UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIDLOGICAS Escuela Académico Profesional de Microbiologia y Parasitologfa AUTORES: Ms. C. Maria Nelly Vasquez Valles Ms. C. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas TRUJILLO — PERU1 ' MANUAL DE PRACTICAS DEL CURSO DE MICROBIOLOGIA GENERAL Ms. . MARIA NELLY VASQUEZ VALLES. Docente Auxiliar D.E. del Laboratorio de Microbiologia y Tecnologia de Alimentos. Departamento de Microbiologia y Parasitologia. Facultad de Ciencias Biolégicas. Universidad Nacional de Trujillo. . Docente de la Seccién de Postgrado en Ciencias Biologicas. Mencién en Microbiologia y Tecnologia de Alimentos. Universidad Nacional de Trujillo. MS. C. PEDRO ARNALDO ALVARADO SALINAS. Docente Principal D.E. del Laboratorio de Microbiologia y Tecnologia de Alimentos. Departamento de Microbiologia y Parasitologia. Facultad de Ciencias Biolégicas. Universidad Nacional de Trujillo. Docente dé la Seccién d Postgrado en Ciencias Biolégicas. Mencién Microbiologia y Tecnologia de Alimentos. Universidad Nacional de Trujillo. DERECHOS RESERVADOS® QUEDA PROHIBIDA LA REPRODUCCION TOTAL O PARCIAL DE LA PRESENTE GUIA, SIN EL. CONSENTIMIENTO PREVIO DE LOS AUTORES. EDITADO POR EL COMITE DE PUBLICACIONES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS,i | INDICE. Pag, Seguridad en el laboratorio. Normas generales de trabajo en el laboratorio de microbiologia. ... Normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologia Practica 01. Microscopia. 12 Préctica 02. Colorantes y coloraciones........... 19 Prictica 03. Medios de cultivo . 29 Préctica 04. Siembra y aislamiento de microorganismos. 39 Prictica 05. Metabolismo bacteriano... 45 Préctica 06. Accién de los microorganismos sobre proteinas y otras sustancias nitrogenadas. - 32 Préctica 07. Accién de los microorganismos sobre las grasas. 62 Préctica 08 y 09. Aislamiento de hongos ambientales y de alimentos. 66 Practica 10. Aislamiento e identificacion de bacteriéfagos .R Practica 11. Observacién de quistes de protozoarios y huevos de helmintos ... 7 Prictica 12. Accién de agentes fisicos y quimicos sobre el crecimiento microbiano . 84 Practica 13. Aislamiento de microorganismos del suelo 90 Practica 14. Aislamiento de microorganismos a partir de cavidades naturales del huésped 96 Practica 15. Aislamiento y observacién de estreptococos........ 101 Practica 16. Anélisis bacteriolégico del agua potable.......... 105 Practica 17. Control de calidad higiénica de la leche: prueba de a reduetasa .. 116 Practica 18. Andlisis microbioldgico de helados. 122 Préctica 19, Elaboracién de yogurt. 128PRESENTACION La microbiologia como ciencia, continuamente esta suftiendo grandes cambios debido a los nuevos descubrimientos que dia a dia ocurren en este fascinante mundo de los microbios. La informacién cientifica relacionada con las caracteristicas metabolicas, fisioldgicas y genéticas de los microorganismos ha proporcionado Ia base para las pruebas de identificacién de microorganismos de interés industrial y clinico. Por tanto, la Microbiologia puede ser estudiada bajo dos aspectos: 1) Como ciencia bisica, proporciona algunas de las herramientas de investigacién més accesibles para probar la naturaleza de los procesos vitales, pues, nuestra comprensién de los principios fisicos y quimicos que hay detrés de los procesos de la vida, ha surgido de da, se relaciona estudios en los que se utilizan microorganismos; 2) Como eiencia apli con muchos problemas practicos importantes en medicina, agricultura e industria, asi_ se tiene que algunas de las enfermedades mas importantes de los humanos, los animales y las plantas son causadas por microorganismos, por tanto, los microorganismos desempefian un papel importante en las enfermedades del hombre, los animales, las plantas, en Ia fertilidad de la tierra y en la: produccién animal; asi mismo, muchos procesos a nivel industrial, requieren la participacién de los microorganismos. Con la finalidad de cubrir las expectativas para el desenvolvimiento del Ingeniero Agroindustrial en el campo microbiolégico, se ha desarrollado el presente manual que incluye una serie de técnicas 0 métodos adecuados para la observacién, aislamiento, identificacion y control de microorganismos. Ademés, se destaca !a relacién de los microbios con su huésped, la importancia en el control de calidad de alimentos y en la elaboracién de productos alimenticios. También se pone especial énfasis en la importancia de las normas de bioseguridad en el laboratorio de Microbiologia. Se espera que el manual haga llegar a los estudiantes de Ingenieria Agroindustrial que evan el curso de Microbiologia General, informacién util obtenida de la experiencia de los autores y de la revision hecha a numerosas obras, cuyos contenidos han servido de base para su preparacién. Los autoresToda vez que en cada prictica se presentan tanto aspectos teéricos como | RECOMENDACIONES | | practicos, el estudiante debe asistir al desarrollo de la misma con la informacién suficiente a fin de responder a las interrogantes que el profesor haga en el momento que crea necesario. Para cada una de las practicas programadas durante el ciclo académico, el estudiante debe desarrollar el trabajo practico de acuerdo al esquema que se plantea. Por tanto, en cada practica debe considerar: a) Esquema de trabajo. El estudiante consideraré el trabajo ejecutado en el | laboratorio teniendo como base el procedimiento descrito en cada practica. Podré | incluir dibujos. { b) Resultado, Estard de acuerdo al trabajo realizado y la lectura podra expresarse en: esquemas, dibujos, tablas u otros, segiin sea el caso. Asimismo, el estudiante t tendra en cuenta que en determinadas practicas, las lecturas que realice no son resultados sino que en base a las lecturas debe de llegar al resultado. ©) Comentario. Se cefiré al resultado de la prictica, considerando el andlisis que se haga tomando en cuenta la informacion existente en la guia de prictica, asi como Ja informacién de las referencias bibliograficas que se consignan en cada practica. 4d) Cuestionario. El alumno responderd a cada una de las interrogantes que se plantean en cada prictica, para lo cual debe hacer uso de la informacién de la guia de prictica, de lo expresado por el profesor y de la literatura pertinente. Por ultimo, la guia de practica debe presentarse en la fecha establecida en el silabo. Toda presentacién después de la fecha serd considerada como deméritoSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Desde hace mucho tiempo la organizacién Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la seguridad bioldgica son importantes cuestiones de interés internacional. Es importante conocer los principios bisicos © de seguridad con microorganismos, considerando los peligros relatives que implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microorganismos para infectar al ser humano y a Jos animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo que se presentan en la tabla 1 Tabla 1. Clasificacién de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo. Gnipo de riesgo T: Microorganismos que tienen pocas (Riesgo individual y poblacional escaso o | probabilidades de provocar enfermedades nulo) en el ser humano o en los animales Grupo de riesgo 2: ‘Agentes patégenos que pueden provocar (Riesgo individual moderado, riesgo enfermedades humanas 0 animales pero poblacional bajo) que tienen pocas probabilidades de entrafiar un riesgo grave para el personal | de laboratorio, la poblacién, los animales 0 el medio ambiente. La exposicién en el laboratorio puede provocar una infeccién grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagacién es limitado. | Grupo de riesgo 3 ‘Agentes patégenos que suelen provocar (riesgo individual elevado, riesgo graves enfermedades humanas 0 poblacional bajo) animales, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y _ terapéuticas eficaces Grupo de riesgo 4 ‘Agentes patégenos que suelen provocar (riesgo individual y poblacional elevado) | enfermedades graves en el ser humano y los animales y que se transmiten con | facilidad de un individuo a otro, directa 0 indirectamente . Por lo regular no existen medidas preventivas y — terapéuticas | eficaces.NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Un laboratorio de Microbiologia es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica y, por tanto, se requiere un ambiente limpio y ordenado a fin de trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biolégica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o bunsen). Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patogenos, todos los cultivos de microorganismos deben ser manejados con precaucién por su potencial patogenicidad, Es necesario cumplir dos REQUISITOS BASICOS 1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compaiiero. 2. Evitar que los microorganismos presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc. contaminen las ‘muestras que estn procesando con lo cual no se llega a ningin resultado fidedigno. Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA.NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA El trabajo en el laboratorio, requiere la observacién de una serie de normas de seguridad, a fin de evitar posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se esté. haciendo o @ una posible negligencia. Quien trabaja en el laboratorio esta expuesto a muchos riesgos, pues, hay productos quimicos que son t6xicos, inflamables, explosivos, corrosivos, carcinogénicos y, a veces, hay el peligro derivado del uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras radiaciones. Ademés de estos riesgos, los microbidlogos estén expuestos a los microorganismos con los que trabajan; ademds, los medios de cultivo presentan muchas de las veces, ingredientes que son dafiinas para el que los manipula sin el debido cuidado. : NORMAS PERSONALES 1, Preparar cada sesién de laboratorio leyendo cada experimento hasta familiarizarse con el método empleado, con lo cual se disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y al mismo tiempo permite emplear el tiempo de una manera eficaz. 2. Llevar puesto en todo momento en el laboratorio la bata o el mandil. Esto garantiza que ningin material de cultivo caiga al alumno accidentalmente sobre su. ropa o piel, ademas protege la piel o la ropa de manchas y/o vertidos de sustancias quimicas. 3. Llevar al laboratorio s6lo aquellos materiales estrictamente necesarios para el trabajo, como lo son el manual de laboratorio o el cuademo de laboratorio, entre otros; el resto de objetos como bolsos, libros, casacas, etc. deben dejarse fuera del area de trabajo. 4, Comenzar cada jomada desinfectando el rea de trabajo con alcohol yodado. Repetir este procedimiento después de terminar el trabajo para asegurar que cualquier material depositado en el area de trabajo es desinfectado en forma adecuada, 5. Ponerse una mascarilla cuando se esté en el laboratorio, 6. Sisse tiene el pelo largo, es conveniente Ilevarlo recogido. No se debe comer, beber, ni fumar.8. Las etiquetas deben ser autoadhesivas para evitar la tentacién de humedecer su pegamento con la lengua. 9. Las heridas y rozaduras, deben desinfectarse cuidadosamente y cubrirse adecuadamente con un apésito después que se han brindado convenientemente los primeros auxilios. 10. Lavarse cuidadosamente las manos antes de dejar el Laboratorio, NORMAS DE UTILIZACION DE PRODUCTOS QUIMICOS 1. Antes de utilizar un compuesto quimico, asegurarse de que es el que se necesita, 2. No devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos quimicos y medios de cultivo. 3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos quimicos. 4. Los dcidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluitlos, nunca echar agua sobre ellos, por el contrario, se debe agregar acido sobre agua. 5. No pipetear con la boca. Utilizar peras de succién. 6. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hard al bafio maria, nunca directamente a la Hama. 7. Si se vierte sobre la piel cualquier dcido 0 producto corrosive, lavarse inmediatamente con abundante agua y avisar al encargado del laboratorio. 8. Todas sustancias quimicas deben estar adecuadamente etiquetadas con su nombre y fecha. El etiquetado es indispensable para evitar usos indebidos. 9. Si se preparan soluciones quimicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco y rotulado convenientemente. NORMAS DE UTILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO 1, Manipular con mucho cuidado los cultives que contienen microorganismos patégenos. Se debe usar guantes quinirgicos descartables. La bata se pasaré por el autoclave antes de mandarlo lavar y los guantes también antes de eliminarlos. 2. A un medio de cultivo con microorganismos derramado, se le debe afiadir una solucion apropiada de desinfectante y esta mezcla no se recoge hasta que pasen de15 a 30 minutos, con la finalidad de que actie el desinfectante y que se haya reducido la concentracién de cualquier aerosol que se hubiera producido. Los cultivos de hongos deben ser manipulados despacio y sin movimientos bruscos en una cdmara de seguridad, toda vez que los hongos que han esporulado, presentan riesgos de infeccién respiratoria, incluso no habiendo produccién de aerosol. . Las agujas de inoculacién de medios de cultivo deben esterilizarse antes y después de usarse, flameandolas en la llama hasta ponerlas al rojo en toda la extension del asa, Para evitar que salpique el material contaminado del asa, ésta se introduce lentamente en la llama del mechero. sy . Los tubos de cultivo deben quedar siempre en sus respectivas sradillas, No deben dejarse nunca los tubos en el extremo de la mesa. En ningtin caso los medios de cultivo sembrados con microorganismos, pueden ca considerase inofensivos. . Todo medio de cultivo sembrado asi como las muestras trabajadas, debe ser esterilizado antes de su eliminacién, de . Los cultivos no deben aspirarse o expulsarse de la pipeta con la boca, sino que se fio debe utilizar una pera de goma conjuntamente con la pipeta. se i NORMAS DE UTILIZACION DE MATERIAL DE VIDRIO bre | 1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. oe 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. 3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solucién desinfectante (mezela sulfocrémica 6 bicloruro de mercurio). De la misma manera se procede con léminas y laminillas. baad 4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe el considerarse los siguiente: a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningiin compafiero de trabajo ni a iat si mismo. Puede hervir el liquido y salir disparado, ocasionando un accidente. de b)EI tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo, agitando suavemente. 10OTRAS NORMAS 1. Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dénde esta el botiquin, las botellas de irrigacién de los ojos y los extintores de incendio. Se debe elaborar y poner a disposicién de todos, una lista de los peligros especificos de los productos quimicos y de los microorganismos del laboratorio, para que en cada caso de accidente se pueda facilitar al médico del hospital la informacién més completa posible. i 2. Al iniciar y terminar el trabajo en el laboratorio, desinfectar la zona de trabajo. Los cultivos y el material contaminado, no deben dejarse en las mesas sino en cestas metilicas apropiadas para ser esterilizadas en la autoclave. Finalmente, limpiar la zona de trabajo con una solucién desinfectante apropiada (por ¢j. alcohol yodado). eempen7 “Tr uPRACTICA 01 MICROSCOPIA EL MICROSCOPIO IL. INTRODUCCION: Las bacterias son tan pequefias que resulta imposible percibirlas a simple vista; hay que aumentarlas muchisimo para poder distinguirlas y estudiar bien, por Jo cual hay que hacer uso del microscopio. EI microscopio es un instrumento éptico que consiste en una combinacién de lentes para conseguir imagenes aumentadas 0 agrandadas de objetos diminutos. : Un microscopio simple consiste de una lente o cristal de aumento montado en una armazén, por lo general graduable y con frecuencia provisto de un soporte para la conveniente colocacién del objeto y de un espejo que refleja la luz. Los microscopios compuestos dan aumentos mucho mayores que los simples y son necesarios para ver y examinar objetos tan pequefios como las bacterias; se diferencian del simple porque constan de dos juegos de lentes, uno conocido como objetivo, y el otro como ocular, usualmente montados en un tubo. El microscopio electronico posee un poder de resolucién superior al de los microscopios que emplean luz visible. En su lugar usa un haz de electrones, Con este microscopio es posible obtener imagenes sumamente aumentadas, gracias a los sistemas épticos de electrones. Il. OBJETIVO: 2.1. Conocer las partes de! microscopio compuesto de luz 2.2. Adiestrar al estudiante en el manejo del microscopio compuesto de luz. para la visualizacién correcta de microorganismos. 2.3. Adiestrar al estudiante en la preparaci6n en fresco de una muestra biolégica. 12IIL MATERIALES: 3.1. Material Biolégico: Cultivo de levadura, 3.2. Material de vidrio: Léminas cubreobjeto - Lamina portaobjeto - Gotero - Mechero con ron 3.3. Reactiv Aceite de inmersién, 3.4, Equipos: - Microscopio 3.5. Otros: - Asa bacteriolégica. Agua destilada estéri. IV. PROCEDIMIENTO Identificar en el esquema los tres sistemas del microscopio de luz visible: SISTEMA OPTICO Oculares: Estén colocados en la parte superior del tubo. Se denominan as{ porque estén muy cercanos al ojo. Las principales funciones del ocular son las siguientes: + Amplificar la imagen real del objeto que forma el objetivo, ~ Corregir algunos defectos del objetivo, - _ Reflejar reticulos, escalas u otros objetos que se coloquen en el ocular. 13que Objetivos: Estén colocados en la parte inferior de! tubo ocular insertados en una pieza metélica, denominada revélver, que permite cambiarlos fécilmente. Son las lentes de mayor importancia en un microscopio, pues de sus propiedades depende que se consiga o se frustre la imagen final. Generan una imagen real invertida y aumentada. Los més frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. En la superficie de cada objetivo se indican sus caracteristicas principales: aumento, apertura numérica y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el nimero de aumentos. Las principales funciones del objetivo son: - _ Reunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto, - Concentrar la luz en un punto de la imagen, y - Amplificar la imagen. Lentes: Pueden ser convexas 0 céncavas en ambas superficies, planas en una cara © tener cualquier combinacién de éstas dos formas en su superficie. SISTEMA MECANICO Tubo: Es una camara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el tevélver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en su extremo superior. Brazo: Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado 6 vertical y une al pie con el tubo, 4Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacién, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacién situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tomillos de desplazamiento permite mover la preparacién de delante hacia atrés © de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior se encuentra un nonio que permite fijar las coordenadas de cualquier campo éptico; de ésta forma se puede acudir a é1 cuando interesa. Revélver: Sistema giratorio relacionado con el tubo, que porta los lentes objetivos para diversos aumentos, pudiendo utilizarlos alternativamente. Pie: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. Es una plataforma rectangular y en él se integra la fuente Juminosa. Tornillo macrométrico y micrométrico: Son tomnillos de enfoque. Mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma répida y el micrométrico de forma lenta. SISTEMA DE ILUMINACION Condensador: Es un sistema de lentes situadas bajo la platina. Su funcién es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacién hacia la preparacin. Enel interior del condensador existe un diafragma-iris cuya funcién es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados. Diafragma: Abertura que regula la cantidad de luz que ingresa hacia la preparacién, 15 F bE eFuente: Se trata de una lampara halégena de intensidad graduable. Esta situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualizacién, TORNILLOS FUENTE DE MACRO Y ILUMINACIGN MICROMETRICO de ion. yos MICROSCOPIO COMPUESTO.OBSERVACION EN FRESCO PROCEDIMIENTO: = Enun portaobjeto limpio y desengrasado colocar con un gotero, una gota de agua destilada estéril ~ Sobre la gota de agua realizar una suspensién con el cultivo de levadura. = Colocar una laminilla sobre la preparacién. = Colocar la lamina sobre la platina del microscopio = Enfocar con el objetivo de 10X - Observar la preparacién Vv. RESULTADOS Observacién: 7VI. COMENTARIO VIILCUESTIONARIO 1. {Que tipos de microscopia se conocen? Mencione sus diferencias. VIII. ” REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Salle AJ. (1966). Bacteriologia. 4ta ed. Edit. Gustavo Gili, S.A. Barcelona. Espafia Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse AA, Mietzner TA. (2011). Microbiologia Médica. Jawetz, Melnick y Adelberg. 25ava ed. Edit. Mc Graw Gill LANGE. Harrigan WF. (1998). Laboratory methods in food microbiology. Academic Press 3ra ed. 18PRACTICA 02 COLORANTES Y COLORACIONES I. GENERALIDADE! Se define a un colorante 0 tinte como una substancia 0 compuesto orgénico que tiene los grupos cromoforo y auxécromo ligados al grupo bencénico. El grupo eroméforo comunica al cuerpo la propiedad del color y el auxScromo proporciona al compuesto la cualidad de formar sales con lo cual confiere al compuesto la capacidad de colorear. En algunas coloraciones se utiliza una sustancia quimica conocida como mordiente, la cual puede definirse como cualquier sustancia que forme ‘compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacién a las bacterias. Los mordientes se aplican por lo general primero a los frotis o extensiones bacterianos y a continuacién se afiade la solucién de colorante; es tipica la aplicacion de mordientes en la coloracion Gram, la de gérmenes acido resistentes, etc. Los colorantes pueden ser: Naturales y artificiales. Colorantes naturales: jematoxilina, carmin, tomasol, etc. Colorantes artificiales: Pueden ser colorantes basicos como la tionina, violeta de genciana, fucsina bisica, ete; colorantes éeidos como el Acido picrico, la fucsina Acida, la eosina, etc.; colorantes meutros como el eosinato azul de metileno y los colorantes indiferentes como el sudan III. Coloraciones simples son aquellas que utilizan un colorante ‘nico disuelto en el disolvente adecuado; se aplica a las bacterias en una sola operacién. Las eélulas se tiften en general, en forma uniforme. Las soluciones simples que ‘mayormente se usan para teflir microorganismos son la de fucsina fenicada, cristal violeta o violeta de genciana y azul de metileno, 19esto Aico. reida ome Los ianos m de tanico acion. es que cristal El azul de metileno es acaso el colorante més usado en trabajos biolégicos. Por su condicién fuertemente basica, tifle con intensidad nicleos y granulos de écido nucleico. Es muy util para apreciar con rapidez la poblacion bacteriana de la leche. Coloraciones compuestas. Son aquellas que utilizan més de una sustancia tintérea. Las dos coloraciones compuestas més importantes que se emplean en bacteriologia son la de Gram y la de gérmenes acidorresistentes (BAAR) La coloracién Gram fue desarrollada por el médico danés Hans Christian Joachim Gram. Es una de las técnicas de tincién diferencial mas importante y més empleada en la microbiologia. Las bacterias tratadas por el método de Gram se clasifican en dos grupos: bacterias Gram-positivas, que retienen el cristal violeta y aparecen coloreadas en violeta intenso, y bacterias Gram-negativas, que pierden el cristal violeta y se vuelven a tefir con la safranina, apareciendo de color rojo. Il. OBJETIVOS. ~ Familiarizar al estudiante con las técnicas basicas de coloracién. + Mediante las coloraciones hacer visibles los gérmenes y observar su estructura. Il MATERIAL: 3.1. Material biolégico: - Cultivos de Bacillus sp, Klebsiella sp Escherichia coli, Staphylococcus aureus. ~ Muestras de: mucosa labial y sarro dental. 3.2. Colorantes: + Cristal violeta + Safranina “0” (solucién acuosa al 0.5%). 20Azul de metileno = verde de malaquita (solucién acuosa al 5%). = Maneval A (solucién acuosa de rojo de congo al 1%). = Colorante Maneval B (fuesina écida). 3.3. Equipos: = Microscopio éptico compuesto. 3.4. Reactivos: - Alcohol acetona. - Lugol. - Accite de inmersion 3.5. Otros: - Asa bacteriolégica, ~ Solucién Salina Fisiolégica (SSF). - Mondadientes 6 hisopo. - Mechero - Lamina portaobjetos ~ Mondadientes IV. PROCEDIMIENTO: PASOS GENERALES DE UNA COLORACION: - Extensién: Extender en una lémina porta objeto con la ayuda del aza bacteriologica, aza de cole u otro instrumento una pequefia muestra de material biolégico. - Fijacion: Pasar la lamina porta objeto suavemente por encima de la flama del mecheto con el objeto de adherir firmemente la preparacién sobre la lémina o emplear alcohol éter cuando la muestra es serosa. 21zade Tincién: Realizarla con el colorante o grupo de colorantes apropiados. Lavar la lamina para eliminar el colorante. Secar la ldmina al calor suave o el aire a presién. Observacién: Observar la ldmina al microscopio con el objetivo adecuado. En caso de observar con el lente de inmersién adicionar previamente una gota de aceite de inmersién por sobre la coloracién. COLORACION SIMPLE: Con una lémina porta objeto de primer uso, realizar un raspado de la mucosa bucal y extenderla uniformemente en el centro de otra lamina. Fijar al mechero. Colorear con azul de metileno durante 60 segundos. Eliminar el colorante. Lavar con agua hasta que ya no desprenda colorante. Secar al ambiente Colocar la lamina sobre la platina Enfocar con el objetivo de 10X, posteriormente adicionar sobre ta coloracién una gota de aceite de inmersién. Observar con el lente de inmersién (100X) B. COLORACION COMPUESTA COLORACION DE GRAM - Con Ia ayuda de un mondadientes, obtener una pequefia muestra de sarro dental y extenderla uniformemente en el centro de la lamina porta objeto. 22Fijar la muestra en el porta objeto pasindola tres a cuatro veces a la flama del mechero de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tincién, Colocar el frotis sobre un soporte para tincién y cubrir la superficie con solucién de cristal violeta por 30a 60 segundos aproximadamente. Después de un minuto (Puede ser menos o més tiempo con algunas soluciones), eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente. Cubrir con lugol y dejar actuar por espacio de 2 a 3 minutos. Lavar con agua corriente. Decolorar con alcohol acetona 6 alcohol hasta que ya no se desprenda mas colorante de la lémina. . Lavar con agua corriente. ‘ Colorear con safranina y dejar actuar por 30 a 60 segundos. Lavar, secar y observar el frotis teflido con aceite de inmersién con el objetivo de 100x del microscopio. Observacién: Las bacterias Gram positivas se tifien de color azul oscuro y las bacterias Gram negativas se ven de color rojo-rosado. Nota: En términos generales, son Gram positivos todos los cocos a excepcién de las neiserias y Gram negativos todos los bacilos a excepcién de los esporulados, Mycobacterium y Corynebacterium COLORACION DE CAPSULA: METODO DE MANEVAL Preparar una suspensin turbia del cultivo de Klebsiella sp. Colocar una gota de Maneval A sobre la superficie limpia y desengrasada de una lamina portaobjeto. Trasladar una azada de la suspensién del cultivo de Klebsiella sp. sobre la gota del colorante y realizar una extensién uniforme. Dejar secar a temperatura ambiente. Agregar el colorante de Maneval B por sobre la extensién hasta que la cubra , completamente. Dejar actuar por espacio de un minuto. Eliminar el exceso de colorante. 23- Secar a temperatura ambiente y observar el frotis tefiido con aceite de inmersi6n y con el objetivo de 100x del microscopio. Observacién: Observar el cuerpo bacteriano de color rojo; alrededor del mismo un halo claro (cépsula) en un fondo azul. COLORACION DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ. Realizar la extensién con el cultivo de Bacillus sp en el centro de una lamina porta objeto. Fijar la muestra a la lamina porta objeto pasdndola tres a cuatro veces a la flama del mechero. - Cubrir la muestra con verde de malaquita. - Calentar la lémina hasta el desprendimiento de vapores por 3 a 4 veces. = Lavar con agua corriente. - Agregar safranina por 30 a 60 segundos. - Lavar con agua corriente. = Secar y observar el frotis con aceite de inmersién y con el objetivo de 100x del microscopio. Observacién: Se observa la espora de color verde y cuerpo bacteriano de color rojo. V. ESQUEMA DE LA PRACTICA 24B. Coloracién de Gram C. Coloracién de capsula D. Coloracién de esporas 25VLRESULTADOS 26Aumento: Muestra: Observacién: .. Coloracién: .. Aumento!VI. COMENTARIO. VIL CUESTIONARIO. 1, ¢Cuales el fundamento de la coloracién Gram? 2. Con cual objetivo se observa a inmersién? 3. ,Qué papel cumple el aceite de inmersién, en una observacién microscépica? VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. Salle AJ. (1966). Bacteriologia. 4ta ed. Edit. Gustavo Gili, S.A. Barcelona. Espaiia. Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse AA, Mietzner TA. (2011). Microbiologia Médica. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2Sava ed. Edit. Me Graw Gill LANGE. Harrigan WF. (1998). Laboratory methods in food microbiology. ‘Academic Press 3ra ed.PRACTICA 03 MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCION: EI material en que se cultivan los microorganismos en el laboratorio se lama medio de cultivo. Los medios de cultivo microbiolégicos consisten en una mezcla de varios nutrientes, que sirven para favorecer el crecimiento de determinados tipos de microorganismos_y la formacién de productos éptimos. Para lograr esto, los medios deben poser una fuente de energia, una concentracién adecuada de otros elementos y ciertos requerimientos especificos de acuerdo al tipo de microorganismo que se desea cultivar. La determinacién de estos requerimientos se puede conseguir a partir de Principios bésicos. El principal constituyente de los microorganismos es el carbono. Los organismos fotosintéticos obtienen su energia de la oxidacién de compuestos inorgénicos, tipicamente usan didxido de carbono como la tinica fuente de carbono celular. La fijacién de CO2 requiere de energia la cual se obtiene de la luz solar o de compuestos inorginicos. Los demés organismos obtienen el carbono a partir de nutrientes organicos, los cuales cumplen una doble funcién como fuente de energia y de carbono, Las fuentes de carbono que se usan en la preparacién de medios de cultivo son: glucosa, suerosa (remolacha y cafla de aziicar), lactosa, maltosa, almidén, celulosa, metanol, etanol polialcoholes, Acido acético, metano, etc. Junto con la fuente de carbono es de vital importancia una fuente de nitrégeno como las sales de amonio 0 nitrato, el extracto de levadura, urea, harina de soya, proteinas hidrotizadas, etc y ciertos elementos traza. Algunos microorganismos necesitan otro tipo de adiciones tales como aminodcidos, purinas y pirimidinas, vitaminas. Aunque muchos organismos heterdtrofos crecen bien en agar o en caldos nutritivos, otros lo hacen con dificultad, y algunos no se desarrollan.” Ciertos heterétrofos son mas exigentes por lo cual necesitan nutrientes especiales como las 29io se tuna > de Para acion I tipo tir de bono. restos rbono rode tir de rergia ultivo aidén, 2on la es de steinas m otro caldos Siertos mo las vitaminas y otras sustancias estimulantes del crecimiento. Se utilizan también medios con fines especiales que facilitan el reconocimiento, enumeracién y aislamiento de ciertos tipos de bacterias. Los medios de cultivo pueden clasificarse teniendo en cuenta su aplicacién en medios comunes y medios especiales: Medios comunes: se destinan a la mayoria de las bacterias. Ejm. Caldo comin, agar comin, etc. Medios especiales: Medios mejorados 0 enriquecidos (si se les adiciona sustancias de mayor poder nutritive como sangre, huevo), medios selectivos, medios selectivos indicadores y medios para identificacién bioquimica. Terminada la formulacién de un medio de cultivo hay que realizar la climinacién por remocién 0 muerte de todos los microorganismos presentes en él mediante una esterilizacién adecuada. Las condiciones estériles son necesarias para el mantenimiento de cultivos puros evitando de esta forma el crecimiento de microorganismos indeseables; sin embargo hay que tener presente que en muchas fermentaciones de alimentos se realizan no sépticamente donde las inoculaciones altas, limpieza y ajuste de condiciones para inhibir a los contaminantes son suficientes para mantener a un cultivo simple. Habiéndose obtenido el cultivo puro se presenta el problema de conservar el cultivo en estado viable durante diferentes periodos de tiempo para lo cual es necesario seguir ciertas consideraciones para su conservacién como lo es realizando uuna transferencia periédica a un medio reciente, cubriendo los cultivos con aceite mineral, conservando los cultivos por desecacién répida en estado de congelacién (liofilizacién), conservandolos en arena estéril, etc. Il. OBJETIVOS: 3.1. Familiarizar al estudiante con las técnicas de preparacién de medios de cultivo, su esterilizacién y su almacenaje. 3.2. Dara conocer al estudiante sobre la importancia de los medios de cultivo y su uso. 30J. MATERIAL: 3.1. Material de vidrio: ~ Tubos de ensayo de 13 x 100mm. ~ Pipetas de 5 y 10 mL. ~ Bagueta de vidrio. - Matraces Erlenmeyer 250 mL. - Probeta de 100 mL. 3.2. Ingredientes de medios de cultivo: - Peptona - Extracto de came. - Glucosa ~ Agar. 3.3. Reactivos: = ~ Cloruro de sodio (NaC). - Agua destilada 3.4, Equipos: - Autoclave. + Cocina eléctrica. - Estufa. Balanza analitica 3.5. Otros = Algodén. = Agua destilada, = Alcohol de 96,5°. - Alcohol yodado. - Cinta de pH. - Pabilo. - Papel de aluminio 31IV. PROCEDIMIENTO: A PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO: En aquellos casos en los que sea posible, preparar los medios a partir de los productos deshidratados existentes en el comercio, Esto tiene la gran ventaja de que se garantiza una composi constante y de que los errores personales se reducen al minimo. Es eseneial consultar los manuales de instrucciones de uso publicados por los fabricantes de los. medios. Se deben seguir estrictamente las instrucciones de las casas proveedoras relativas a la preparacién, esterilizacién, conservacién ¢ inoculacién de los medios ya que de esto depende en gran medida el funcionamiento tanto de los medios selectivos como el de los no selectivos. Pasos generales: = Calcular las cantidades indicadas en la formula en relacién con el volumen de medio requerido. Si el medio de cultivo es completo (deshidratado) disolver en el volumen apropiado de agua destilada. ~ Filtrar si es necesario. - Determinar el pH del medio de cultivo y ajustar el pH si es necesario. - Distribuir el medio en recipientes adecuados (tubos, matraces o frascos) y obturar la boca de estos recipientes con tapones de algodén o capuchas de plastico o de metal. - Esterilizar el medio, por lo general en autoclave a 121°C por 15 a 20 minutos. = Comprobar Id esterilidad en estufa a 37°C durante 24 horas. Algunas indicaciones: = Repartir los medios sélidos estériles en tubos estériles y darles la inclinacién necesaria para obtener una mayor superficie de siembra. ~ Ota forma de preparacién es repartir el medio en tubos y esterilizar después. 32Los medios sélidos estériles, deben licuarse previamente en baiio maria antes de verterlos en placas 0 tubos de ensayo. Almacenar los medios de cultivo preparados si es que no se van a usar en el momento, de preferencia en la nevera o a temperatura ambiente en bolsas de primer uso y cerradas herméticamente para evitar que el medio se deshidrate y se deteriore. Ejemplos de medios de cultivo. MEDIOS DE CULTIVO LiQUIDOS: CALDO NUTRITIVO: Ingredientes: Peptona 5,0- 10,08 Cloruro de sodio 30g Extracto de came 30g Agua destilada 1000 mL Pesar todos los ingredientés y ponerlos en un matraz. Ajustar el pH a7, Autoclavar a 121°C por 15 a 20 minutos. AGUA PEPTONADA DE KOCH Ingredientes: Peptona Wg Cloruro de sodio Se Agua destilada 1000 mL - Pesar todos los ingredientes y ponerlos en un matraz. - Medir el pH y ajustar si fuera necesario. ~ Llevar a la autoclave a 121°C por 15 a 20 minutos. 33asar onte eel 1 pH B. MEDIOS DE CULTIVO SOLIDOS: AGAR NUTRITIVO: Preparar caldo nutritivo y adicionar 15 g de agar. Licuar y ajustar el pH a7. Llevar a la autoclave a 121°C por 15 a 20 minutos. AGAR Mac CONKEY Ager Selectivo para aislamiento de salmonelas, shigelas y bacterias coliformes, a partir de heces, orina, alimentos, aguas residuales, etc. Composicién (gflitro) Peptona de caseina 170 Extracto de carne 3,0 Cloruro de sodio 5,0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 13 Rojo neutro 0,03 Cristal violeta 0,001 Agar agar 13,5 Preparacién: Disolver 50 g/lito, esterilizar a la autoclave y verter en placas. PH: 7,1 0,1 34TABLA DE INDICADORES DE CLARK Y LUBS INDICADORES Metacresol purpura Rojo- Amarillo 0,5-2,5 ‘Azul de timo! Rojo- Amarillo 12-28 Azul de Bromotimol Amarillo- Violeta 3,0-4,6 Rojo de Metilo Rojo- Amarillo 44-60 Purpura de Bromocresol ‘Amarillo- Parpura 52-68 Paranitrofenol Incoloro- Amarillo 5,4-7,0 Azul de Bromotimol Amarillo- Azul 6,0 -7,6 Rojo de Fenol Amarillo- Rojo 68-84 7 Rojo de Cresol ‘Amarillo- Rojo 72-88 Azul de Timol Amarillo- Azul 8,0-9,6 Cresolftaleina Incoloro- Rojo 82-98 Metilvioleta Amarillo- Azul- Violeta 0,1-5,5— 3,2 Rojo de Congo Azul- Rojo 3,1-4,4 Tornasol Rojo- Azul 6,0 - 8,0 Rojo Neutro Rojo- Amarillo 6,8-8,0 | Fenolftaleina Incoloro- Rojo 8,3- 10,0 | Nota: Los uiltimos cinco indicadores no figuran en la Tabla de Clark y Lubs.ESTERILIZACION MANEJO DEL AUTOCLAVE: - Colocar el material a esterilizar en la canastilla de la autoclave. ~ Asegurarse de que exista agua suficiente para la formacién de vapor. = Cerrar la autoclave, dejando la espita abierta hasta que comience a salir vapor, - Cerrar la espita y registrar el ascengo de temperatura y presién en el manémetro. = Cuando la temperatura llega a 121°C, a una atmésfera de presién, contabilizar el tiempo de esterilizacién de 15 a 20 minutos. - No abrir la tapa de la autoclave mientras que la aguja del manémetro no haya regresado a su posicién original. Nota: En caso de contar con otro tipo de autoclave (automético), una vez colocado el material a esterilizar, cerrar la tapa, prender el autoclave, ajustar la temperatura y la presién, dejar funcionar hasta que cumpla el ciclo de esterilizacién. V. ESQUEMA DE TRABAJO: 36VL RESULTADO VII. CUESTIONARIO 1. {Qué es el agar y de donde se obtiene? 2. Indique dos finalidades por las cuales se preparan los medios de cultivo. 3. Por qué es importante medir el pH cuando se formulan medios de cultivo? 4. Aparte de las fuentes de carbono y energia, ;Qué contendria ua medio de cultivo para microorganismos anaerobios? VU REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 37Merck E. Manual de preparados para microbiologia. Medios de cultivo Merck . Bergey’s Manual of determinative Bacteriology. 9na ed. The Williams and Wilkins CO. Baltimore. USA. ios de lios de ria un 38PRACTICA 04 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS GENERALIDADE:! La poblacién microbiana del ambiente circundante del hombre es muy amplia_y compleja, Muchas especies microbianas diferentes habitan normalmente diversas partes de nuestro organismo; de igual forma se hallan distribuidas extensamente en la naturaleza, Se los encuentra en el suelo, sobre vegetales, en el agua y en el aire. El estudio de los microorganismos en tan diversas localizaciones exige que se disponga de técnicas adecuadas para poder realizar con éxito su aislamiento a partir de poblaciones microbianas mixtas en sus distintas partes integrantes, esto es para cultivar cada especie sola (cultivo puro). Un cultivo puro es un estado artificial, impuesto en el laboratorio. Para establecer las propiedades de los microbios en la naturaleza hay que tener Presente que el medio natural es completamente diferente a las condiciones del tubo de ensayo. Para el aislamiento de uno 0 varios microorganismos se emplean diferentes métodos de aislamiento tales como la técnica de siembra en placa en estrias y en superficie; técnica de vertido en placa, técnica de enriquecimiento del cultivo, técnica de dilucién en serie, ete. Es importante recordar que cuantas mis células se cogen con el asa de siembra, més habré que rayar sobre la placa para obtener células aisladas. La mayoria de los métodos de obtencién de cultivos puros se basa en algin método de dilucién. El método més util y préctico es el aislamiento en Placa, en el que un cultivo mezclado se extiende o se raya sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales quedan separadas una de otra. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y por fo tanto, un cultivo (o clon) puro, puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una tinica célula. 39Para tener ones 98 se mbra a de sade El examen microscépico de los organismos procedentes de una colonia debe mostrar un inico tipo celular para lo cual se debe confirmar la pureza de tun cultivo. Los métodos diferenciales de tincién, como por ejemplo la tincién Gram, son utiles para establecer que la colonia no contiene una mezcla de tipos microbianos diferentes. Il. OBJETIVOS: 2.1. Familiarizar al estudiante con las técnicas empleadas en Microbiologia para la siembra y el aislamiento de microorganismos de interés. 2.2. Familiarizar al estudiante con las técnicas empleadas en Microbiologia para la siembra de microorganismos en condiciones de esterilidad I. MATERIAL: 3.1. Material biolégico: 3.3. 3.4. Otros: ~ Cultivo de Escherichia coli + Cultivo de levadura + Cultivo de Bacillus sp . Medios de cultivo: - Placas con agar comin (AC) - Placas con agar Mc Conkey - Placas con Agar Glucosa oxitetraciclina (OGA). = Tubos con caldo comin, ~ Tubos con agar comin Equipos: - Estufa, + Refrigeradora, = Alcohol yodado. 40+ Asa bacteriolégica, > Mechero con ron. - Tubos con agua destilada estéril. + Encendedor. ~ Solucién de lugol + Set de Gram, IV. PROCEDIMIENTO: 1. SIEMBRA EN MEDIO SOLIDO: . Los medios bésicos y elementales son el agar simple o comtin y el medio gelatina. Método de siembra en superficie y aistamiento en placa por rayado continuo: 4 ~ Limpiar y desinfectar el area de trabajo con un agente antiséptico (alcohol yodado). ~ Esterilizar por flameado el asa de cole, dejar enfriar y sacar una alicuota de agua destilada y colocarla en el extremo de la placa con el medio de = cultivo. ~ Tomar una pequefia cantidad de inéculo (Cultivo bacteriano) con el asa de siembra y extenderla por rayado con un solo movimiento continuo de zig- zag sobre la mitad de la placa petri conteniendo el medio de cultivo E. apropiado. E ~ Fevantar ligeramente el asa de siembra y hacer rotar la placa en la mano y Continuar con el protocolo de rayado de igual forma que con la primera mitad, = ~ Para bacterias, incubar las placas a 35-37°C por 24-48 horas en forma invertida y para levaduras a temperatura ambiente por 3a 5 dias. - Después del periodo de incubacién, realizar la observacién de las _ caracteristicas culturales de las colonias en el medio de cultivo. _ 41- Elegir una o varias de las colonias que presenten las caracteristicas deseadas y sembrar(los) en tubo(s) conteniendo agar comin. - Incubar a las mismas condiciones anteriores. SIEMBRA EN MEDIO LiQuIDo: Los medios elementales y basicos son el agua peptonada de Koch, el caldo simple (caldo comin 6 caldo nutritivo) y el caldo infusion de came. ~ Con la ayuda del asa de siembra, previo flameado de la misma coger una asada de la muestra y sembrar en un tubo conteniendo caldo comin. + Incubar a 35-37°C por 24-48 horas. Realizar la lectura en base a crecimiento, viraje de color, formacién de grumos, formacién de pelicula y formacién de sedimento. Pasos Generales de Transferencia de Cultivos: Limpiar el frea de trabajo previamente con un agente antiséptico para reducir el niimero de contaminantes potenciales. Sujetar el asa de siembra entre los dedos indice y pulgar, colocar la porcién de alambre sobre la flama del mechero y flamear toda la longitud del alambre sobre la llama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. Enfriar el asa de siembra'durante 5 a 10 segundos antes de proceder con el siguiente paso. Abrir y flamear la boca del tubo conteniendo el medio de cultivo. Recoger un poco de cultivo crecido y transferirlo al medio fresco. ~ Flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes de cerrarlos. - Flamear nuevamente el asa de siembra. Incubar a 35-37°C por 24-48 horas. 42V. ESQUEMA DE TRABAJO: VI. RESULTADOS. 43VII. COMENTARIO VIII. CUESTIONARIO 1. @Para que se usan los tubos con medios de cultivo inclinado? 2. Mencione otra técnica de aislamiento en medio s6lido que se usa en microbiologia. IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: Mossel D.A.A; Moreno B. y Struijk C.B. (2006). Microbiologia de los alimentos. Fundamentos ecolégicos para garantizar y comprobar la integridad (inocuidad y calidad) microbiolégica de los alimentos. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza (Espafia). Jay J.M.; Loessner_M.J; Golden D.A. (2009). Microbiologia moderna de los alimentos. Sta ed. Edit. Acribia, S.A. PRACTICA 05L METABOLISMO BACTERIANO DEGRADACION DE CARBOHIDRATOS INTRODUCCION: El metabolismo es la serie de reacciones que ocurren en los seres vivos. Los microorganismos, por medio de su metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos de su medio ambiente en compuestos necesarios para poder vivir, crecer y Teproducirse. En estas transformaciones intervienen diversas enzimas que catalizan las reacciones de oxidacién, reduccién, hidrélisis, transferencia de grupos, isomerizacién y sintesis dando lugar a la degradacién de los compuestos incorporados (durante el catabolismo) y a la sintesis de nuevos compuestos (anabolismo). Las exoenzimas son secretadas por la célula y actiian fuera de ella sobre él sustrato, disminuyendo el tamafio de las moléculas complejas en el medio ambiente hasta lograr un tamaiio que pueda difundir al interior de la célula, donde servirén de sustrato a las endoenzimas. Al mismo tiempo, cada grupo de microorganismos muestra una capacidad diferente para transformar los compuestos, regida por su constitucién génica y por factores ambientales. Pueden poseer una bateria reducida de enzimas (actuando sobre pocos sustratos) 0 pueden presentar una amplia variedad de sistemas enzimaticos (actuando sobre una gran diversidad de sustratos). En el laboratorio, es posible conocer las caracteristicas‘metabilicas de los microorganismos, inoculindolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energia, fuente de carbone y de otros nutrientes esenciales para su crecimiento. La mayorfa de microorganismos utilizan la glucosa como fuente de carbono y de energia. Al entrar a la célula, la glucosa es oxidada en forma incompleta (fermentacién) 0 completa (respiracién) dependiendo de la presencia de oxigeno y de las capacidades enzimiticas de los microorganismos. 45cas de , con ry de ite de forma de la los I. OBJETIVOS: 2.1. Familiarizar al estudiante con las pruebas bioquimicas para la caracterizacién e identificacién de los microorganismos. 2.2 Demostrar la accién enzimética de los microorganismos sobre diversos sustratos. Il MATERIAL: 3.1 Material biolégico: - Cultivos puros de Escherichia coli, Shigella sp, Pseudomonas sp, Enterobacter sp, Bacillus sp, Staphylococcus. 3.2. Material de vidrio: - _ Pipetas pasteur. = Placas petri estériles. = Mechero con ron. Campanas Dirham. - Pipetas de 5 mL. = Tubos de ensayo de 13 x 100 3.3. Medios de cultivo: = Tubos con caldo glucosado al 1% con rojo de fenol como indicador, - Tubos con Medio VP-RM mis glucosa. - Placas con Agar Almidén al 0,2%. 3.4, Reactivos: - Hidréxido de potasio (KOH). - Alfa naftol. = Lugol. 3.5. Equipos: - Estufa regulada a 35-37 °C. %63.6. Otros: - Asa bacteriolégica. = Algoden. + Alcohol yodado. > Gradilla. IV. PROCEDIMIENTO: A. Formacién de scido 6 acido y gas: Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren ser degradados en monémeros y transportados a la célula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metaboli dos por la via fermentativa. La fermentacién (degradacién) de un compuesto orgénico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formacién de gas capturado en la campana de fermentacién, - Sembrar las cultivos de E: coli, Shigella sp y Pseudomonas sp en tubos conteniendo caldo glucosado al 1% con indicador rojo de fenol y campana de Diitham. ~ _ Incubar a 35-37°C por 24-48 horas. ~ _ Realizar la lectura observando la formacién de dcido, 0 dcido y gas. B. Produccién de Acetil Metil Carbinol: Fermentacién acide mixta: Los productos finales son dcidos orgénicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (vitaje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a acido léctico y dos las metabolizan para formar acido acético y formico; parte del acetato pasa a etanol y parte del formico a CO2e He en cantidades iguales. 47Fermentacién butilenglicélica: en ésta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de dcido ldctico, férmico y acético, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetil metil carbinol, que es reducido a 2,34-butilenglicol, productos que son neutros. Sembrar las cultivos de Enterobacter sp y E. coli. en tubos conteniendo medio VP-RM. Incubar a 35-37°C por 48 -72 horas. Cada cultivo sembrado distribuirlo en partes iguales en dos tubos de deben ake a A un tubo adicionarle 3.a 4 gotas de KOH y alfa naftol. Agitar (para a observar la presencia de acetil metil carbinol). Al otro tubo adicionarle tncion 2 a3 gotas de rojo de metilo y homogeneizar (para observar la formacién de acidez) renel Realizar la lectura en ambos tubos: ina de VP (+): Rojo. VP (-): Ausencia de color. oa RM (+): Rojo. RM(.): Amarillo. + fenol C. Hidrélisis del Almidén. El almidén es producido principalmente por plantas superiores, sas. esti compuesto “de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amiloliticas denominadas amilasas producidas por los microorganismos hidrolizan el almidén, decidos = - Sembrar por puntura en la superficie de una placa conteniendo agar almidén soluble al 0.2% el cultivo de Bacillus sp y de 1H por a Staphylococcus aureus = Incubar a 35-37*C por 24.048 hs. volizan - _ Realizar la lectura adicionando lugol a la place: anol y Lectura: Zona azul alrededor del cultivo: Hidrélisis del almidén (-). 48Zona transparente (sin color) alrededor del cultivo: Hidrélisis del almidén (+). Bacillus sp: Produce hidrélisis del almidén (+). ‘Staphylococcus sp: No produce hidrdlisis del almidén (-). V. RESULTADOS A. FORMACION DE ACIDO 6 ACIDO Y GAS B_ PRODUCCION DE ACETIL METIL CARBINOL: C. HIDROLISIS DEL ALMIDON. 49del VI. COMENTARIO VII. CUESTIONARIO 1. @Para qué es necesario incorporar las campanas de Diirham en el tubo con caldo glucosado? 2. {Qué tipo de enzimas deben poseer los microorganismos para degradar el almidén? 3. Cuél es el reactivo de lectura para observar la presencia de acetil metil carbinol en el medio de cultivo utilizado? 50IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS, Merck E. Manual de preparados para microbiologia. Medios de cultivo Merck. Bergey's Manual of determinative Bacteriology. 9na ed. The Williams and Wilkins CO. Baltimore. USA. Mossel D.A.A; Moreno B. y Struijk C.B. (2006). Microbiologia de los alimentos. Fundamentos ecolégicos para garantizary comprobar la integridad (inocuidad y calidad) microbiol6gica de los alimentos. 2da ed. Edit. Acribia, S.A. Zaragoza (Espaita). 51PRACTICA 06 ACCION DE LOS MICROORGANISMOS SOBRE PROTEINAS Y OTRAS SUSTANCIAS NITROGENADAS. INTRODUCCIO! Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes ¢ intervienen en varios procesos biolégicos. El crecimiento microbiano requiere la formacién de estructuras complejas como proteinas, dcidos nucleicos, polisacdridos y lipidos a partir de elementos preformados en el medio de crecimiento o ser sintetizados por la propia célula, a su vez, este crecimiento necesita de una fuente de energia, todo este proceso se designa con el nombre de metabolismo, que se define como todas las transformaciones quimicas que ocurren en una célula, lo cual conlleva a transformar las moléculas nutritivas en elementos que posteriormente serén utilizados para la sintesis de los componentes estructurales; como pueden ser las proteinas. Después del carbono el elemento més abundante en la célula es el nitrégeno, representa entre el 12 y el 15% del peso seco, y es el constituyente principal de proteinas y acidos nucleicos. La mayoria de las bacterias son capaces de utilizar el amonio como fuente de nitrogeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reduccién de nitratos, se puede lograr por 2 mecanismos diferentes: 1. Reduccién asimiladora: En la cual es reducido por la via del nitrito, y 2. Reduccién desasimiladora: Donde el nitrato (NOs) sirve como aceptor final de clectrones. Muchos anaerobios facultativos utilizan la desnitrificacién porque el nitrato, como el oxigeno, tiene un bajo potencial de reduccién, Muchas bacterias desnitrificadoras pueden también utilizar el hierro férrico (Fe) y algunos compuestos orgénicos como receptores de electrones.La desnitrificacién implica la teduccién paso a paso del nittato (NO) al nitrito (NO*), al 6xido nitrico (NO), al éxido nitroso (NOx) y al nitrégeno molecular (N2) mediante las enzimas nitrato reductasa, nitrito reductasa, 6xido nitrico reductasa y Gxido nitroso reductasa, respectivamente. UL. OBJETIVOS: m1. 2.1. Familiarizar al estudiante con la utilizacién de las fuentes nitrogenadas por los microorganismos. 2.2 Demostrar la accién enzimética de los microorganismos sobre los nitratos y otras sustancias nitrogenadas. MATERIAL: 3.1. Material biolégico: ~ Cultivos puros de £. coli, Pseudomonas sp, Proteus vulgaris, Citrobacter sp. 3.2. Material de vidrio: - Placas petri estériles. - Mechero con ron. - Pipeta pasteur 3.3. Medios de cultivo: ~ Tubos con caldo triptonado. + Tubos con medio gelatina. ~ _ Tubos con agar urea (rojo de fenol como indicador). - Tubos con caldo nitratado, 3.4. Reactivos: - Reactivo de Kovac’s. > Tiras de papel con acetato de plomo - Reactive de Gries 333.3. Equipos: igena - Estufa regulada a 35-37 °C. ctasa, 3.6. Otros: = Asa bacteriologica. = Algodén. nadas = Alcohol yodado. © los IV. PROCEDIMIENTO: DEMOSTRACION DEL METABOLISMO BACTERIANO SOBRE PROTEINAS: a. Lienefaccién de la Gelatina: aa La gelatina, una proteina derivada del colageno animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir proteinas proteoliticas (proteinasas), detectadas por digestién o licuefaccién de la gelatina. Las enzimas capaces de producir gelatinélisis se denominan gelatinasas. Estas enzimas a menudo son factores de virulencia de algunos microorganismos. Las proteinas naturales son demasiado grandes para ingresar a la célula bacteriana; por ende para que una célula pueda usar las proteinas, estas primero deben ser catabolizadas a componentes més pequefios. Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las proteinas y esta capacidad ayuda a la identificacién bacteriana. La gelatina es hidrolizada por la gelatinasa en sus aminoécidos constitutivos, con pérdida de sus caracteristicas gelificantes. = Sembrar los cultivos de E. coli y Pseudomonas sp en medio gelatina. = Incubar a 35-37°C por 48 horas. - Realizar la lectura colocando los tubos sembrados ¢ incubados a temperatura de refrigeracién (10°C) 0 en un vaso conteniendo hielo. E. coli : Hidrélisis de la gelatina (-). 54Pseudomonas sp: Hidrélisis de la gelatina (+). b. Produceién de indol: La peptona de caseina (triptona), contiene una elevada proporcién de triptofano el cual es degradado por las triptofanasas. Producto de esta degradacién se forman tres metabolitos: indol, metil indol y Acido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen p- dimetilaminobenzaldehido (DMBA) que reacciona con el indol producido formando un compuesto quinénico color violeta, que se observa por la aparicién de un anillo en la superficie del medio - Sembrar los cultivos de E. coli, Proteus vulgaris y Citrobacter sp en tubos conteniendo caldo triptonado. + Incubar a 35-27°C por 24 a 48 horas. ~ Realizar la lectura adicionando a cada cultivo 3 a 4 gotas de reactivo de Kovac’s. Agitar y ver la formacién de un anillo de color grosella en la interfase del medio de cultivo. Proteus vulgaris: Indol (+) - Color grosella. [Link] sIndol (+) Color grosella. Citrobacter sp: Indol(-) No cambia de color. c, Produccién de Acido Sulfidrico (H2S): La protedlisis de las proteinas produce aminodcidos individuales; ciertas bacterias heterotréficas pueden liberar enzimiiticamente el azufre de los diversos aminodcidos azuftados (-SH), produciendo H2S gaseoso. La peptona, cisteina, cistina, metionina y tiosulfato son fuentes de azufre, pero diferentes especies usan diferentes aminodcidos azutrados para producir H2S. Las enzimas responsables de esta actividad son la cisteina desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa, La produccién de HS se detecta cuando el gas entra en contacto con ciertos metales, como plomo, hierro o bismuto y forma sulfuros de estos metales. 35cin de de esta * Acido wen p- rducido por la - spen tivo de terfase fuales: azufre \se0so. wzutre, 5 para isteina to con estos . Hidrélisis de la Urea: = Sembrar los cultivos de £. coli, Proteus vulgaris y Citrobacter sp en tubos conteniendo caldo triptonado. = Poner a cada tubo una tira de papel de filtro con acetato de plomo en la parte superior del mismo. = Incubar a 35-37°C por 24 a 48 horas ~ Realizar la lectura observando la formacién de sulfuro de plomo en la tira de papel (color negro). Proteus vulgaris : H2S (+) E. coli : RS (-) Citrobacter sp: HaS (+) DEMOSTRACION DEL METABOLISMO BACTERIANO SOBRE OTRAS SUSTANCIAS NITROGENADAS: La hidrélisis de la urea por la enzima ureasa presente en algunos microorganismos libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, con lo cual hace virar el indicador de pH rojo de fenol. Sembrar las cultivos de £. coli y Proteus vulgaris en agar urea. = Incubar a 35-37°C por 24 a 48 horas. ~ Realizar la lectura. - [Link]: Medio de cultivo sin viraje de color (ureasa negativo). = Proteus: Medio de cultivo de color grosella (ureasa positivo). . Reduccién de Nitratos a Nitritos: El nitrito reacciona con dos reactivos: cido sulfanilico y dimetil a-naftilamina (0 o-naftilamina). La reaccién de color se debe a la formacién de un compuesto diazonio, p-sulfobenceno-az0-a naftilamina. = Sembrar E. coli y Pseudomonas sp a partir de un cultivo en agar inclinado, en caldo nitratado. = Incubar a35-37°C por 24 horas. 56