elevados si la toma de muestra se
hace del fondo del tubo donde se concentran los microorganismos por gravedad. El recuento
directo consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de suspensiones
de bacterias. En portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser o de
Neubauer.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Material Reactivo
10 cajas de Petri con PDA 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
15 pipetas de 1 mL 2 balanzas analíticas
2 pipetas de 10 mL 2 pares de guantes de asbesto
10 tubos con 9 mL de solución salina isotónica escobillones, fibra, detergente y toallas de
(SSI) papel
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de 1 piceta con alcohol etílico al 70%
SSI 1 frasco gotero con azul de metilo
1 matraz aforado de 100 mL 1 equipo cuenta colonias
1 pipetero metálico
2 vasos de precipitados de 50 mL
Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 15
1 parrilla con agitación
1 potenciómetro
1 agitador de tubos tipo Vórtex
1 cámara de Neubauer
2 microscopios ópticos
2 pipetas Pasteur
2 mecheros Fisher
2 propipetas de 5 y 10 mL
1 varilla de vidrio doblada en “L”
1 gradilla
1 piceta con agua destilada

Procedimientos
El profesor proporcionará un cultivo líquido de Saccharomyces cerevisiae; todos los equipos de
trabajo determinarán las UFC por diluciones decimales y siembra en placas con medio de cultivo.
Se compararán estos resultados con los de cuenta directa en cámara. Al final, compartirán sus
cuadros de resultados, calcularán la desviación estándar de los resultados y compararan los
resultados del grupo.

Técnica de dilución y siembra en placa (Figura 4)

1. En condiciones asépticas, pipetear 1 mL del cultivo del microorganismo o de la muestra
problema y depositarla en el matraz
Erlenmeyer con 99 mL de SSI. Esta corresponderá a la dilución 10-2. Hacer diluciones decimales
del cultivo hasta 10-7.
2. Para la inoculación por la técnica de superficie, se deposita 0.1 mL de cada una de las
diluciones 10-3-10-7. Distribuir cuidadosamente
el inóculo en toda la superficie de la caja con una varilla de vidrio doblada en “L” que
previamente se sumergió en alcohol, se pasó en la flama del mechero y se dejó enfriar.
3. Dejar absorber el líquido durante 5-10 minutos. En caso de utilizar la técnica de vertido se
deposita 1.0 mL de la dilución en la caja de Petri a la cual se le añaden ca. 20 mL de medio
fundido (48-50°C).
 Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 72 horas y realizar la cuenta de
colonias.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 16

Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer (Figura 5)
1. Se coloca 1 mL de cultivo microbiano original en un tubo de ensaye y se agrega 1 gota de azul
de metileno. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el
portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el cubreobjetos sobre la zona central limitada por
dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada en forma de cruz.
3. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar de inmediato una alícuota con pipeta Pasteur de
punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara,
evitando el exceso, dejando que la muestra se distribuya por capilaridad.
4. Reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el
objetivo seco débil (10X) la zona de cuenta que se muestra en la Figura 5. El cuadro central mide
1.0 mm por lado y al observar en objetivo seco fuerte (40X) se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeños de 0.2 mm por lado.
5. Observar que las células que se tiñen de azul son las no viables y las que no se tiñen son las
viables. La cuantificación de células se hace generalmente en el cuadro central a 40X, contando
en diagonal las células de 9 cuadros (que a su vez están divididos en 16 cuadros más pequeños).
Al dividir el número de células entre 9, se obtiene el # células/cuadro de 0.2 mm de lado.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 17

6. Se multiplica el # células/cuadro (de 0.2 mm) X 25 para obtener el # total de células/0.1 mm3
(1 mm x 1 mm de cada lado del cuadrante central x 0.1 mm de profundidad de la cámara), que se
multiplicará por 104 para obtener el # células/mL. Hacer esta cuenta por duplicado.
7. En el caso de que el cultivo esté muy concentrado, se recomienda hacer diluciones (1:2, 1:5,
1:10 etc. según sea necesario) para facilitar el conteo.

Resultados
A. Para calcular las UFC, células viables y no viables por mL de muestra original, se aplicará lo
siguiente:

En cajas de Petri:
- Número de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL,
El factor de dilución (FD) se calcula tomando en cuenta la dilución que se seleccionó como
válida para la cuenta
(que tenga entre 30-300 colonias) y el volumen de muestra inoculado en cada caja.
FD = 1
Dilución x Vol. inoculado

En la cámara de Neubauer:
- Número de células promedio/cuadro central X (Fd)= # células/ mL
El factor de dilución (Fd) se aplicará solamente en casos de cultivos con alta densidad de células,
en las que se hicieron diluciones de la muestra original para hacer una cuenta confiable.

B. Reportar los resultados de cuantificación en los cuadros 14 y 15.

C. Recopilar los resultados de los otros equipos y calcular la desviación estándar y coeficiente de
variación de todos los datos.
Cuadro 14. Cuenta viable de Saccharomyces cerevisiae en placa.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 18

 Cuantificación de hongos y levaduras en maíz
PRACTICA 5
UNIDAD 2

OBJETIVO

Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos
viables.

INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se define como el aumento del número de microorganismos o de

biomasa en un periodo de tiempo determinado. Existen diferentes métodos para detectar y medir
el crecimiento de microorganismos. La forma de cuantificar células viables más utilizada en
microbiología es la de recuento en placa con medios de cultivo específicos para la población de
interés. Consiste en inocular un volumen determinado de cultivo o muestra sobre un medio de
cultivo sólido adecuado para el crecimiento de colonias el crecimiento de colonias. Cada una de
estas deriva de una célula aislada; es decir, una unidad formadora de colonia (UFC).

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 19

Hay dos variaciones en la forma de realizar esta técnica: la siembra en superficie o vertido en
placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas y
cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles. Es recomendable homogenizar las diluciones
y hacer la adecuada inoculación de las muestras para evitar resultados erróneos. Si no se separan
bien las células, se obtendrán valores bajos y los valores serán elevados si la toma de muestra se
hace del fondo del tubo donde se concentran los microorganismos por gravedad.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Material Reactivo
15 cajas Petri de vidrio
10 pipetas serológicas de 1.0 mL agar bacteriológico ADP
5 pipetas serológicas de 10 mL
4 matraces Erlenmeyer de 500 mL
1 matraz volumétrico de 100 mL
3 vasos de precipitados de 100 mL
1 gradilla
3 espátulas

Procedimientos
El profesor hará la demostración para: envolver las cajas Petri y pipetas con papel estraza, así
como elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces.

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarán en un horno a 150ºC durante
2 horas. Después de sacarlas,
dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica (cerca del mechero).
2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo
indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso de guantes de
asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.
c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el
vapor por el orificio de purga, después cerrarlo con la válvula.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in2 de presión y mantener
estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el manómetro y regular el control

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 20

de temperatura a valor medio o mínimo.
e. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la válvula y con la
ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que
el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación.

1. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50°C,
que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.
3. Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos a una
distancia de 50 cm. Verter entre 15 y 20 mL de cada uno de los medios en 4 cajas Petri en esta
zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.
3. Adicionar 1 ml de cada dilución y llevar a la estufa a 30° C durante 48 h. Observar y tomar
fotografías.

La NOM NORMA Oficial Mexicana NOM-247-SSA1-2008, Productos y servicios. Cereales y

sus productos. Cereales, harinas de cereales, sémolas o semolinas. Alimentos a base de: cereales,
semillas comestibles, de harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas. Productos de panificación.
Disposiciones y especificaciones sanitarias y nutrimentales. Métodos de prueba.

RESULTADOS
A. Reportar el crecimiento en UFC/ g muestra para cada dilución
B. Describir la morfología de las colonias.

Manual de prácticas de laboratorio Microbiología 21

 Cuestionario
1. ¿Cómo se realiza la cuantificación de hongos y bacterias filamentosas?
2. ¿Qué diferencias hay entre los procedimientos de observación e identificación de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos?
3. ¿Cuáles son los principales criterios de identificación de los hongos?
4. Describa los tipos de esporas sexuales y asexuales que caracterizan a los diferentes phyla de hongos.
5. Describa de manera breve tres problemáticas causadas al hombre por hongos y tres ejemplos de sus aplicaciones
industriales.

Medios de cultivo líquido

PRACTICA 6
UNIDAD 3

OBJETIVO

Que el alumno conozca la preparación y el uso de medios de cultivo líquidos.

INTRODUCCIÓN

El caldo soya tripticaseína es un medio de cultivo líquido, muy nutritivo y no selectivo. Por su
gran versatilidad es uno de los medios de cultivo líquido más utilizado a nivel general en el
laboratorio de microbiología. También se le conoce con el nombre de caldo soya tripticasa o
digerido de caseína-soya, cuya abreviatura es TSB por sus siglas en inglés Tryptic Soy Broth o
CST por sus siglas en español. Sus usos son muy variados debido a su composición. Está
compuesto por tripteína, peptona de soya, cloruro de sodio, fosfato dipotásico y glucosa. Es capaz
de reproducir las bacterias patógenas clínicamente importantes, incluyendo las que son exigentes
desde el punto de vista nutricional y bacterias anaerobias. Algunos hongos oportunistas y
contaminantes también pueden desarrollarse en este medio. Por su alto poder nutritivo posee
elevada sensibilidad para detectar contaminación microbiana, por tal motivo fue elegido por el

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Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal del USDA para el análisis microbiológico
de vacunas.

Así mismo, el caldo soya tripticaseína cumple las exigencias de las distintas farmacopeas
(Europea EP, Japonesa JP y Norteamericana USP) para el estudio microbiológico de productos a
nivel industrial, como cosméticos y alimentos. Por otra parte, vale la pena mencionar que a pesar
de su gran utilidad este medio es relativamente económico, por lo que es asequible para la
mayoría de los laboratorios de microbiología. Además, es muy fácil de preparar.

Fundamento

La tripteína, la peptona y la glucosa le proporcionan las propiedades nutritivas esenciales para

convertirlo en un medio ideal para un desarrollo microbiano rápido.

Aproximadamente en 6 a 8 horas de incubación ya se puede apreciar un crecimiento en la

mayoría de los microorganismos. Sin embargo, existen cepas de crecimiento lento que pueden
durar días en crecer.

El cloruro de sodio y el fosfato dipotásico actúan como equilibrio osmótico y regulador del pH
respectivamente. La presencia de crecimiento se evidencia por la aparición de turbidez en el
medio; si no hay crecimiento el medio permanece traslúcido.

Por su color claro es posible observar la producción de pigmentos, como el que se muestra en la
imagen ubicada al inicio del artículo, el cual corresponde al pigmento producido
por Pseudomonas aeruginosa.

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Preparación

-Caldo soya tripticaseína

Para preparar el caldo soya tripticasa se deben pesar 30 gr del medio comercial deshidratado en
una balanza digital. Luego se disuelve en un litro de agua destilada contenida en una fiola.

La mezcla se deja en reposo por 5 minutos y posteriormente se lleva a una fuente de calor para
ayudar a la disolución del medio. Se debe agitar frecuentemente mientras hierve por 1 minuto.

Una vez disuelto se distribuye en tubos del tamaño adecuado según se necesite. Se pueden usar
tubos con tapón de algodón o con tapas de baquelita. Posteriormente, se esterilizan los tubos con
el medio en el autoclave a 121°C por 15 minutos.

El pH del medio debe quedar en 7,3 ± 0,2

Se debe tener en cuenta que el color del medio de cultivo deshidratado es beige claro y debe
almacenarse entre 10 a 35°C, en lugar seco. Mientras que el caldo preparado es de color ámbar
claro y debe guardarse en nevera (2 a 8°C).

-Variantes de caldo soya tripticaseína

Se pueden preparar caldo soya tripticaseína modificado adicionando sales biliares y novobiocina
con el fin de hacerlo selectivo para el aislamiento de E. coli. Otra opción para el mismo fin es
preparar el caldo soya tripticasa suplementado con vancomicina, cefixime y telurito (2,5 µg/ml).

Por otra parte, se puede adicionar más glucosa (0,25%) al caldo soya tripticaseína cuando el
objetivo es estimular la formación de biopelículas.

Cuestionario

 ¿Cuáles son los usos que tienen los cultivos líquidso?

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  ¿Cuáles son los caldos más utilizados?

 ¿Qué tipo de microorganismos crecen en caldos?

 ¿Cuáles son las formar de sembrar en medios líquidos?

 ¿Cuáles son algunas limitaciones o desventajas de los medios líquidos?

Referencias

1. Laboratorio Britania. Tripteína soya caldo. Disponible en: [Link]

2. Laboratorio MCD. Caldo Soya Tripticaseína. Disponible en: [Link]

3. Laboratorio Neogen. Caldo de Soya Tríptico. Disponible en: [Link]

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