Machine Translated by Google

Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
1

á621ñ CROMATOGRAFÍA
(Las secciones Sensibilidad del sistema y Simetría máxima se harán oficiales el 1 de diciembre de 2023, como se indica).
Para ver el Aviso del Comité de Expertos publicado junto con esta revisión acelerada, haga clic en https://
[Link]/rb­621­20221028.

Cambiar para leer:

▲INTRODUCCIÓN

Las técnicas de separación cromatográfica son procedimientos de separación de varias etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen
en dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado sobre un sólido o un gel. La fase
estacionaria puede empaquetarse en una columna, esparcirse como una capa o distribuirse como una película, etc. La fase móvil puede ser gaseosa, líquida o
un fluido supercrítico. La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición), intercambio iónico, etc., o puede basarse en diferencias
en las propiedades fisicoquímicas de las moléculas como tamaño, masa, volumen, etc.

Partes del texto del presente capítulo general que son textos nacionales USP­NF y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado,
están marcados con símbolos (♦♦) para especificar este hecho.
♦Este capítulo describe procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y requisitos generalmente aplicables para la idoneidad
del sistema.
Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo empleados en los procedimientos USP son la cromatografía en columna, de gas, en
papel, en capa delgada (incluida la cromatografía en capa fina de alto rendimiento) y la cromatografía líquida presurizada (comúnmente llamada cromatografía
líquida de alta presión o de alto rendimiento). cromatografía).

Oficial
PROCEDIMIENTOS GENERALES

Esta sección describe los procedimientos básicos utilizados cuando se describe un método cromatográfico en una monografía. Se siguen los siguientes
procedimientos a menos que se indique lo contrario en la monografía individual.

Cromatografía en papel

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y grosor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en el que el disolvente sube por el papel
mediante fuerzas capilares, o descendente, en el que el flujo del disolvente también es asistido por la fuerza gravitacional.
La orientación del grano del papel con respecto al flujo de disolvente debe mantenerse constante en una serie de cromatogramas. (La dirección de la máquina
suele ser designada por el fabricante).

APARATO

El equipo esencial para la cromatografía en papel consiste en una cámara estanca al vapor con entradas para la adición de disolvente y una rejilla de material
resistente a la corrosión unos 5 cm más corta que la altura interior de la cámara. La gradilla sirve de soporte para las cubetas de disolvente y para las varillas
antisifón que, a su vez, sostienen las láminas cromatográficas. El fondo de la cámara se cubre con el sistema disolvente o fase móvil prescrito. La saturación de
la cámara con vapor de disolvente se facilita recubriendo las paredes interiores con papel humedecido con el sistema disolvente prescrito.

PUNTEO

La sustancia o sustancias analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Los volúmenes convenientes administrados con micropipetas adecuadas
de la solución resultante, que normalmente contienen de 1 a 20 µg del compuesto, se colocan en puntos de 6 a 10 mm separados por no menos de 3 cm.

PROCEDIMIENTO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DESCENDENTE

1. Se suspende una lámina cromatográfica manchada en el aparato, utilizando la varilla antisifón para sujetar el extremo superior de la lámina en la cubeta de
disolvente. [NOTA: asegúrese de que la parte de la lámina que cuelga debajo de las varillas quede suspendida libremente en la cámara sin tocar la
rejilla, las paredes de la cámara o el fluido de la cámara.]
2. La cámara se sella para permitir el equilibrio (saturación) de la cámara y el papel con el vapor del disolvente. Cualquier exceso
La presión se libera según sea necesario.
3. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil preparada se introduce en el canal a través de la entrada.
4. Se cierra la entrada y se permite que la fase de disolvente móvil recorra la distancia deseada por el papel.
5. Se retira la lámina de la cámara.
6. Se marca rápidamente la ubicación del frente del disolvente y se seca la lámina.
7. El cromatograma se observa y mide directamente o después de un revelado adecuado para revelar la ubicación de las manchas.
del fármaco o fármacos aislados.

[Link] [Link] 1/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 2 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

PROCEDIMIENTO DE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL ASCENDENTE

1. La fase móvil se agrega al fondo de la cámara.

2. La cámara se sella para permitir el equilibrio (saturación) de la cámara y el papel con el vapor del disolvente. Cualquier exceso
La presión se libera según sea necesario.
3. El borde inferior de la fase estacionaria se sumerge en la fase móvil para permitir que la fase móvil suba en la
lámina cromatográfica por acción capilar.
4. Cuando el frente de disolvente ha alcanzado la altura deseada, se abre la cámara, se retira la lámina, se marca rápidamente la ubicación del frente de
disolvente y se seca la lámina.
5. El cromatograma se observa y mide directamente o después de un revelado adecuado para revelar la ubicación de las manchas.
del fármaco o fármacos aislados.

Cromatografía de capa fina

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y finamente pulverizado que se aplica a una lámina o placa de vidrio,
plástico o metal (normalmente llamada placa). La fase estacionaria de las placas de cromatografía de capa fina (TLC) tiene un tamaño de partícula promedio de
10 a 15 µm, y la de las placas de TLC de alto rendimiento (HPTLC) tiene un tamaño de partícula promedio de 5 µm. Se pueden utilizar placas comerciales con
zona preadsorbente si así se especifica en una monografía. La muestra aplicada a la región preadsorbente se desarrolla en bandas estrechas y afiladas en la
interfaz preadsorbente­sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en adsorción, partición o una combinación de ambos efectos, dependiendo
del tipo particular de fase estacionaria.

APARATO

Oficial
Se utiliza una cámara cromatográfica hecha de material inerte, transparente y que tiene las siguientes especificaciones: fondo plano o doble cubeta, tapa
hermética y tamaño adecuado para las placas. La cámara está revestida al menos en una pared con papel de filtro.
Se añade a la cámara suficiente fase móvil o disolvente de revelado de modo que, después de la impregnación del papel de filtro, se disponga de una
profundidad adecuada a las dimensiones de la placa utilizada. La cámara cromatográfica se cierra y se deja equilibrar.
[NOTA: A menos que se indique lo contrario, las separaciones cromatográficas se realizan en una cámara saturada.]

DETECCIÓN/VISUALIZACIÓN

A menudo se utiliza una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) y
una variedad de reactivos en aerosol para hacer visibles las manchas.

PUNTEO

Las soluciones se aplican sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones suficientemente pequeñas para obtener
manchas circulares de 2 a 5 mm de diámetro (1 a 2 mm en placas HPTLC) o bandas de 10 a 20 mm × 1. –2 mm (5–10 mm × 0,5– 1 mm en placas HPTLC) a
una distancia adecuada del borde inferior y los lados de la placa. [NOTA: Durante el desarrollo, la posición de aplicación debe estar al menos 5 mm (TLC) o 3
mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil.] Las soluciones se aplican en una línea paralela al borde inferior de la placa con un intervalo de al menos 10
mm (5 mm en placas HPTLC) entre los centros de las manchas, o 4 mm (2 mm en placas HPTLC) entre los bordes de las bandas, luego se deja secar.

PROCEDIMIENTO

1. Coloque la placa en la cámara, asegurándose de que los puntos o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil.
2. Cerrar la cámara.
3. Deje que la fase móvil ascienda por la placa hasta que el frente del disolvente haya recorrido tres cuartos de la longitud de la placa.
o la distancia prescrita en la monografía.
4. Retire la placa, marque el frente del disolvente con un lápiz y déjelo secar.
5. Visualice los cromatogramas según lo prescrito.
6. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF ) para los puntos o zonas principales.
7. La identificación presuntiva puede realizarse mediante la observación de puntos o zonas de idéntico valor de RF y aproximadamente de igual magnitud
obtenidos, respectivamente, con una cromatografía desconocida y estándar en la misma placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad de
las manchas o zonas puede servir para una estimación semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas son posibles mediante densitometría
(mediciones de absorbancia o fluorescencia).

Cromatografía de columna
SOPORTE SÓLIDO

Para la separación de fases normales se utiliza tierra silícea purificada. La tierra silícea cromatográfica silanizada se utiliza para la cromatografía
de partición en fase inversa.

[Link] [Link] 2/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
3

FASE ESTACIONARIA

El soporte sólido se modifica mediante la adición de una fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si una mezcla de
Se utilizan líquidos como fase estacionaria, mezcle los líquidos antes de la introducción del soporte sólido.

FASE MÓVIL

La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibrar con
agua. Si la fase estacionaria es un fluido orgánico polar, equilibre con ese fluido.

APARATO

A menos que se especifique lo contrario en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene aproximadamente 22 mm de diámetro interior y 200
a 300 mm de longitud. Unido a él hay un tubo de suministro, sin llave de paso, de aproximadamente 4 mm de diámetro interior y aproximadamente 50 mm
de longitud.
Preparación del aparato: Empaque una gasa de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combine el volumen especificado de fase estacionaria y la cantidad
especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y esponjosa. Transfiera esta mezcla al tubo cromatográfico y apisone
ejerciendo una presión suave para obtener una masa uniforme. Si la cantidad especificada de soporte sólido es superior a 3 g, transfiera la mezcla a la
columna en porciones de aproximadamente 2 gy apisone cada porción. Si el ensayo o prueba requiere una columna de múltiples segmentos con una fase
estacionaria diferente especificada para cada segmento, apisone después de agregar cada segmento y agregue cada segmento sucesivo directamente
al anterior. Empaque una gasa de lana de vidrio fina encima del relleno de la columna completa. [NOTA: La fase móvil debe fluir a través de una columna
correctamente empaquetada como una corriente moderada o, si se aplica cromatografía de fase inversa, como un goteo lento.]

Si se incorpora una solución del analito a la fase estacionaria, complete la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico lavando el
vaso de precipitados utilizado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g de soporte sólido y varias gotas del
disolvente utilizado. para preparar la solución de muestra antes de agregar la porción final de lana de vidrio.

Oficial
PROCEDIMIENTO

1. Transfiera la fase móvil al espacio de la columna encima del relleno de la columna y permita que fluya a través de la columna.
bajo la influencia de la gravedad.
2. Enjuague la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 ml de fase móvil antes de cada cambio en la composición de la fase
móvil y después de completar la elución.
3. Si el analito se introduce en la columna como una solución en la fase móvil, déjelo pasar completamente al empaque de la columna, luego agregue
la fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada una drene por completo, antes de agregar la mayor parte de la fase móvil. fase.

4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adición de fase móvil en
porciones divididas, permita que cada porción drene completamente a través de cada columna y enjuague la punta de cada una con fase móvil
antes de agregar cada porción sucesiva.

Cromatografía de gases (GC)

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA

Este tipo de fase está disponible en columnas empacadas o capilares.

COLUMNA EMPACADA GC

La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como tierra de diatomeas, polímero poroso,
o carbono grafitizado, que se empaqueta en una columna que suele tener entre 2 y 4 mm de diámetro interno y entre 1 y 3 m de longitud.

COLUMNA CAPILAR GC

En las columnas capilares, que no contienen soporte sólido empaquetado, la fase estacionaria líquida se deposita en la superficie interna de
la columna y puede estar unido químicamente a ella.

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

Este tipo de fase está disponible únicamente en columnas empaquetadas. En estas columnas, la fase sólida es un adsorbente activo, como
alúmina, sílice o carbono, empaquetado en una columna. Las resinas porosas poliaromáticas, que a veces se utilizan en columnas empaquetadas, no
están recubiertas con una fase líquida. [NOTA: Las columnas empaquetadas y capilares deben acondicionarse antes de su uso hasta que la línea base y
otras características sean estables. El proveedor de la columna o del material de embalaje proporciona instrucciones para el procedimiento de
acondicionamiento recomendado.]

APARATO

Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas portador, un puerto de inyección, una columna, un detector y un dispositivo de registro. El
puerto de inyección, la columna y el detector tienen temperatura controlada y pueden variarse como parte del análisis. El gas portador típico es helio,
nitrógeno o hidrógeno, según la columna y el detector que se utilice. El tipo de detector utilizado depende de la naturaleza del

[Link] [Link] 3/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 4 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

compuestos analizados y se especifica en la monografía individual. La salida del detector se registra en función del tiempo y la respuesta del instrumento, medida
como área de pico o altura de pico, es una función de la cantidad presente.

PROGRAMA DE TEMPERATURA

La duración y la calidad de una separación por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatográfica.
Cuando es necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura
inicial, la tasa de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de mantenimiento a la temperatura final.

PROCEDIMIENTO

1. Equilibre la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas portador hasta que se reciba una señal constante.
2. Inyecte una muestra a través del tabique del inyector o utilice un muestreador automático.
3. Inicie el programa de temperatura.
4. Registre el cromatograma.
5. Analizar como se indica en la monografía.

Cromatografía líquida
El término "cromatografía líquida" (LC), tal como se utiliza en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión.
y cromatografía líquida de alta resolución. LC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida.

FASE ESTACIONARIA

Oficial
Las separaciones se logran mediante procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria utilizada. Las fases
estacionarias más comúnmente utilizadas son sílice modificada o perlas poliméricas. Las perlas se modifican mediante la adición de hidrocarburos de cadena
larga. El tipo específico de empaquetamiento necesario para completar un análisis se indica con la designación "L" en la monografía individual (consulte
también la sección Columnas cromatográficas). El tamaño de las cuentas también se describe a menudo en la monografía. Los cambios en el tipo y tamaño
del empaque se tratan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo.

COLUMNA CROMATOGRAFICA

El término "columna" incluye columnas de acero inoxidable, acero inoxidable revestido y columnas poliméricas rellenas con una fase estacionaria. La longitud
y el diámetro interior de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los
cambios en las dimensiones de las columnas se analizan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo.
Las monografías compendiales no incluyen el nombre de las columnas apropiadas; esta omisión evita la apariencia de respaldo al producto de un proveedor y
cambios naturales en el mercado. Consulte la sección Columnas cromatográficas para obtener más información.
En los procedimientos de LC, se puede utilizar una precolumna con los siguientes requisitos, a menos que se indique lo contrario en la monografía individual:
(a) la longitud de la precolumna debe ser no más del 15% de la longitud de la columna analítica, (b) la el diámetro interior debe ser igual o menor que el de la
columna analítica, y (c) el material de relleno debe ser el mismo que el de la columna analítica (p. ej., sílice) y contener la misma fase unida (p. ej., C18). En
cualquier caso, con la precolumna instalada se deberán cumplir todos los requisitos de idoneidad del sistema especificados en el procedimiento oficial.

FASE MÓVIL

La fase móvil es un disolvente o una mezcla de disolventes, como se define en la monografía individual.

APARATO

Un cromatógrafo líquido consta de un depósito que contiene la fase móvil, una bomba para forzar la fase móvil a través del
sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector y un dispositivo de recolección de
datos.

ELUCIÓN EN GRADIENTE

La técnica de cambiar continuamente la composición del disolvente durante la ejecución cromatográfica se denomina elución en gradiente o programación de
disolvente. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla de gradientes, que enumera el tiempo y la composición
proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado.

PROCEDIMIENTO

1. Equilibre la columna y el detector con fase móvil al caudal especificado hasta que se reciba una señal constante.
2. Inyecte una muestra a través del inyector o utilice un muestreador automático.
3. Inicie el programa de gradiente.
4. Registre el cromatograma.
5. Analizar como se indica en la monografía.

[Link] [Link] 4/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]
5

COLUMNAS CROMATOGRAFICAS

Una lista completa de los empaques (L), fases (G) y soportes (S) utilizados en las pruebas y ensayos USP­NF se encuentra en USP­NF, Reactivos,
Indicadores y soluciones: columnas cromatográficas. Esta lista pretende ser una referencia conveniente para el cromatógrafo.
en la identificación de la columna cromatográfica pertinente especificada en la monografía individual.♦

DEFINICIONES

Los criterios de idoneidad y aceptación del sistema en las monografías se han establecido utilizando los parámetros que se definen a continuación. Con algo
equipo, ciertos parámetros, como la relación señal­ruido y la resolución, se pueden calcular utilizando el software proporcionado por
el fabricante. Es responsabilidad del usuario asegurarse de que los métodos de cálculo utilizados en el software sean equivalentes.
a los requisitos de la Farmacopea de EE. UU . y realizar las correcciones necesarias si este no es el caso.
Cromatograma: representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector, concentración del efluente u otra cantidad.
Se utiliza como medida de la concentración del efluente versus el tiempo o el volumen. Los cromatogramas idealizados se representan como una secuencia de
Picos gaussianos en una línea de base (Figura 1).

Oficial
Figura 1.

VM = volumen de retención
tM = tiempo de espera
VR1 = volumen de retención del pico 1
tR1 = tiempo de retención del pico 1
VR2 = volumen de retención del pico 2
tR2 = tiempo de retención del pico 2
¿Qué? = ancho de pico a media altura
= ancho del pico en el punto de inflexión
= altura del pico
con h /2 = media altura del pico

Constante de distribución (K0): En la cromatografía de exclusión por tamaño, las características de elución de un componente en un
columna particular puede estar dada por la constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución), que se calcula
usando la siguiente ecuación:

n n
0
0 = n
n0n

tR = tiempo de retención
t0 = tiempo de retención de un compuesto no retenido
tt = tiempo total de la fase móvil

[Link] [Link] 5/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir 6 Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]

Volumen de permanencia (D) (también conocido como VD): el volumen de permanencia (también conocido como volumen de retardo de gradiente) es el volumen
entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna. Se puede determinar mediante el siguiente procedimiento.
COLUMNA: Reemplace la columna cromatográfica por un tubo capilar adecuado (p. ej., 1 m × 0,12 mm).
FASE MÓVIL: Ver Tabla 1.
FASE MÓVIL A: Agua
FASE MÓVIL B: Solución de acetona en agua al 0,1% v/v

tabla 1
Tiempo Fase móvil A Fase móvil B
(minutos) (% v/v) (% v/v)

0–20 100→0 0→100

20–30 0 100

CAUDAL: Ajústelo para obtener suficiente contrapresión (p. ej., 2 ml/min).

DETECCIÓN: Espectrofotómetro a 265 nm
Determine el tiempo (t0,5), en minutos, cuando la absorbancia ha aumentado un 50% (Figura 2).

D = tD × F

td = t0,5 — 0,5tG (mín.)

tg = tiempo de gradiente predefinido, 20 min
F = caudal (mL/min)

Oficial
Figura 2.

[NOTA: cuando corresponda, esta medición se realiza con el muestreador automático en la posición de "inyección" para incluir el
volumen del circuito de inyección en el volumen de permanencia.]
Tiempo de retención (tM): tiempo necesario para la elución de un componente no retenido (consulte la Figura 1, la escala inicial está en minutos).
o segundos).
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se utiliza el término tiempo de retención de un compuesto no retenido (t0 ).
Volumen de retención (VM): Volumen de la fase móvil requerido para la elución de un componente no retenido. Puede ser
calculado a partir del tiempo de espera y el caudal (F) en mililitros por minuto usando la siguiente ecuación:

VM = tM × F

En cromatografía de exclusión por tamaño, se utiliza el término "volumen de retención" de un compuesto no retenido V0 .
Pico: porción de un cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un solo componente (o dos o más no resueltos)
componentes) se eluye de la columna.
La respuesta del pico puede estar representada por el área del pico o la altura del pico (h).

[Link] [Link] 6/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
7

Relación pico­valle (p/v): La relación pico­valle puede emplearse como criterio de idoneidad del sistema cuando se
no se logra la separación entre dos picos (ver Figura 3).

Oficial
Figura 3.

= /

CV = altura por encima de la línea base extrapolada del pico menor

hv = altura por encima de la línea base extrapolada en el punto más bajo de la curva que separa los picos menor y mayor

Altura del plato (H) (altura equivalente a un plato teórico [HETP]): Relación de la longitud de la columna (L), en
micrómetros, al número de placa (N):

Número de platos (N) (número de platos teóricos): un número indicativo del rendimiento de la columna (eficiencia de la
columna) solo se puede calcular a partir de datos obtenidos en condiciones isotérmicas, isocráticas o isodensas, según la técnica,
como el número de platos, utilizando la siguiente ecuación, expresándose los valores de tR y Wh en las mismas unidades:

n 2
= 5,54

[Link] [Link] 7/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir 8 Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]

TR = tiempo de retención del pico correspondiente al componente

¿Qué? = ancho de pico a media altura (h/2)

El número de plato varía según el componente, así como con la columna, la temperatura de la columna, la fase móvil y
el tiempo de retención.
Altura de placa reducida (h): Relación entre la altura de la placa (H), en micrómetros, y el diámetro de partícula (dp ) en micrómetros:

Retardo relativo (Rrel ): El retardo relativo, utilizado en cromatografía de capa fina, se calcula como la relación de
las distancias recorridas por el lugar del compuesto de interés y un compuesto de referencia (Figura 4).

Oficial
Figura 4.

/=
n

a = distancia de migración de la fase móvil

B = distancia de migración del compuesto de interés
C = distancia de migración del compuesto de referencia

Retención relativa (r): La retención relativa se calcula como una estimación utilizando la siguiente ecuación:

=
n

tRi = tiempo de retención del pico de interés

tRst = tiempo de retención del pico de referencia (normalmente el pico correspondiente a la sustancia a examinar)
tM = tiempo de espera

[Link] [Link] 8/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
9

Retención relativa, no ajustada (rG)♦o (RRT)♦

La retención relativa no ajustada se calcula mediante la siguiente ecuación:

n
=
n

A menos que se indique lo contrario, los valores de retención relativa indicados en las monografías corresponden a retención relativa no ajustada.
♦Tiempo de retención relativo (RRT): Ver Retención relativa, no ajustada♦
Resolución (Rs ): La resolución entre picos de dos componentes (Figura 1) se puede calcular usando la siguiente
ecuación:

=
1,18
21
+ 1 2

2 1 <

tR1 , tR2 = tiempos de retención de los picos

Wh1 , Wh2 = anchos de pico a media altura

En cromatografía cuantitativa en capa fina, mediante densitometría, se utilizan las distancias de migración en lugar de los tiempos de retención.
y la resolución entre picos de dos componentes se puede calcular usando la siguiente ecuación:

1.18
=

Oficial
2 1

+
1 2
<
2 1

RF1 , RF2 = factores de retardo de los picos

Wh1 , Wh2 = anchos de pico a media altura
a = distancia de migración del frente de disolvente

Factor de retardo (RF ): El factor de retardo, utilizado en cromatografía de capa fina, es la relación entre la distancia desde
el punto de aplicación al centro del punto y la distancia recorrida simultáneamente por el frente de disolvente desde el punto
de aplicación (Figura 4).

b = distancia de migración del componente =

a distancia de migración del frente del disolvente

Factor de retención (k): El factor de retención (también conocido como relación de distribución de masa (Dm) o factor de capacidad (k′)) se define
como:

= n =

kc = constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución de

contra equilibrio) = volumen de la fase
máquina virtual
estacionaria = volumen de la fase móvil

El factor de retención de un componente se puede determinar a partir del cromatograma utilizando la siguiente ecuación:

=
n

tR = tiempo de retención
tM = tiempo de retención

Tiempo de retención (tR ): Tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición del pico máximo
respuesta de la zona de muestra eluida (Figura 1, la escala inicial está en minutos o segundos).

[Link] [Link] 9/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 10 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

Volumen de retención (VR ):

Volumen de la fase móvil necesario para la elución de un componente. Puede calcularse a partir del tiempo de retención y del flujo.
velocidad (F), en mililitros por minuto, usando la siguiente ecuación:

n= ×

Tiempo de retención de un compuesto no retenido (t0): En cromatografía de exclusión por tamaño, el tiempo de retención de un
componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel (Figura 5).

Oficial

Figura 5.

Volumen de retención de un compuesto no retenido (V0): en cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un componente cuyas moléculas
son más grandes que los poros más grandes del gel. Puede calcularse a partir del tiempo de retención de un compuesto no retenido y el caudal (F), en mililitros por
minuto, utilizando la siguiente ecuación:

V × =00

Factor de separación (α): Retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por convención, el valor del factor de separación
es siempre >1):

= ???
2/ 1

[Link] [Link] 10/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]
11

k1 = factor de retención del primer pico

k2 = factor de retención del segundo pico

Relación señal­ruido (S/N): el ruido a corto plazo influye en la precisión y exactitud de la cuantificación. El
La relación señal­ruido se calcula mediante la siguiente ecuación:

2
/=

h = altura del pico (Figura 6) correspondiente al componente en cuestión, en el cromatograma obtenido con el
solución de referencia prescrita, medida desde el máximo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal
observado a una distancia igual a 20 veces el ancho a media altura
h = rango del ruido en un cromatograma obtenido después de la inyección de un blanco (Figura 7), observado a una distancia igual
hasta 20 veces el ancho a media altura del pico en el cromatograma obtenido con la referencia prescrita
solución y, si es posible, situada igualmente alrededor del lugar donde se encontraría este pico

Oficial
Figura 6. Cromatograma de la solución de referencia.

Figura 7. Cromatograma de un blanco.

Si no se puede obtener una línea base de 20 veces el ancho a media altura debido a picos debidos a los solventes o reactivos, o que surgen
de la fase móvil o de la matriz de la muestra, o debido al programa de temperatura de la cromatografía de gases, una línea base de al menos 5
veces el ancho permitido a media altura.

[Link] [Link] 19/11

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 12 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

Factor de simetría (AS ): El factor de simetría de un pico (también conocido como factor de asimetría o factor de cola) (Figura 8) se
calcula utilizando la siguiente ecuación:

0,05
2
=

W0.05 = ancho del pico a una vigésima parte de la altura del pico d = distancia entre la
perpendicular caída desde el máximo del pico y el borde anterior del pico a una vigésima parte de la altura del pico

Un valor de As de 1,0 significa simetría. Cuando As > 1,0, el pico está siguiendo. Cuando As < 1,0, el pico está al frente.

Figura 8.

Oficial
Repetibilidad del sistema: La repetibilidad de la respuesta se expresa como un porcentaje estimado de desviación estándar relativa
(%RSD) de una serie consecutiva de mediciones para no menos de tres inyecciones o aplicaciones de una solución de referencia, y se
calcula utilizando la siguiente ecuación.

2
100 nΣ
= %
n 1

yi = valores individuales expresados como área de pico, altura de pico o relación de áreas mediante el método de estandarización interna = media de valores individuales =
y número de valores individuales
norte

Tiempo total de fase móvil (tt ): en cromatografía de exclusión por tamaño, tiempo de retención de un componente cuyas moléculas
son más pequeños que los poros más pequeños del gel (Figura 5).

Volumen total de fase móvil (Vt ): en cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un componente cuyas
moléculas son más pequeñas que los poros más pequeños del gel. Se puede calcular a partir del tiempo total de la fase móvil y el
caudal (F), en mililitros/minuto, mediante la siguiente ecuación:
n=n ×

IDONEIDAD DEL SYSTEMA

[NOTA: esta sección solo cubre la cromatografía líquida y la cromatografía de gases]

Los diversos componentes del equipo empleado deben estar calificados y ser capaces de lograr el rendimiento requerido para realizar la prueba o ensayo. Las pruebas de idoneidad del
sistema representan una parte integral del procedimiento analítico y se utilizan para garantizar el rendimiento adecuado del sistema cromatográfico. El número de placa de columna, el factor
de retención (relación de distribución de masa), la repetibilidad del sistema, la señal/ruido, el factor de simetría y la relación resolución/pico­valle son los parámetros que pueden emplearse
para evaluar el rendimiento del sistema cromatográfico. Cuando así se indique en la monografía individual, en el caso de perfiles cromatográficos complejos (por ejemplo, para productos
biotecnológicos y biológicos), la comparación visual de los perfiles se puede utilizar como prueba de idoneidad del sistema. Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico
incluyen:

• Composición y temperatura de la fase móvil • Fuerza iónica y pH del componente

acuoso de la fase móvil • Caudal, dimensiones de la columna, temperatura y presión de la columna •
Características de la fase estacionaria, incluido el tipo de soporte cromatográfico (a base de partículas o
monolítico ), partícula o
Tamaño de poro, porosidad y área de superficie específica.
• Fase inversa y otras modificaciones de la superficie de las fases estacionarias, el alcance de la modificación química (expresada por el recubrimiento final, la carga de carbono, etc.)

Los tiempos de retención y las retenciones relativas pueden proporcionarse en monografías únicamente con fines informativos, a menos que se indique lo contrario.
indicado en la monografía. No se aplican criterios de aceptación a las retenciones relativas.

[Link] 19/12

[Link]
Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US

Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]
13

Se requiere el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema durante todo el procedimiento cromatográfico. Sin análisis de muestra
es aceptable a menos que se haya demostrado la idoneidad del sistema.
Se deben cumplir los siguientes requisitos, además de cualquier otro criterio de idoneidad del sistema establecido en la monografía.
Cuando se establecen requisitos específicos en la monografía, reemplazan a los requisitos mencionados en este capítulo.

Cambiar para leer:

Repetibilidad del sistema▲▲ (ERR 1­dic­2022)

♦Cuando se especifica un requisito de desviación estándar relativa en una monografía individual, si el requisito es 2,0 o menos
el cálculo se basa en datos de cinco inyecciones repetidas del analito, si el requisito es superior al 2,0 % de datos de seis
se utilizan inyecciones repetidas.♦
En un ensayo de una sustancia activa o un excipiente, donde el valor objetivo es 100% para una sustancia pura, y un sistema
no se especifica el requisito de repetibilidad, la desviación estándar relativa máxima permitida (%RSDmax) para los límites definidos
se calcula para una serie (n = 3 a 6) de inyecciones de la solución de referencia. La desviación estándar relativa máxima permitida
de la respuesta máxima no excede el valor apropiado indicado en la Tabla 2.

= máx % n
90 % , 1

k n
0,6 90 % , 1 0,6
= constante (0,349), obtenida de la expresión = × en el cual representa lo requerido
2 6 2
porcentaje de desviación estándar relativa determinada en 6 inyecciones para B = 1,0
B = límite superior dado en la definición de la monografía individual menos 100%
norte
= número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3 ≤ n ≤ 6)

Oficial
t90%,n–1 = t de Student en el nivel de probabilidad del 90% (doble cara) con n−1 grados de libertad

Tabla 2. Desviación estándar relativa máxima permitida de la respuesta máxima (ensayo)

Número de inyecciones individuales (n)

3 4 5 6

B (%) Desviación estándar relativa máxima permitida (%)

2.0 0,41 0,59 0,73 0,85

2.5 0,52 0,74 0,92 1.06

3.0 0,62 0,89 1.10 1.27

B = límite superior del contenido dado en la monografía individual menos 100%

Cambiar para leer:

▲Sensibilidad del sistema

La relación señal­ruido se utiliza para definir la sensibilidad del sistema. El límite de cuantificación (correspondiente a una relación señal­ruido)
ratio de 10) es igual o menor que el umbral de notificación.

Simetría máxima

A menos que se indique lo contrario, en una prueba o ensayo, el factor de simetría (factor de cola) del pico utilizado para la cuantificación es 0,8–
1.8.▲ (BR 1­dic­2023)

Cambiar para leer:

AJUSTE DE LAS CONDICIONES CROMATOGRAFICAS

Las condiciones cromatográficas descritas han sido validadas durante la elaboración de la monografía.
La medida en que los diversos parámetros de una prueba cromatográfica pueden ajustarse sin modificar fundamentalmente
Los procedimientos analíticos de la farmacopea se enumeran a continuación. Los cambios distintos a los indicados requieren la revalidación del
procedimiento.
Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el rendimiento del sistema y deben ser evaluados adecuadamente por
Los usuarios. Esto es particularmente importante en los casos en los que el patrón de separación se describe como un perfil. En esos casos, un riesgo
es necesario realizar una evaluación.
Cualquier ajuste debe realizarse sobre la base del procedimiento de la farmacopea.
Si se realizan ajustes a un procedimiento farmacopeico, es posible que se requieran pruebas de verificación adicionales. Para verificar la idoneidad
del procedimiento farmacopeico ajustado, evaluar las características de rendimiento analítico relevantes potencialmente afectadas por el
cambiar.

[Link] [Link] 13/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 14 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

Cuando un procedimiento de la farmacopea se ha ajustado de acuerdo con los requisitos establecidos a continuación, no se permiten ajustes adicionales sin la revalidación
adecuada.
Se requiere el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema para verificar que se cumplan las condiciones para la realización satisfactoria de la prueba o
ensayo se logran.
El ajuste de las condiciones con elución en gradiente (HPLC) o programación de temperatura (GC) es más crítico que con isocrático.
(HPLC) o elución isotérmica (GC), ya que puede desplazar algunos picos a un paso diferente del gradiente o a diferentes temperaturas de elución, lo que podría causar una
coelución parcial o completa de picos adyacentes o una inversión de picos y, por lo tanto, conducir a una asignación incorrecta. de picos y al enmascaramiento de picos o un cambio
tal que la elución se produzca más allá del tiempo de elución prescrito.
Para algunos parámetros, los ajustes se definen explícitamente en la monografía para garantizar la idoneidad del sistema.

Cromatografía de capa fina

Composición de la fase móvil: la cantidad de los componentes menores del disolvente se puede ajustar en ±30% relativo o ±2% absoluto, lo que sea mayor; ningún otro
componente se altera en más del 10% absoluto. Un componente menor comprende menos de o igual a (100/n)%, siendo n el número total de componentes de la fase móvil. Para un
componente menor al 10% de la fase móvil, un ajuste relativo del 30% permite un rango del 7% al 13%, mientras que un ajuste absoluto del 2% permite un rango del 8% al 12%,
siendo por lo tanto el valor relativo el mayor; para un componente menor al 5% de la fase móvil, un ajuste relativo del 30% permite un rango de 3,5% a 6,5%, mientras que un ajuste
absoluto del 2% permite un rango de 3% a 7%, siendo el valor absoluto el mayor en este caso. caso.

pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario. Concentración de sales en el
componente tampón de una fase móvil: ± 10 % . Volumen de aplicación: 10 %–20 % del volumen
prescrito si se utiliza un tamaño de partícula fino. placas (2–10 µm)

Cromatografía líquida: elución isocrática

Oficial
PARÁMETROS DE COLUMNA Y CAUDAL

Fase estacionaria: Sin cambio de identidad del sustituyente (p. ej., sin sustitución de C18 por C8); las demás características fisicoquímicas de la fase estacionaria, es decir, soporte
cromatográfico, modificación de la superficie y grado de modificación química, deben ser similares; Se permite el cambio de columnas de partículas totalmente porosas (TPP) a
columnas de partículas superficialmente porosas (SPP), siempre que se cumplan los requisitos mencionados anteriormente.

Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud): El tamaño de partícula y/o longitud de la columna se puede modificar, siempre que la relación entre la longitud de la
columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o en el rango entre −25 % a +50% de la relación L/dp prescrita .

Ajustes de partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas: Para la aplicación del ajuste del tamaño de partículas de partículas totalmente porosas a
partículas superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp , siempre que el número de placa (N) esté entre −25% y + 50%, respecto de la columna
prescrita. Estos cambios son aceptables, siempre que se cumplan los criterios de idoneidad del sistema y se demuestre que la selectividad y el orden de elución de las impurezas
especificadas a controlar son equivalentes.
Diámetro interno: En ausencia de un cambio en el tamaño y/o longitud de las partículas, se puede ajustar el diámetro interno de la columna.
Es necesario tener precaución cuando el ajuste da como resultado volúmenes máximos más pequeños debido a un tamaño de partícula más pequeño o a un tamaño interno más pequeño.
diámetro de la columna, una situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extracolumna por factores como las conexiones del instrumento,
el volumen de la celda del detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyección.
Cuando se cambia el tamaño de partícula, es necesario ajustar el caudal, porque las columnas de partículas más pequeñas requerirán velocidades lineales más altas para el
mismo rendimiento (medido por la altura reducida del plato). El caudal se ajusta tanto para el cambio en el diámetro de la columna como para el tamaño de partícula usando la siguiente
ecuación:

2 1 =× 2/21 × 212 ×

F1 = caudal indicado en la monografía (mL/min) = caudal ajustado (mL/min)

= diámetro interno de la columna indicado
F2 en la monografía = diámetro interno de la columna utilizada (mm) = tamaño de partícula
dc1 indicado en la monografía (μm ) = tamaño de partícula de la
dc2 columna utilizada (μm)
dp1 dp2

Cuando se realiza un cambio de partículas ≥3 µm a <3 µm en separaciones isocráticas, puede justificarse un aumento adicional en la velocidad lineal (ajustando el caudal), siempre
que el rendimiento de la columna no caiga más del 20%. . De manera similar, cuando se realiza un cambio de partículas <3 µm a ≥3 µm, se puede justificar una reducción adicional
de la velocidad lineal (caudal) para evitar una reducción en el rendimiento de la columna en más del 20 %.

Después de un ajuste debido a un cambio en las dimensiones de la columna, se permite un cambio adicional en el caudal de ±50 %.
Temperatura de la columna: ± 10°C, donde se especifica la temperatura de funcionamiento, a menos que se indique lo contrario. Es posible que se
requieran ajustes adicionales en las condiciones del procedimiento analítico (fase móvil, temperatura, pH, etc.), dentro del
rangos permitidos descritos en Idoneidad del sistema y ajuste de las condiciones cromatográficas en este capítulo.

[Link] [Link] 14/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
15

FASE MÓVIL

Composición: La cantidad de los componentes menores de la fase móvil se puede ajustar en ±30% relativo. Sin embargo, el cambio en cualquier
componente no puede exceder el ±10% absoluto. Un componente menor comprende menos o igual que (100/n), siendo n el número total de
componentes de la fase móvil: ♦A continuación se dan ejemplos
de ajustes para mezclas binarias y ternarias.

MEZCLAS BINARIAS

Proporción especificada de [Link] 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio máximo permitido de ±10% absoluto en
cualquiera de los componentes. Por lo tanto, la relación de fase móvil sólo puede ajustarse dentro del rango de 40:60–60:40.
Proporción especificada de [Link] 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por tanto, el ajuste máximo permitido está dentro del rango de 1,4:98,6–2,6:97,4.

MEZCLAS TERNARIAS

Proporción especificada de [Link] Para el segundo componente, el 30% de 25 es el 7,5% absoluto. Por lo tanto, el segundo componente puede
ajustarse dentro del rango del 32,5% al 17,5% absoluto. Para el tercer componente, el 30% de 5 es el 1,5% absoluto. En todos los casos se utiliza
una cantidad suficiente del primer componente para dar un total del 100%. Por lo tanto, los rangos de mezcla de 62,5: 32,5: 5 a 77,5: 17,5: 5 o 68,5:
25: 6,5 a 71,5: 25: 3,5 cumplirían con el requisito.♦
• pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario •
Concentración de sales en el componente tampón de una fase móvil: ±10% • Caudal:
en ausencia de un cambio en las dimensiones de la columna, se debe realizar un ajuste Se permite reducir el caudal en ±50 %.

LONGITUD DE ONDA DEL DETECTOR

Oficial
No se permite ningún ajuste.

VOLUMEN DE INYECCIÓN

Cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede utilizar la siguiente ecuación para ajustar el volumen de inyección:

2
▲2 = 1 2_
2
/
211 ▲ (ERR 1­dic­2022)

Vinj1 = volumen de inyección indicado en la monografía (μL) =

Vinj2 volumen de inyección ajustado (μL) =
L1 longitud de la columna indicada en la monografía (mm) =
L2 ▲longitud de la nueva columna (mm)▲ (ERR 1­
pa1 dic­2022) = ▲diámetro interno de la columna indicado en la monografía (mm)▲ (ERR 1­
pa2 dic­2022) = ▲diámetro interno de la nueva columna (mm)▲ (ERR 1­dic­2022)

Es posible que esta ecuación no sea aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cualquier cambio en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variarse siempre que los criterios de
idoneidad del sistema permanezcan dentro de sus límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se reduce el volumen de inyección, se presta especial
atención al (límite de) detección y repetibilidad de la(s) respuesta(s) máxima(s) a determinar. Se permite un aumento, siempre que la linealidad y
la resolución del pico o picos a determinar sigan siendo satisfactorias.

Cromatografía líquida: elución en gradiente

El ajuste de las condiciones cromatográficas para los sistemas de gradiente requiere mayor precaución que para los sistemas isocráticos.

PARÁMETROS DE COLUMNA Y CAUDAL

Fase estacionaria: Sin cambio de identidad del sustituyente (p. ej., sin sustitución de C18 por C8); las demás características fisicoquímicas de la
fase estacionaria, es decir, soporte cromatográfico, modificación de la superficie y grado de modificación química, deben ser similares; Se permite el
cambio de columnas de partículas totalmente porosas (TPP) a columnas de partículas superficialmente porosas (SPP), siempre que se cumplan los
requisitos mencionados anteriormente.
Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud): El tamaño de partícula y/o la longitud de la columna se pueden modificar siempre que
la relación entre la longitud de la columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o en el rango entre −25 %. a +50% de la relación L/
dp prescrita .
Ajustes de partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas: Para la aplicación del ajuste del tamaño de partículas de
partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que la relación (tR /Wh )
2 esté dentro del −25% a +50%, con respecto a la columna prescrita ♦para todos los picos utilizados para determinar los parámetros de idoneidad del
sistema♦. Estos cambios son aceptables siempre que se cumplan los criterios de idoneidad del sistema y se demuestre que la selectividad y el
orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
Diámetro interno: En ausencia de un cambio en el tamaño y/o longitud de las partículas, se puede ajustar el diámetro interno de la columna.

[Link] [Link] 15/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US

Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir 16 Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]

Es necesario tener precaución cuando el ajuste da como resultado un volumen máximo más pequeño debido a un tamaño de partícula más pequeño o a un tamaño interno más pequeño.
diámetro de la columna, situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extracolumna por factores como
conexiones de instrumentos, volumen de la celda del detector y frecuencia de muestreo, y volumen de inyección.
Cuando se cambia el tamaño de partícula, es necesario ajustar el caudal, porque las columnas de partículas más pequeñas requerirán mayor
velocidades lineales para el mismo rendimiento (medido por la altura reducida de la placa). El caudal se ajusta tanto para el cambio en
diámetro de la columna y tamaño de partícula usando la siguiente ecuación:

2
2 ▲1 =× 2 1 × / 21 × 2) ▲ ERR 1­dic­2022)

F1 = caudal indicado en la monografía (mL/min)

= caudal ajustado (mL/min)
F2 = diámetro interno de la columna indicado en la monografía (mm)
dc1 = diámetro interno de la columna utilizada (mm)
dc2 = tamaño de partícula indicado en la monografía (μm)
dp1 dp2 = tamaño de partícula de la columna utilizada (μm)

Un cambio en las dimensiones de la columna y, por tanto, en el volumen de la columna, afecta el volumen del gradiente que controla la selectividad.
Los gradientes se ajustan al volumen de la columna cambiando el volumen del gradiente en proporción al volumen de la columna. Este
se aplica a cada volumen de segmento de gradiente. Dado que el volumen del gradiente es el tiempo del gradiente, tG, multiplicado por el caudal, F,
El tiempo de gradiente para cada segmento de gradiente debe ajustarse para mantener una relación constante entre el volumen del gradiente y el
volumen de la columna (expresado como L × dc 2 ). Por lo tanto, el nuevo tiempo de gradiente, tG2, se puede calcular a partir del tiempo de gradiente original, tG1 ,
los caudales y las dimensiones de la columna de la siguiente manera:

× 2 × 2
2 1 =
1 ×2 /2 2
/
1 1

Oficial
Por tanto, el cambio de condiciones para la elución en gradiente requiere tres pasos:
1. Ajuste la longitud de la columna y el tamaño de las partículas según L/dp.
2. Ajuste el caudal según los cambios en el tamaño de las partículas y el diámetro de la columna.
3. Ajuste el tiempo de gradiente de cada segmento para los cambios en la longitud, el diámetro y el caudal de la columna. El siguiente ejemplo
ilustra este proceso.

Tabla 3
Variable Condiciones originales Condiciones ajustadas Comentario

Longitud de la columna (L), en mm 150 100 elección del usuario

Diámetro de la columna (dc), en mm 4.6 2.1 elección del usuario

Tamaño de partícula (dp), en µm 5 3 elección del usuario

L/dp 30.0 33.3 (1)

Caudal, en ml/min 2.0 0,7 (2)

— 0,4
Factor de ajuste de gradiente (tG2 /tG1 ) (3)

Condiciones de gradiente — — —

Tiempo Tiempo
B (%) (minutos) (minutos)

30 0 0 —

30 3 —
(3 × 0,4) = 1,2

70 13 —
[1,2 + (10 × 0,4)] = 5,2

30 —
dieciséis
[5,2 + (3 × 0,4)] = 6,4

1. Un aumento del 11 % dentro del cambio de L/dp permitido de −25 % a +50 %

2. Calculado usando F2 = F1 [(dc2 2 × dp1 )/(dc1 2 × dp2 )]

3. Calculado usando tG2 = tG1 × (F1 /F2 ) [(L2 × dc2 2)/(L1 × pa1 2)]

Temperatura de la columna: ±5° C, donde se especifica la temperatura de funcionamiento, a menos que se indique lo contrario.
Es posible que se requieran ajustes adicionales en las condiciones del procedimiento (fase móvil, temperatura, pH, etc.), dentro de los límites permitidos.
rangos descritos en Idoneidad del sistema y ajuste de las condiciones cromatográficas en este capítulo.

FASE MÓVIL

Composición/gradiente: Los ajustes de la composición de la fase móvil y del gradiente son aceptables siempre que:
• Se cumplen los criterios de idoneidad del sistema.
• Los picos principales eluyen dentro de ±15% del tiempo de retención obtenido con las condiciones originales; este requisito
no se aplica cuando se cambian las dimensiones de la columna.

[Link] [Link] 16/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01
17

• La composición de la fase móvil y el gradiente son tales que los primeros picos se retienen suficientemente y los últimos
los picos se eluyen.
pH del componente acuoso de la fase móvil: ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario. Concentración
de sales en el componente tampón de una fase móvil: ±10 % Cuando no se puede lograr
el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema, a menudo es preferible considerar el volumen de permanencia
o para cambiar la columna.

VOLUMEN DE PERMANENCIA

La configuración del equipo empleado puede alterar significativamente la resolución, el tiempo de retención y las retenciones relativas.
descrito. Si esto ocurre, puede deberse a un cambio en el volumen de permanencia. Las monografías incluyen preferiblemente un paso isocrático antes del inicio
del programa de gradiente para que se pueda hacer una adaptación a los puntos de tiempo del gradiente para tener en cuenta las diferencias en el volumen de
permanencia entre el sistema utilizado para el desarrollo del procedimiento analítico y el realmente utilizado. Es responsabilidad del usuario adaptar la longitud
del paso isocrático al equipo analítico utilizado. Si en la monografía se indica el volumen de permanencia utilizado durante la elaboración de la monografía, los puntos
de tiempo (t min) indicados en la tabla de gradientes podrán sustituirse por puntos de tiempo adaptados (tc min), calculados mediante la siguiente ecuación:

n n=

D = volumen de permanencia
D0
(mL) = volumen de permanencia utilizado para el desarrollo del método (mL)
F = caudal (mL/min)

El paso isocrático introducido para este fin podrá omitirse si no se dispone de datos de validación para la aplicación del procedimiento analítico.

Oficial
sin este paso está disponible.
Longitud de onda del detector: No se permite ajuste Volumen
de inyección: Cuando se cambian las dimensiones de la columna, se puede utilizar la siguiente ecuación para ajustar el volumen de inyección:

2
= 2
2 1 22 /11

Vinj1 = volumen de inyección indicado en la monografía (μL) = volumen

Vinj2 de inyección ajustado (μL) = longitud de la
L1
columna indicada en la monografía (cm) = longitud de la nueva
L2
columna (cm) = diámetro interno
pa1
de la columna indicado en la monografía (mm) = diámetro interno de la nueva
pa2 columna (mm)

Es posible que esta ecuación no sea aplicable a cambios de columnas TPP a columnas SPP.
Incluso en ausencia de cualquier cambio en las dimensiones de la columna, el volumen de inyección puede variarse siempre que los criterios de idoneidad del
sistema permanezcan dentro de sus límites de aceptabilidad establecidos. Cuando se reduce el volumen de inyección, se presta especial atención al (límite de)
detección y repetibilidad de la(s) respuesta(s) máxima(s) a determinar. Se permite un aumento, siempre que la linealidad y la resolución del pico o picos a
determinar sigan siendo satisfactorias.

Cromatografía de gases

PARÁMETROS DE COLUMNA

Fase estacionaria
Tamaño de partícula: Reducción máxima del 50%; no se permite ningún aumento (columnas empaquetadas)
Espesor de la película: −50% a +100% (columnas capilares)
Dimensiones de la columna
Longitud: −70% a +100%
Diámetro interno: ±50%
Temperatura de la columna: ±10%
Programa de temperatura: Se permite el ajuste de las temperaturas como se indicó anteriormente; Se permite el ajuste de velocidades de rampa y tiempos de
retención de hasta ±20 %.
Caudal: ±50%
Los cambios anteriores son aceptables siempre que se cumplan los criterios de idoneidad del sistema y se cumplan la selectividad y el orden de elución del
Se demuestra que las impurezas especificadas a controlar son equivalentes.
Volumen de inyección y relación de división: pueden variarse siempre que los criterios de idoneidad del sistema se mantengan dentro de los límites de aceptabilidad
establecidos. Cuando se disminuye el volumen de inyección o se aumenta la relación de división, se presta especial atención al (límite de) detección y repetibilidad
de las respuestas máximas que se determinarán. Se permite un aumento del volumen de inyección o una disminución de la relación de división siempre que, en
particular, la linealidad y la resolución del pico o picos a determinar sigan siendo satisfactorias.
Temperatura del puerto de inyección y temperatura de la línea de transferencia en condiciones estáticas del espacio de cabeza: ±10 °C, siempre que no
se produzca descomposición ni condensación.

[Link] [Link] 17/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 DocId: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US Tipo de
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 DOI de USPC: [Link]
No distribuir 18 Ref. DOI: nu938 USPNF_M99380_06_01

CUANTIFICACIÓN

Los siguientes enfoques de cuantificación se pueden utilizar en textos generales o monografías.

Método estándar externo

Usando una función de calibración: Se preparan soluciones estándar con varias cantidades graduadas de un estándar de referencia del compuesto
a analizar en un rango que se ha demostrado que da una respuesta lineal, y se inyecta un volumen fijo de estas soluciones estándar. Con los
cromatogramas obtenidos, se prepara una función de calibración trazando las áreas de los picos o las alturas de los picos en ordenadas frente a la
cantidad de estándar de referencia en abscisas. La función de calibración generalmente se obtiene mediante regresión lineal. Luego, se prepara una
solución de muestra según el procedimiento especificado en la monografía individual.
La cromatografía se realiza en las mismas condiciones operativas que para la preparación de la función de calibración, se mide el área del pico o la
altura del pico del compuesto a analizar y la cantidad del compuesto se lee o calcula a partir de la función de calibración.

Usando calibración de un punto: en una monografía individual, generalmente se prepara una de las soluciones estándar con una concentración
dentro del rango lineal de la función de calibración y una solución de muestra con una concentración cercana a la de la solución estándar, y se realiza
la cromatografía. en condiciones fijas para obtener la cantidad del componente comparando las respuestas obtenidas. En este método, todos los
procedimientos, como el procedimiento de inyección, deben realizarse en condiciones constantes.

Método de estándar interno

Usando una función de calibración: En el método del estándar interno, se elige un compuesto estable como estándar interno que muestra un
tiempo de retención cercano al del compuesto a analizar y cuyo pico está bien separado de todos los demás picos en el cromatograma. Se preparan

Oficial
varias soluciones estándar que contienen una cantidad fija del estándar interno y cantidades graduadas de un estándar de referencia del compuesto a
analizar. A partir de los cromatogramas obtenidos mediante inyección de un volumen fijo de soluciones estándar individuales, se calcula la relación
entre el área del pico o la altura del pico del estándar de referencia y la del estándar interno. Se prepara una función de calibración trazando estas
proporciones en ordenadas frente a la cantidad de estándar de referencia o la proporción de la cantidad de estándar de referencia con respecto a la del
estándar interno en abscisas. La función de calibración generalmente se obtiene mediante regresión lineal. Luego, se prepara una solución de
muestra que contiene el estándar interno en la misma cantidad que las soluciones estándar utilizadas para la preparación de la función de calibración
de acuerdo con el procedimiento especificado en la monografía individual. La cromatografía se realiza en las mismas condiciones operativas que
para la preparación de la función de calibración. Se calcula la relación entre el área del pico o la altura del pico del compuesto a analizar y la del
estándar interno, y la cantidad del compuesto se lee o calcula a partir de la función de calibración.

Usando calibración de un punto: En una monografía individual, generalmente una de las soluciones estándar con una concentración dentro del rango
lineal de la función de calibración y una solución de muestra con una concentración cercana a la de la solución estándar, ambas contienen una cantidad
fija del Se preparan patrón interno y se realiza la cromatografía en condiciones fijas para determinar la cantidad del compuesto a analizar
comparando las proporciones obtenidas.
Procedimiento de normalización: siempre que se haya demostrado la linealidad de los picos, las monografías individuales pueden prescribir que
El contenido porcentual de un componente de la sustancia a examinar se calcula determinando el área del pico correspondiente como
porcentaje del área total de todos los picos, excluidos los debidos a disolventes o reactivos o los que surgen de la fase móvil o de la muestra. matriz,
y aquellos que se encuentran en o por debajo del límite de desestimación o umbral de notificación.

OTRAS CONSIDERACIONES

Respuesta del detector: ♦La sensibilidad del detector es la salida de señal por unidad de concentración o unidad de masa de una sustancia
(también conocida como factor de respuesta) en la fase móvil que ingresa al detector. El factor de respuesta relativa del detector, comúnmente
denominado factor de respuesta relativa, expresa la sensibilidad de un detector para una sustancia determinada en relación con una sustancia estándar.
En los ensayos de sustancias afines se aplican los factores de corrección indicados en la monografía.♦
Picos de interferencia: se ignoran los picos debidos a disolventes y reactivos o que surgen de la fase móvil o de la matriz de la muestra.
Medición de picos: Integración del área del pico de cualquier impureza que no esté completamente separada del pico principal.
Se realiza preferentemente por desnatado tangencial (Figura 9).

[Link] [Link] 18/19

Machine Translated by Google
Impreso el: miércoles 8 de febrero de 2023, [Link] p. m. (EST) Estado: actualmente oficial el 9 de febrero de 2023 ID de documento: GUID­6C3DF8B8­D12E­4253­A0E7­6855670CDB7B_6_en­US
Impreso por: Dang Van Vu Fecha Oficial: Oficial a partir del 01­dic­2022 Tipo de Documento: CAPÍTULO GENERAL @2023 USPC
No distribuir Ref. DOI: nu938 DOI: [Link]
19

Oficial Figura 9.

umbral de notificación
Cuando la prueba de sustancias relacionadas prescriba un límite para el total de impurezas o una determinación cuantitativa de una impureza,
Es importante elegir un umbral de notificación adecuado y las condiciones apropiadas para la integración de las zonas de máxima actividad.
En tales pruebas, el umbral de notificación, es decir, el límite por encima del cual se informa un pico, se define generalmente en 0,05%.▲ (USP 1 de diciembre de 2022)

[Link] [Link] 19/19