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DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA

FARMACÉUTICA

PROTOCOLO :

“OPERACIONES PARA LA PUESTA EN MARCHA Y UTILIZACION Fecha de elaboración:

DE LOS EQUIPOS DE ANÁLISIS DE TAMAÑO DE PARTÍCULA Y 20.10.2009
POTENCIAL ZETA”

1. INTRODUCCIÓN:
Este protocolo que a continuación presentamos pretende ser tan sólo una guía inicial
para los nuevos usuarios del aparato. La lectura del mismo dará sólo unas ideas
generales de cómo llevar a cabo un ensayo. Cada usuario podrá acceder al extensísimo
manual que está incluido dentro del programa (en el icono de “help”) donde se podrá
encontrar más información sobre cada uno de los apartados que aquí se tratan y sobre
muchos otros que serán de interés particular en cada ocasión, por ejemplo,
tratamiento de datos, particularidades de la muestra, etc.

2. OBJETIVO:
Establecer las instrucciones básicas que han de seguirse para la utilización y limpieza
de los equipos MICROTRAC S-3500 y MICROTRAC-ZETATRAC, en la determinación del
tamaño de partícula y del potencial zeta.

3. CONSIDERACIONES GENERALES:
Ambos equipos utilizan el software Microtrac Flex.

La determinación del tamaño de partícula se realiza por laser Light scattering. En el

caso de Microtrac S-3500 la técnica empleada es static Light scattering y para
Microtrac-Zetatrac es dynamic Light scattering. Esta segunda técnica permite además
el análisis de la carga superficial de las partículas (potencial zeta).

El rango de medida del equipo Microtrac S-3500 se encuentra entre 0,02 µm y 2800
µm. Para partículas inferiores a 0,01 µm se aconseja usar “Microtrac-Zetatrac”, cuyo
rango de medida está entre 0,8 nm y 6500 nm y que además de determinar el
potencial zeta, permite obtener información sobre el peso molecular de la sustancia en
análisis.
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4. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA

Encender Microtrac-S3500 o el Microtrac Zetatrac y seguidamente el ordenador
acoplado.

En el escritorio aparece el icono del programa:

“Microtrac FLEX 10.5.3”. Aparece la pantalla
principal:

Seleccionar el aparato en Measure  Select

instrument  Microtrac

Aparece la pantalla general del último

usuario (en este caso “ExampleDB”)

Si vamos se trata de un nuevo usuario

entonces acceder a: File  “Create new
database”

Dar nombre a la nueva base de datos donde

se irán guardando todos los métodos así
como los resultados (En el ejemplo
“biofarmacia”). Si vamos a trabajar con una
base de datos ya creada entonces en File 
“Change measurement Database” 
seleccionar la deseada.
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Nos devuelve a la pantalla general

El siguiente paso es crear un standard operation procedure (SOP), que es el método

donde dejaremos recogidas las especificaciones de nuestra medida. Este SOP se
guardará en la base de datos que hemos creado y se podrá reutilizar cuando sea
necesario.

Para crear SOP vamos al icono SOP y tras hacer click aparece la siguiente
pantalla:

Aquí podríamos abrir un SOP ya creado con anterioridad, cambiar una ya

existente y guardarlo con otro nombre, o crear uno nuevo. Para ello vamos a
options y aparece otra pantalla con varias pestañas: Timing; Identifiers;
Analysis, Perspectives.

TIMING permite establecer el tiempo

del Setzero (en principio con 30
segundos es suficiente). El número de
medidas y el tiempo de cada medida. Si
se quiere repetir el ensayo también puede
establecerse un tiempo de “reposo”
entre una medida y otra.

IDENTIFIERS Se escribe lo
necesario para que la muestra quede bien
identificada (realmente no es necesario
rellenarlo todo, claro!)

ANALYSIS abre a su vez varias pestañas. De

todas ellas sólo nos tenemos que fijar en las
dos primeras, en “PARTICLE
INFORMATION” debemos
establecer varios puntos:
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Transparency: si la partícula es opaca no refractará la

luz y toda la luz que de ella salga tendrá que ser
considerada de dispersión y por tanto útil para evaluar
el tamaño de la misma. Si por el contrario es
transparente, parte de la luz que incida sobre la
partícula será refractada, dando lugar a luz en un
ángulo que realmente no refleja el tamaño de la
partícula y que por tanto debe ser corregido. Cuando
esto ocurre, debemos incluir el índice de refracción de
nuestro material, lo cual no siempre es fácil. Así, en “Reference” existe una lista de materiales
(PDF) con su IR, si nuestro material no está entre los del listado, es
aconsejable/necesario/imperioso, conocer el IR de la muestra usando un refractómetro.

a) Shape: si la partícula es esférica la luz dispersada reflejará mejor el verdadero

tamaño que si es irregular. El aparato permite corregir en cierta medida el valor
del diámetro cuando estemos tratando muestras irregulares.

b) Density. Se puede obtener también un valor aproximado del peso molecular del
material, pero para ello es necesario conocer la densidad del mismo.

Los cambios realizados pueden guardarse con el nombre que sea “LIPOSOMAS” en
este caso para no tener que introducirlos cada vez que se use el mismo material.

Del mismo modo, en “FLUID INFORMATION”

hay que introducir los datos correspondientes al
medio donde están dispersas las partículas.

Debemos conocer el índice de refracción del

líquido (igual que en el caso anterior en
“references” existe una lista en PDF con los
principales líquidos y sus IR) y la viscosidad a la
temperatura máxima y mínima que se prevea
que puede alcanzarse.

PERSPECTIVES permite determinar cómo van

a presentarse los resultados. Así,
“Progression” permite establecer la
progresión en las fracciones de tamaño que
van a ser medidas. “Distribution” permite
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definir cómo va a presentarse los resultados de tamaño (en volumen, en área, en

intensidad o en número respecto a 100 partículas). Del mismo modo se pueden definir
los percentiles y el % de tamaños que queremos que aparezca en la pantalla.

Una vez estén todos los parámetros establecidos se pulsa OK y se guardan los cambios
con el nombre deseado en la pantalla de SOP.

Si se desea rectificar los datos registrados en “Identificators” puede hacerse

directamente a través del iconito “ID”

Antes de hacer la medida hay que comprobar que está limpia la celda, para ello se
hacen 2-3 lavados con agua Milli Q. Si estamos trabajando con el aparato Microtrac
3500 entonces el lavado se realiza de la siguiente manera: se llena la celda con agua
milliQ, se enciende el sistema de circulación de muestra, se abre la llave (posición
vertical) que controla la eliminación de muestra para eliminar el agua de lavado, cerrar
la llave (posición horizontal) y parar el sistema de circulación de muestra. Este
procedimiento se puede repetir un par de veces. Si por el contrario estamos
trabajando con el aparato “Microtrac-Zetatrac” entonces el lavado consiste en llenar y
vaciar varias veces la celda con Agua MilliQ ayudándose de una pipeta de plástico.

Por último, se deja la celda llena de agua milliQ y se hace un “Setzero measurement”,
para ello se presiona sobre la tecla S/Z. Durante un tiempo que puede ser fijado por el
operador (ver más adelante), pero que por defecto es de 30 segundos, el aparato
verifica que no hay ruido de fondo, es decir, que no hay nada suspendido (suciedad,
resto de partículas anteriores, etc.). Si efectivamente todo está limpio, la marca que
antes ponía “Not setzero” en amarillo pasa a “Setzero OK” en verde, indicando la fecha
y la hora en que éste se realizó. Si el sistema no estaba limpio entonces aparecería
“high background” en rojo. Habría que seguir limpiando hasta que el setzero fuera ok.

El siguiente paso sería ya la adición de la muestra. En el caso de Microtrac 3500, como

el sistema de circulación está
encendido, se produce la mezcla
adecuada de la muestra cons u
vehículo. En el caso del Microtrac
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Zetatrac, con la propia pipeta con la que se haya aplicado la muestra se deberá
intentar mezclar ésta con el vehículo, mediante sucesivas succiones. Si es en medio
acuoso, como teníamos agua milliQ del Setzero pues simplemente tenemos que añadir
una cantidad de nuestra suspensión. Si queremos hacerlo en otro medio tendremos
que retirar el agua, lavar un par de veces con el nuevo medio y volver a hacer el
Setzero. Para saber exactamente qué cantidad debemos añadir pulsamos LD (load) y
aparece esta pantalla

Conforme vamos añadiendo muestra, poco a poco, la barrita roja va subiendo y debe
estar en la zona verde. En ese momento en el rectángulo azul de Status aparecerá la
palabra READY. Al lado tenemos una aproximación (diagrama de barras) de la señal.

Después damos a RUN. Aparece de nuevo la página de identificador por si queremos

cambiar algo y cuando le damos a ok comienza la medida.

Una vez finalizada obtenemos los siguientes valores en la pantalla:

Observamos:

a) La gráfica de la distribución de tamaño, acumulada y en histograma. Podemos

ver ya si existe 1 población o más de 1.
b) En el “Tabular Data” vemos los datos de % retenido (% Channel) y % que pasa
(% pass) por un tamiz de luz “size (nm)”.
c) Los percentiles, por ejemplo vemos que el 50% de la muestra tiene un tamaño
inferior a 59,4 nm
d) El % de partículas inferiores a un determinado tamaño, por ejemplo: 25,5 % de
las partículas tiene un tamaño inferior a 50 nm.
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e) En el summary vemos el diámetro medio en volumen (MV), el diámetro medio

en número (MN), el diámetro medio en área (MA), el área superficial calculada
(CS), la desviación estándar (SD), El peso molecular calculado (MW), la mediana
(Mz), el coeficiente de Kurtosis (Kg), el “inclusive graphic Sk.,
Para más detalles sobre este punto ir al manual (help) página 34.
f) Si tuviéramos más de una población, estos valores del apartado e) no servirían,
tendríamos que fijarnos en la parte de “Peaks summary” para poder ver cada
pico por separado.

Realmente estos valores corresponden a la media de las 3 medidas que se ha

realizado. Los datos se guardan automáticamente de forma que uno puede
recuperarlos de la base de datos cuando lo necesite. Este ordenador está conectado a
la impresora, por lo tanto pueden imprimirse los resultados directamente. Además, se
puede guardar la información en un pendrive tal cual en PDF (Menú
principalReportExport). En cuanto al tratamiento de datos tendremos que irnos a
File  “Open database for retrieval”. Aquí elegimos nuestra base de datos”

Luego hacemos click en el dibujo del disquete con el texto “open database retrieval” y
aparece la siguiente pantalla

En “Database Query Filters” vamos a “Brench Type” y seleccionamos “S3000/3500/”.

En el caso del Microtrac-Zetatrac se elige “Nanotrac”.
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Vamos a “query results” y nos aparece la lista de medidas ya recogidas en esa base de
datos.

Podemos señalar las que queramos arrastrando el ratón y luego con el botón derecho
del ratón tenemos las siguientes opciones:

Así por ejemplo podemos representar las medidas seleccionadas en una misma gráfica,
dando a “compare plots selected”, tanto en 2D como en 3D.

Con la opción “Recalculate” (botón derecho del ratón) se pueden cambiar algunos
parámetros de una medida (realizada previamente), por ejemplo forma de la partícula
(esférica o irregular), índice de refracción, etc., y obtener un nuevo análisis que se
puede comparar con el realizado inicialmente.
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Podemos también por ejemplo comparar

determinados parámetros de cada medida.
Para ello vamos primero a la pestaña “Trends
Plot setup”. Señalamos los parámetros que
queremos comparar.

Luego volvemos a Query results, seleccionamos las medidas que queremos comparar y
con el botón derecho del ratón vamos a “Retrieve to Trend plot” y obtenemos gráficas
donde se comparan los distintos parámetros seleccionados de las distintas medidas.

Para crear un Report vamos a Report  Design

Seleccionamos la plantilla que queramos:

En Design Report aparece una pantalla que es

como un power-point donde podemos hacer las
variaciones estéticas que queramos, para
guardar los resultados Reports  Export:A4
Landscape  Direct to  pdf OK  name 
save:
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Entre muestra y muestra hay que limpiar varias veces la celda con agua o con el medio
en el que estén las partículas suspendidas. Del mismo modo, al finalizar todas las
medidas hay que limpiar varias veces con agua, luego hacer un “Setzero” para
comprobar que no quedan residuos y por último vaciar la celda.

Para chequear el equipo y comprobar que está funcionando correctamente nos vamos
al menú principal, elegimos la opción “Tools” y aquí seleccionamos “Optical Brench
Status”.

5. DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL ZETA

El encendido del aparato y la apertura del programa lógicamente son iguales que en el
caso anterior. Ahora, en vez de tener deshabilitado “Zeta” (“Zeta disable), tenemos
que tener el iconito en verde “Zeta enable”. Con esta opción lo que vamos a hacer es
medir ambas cosas, primero el tamaño de las partículas en suspensión, y
posteriormente el tamaño de las partículas cuando están sometidas a un campo
eléctrico de forma que la velocidad con que se mueva dependerá de la carga
superficial de las mismas y de ahí se calcula el potencial Z. Por lo tanto la información
que el aparato nos va a pedir es exactamente la misma. Debemos comenzar por
limpiar la celda y hacer un “Setzero” (S/Z), posteriormente habrá que incluir la muestra
en el medio (LD) y finalmente hacer el ensayo dándole a RUN.

Durante RUN se procede primero a la medida del amaño de partícula tal cual, y
posteriormente, de forma automática, pasa a medir el potencial Z. Una vez finalizado
el ensayo aparecerá la página de resultados.

6. RECOMENDACIONES PARA UNA CORRECTA MEDICIÓN:

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1. Es fundamental para una correcta medida que la celda se encuentre perfectamente

limpia.

2. La muestra se prepara agregando una pequeña cantidad de sólido en un medio

líquido (comúnmente agua). Si el sólido se encuentra aglutinado se puede aplicar
ultrasonido o bien un poco de tensioactivo (viene con el equipo). Hay que tener
cuidado con las burbujas porque pueden alterar las medidas, debemos evitarlas en lo
posible.

7. LIMPIEZA DE LOS EQUIPOS:

Es fundamental que la celda esté totalmente limpia, de ello dependerá el buen
funcionamiento y la duración del aparato, y por tanto es responsabilidad de todos. En
principio, si el medio de suspensión de las partículas es acuoso, con llenar y vaciar
varias veces la celda con agua sería suficiente. Si no fuera así puede recurrirse al uso de
otro tipo de soluciones, exceptuando las de ácidos y bases fuertes. El motivo es que
aunque la celda es de teflón y por tanto resiste cualquier producto, los electrodos
tienen una membrana de protección que podría verse alterada en presencia de
soluciones de pH extremo. En principio no hay limitación para el uso de disolventes
orgánicos.

Si no fuera suficiente la limpieza con agua se puede desmontar la celda y limpiar con
unas toallitas suaves que vienen con el equipo. También se dispone de unas barillas
suaves para limpiar la celda por dentro. Ésto se realiza con el líquido de limpieza que
viene con el equipo.

En resumen el protocolo de limpieza general sería el siguiente:

Antes de empezar el ensayo: hacer 2-3 lavados con agua Milli Q. Hacer un “setzero”. Si
todo es correcto y el medio de suspensión es agua, comenzar con el ensayo. Si el
medio de suspensión de las partículas no fuera agua (ej PBS), entonces vaciar la celda,
llenar y vaciar 2-3 veces con el nuevo medio y volver a hacer otro “setzero” antes de
empezar con el ensayo.

Una vez finalizado el ensayo: Lavar 3-4 veces con agua Milli Q y hacer un “setzero”
para demostrar que todo está perfectamente limpio. Si no fuera así repetir lavados con
agua hasta que el test “setzero” demuestre que no hay ruido de fondo (señal de que
existen aun partículas en la celda).