UNIVERSIDAD NACIONAL SAN CRISTOBAL DE
HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNSCH.FGM-
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GUÍA DE PRÁCTICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA Y GENÉTICA MICROBIANA VERSIÓN 02
PRÁCTICA N°10
GENÉTICA MICROBIANA: PLÁSMIDO RECOMBINANTE
OBJETIVOS
• Realizar el proceso de diseño de plásmidos recombinantes dirigidas utilizando el
software Snapgene
• Explicar el proceso de transformación y conjugación genética y su utilidad en la
práctica
• Demostrar la utilidad del uso de herramientas bioinformáticas para el diseño de
plásmidos recombinantes y su aplicación en el campo.
INTRODUCCIÓN
Los genomas procariota y eucariota están organizados de forma diferente. En los
eucariotas, el DNA está presente como moléculas lineales en el interior de un núcleo
rodeado por una membrana. En cambio, el genoma de Bacteria y Archaea suele ser un
cromosoma circular cerrado (aunque algunos procariotas tienen cromosomas lineales). El
cromosoma se agrega en el interior de la célula formando el nucleoide, una masa visible
bajo el microscopio electrónico. La mayoría de los procariotas tienen un solo cromosoma,
pero muchos contienen también uno o más círculos pequeños de DNA diferente al del
cromosoma, que llamamos plásmidos. Los plásmidos normalmente contienen genes que
confieren propiedades especiales a la célula (como un metabolismo especial, o la
resistencia a algún antibiótico) en lugar de genes esenciales, necesarios en cualesquiera
condiciones de crecimiento. Esto contrasta con los genes del cromosoma, la mayoría de
los cuales son necesarios para la supervivencia básica de la célula. (Madigan et al., 2009)
Principios generales de los plásmidos
Muchas células procariotas contienen otros elementos genéticos, en concreto plásmidos,
además del cromosoma. Aunque tienen su propio origen de replicación, los plásmidos
utilizan enzimas codificadas en el cromosoma para su replicación.
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Con frecuencia los plásmidos codifican dos de las principales características de la
virulencia (capacidad para causar enfermedades): (1) la habilidad del patógeno para
unirse y colonizar tejidos específicos del hospedador y (2) la producción de toxinas,
enzimas y otras moléculas que causan daño al hospedador. Muchas bacterias producen
también proteínas que inhiben o matan especies estrechamente relacionadas o incluso
cepas diferentes de la misma especie. Estos agentes, llamados bacteriocinas, son análogos
a los antibióticos, pero tienen un espectro más estrecho de actividad que estos. Los genes
que codifican bacteriocinas y las proteínas necesarias para procesarlas y transportarlas y
para conferir inmunidad al organismo productor se encuentran normalmente en
plásmidos. Por ejemplo, E. coli produce bacteriocinas llamas colicinas, que se unen a
receptores específicos en la superficie de células susceptibles y las matan al alterar el
funcionamiento de la membrana. Otras colicinas son nucleasas que degradan el DNA o
el RNA de cepas susceptibles.
En algunos casos, los plásmidos codifican propiedades fundamentales para la ecología de
la bacteria. Por ejemplo, la habilidad de Rhizobium para interaccionar con plantas y
formar nódulos radicales fijadores de nitrógeno depende de varias actividades codificadas
por plásmidos. Otros plásmidos confieren propiedades metabólicas especiales, como la
capacidad para degradar contaminantes tóxicos. (Madigan et al., 2009)
Los plásmidos como vectores de clonación
Los plásmidos se replican independientemente del control cromosómico en su célula
hospedadora. Además de contener los genes necesarios para su propia replicación, la
mayoría de los plásmidos son vectores naturales porque a menudo contienen otros genes
que confieren importantes propiedades a sus hospedadores. Como veremos a
continuación, algunos plásmidos tienen otras propiedades muy útiles (Imagen 1) como
vectores de clonación. (Madigan et al., 2009)
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Imagen 1 tomada de Madigan (2015): Vector de plasmídico clonación pUC19
Si bien en la naturaleza los plásmidos conjugativos son transferidos mediante el contacto
entre células, la mayoría de los vectores de clonación plasmídicos han sido modificados
genéticamente para eliminar la transferencia conjugativa. De este modo se impide la
entrada no deseada del vector en otros organismos. No obstante, en el laboratorio la
transferencia del vector se puede facilitar por transformación mediada por compuestos
químicos o por electroporación. Según sea el sistema hospedador–plásmido, la
replicación del plásmido puede estar sometida a un control celular estricto, en cuyo caso
solo se sintetizan unas pocas copias, o a un control celular relajado, en cuyo caso se
obtendrá un gran número de copias. La obtención de muchas copias suele ser importante
en la clonación génica y, mediante una selección adecuada del sistema hospedador–
plásmido y la manipulación de la síntesis celular de macromoléculas, se puede conseguir
varios miles de copias del plásmido por célula. (Madigan et al., 2009)
El trabajo pionero de Stanley Cohen y Herbert Boyer, quienes inventaron la técnica de
clonación de ADN, marcó el nacimiento de la ingeniería genética, que permitió que los
genes se transfirieran fácilmente entre diferentes especies biológicas. (Cohen et al., 1973)
Su descubrimiento condujo al desarrollo de varias proteínas recombinantes con
aplicaciones terapéuticas como la insulina y la hormona del crecimiento. Los genes que
codifican la insulina humana y la hormona del crecimiento se clonaron y expresaron en
E. coli en 1978 y 1979, respectivamente. El primer fármaco con licencia producido
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utilizando tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, que fue desarrollada
por Genentech y licenciada y comercializada por Eli Lilly en 1982 (Baeshen et al., 2014).
E. coli es un microorganismo preferido para la producción a gran escala de proteínas
recombinantes. Sin embargo, varias desventajas limitan su uso para la producción de
productos biofarmacéuticos recombinantes. Varias modificaciones postraduccionales
(PTM), como la glicosilación, la fosforilación, el procesamiento proteolítico y la
formación de enlaces disulfuro, que son cruciales para la actividad biológica, no ocurren
en E. coli (Jenkins, 2007; Walsh & Jefferis, 2006).
E. coli se puede mejorar reemplazando codones que rara vez se encuentran en genes de
E. coli altamente expresados con codones principales más favorables De manera similar,
la coexpresión de los genes que codifican una serie de ARNt para codones raros puede
potenciar la expresión de proteínas heterólogas en E. coli. Hay algunas cepas comerciales
de E. coli disponibles que codifican ARNt para codones raros como BL21 (DE3)
CodonPlus-RIL, BL21 (DE3) CodonPlus-RP (Stratagene, EE. UU.) y Rosetta (DE3).
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL alberga genes de ARNt para codones raros como AGG,
AGA (arginina), AUA (isoleucina) y CUA (leucina). De manera similar, la cepa Rosetta
(DE3) alberga genes de ARNt para codones raros como AGG, AGA (arginina), CGG
(arginina), AUA (isoleucina), CUA (leucina), CCC (prolina) y GGA (glicina). Estos
codones raros se han asociado con una baja expresión de proteínas en E. coli, por lo tanto,
la aplicación de estas cepas huésped de E. coli modificadas genéticamente puede mejorar
el nivel de expresión de proteínas heterólogas y, por lo tanto, podría dar como resultado
un mayor rendimiento de la proteína deseada (Sørensen et al., 2003; Trundova & Celer,
2007). El uso de cepas de E. coli deficientes en proteasa, que portan mutaciones que
eliminan la producción de proteasas, también puede mejorar el rendimiento de la proteína
recombinante al reducir la degradación proteolítica.
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PROCEDIMIENTO
Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco o de interés (el de la insulina humana,
por ejemplo) en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente
elegida, digerimos:
• El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.
• El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un
plásmido recombinante que contenga el gen:
Figura tomada de Khan Academy: Overview-dna-cloning
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ACTIVIDAD 1 – pUC19
pUC19 es un vector de clonación de uso común que transmite la resistencia Amp.
La molécula es un pequeño círculo de doble cadena, 2686 pares de bases de longitud y tiene un alto número de copias.
pUC19 lleva un polienlazador de sitio de clonación múltiple de 54 pares de bases que contiene sitios únicos para 13 endonucleasas de
restricción específicas de hexanucleótido diferentes (Anexo 1) (PUC19 Vector, n.d.).
Usando PCR, se agregan sitios de restricción a ambos extremos de un dsDNA, que luego es digerido por las enzimas de restricción
correspondientes. El ADN escindido puede luego ligarse a un vector de plásmido escindido por las mismas enzimas de restricción (Chan,
n.d.).
1. Abrir el archivo puc19.fasta utilizando el software Para identificar el sitio de múltiple clonación en nuestro
SNAPGENE plásmido vamos a reconocer automáticamente todas las
features (características) del mismo:
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2. Agregaremos todas las features encontradas:
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3. Ahora en Actions elegiremos la opción Insert Fragment para insertar el ADN foráneo en nuestro plásmido:
Se abrirá una nueva ventana que nos permitirá trabajar y visualizar con el Vector, el inserto y el producto:
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El vector es el plásmido, el inserto es el ADN foráneo y el producto será el plásmido recombinante.
4. El siguiente paso es identificar el sitio de multiclonación (MCS) (Podemos ayudarnos con el mapa del plásmido en el Anexo 1) y
seleccionar las enzimas de restricción necesarias para clonar el inserto.
Tanto el vector como el DNA foráneo que se va a clonar son cortados por la enzima elegida. El vector es linealizado y los segmentos del
DNA foráneo se insertan en el sitio de corte abierto y son ligados en esa posición por la DNA-ligasa. En el pUC19 esto interrumpe el gen
lacZ, un fenómeno llamado inactivación por inserción que puede utilizarse para detectar la presencia de DNA foráneo en el vector. Cuando
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se añade al medio el reactivo incoloro Xgal, la β-galactosidasa lo escinde y genera un producto azul. Así, la célula que contiene el vector
sin DNA clonado forma colonias
azules, mientras que las células con el vector con un inserto de DNA clonado no sintetizan β-galactosidasa y, por tanto, son blancas
(Madigan et al., 2009).
5. Ahora debemos elegir las enzimas que utilizaremos para insertar el fragmento, las enzimas elegidas deben cortar el vector y sus
secuencias también deben estar presentes en los extremos del adn foráneo para poder conseguir que las hebras se complementen y puedan
unirse gracias a las ligasas.
En este ejemplo elegiremos las enzimas EcorI y SalI.
Antes de seleccionar nuestro inserto debemos asegurarnos de aumentar las secuencias de corte en el mismo.
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Para esto utilizamos las técnicas aprendidas en la clase pasada de mutagénesis y crearemos primers que aumenten estos nucleótidos
en ambos extremos de nuestra secuencia DNAforàneo.dna
Sin este paso previo no podremos finalizar nuestro plásmido recombinante.
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6. Una vez finalizados estos pasos elegiremos la zona que queremos reemplazar en el vector y la zona de interés en el inserto:
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7. Seleccionamos Clone y tendremos el plásmido recombinante con el gen para la β-Galactosidasa interrumpido por nuestro inserto:
Tras la ligación del DNA, los plásmidos resultantes son transformados en células
de E. coli. Las colonias se seleccionan en medios que contengan ampicilina, para
seleccionar la presencia del plásmido, además de Xgal, para probar la actividad
β-galactosidasa. Las colonias azules contendrán el plásmido sin ningún DNA
foráneo insertado (es decir, el plásmido simplemente circularizado sin ningún
DNA foráneo), mientras que las colonias que sean blancas contendrán el
plásmido con DNA foráneo insertado y se seleccionarán para análisis posteriores.
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ACTIVIDAD 02 - CBD
pGreen, es un vector binario compacto de Agrobacterium con un gen de resistencia a la
kanamicina. También conocido como pGreen 0000, es un vector de transformación para
plantas. Los vectores de transformación de plantas son plásmidos que se han diseñado
específicamente para facilitar la generación de plantas transgénicas. Los vectores de
transformación de plantas más utilizados se denominan vectores binarios debido a su
capacidad para replicarse tanto en E. coli, una bacteria de laboratorio común, como en
Agrobacterium tumefaciens, una bacteria utilizada para insertar el ADN recombinante
(personalizado) en las plantas. Los vectores de transformación de plantas contienen tres
elementos clave:
• Selección de plásmidos (creando una hebra circular personalizada de ADN)
• Replicación de plásmidos (para que se pueda trabajar fácilmente)
• Región de transferencia de ADN (T-DNA) (inserción del ADN en la agrobacteria)
Carlos Larea es un tesista de la UNSCH que desarrolla un experimento para
producir cultivos alternativos y obtener cannabidiol (CBD) de importancia médica
para controlar la epilepsia, hizo una búsqueda bibliográfica y decidió experimentar
infectando alfalfa (Medicago sativa) con Rhizobium radiobacter como vehículo para
introducir el gen de interés. El tesista acude al laboratorio para obtener asesoría en
cómo desarrollar una simulación del proceso.
Utilice las secuencias brindadas por su docente (pGreen.dna como vector y
CBDA.dna como inserto), tome una captura de cada proceso y explique el paso a
paso de este procedimiento.
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ACTIVIDAD FINAL - Insulina
El trabajo pionero de Stanley Cohen y Herbert Boyer, quienes inventaron la técnica de
clonación de ADN, marcó el nacimiento de la ingeniería genética, que permitió la
transferencia de genes entre diferentes especies biológicas con facilidad (Cohen et al.,
1973). Su descubrimiento condujo al desarrollo de varias proteínas recombinantes con
aplicaciones terapéuticas como la insulina y la hormona del crecimiento. Los genes que
codifican la insulina humana y la hormona del crecimiento se clonaron y expresaron en
E. coli en 1978 y 1979, respectivamente. El primer fármaco con licencia producido
utilizando tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, que fue desarrollada
por Genentech y licenciada y comercializada por Eli Lilly en 1982.
Hay más de 300 productos biofarmacéuticos que incluyen proteínas y anticuerpos
terapéuticos en el mercado con ventas que superan los 100 000 millones de USD
(Goodman, 2009; Nielsen, 2013). Los anticuerpos monoclonales terapéuticos han captado
la mayor cuota de mercado (> 18 000 millones de USD), seguidos de las hormonas (> 11
000 millones de USD) y los factores de crecimiento (> 10 000 millones de USD)
(Aggarwal, 2011). Los productos biofarmacéuticos aprobados por la Administración de
Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos
(EMA) de 2004 a 2013 se derivan en gran medida de células de mamíferos (56 %); E.
Coli (24%); S. cerevisiae (13%); Animales y plantas transgénicos (3 %) y células de
insectos (4 %) (Nielsen, 2013). Actualmente, la insulina se produce
predominantemente en E. coli y Saccharomyces cerevisiae para el tratamiento de
pacientes diabéticos.
Desde principios de la década de 1920, los pacientes diabéticos eran tratados con insulina,
que se purificaba a partir de páncreas bovino o porcino. El desarrollo en el campo de la
ingeniería genética permitió la producción de insulina en E. coli y levaduras, que han sido
aprobadas para aplicaciones terapéuticas en humanos por la FDA (Ferrer-Miralles et al.,
2009; Walsh, 2005).
Hoy en día, la insulina humana recombinante se produce principalmente en E. coli o
Saccharomyces cerevisiae. Usando el sistema de expresión de E. coli, los precursores de
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insulina (PI) se producen como cuerpos de inclusión y finalmente se obtienen
polipéptidos completamente funcionales mediante procedimientos de solubilización y
replegamiento (Nilsson et al., 1996).
Replique el procedimiento de Gilbert y Villokomaroff de 1980, quienes diseñaron
un método de producción de insulina mediante tecnología de ADN recombinante. El
ARNm se transcribe de forma inversa para formar ADN y luego se inserta en el
plásmido PBR 322 en el medio del gen de la penicilinasa.
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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN CRISTOBAL DE
HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNSCH.FGM-
E.F.P.DE BIOLOGÍA CÓDIGO
01
GUÍA DE PRÁCTICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA Y GENÉTICA MICROBIANA VERSIÓN 02
CUESTIONARIO
1. ¿Qué son los plásmidos R y por qué tienen importancia médica?
2. ¿Qué es un sitio de clonación múltiple o MCS?
3. Plantee un problema que podría ser resuelto con la técnica aprendida en esta
práctica, indique el problema a solucionar, cómo aplicaría la técnica de plásmido
recombinante y cuáles serían los resultados esperados.
4. ¿Cómo aplicaría esta técnica para organismos eucariotas?
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“Se prohíbe su reproducción total o parcial sin la autorización de los autores de la presente
guía de prácticas. Documento para uso exclusivo de los estudiantes del curso”.
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HUAMANGA
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E.F.P.DE BIOLOGÍA CÓDIGO
01
GUÍA DE PRÁCTICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA Y GENÉTICA MICROBIANA VERSIÓN 02
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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“Se prohíbe su reproducción total o parcial sin la autorización de los autores de la presente
guía de prácticas. Documento para uso exclusivo de los estudiantes del curso”.
