complejo soluble tipo sándwich. La interacción se ilustra mediante la 8. Aspiradora al vacío (opcional) para los procedimientos de 1.

ntos de 1. Marcar los pozos de la microplaca para cada suero de

siguiente ecuación: lavado referencia, control y muestra del paciente para ser procesados
Ka 9. Cronometro por duplicado. Colocar las tiras no utilizadas de micropozos
Enz
Ac (p)+AgPRL+Btn Ac (m) ENZ
Ac (p)-AgPRL-BtnAc(m) 10. Materiales para control de calidad nuevamente en la bolsa de aluminio, sellar y almacenar de
K-a 2-8ºC.
2. Pipetear 0.025 ml (25μl) del suero de referencia apropiado,
Btn
Ac (m) Anticuerpo monoclonal Marcado con biotina (cantidad en 5.0 PRECAUCIONES control o muestra dentro del pozo asignado.
exceso) Para uso en Diagnóstico in Vitro 3. Adicionar 0.100ml (100μl) de reactivo trazador hPRL a todos los
AgPRL = Antígeno nativo (cantidad variable) No usar en humanos o animales en forma interna o externa pozos.
ENZ
Ab(p)= Anticuerpo marcado con Enzima (Cantidad en exceso) 4. Agitar suavemente la placa durante 20-30 segundos para
Enz
Ac (p) -AgPRL. -Btn Ac (m)=Complejo en sándwich antígeno– anticuerpo Todos los productos que contienen suero humano han demostrado mezclar y cubrir.
Ka = Tasa Constante de Asociación ser no reactivos al antígeno de superficie de hepatitis B, VIH 1 y 2 y 5. Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
k-a = Tasa Constante de Disociación HCV según pruebas exigidas por la FDA. Debido a que ninguna 6. Eliminar el contenido de la microplaca mediante decantación o
prueba conocida hasta ahora puede ofrecer una garantía total de aspiración. Si decanta, secar la placa con papel absorbente.
Simultáneamente el complejo se deposita en el pozo a través de la ausencia de agentes infecciosos, los productos de suero humano 7. Adicionar 350μl de buffer de lavado (ver Sección preparación de
alta afinidad de reacción entre la estreptavidina y el anticuerpo deben manejarse como potencialmente peligrosos y en condiciones Reactivos), decantar, secar o aspirar. Repetir 4 veces más para
marcado con biotina. Esta interacción se ilustra a continuación. de transmitir enfermedades. Los buenos procedimientos de obtener un total de 5 lavados. Se puede utilizar un lavador
laboratorio para el manejo de productos sanguíneos pueden ser automático o manual de placas. Seguir las instrucciones del
Enz
Ac (m) - AgPRL. - Btn Ac (m)+ EstreptavidinaCW Complejo encontrados en el Centro de Control de Enfermedades/ Instituto fabricante para asegurar el uso apropiado. Si se utiliza un
Sistema de Prueba Prolactina (hPRL) inmovilizado. Nacional de Salud, “Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y frasco de lavado, llenar cada pozo oprimiendo el recipiente
Biomédicos”, 2da Edición, 1988, HHS Publicación Nº (CDC) 88-8395. (evitar las burbujas de aire) para dispensar la solución de
Código de Producto: 775-300 EstreptavidinaCW = estreptavidina inmovilizada en la pozo. lavado. Decantar y repetir 4 veces adicionales.
Muestra 25 μl Complejo inmovilizado= complejo en sándwich enlazado al pozo La eliminación adecuada de los componentes del kit debe ser 8. Adicionar 0.100 ml (100μl) de reactivo de trabajo de señal a
acorde con los requerimientos estatutarios y de regulación. todos los pozos (Ver sección Preparación del Reactivo).
Luego de un periodo adecuado, el anticuerpo enlazado a la fracción Siempre adicione reactivos en el mismo orden para
es separado del antígeno no enlazado por decantación o aspiración. 6.0 RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS minimizar las diferencias del tiempo de reacción entre los
1.0 INTRODUCCIÓN La actividad enzimática determinada por la reacción con el sustrato Se deben emplear las precauciones en la recolección de muestras pozos.
que genera luz, el anticuerpo enlazado a la fracción será por punción venosa para las muestras de suero o sangre. Para lograr 9. Incubar a temperatura ambiente y en oscuridad durante 5
Uso: Determinación cuantitativa de la concentración de Hormona directamente proporcional a la concentración relativa del antígeno. Al una comparación precisa a valores normales establecidos, se debe minutos
Prolactina en Suero humano mediante ensayo de Utilizar varias referencias de suero de valores conocidos del antígeno, tomar una muestra de suero en la mañana en ayunas. La sangre 10. Leer las unidades de luz relativas en cada pozo durante 05-1.0
quimioluminiscencia en microplacas (CLIA). se puede generar una curva dosis-respuesta a partir de la cual se debe ser recolecta en tubo para punción venosa de tapa roja sin segundos como mínimo, utilizando un luminometro de
evalúa la concentración de antígeno de una muestra desconocida. aditivos o anti-coagulantes. Permitir que la sangre coagule. microplaca. Los resultados deben ser leídos dentro de los 30
2.0 RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO Centrifugar para separar el suero de las células. minutos siguientes a la adición de la solución del sustrato.
La Hormona Prolactina (PRL), secretada por los lactotrofos de la 4.0 REACTIVOS Las muestras se pueden refrigerar de 2-8ºC por un tiempo máximo de
pituitaria anterior, es una proteína formada por una cadena sencilla de 5 Días. Si las muestras no se pueden procesar en este tiempo, las 10.0 RESULTADOS
polipéptidos que contienen aproximadamente 200 aminoácidos. La Materiales suministrados muestras se pueden almacenar a temperatura de –20ºC hasta por 30 Se utiliza una curva de dosis-respuesta para evaluar la concentración
acción biológica esencial de la hormona está sobre la glándula A. Calibradores PRL – 1 ml/vial- Iconos A-F días. Evitar la congelación y descongelación repetidas. Cuando el de la Prolactina (PRL) en muestras desconocidas.
mamaria en donde participa en el desarrollo de la mencionada Seis (6) viales de referencia para antígeno PRL en suero a ensayo se realiza por duplicado se requieren 0.100ml de muestra .
glándula y en la inducción y mantenimiento de producción de leche; niveles de 0(A), 5(B), 10 (C), 25(D), 50(E) y 100 (F) ng/ml. 1. Registrar los RLU`s (unidades relativas de luz) obtenidas de la
existen evidencias que permiten sugerir que la prolactina puede Almacenar de 2-8ºC. Un preservante ha sido adicionado. 7.0 CONTROL DE CALIDAD impresión del luminómetro de microplacas como se muestra en
participar en la esteroidogenesis en las gónadas, actuando Nota: Los calibradores, basados en suero humano, fueron Cada laboratorio deberá ensayar controles a los niveles de rango el ejemplo 1.
cinérgicamente con la hormona luteinizante (LH). Los altos niveles de calibrados utilizando una preparación de referencia, la cual fue bajo, medio y alto para monitorear el desempeño del ensayo. Estos 2. Graficar las unidades RLU`s para cada suero de referencia en
prolactina parece que inhiben la esteroidogenesis al igual que inhiben probada frente al WHO 3rd IS (84/500). controles serán tratados como valores desconocidos y los valores duplicado vs. la concentración correspondiente PRL en ng/ml
la LH y la síntesis de la hormona Estimulante del Folículo (FSH) en la determinados en cada procedimiento de prueba realizada. Se sobre papel logarítmico.
B. Reactivo trazador hPRL– 13 ml/vial – icono
E mantendrán gráficos de control de calidad para realizar un 3. Trazar la mejor curva utilizando los puntos señalados en el
glándula pituitaria (1,2).
Un (1) vial que contiene anticuerpo monoclonal IgG de rata seguimiento al desempeño de los reactivos suministrados. Se gráfico.
La utilidad clínica de la medición de la hormona Prolactina (PRL) en biotinilado marcado con enzima, en buffer, colorante y deberán utilizar métodos estadísticos pertinentes para evaluar las 4. Para determinar la concentración de hPRL de una muestra
la evaluación del diagnostico de hiper-prolactinemia y para el preservante. Almacenar de 2-8ºC. tendencias. Las desviaciones significativas con respecto del desconocida, ubicar el RLU´s promedio esta en eje vertical del
posterior monitoreo de la efectividad del tratamiento ha sido desempeño establecido podrá ser un indicio de cambio no detectado gráfico, encontrando el punto de intersección en la curva y
establecido perfectamente (3,4). C. Pozos de reacción lumínica - 96 pozos – icono en condiciones experimentales o degradación de los reactivos. Se tomar la lectura de la concentración (en ng/ml) a partir del eje
Una micro placa blanca de 96 pozos recubierta con deben utilizar reactivos nuevos para determinar el motivo de las horizontal del gráfico (los duplicados de la muestra desconocida
En este método, el calibrador PRL, el control o la muestra del estreptavidina y empacada en una bolsa de aluminio con variaciónes. pueden promediarse según se indica).En el siguiente ejemplo, el
paciente se adiciona en primer término a un pozo recubierto de agente para desecante. Almacenar de 2-8ºC. promedio de RLU`s (33555) de la muestra desconocida se
Streptadivina. Los anticuerpos monoclonales marcados con biotina y intercepta con la curva de calibración en (13.9ngml) de
con enzimas (dirigidos a epítopes claramente diferenciados de PRL) D. Concentrado de solución de lavado – 20 ml- Icono 8.0 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS concentración de PRL (Ver Figura 1).
son adicionados y luego son mezclados sus reactantes. La reacción Un (1) vial que contiene un surfactante en solución salina 1. Buffer de Lavado
entre varios anticuerpos PRL y PRL nativos forman un complejo en amortiguada. Un preservante ha sido adicionado. Almacenar de Diluir el contenido de la solución de concentrado de Lavado en
sándwich que se unen con la estreptavidina que cubre el pozo. 2-8ºC. 1000 ml con agua destilada o desionizada en un recipiente de
almacenamiento adecuado. Almacenar el búffer diluido a Nota: El software reducción de datos de computadoras diseñadas
Después de completarse el periodo requerido de incubación, el E. Reactivo de señal A – 7 ml/vial- Icono CA temperatura ambiente de 2-30ºC por hasta 60 días. para quimiluminosencia también puede ser utilizado para la reducción
anticuerpo conjugado con enzima para la hormona Prolactina se Un (1) frasco que contiene Luminol en buffer. Almacenar de de datos. Si tal software es utilizado, la variación del software debe
separará de las que no han sido unidas al conjugado de la hormona 2-8ºC. 2. Solución de trabajo de señal para reactivo– almacenar a ser comprobada.
enzima- prolactina por aspiración o decantación. La actividad del 2-30ºC
enzima presente en la superficie del pozo se cuantifica mediante F. Reactivo de señal B – 7 ml/vial- Icono CB Determinar la cantidad requerida de reactivo y preparar el
reacción con un sustrato adecuado para producir luz. Un (1) frasco que contiene Peroxido de Hidrógeno (H 2O2) en mismo mezclando porciones iguales de reactivos A y B de señal
buffer. Almacenar de 2-8ºC. en un recipiente aséptico, por ejemplo, adicionar 1ml de A y 1ml
El empleo de varias referencias de suero de niveles conocidos de la de B por cada dos (2) tiras de 8 pozos (se produce un ligero
hormona Prolactina permitirá la construcción de una curva dosis- G. instrucciones del producto exceso de la solución). Descartar la porción no utilizada si
respuesta de actividad y concentración. A partir de la comparación de ésta no se emplea dentro de las 36 horas siguientes al
la curva de dosis-respuesta, se puede correlacionar la actividad de Nota 1: No utilizar los reactivos después de la fecha de expiración. mezclado. Si se piensa utilizar completamente los reactivos,
una muestra desconocida con la concentración de la Hormona Nota 2: Evitar la exposición prolongada al calor y la luz. Los dentro del periodo de tiempo antes señalado, vertir el contenido
Prolactina. reactivos abiertos son estables por 60 días cuando son del reactivo B de señal dentro del reactivo A de señal y marcar
almacenados de 2-8ºC. La estabilidad del kit y los según corresponda.
3.0 PRINCIPIO componentes son identificados en la etiqueta.
Nota 3: Los reactivos anteriores están diseñados para una sola Nota: No use reactivos que estén contaminadas o que tengan
Ensayo Inmunoenzimométrico (TIPO 3): microplaca de 96 pozos. crecimiento bacteriano.
Los reactivos esenciales requeridos para un ensayo
inmunoenzimométrico incluyen alta afinidad y especificidad en los 4.1 Elementos requeridos que no se suministran:
anticuerpos (marcado con enzima e inmovilizados), con 1. Pipeta para dispensar volumen de 25µl con una precisión 9.0 PROCEDIMIENTO DE PRUEBA
reconocimiento de diferentes epitopes, en exceso y antígenos superior a 1.5%.
nativos. En este procedimiento, la inmovilización tiene lugar durante 2. Pipeta (s) para distribuciones repetitivas de volúmenes 0.100ml Antes del procedimiento de ensayo, los reactivos, los sueros de
el ensayo sobre la superficie del pozo mediante la interacción de la y 0.350ml con una presión mayor al 1.5%. referencia y controles deberán estar a temperatura ambiente (20-
estreptavidina recubierta en el pozo y el anticuerpo monoclonal anti- 3. Lavador de micro placas o botella lavadora (opcional) 27ºC).
PRL marcado con biotina agregado exógenamente. 4. Luminometro de microplaca **La prueba puede ser procesada por personal experto o por un
Al mezclar el anticuerpo monoclonal marcado con biotina, el 5. Tubos de ensayo para el mezclado de los sustratos A y B. profesional entrenado**
anticuerpo marcado con enzima y el suero que contiene el antígeno 6. Papel absorbente para secar los pozos de microplacas
nativo, dan lugar a una reacción entre el antígeno nativo y los 7. Envoltura plástica o cubiertas de microplacas para los procesos
anticuerpos, sin competencia u obstáculo estérico, para formar un de incubación
 Ejemplo 1 12.1 Desempeño del análisis Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un rango de
valores que pueda esperarse de un método en particular para una 15.0REFERENCIAS
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea
población de personas “normales, dependerá de una serie de factores
mantenido en forma constante para obtener resultados
como son: especificidad del método, población sometida a prueba y
reproducibles.
presión de método que utilice el analista. Por estas razones, cada
I.D. Nume Valor 2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10 minutos
Media laboratorio deberá utilizar el rango de valores esperados establecido
Muestra ro de RLU (A) para evitar derivar el análisis.
(ng/ml por el fabricante, hasta cuando se establezca un rango utilizando el
Pozo RLU (B) 3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas,
) método con la población propia del área en la cual este ubicado el
bemolizadas o contaminadas.
laboratorio.
4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva de
respuesta a la dosis.
14.0 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
5. La adición del reactivo de señal inicia una reacción cinética por
A1 113 lo tanto el reactivo de señal debe ser adicionado en la misma
Cal A 139 0 14.1 Precisión
frecuencia para eliminar cualquier derivación de tiempo durante
B1 164 La precisión intra e interensayo de la prueba PRL AccuLiteTM CLIA se
la reacción.
determino mediante análisis en tres niveles distintos de suero control.
6. La falla al remover solución adherida en los pasos de aspiración
C1 12028 El número, valor medio, desviación estándar (σ) y el coeficiente de
o decantación puede resultar en replicación baja y resultados
Cal B 12485 5 variación para cada uno de estos sueros controles son presentados
incorrectos.
D1 12941 en la Tabla 2 y Tabla 3.
7. Usar los componentes del mismo lote no mezclar los reactivos
E1 24693 de diferentes lotes.
TABLA 2
Cal C 24603 10 8. Los pacientes con altos niveles de Prolactina pueden causar un
Precisión Intra Ensayo (Valores en ng/ml)
F1 24513 efecto gancho, esto es, paradójicamente los resultados son dan
bajas absorbancias. Si esto sucede, diluya la muestra 1/100
Muestra N X σ C.V.
G1 53221 con el calibrador “0”, re-analice (multiplique el resultado por
Nivel 1 20 5.4 0.23 4.3%
Cal D 53344 25 100) Sin embargo los valores altos por encima de 3000 ng/ml se
Nivel 2 20 18.4 0.67 3.6%
H1 53468 han encontrado que la absorbancia es mayor que la
Nivel 3 20 40.8 2.78 6.8%
absorbancia del calibrador más alto.
A2 76850 10. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos los
Cal E 77335 50 estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de
B2 77820 TABLA 3
manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso adecuado
Precisión Interensayo* (Valores en ng/ml)
del dispositivo.
C2 98568 11. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo: pipetas,
Cal F 100000 100 Muestra N X σ C.V.
lectores, lavadores y/o instrumentos automatizados con este
D2 101432 Nivel 1 20 5.8 0.57 9.8%
reactivo y realizar un mantenimiento preventivo rutinario
Nivel 2 20 19.8 1.73 8.8%
12 El análisis de riesgo – como la requiere la directiva IVD 98/79/EC
E2 14555 Nivel 3 20 43.8 2.97 6.8%
de la marca CE- para estos y otros dispositivos elaborados por
Ctrl 1 8927 5.9
Monobind, pueden ser solicitados vía Email:
F2 14825 * De acuerdo con la medición realizada en 10 experimentos en
Monobind@[Link]
duplicado.
G2 42680
Ctrl 2 42186 18.3
H2 41692 12.2 Interpretación 14.2 Sensibilidad
La sensibilidad (límite de detección) se evaluó estableciendo la Revisión: 4 Fecha: 060412 DCO: 0642
A3 32955 1. Las mediciones e interpretación de resultados deben ser Cat. #: 775-300
procesadas por personal capacitado o profesionales variabilidad del calibrador de suero 0 ng/ml y utilizando la estadística
Paciente 33555 13.9
entrenados. de 2 (95% de seguridad) para calcular la dosis mínima, la cual se
B3 34155 Tamaño 96 (A) 192(B)
2. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un estableció en 0.11 ng/ml.
aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser A) 1ml set 1ml set
la única base para una terapia, particularmente si los resultados B) 1 (13ml) 2 (13ml)

Reactivo
están en conflicto con otros determinantes. 14.3 Exactitud
El método PRL AccuLiteTM CLIA se comparo con el método de C) 1 placa 2 placas
* Los datos presentados en el ejemplo 1 Fig. 1 son únicos y 3. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados y
exclusivamente para ilustración y no deben utilizarse en lugar de una referencia ELISA. Las muestras biológicas provenientes de D) 1 (20ml) 1 (20ml)
otros parámetros deben estar dentro de los rangos listados y
curva que se procese con cada ensayo. Adicionalmente, las requerimientos del ensayo. poblaciones normales y anormales fueron probadas. El número total E) 1 (7ml) 2 (7ml)
unidades RLU de los calibradores se han normalizado a 100.000 4. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de de estas muestras fue de 85. La ecuación de regresión de mínimos F) 1 (7ml) 2 (7ml)
RLUs para el calibrador F (la mayor producción de luz). Esta partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de cuadrados y el coeficiente de correlación se calcularon para la
conversión minimiza las diferencias causadas por la eficiencia de los prueba falsos o si los resultados son interpretados comparación del ensayo PRL AccuLiteTM CLIA con el método de
diversos instrumentos que pueden ser utilizados para medir la incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad. referencia. Los datos obtenidos se observan en la tabla 4.
producción de luz. 5. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por
Computador para interpretar los resultados del ensayo, es
Figura 1 necesario que los valores de predicción para los calibradores se TABLA 4
ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas. Método Media Análisis de Coeficiente de
6. Los pacientes que reciben preparaciones de anticuerpos (x) regresión de correlación
monoclonales de ratón, para el diagnostico o terapia, pueden mínimos
presentar anticuerpos (HAMA) y mostrar valores que se elevan cuadrados
o deprimen en forma falsa cuando se realiza el ensayo. Este Método 18.5 Y=1.63+1.01 (X) 0.978
7. En mujeres embarazadas, lactantes y con anticonceptivos Referencia 19.4
RLU

orales, se puede presentar un incremento en el nivel de

Prolactina. Se indican tan solo ligeras cantidades de sesgos entre este
8. Ciertos medicamentos como morfina, reserpina y drogas procedimiento y el de referencia mediante el acercamiento de los
psicotrópicas aumentan la secreción de Prolactina (5,6 y7). valores medios. La ecuación de regresión de mínimos cuadrados y el
9. Debido a que la concentración de la hormona Prolactina coeficiente de correlación indican una excelente concordancia entre
depende de diversos factores distintos a la homeostasis de la los métodos.
pituitaria, la determinación por si sola no es suficiente para
evaluar la condición clínica. 14.4 Especificidad
El método de reactividad cruzada PRL AccuLiteTM CLIA para
sustancias seleccionadas se evalúo mediante la adición de la
Valores PRL en ng/ml 13.0 RANGOS Y VALORES ESPERADOS sustancia de interferencia a una matriz de suero a diversas
Se realizó un estudio de la población adulta aparentemente normal concentraciones. La reactividad cruzada se calculo derivando una
para determinar, los valores esperados del método PRL AccuLiteTM proporción entre la dosis del sustrato de interferencia con respecto de
11.0 PARÁMETROS DE Q C CLIA. Los valores esperados (con intervalos de confianza del 95%) la dosis de la hormona Prolactina necesaria para producir la misma
Con el fin de que se consideren validos los resultados del se presentan en la tabla 1. intensidad de luz.
ensayo, se deberá cumplir con los siguientes criterios:
1. La curva dosis-respuesta debe ubicarse dentro de los parámetros TABLA I Sustancia Reacción Concentración
establecidos Valores Esperados para el método PRL AccuLite TM CLIA Cruzada
2. Cuatro de cada 6 pools de control de calidad deben ubicarse (En ng/ml) Hormona Prolactina (PRL) 1.0000 -------
dentro de los rangos establecidos. Mujer Hormona Luteinizante (LH) <0.0001 1000ng/ml
Adulto (Número =70) 1.2- 19.5 Folitropina (FSH) <0.0001 1000ng/ml
Postmenopausia (Número = 10) 1.5 –18.5 Gonadotropina Coriónica (GC) <0.0001 1000ng/ml
12.0 ANALISIS DE RIESGOS Tirotropina (TSH) <0.0001 1000ng/ml
Hombres Hormona del crecimiento (GH) <0.0001 1000ng/ml
El MSDS y Forma de Análisis de Riesgo para este producto está Adulto (Número =50) 1.8 – 17.0
disponible en la solicitud de Monoblind Inc.