Biología Molecular

DBIO 1078
Segundo semestre 2023
 Unidad 1: Mecanismos
moleculares de la expresión
génica

Sesión 8: Replicación

Docente: Rodrigo Torres

Correo: [Link]@[Link]
 Replicación

[Link]
 Desafio:
¿Cuál es la hebra complementaria?

ATACGTCGATCGCTAGCATCGATACGATCGATCGATCGATATATACGCGC

ADN polimerasa comete sólo 1 error en

10.000.000
 Características de la replicación
• SEMICONSERVATIVA
• ORDENADA Y SECUENCIAL : Ambas hebras se van alargando
progresivamente
• SITIO DE ORIGEN: Tiene puntos fijos de inicio : burbuja de replicación
• BIDIRECCIONAL
• DIRECCIÓN DE SÍNTESIS: Avanza en sentido 5’ 3’
• SEMIDISCONTINUA
• REQUIERE DE: enzimas, partidor de ARN (ARN primer, cebador)

La doble hélice de DNA como templado

de su propia duplicación

[Link]
 Características de la Replicación
3. Origen
Multiples puntos fijos de inicio y
avance por burbujas de replicación 5. Avanza en sentido 5’-3’

1. Semiconservativa 2. Ordenada y secuencial: Origen Origen

Las nuevas helices Ambas hebras se van
contienen una hebra alargando
del original progresivamente.

4. Bidireccional
Progresa en dos dimensiones desde
un punto de origen a través de:
horquillas de replicación
6. Semi-discontinua
Contiene Hebras continuas y hebras atrasadas
7. Requiere:
Enzimas y un cebador
(Primer) de RNA
1. Replicación semi-conservativa
(Matthew Meselson y Franklin Stahl, 1958)
Alternativas de modelos
 Matthew Meselson y Franklin Stahl, 1958

GRADIENTE
DENSIDAD
CsCl

N15 (H)
N14 (L)
 La síntesis de DNA es catalizada por la DNA polimerasa

2. Es ordenada y secuencial

• Requiere separación de cada hebra

de la doble hélice del DNA

• Requiere una hebra simple de

templado que expone el donador de
enlaces de hidrógeno y alinea al
nucleótido entrante trifosfato para
la polimerización

• El nucleótido entrante es
seleccionado por cada nucleótido
en la hebra templado

Alberts et al (2015) Molecular Biology of the Cell 7th ed

 Corrección de prueba exonucleolítica y edición por la DNA
polimerasa durante la replicación del DNA

Pruebas de lectura
Cebador (Primer) con bases no coincidentes
Polimerización
(mismatched) bajan la eficiencia de la polimerización
1. Base
incorrecta tiene
menos afinidad Edición
por la
polimerasa DNA polimerasa en modo edición
2. Sitio activo. La hebra sintetizada se desaparea
Menor eficiencia y entra en el sitio de edición
sobre base donde se remueve la base mal
errónea apareada por la actividad
exonucleasa 3’-5’
Menor
probabilidad de
incorporarse
covalentemente

Prueba exonucleotída
Base incorrecta incorporada frena la elongación
y es luego removida por la actividad
exonucleasa 3’-5’ de la polimerasa
 Varios mecanismos contribuyen a la fidelidad de la
replicación del DNA

• La enorme fidelidad de la copia de

DNA es tal que solo ocurriría un
error cada 1010 nucleótidos

• Mucho mayor que la esperada para

el simple apareamiento correcto
de las bases

• Tres mecanismos de prueba de

lectura aumentan la fidelidad
3. Sitio de inicio de la replicación del ADN: burbuja de
replicación
La replicación del ADN sucede
bidireccionalmente a partir del
origen, tanto en cromosomas
circulares procariontes (panel A)
como en cromosomas lineales
eucariontes (panel B).

•Origen de replicación:
•ARS (secuencia de replicación autónoma ) → eucariontes (+ ORC)
•OriC → procariontes

•ORC (Origin Replication Complex) es necesario para:

•Activación de la replicación
•Evitar reduplicación de ADN

•Proceso bidireccional:
•Burbuja de replicación
•Hebra adelantada
•Hebra atrasada
 Múltiples origen de replicación en eucariontes
Sintesis Fusión de las
orquilla de
Eucarionte bidireccional
replicación

Procarionte
 4. La replicación es bidireccional

• En la hebra conductora o continua se requiere un

cebador (primer) solo en el sitio de inicio

• En la hebra rezagada (o retardada) la Polimerasa

Cebadora (Primasa) adiciona un primer de RNA
(aprox. 10 nucleótidos) en intervalos de 100-200
Se inicia en un punto y va progresando en dos direcciones nucleótidos
formando horquillas y burbujas de replicación
 Horquilla de replicación

• Región localizada de replicación

que se mueve progresivamente a
lo largo de la doble hélice parental

• Un complejo multienzimático que

incluye a la DNA polimerasa
sintetiza el DNA de las dos nuevas
hebras hermanas

• La DNA polimerasa solo puede

sintetizar en el sentido 5’-3’

Hebra lider: Síntesis continua y

precede a la otra hebra

Hebra retrasada: Síntesis

discontinua con orientación
opuesta a la dirección del
crecimiento de la cadena de
DNA Fragmentos de Okasaki
• 100-200 nucleótidos de largo en dirección 5’-3’
La replicación solo requiere un • Luego se unen formando hebras más largas
tipo de DNA polimerasa 5 -3 • Síntesis por la misma polimerasa que la hebra líder
5. Avanza en sentido 5’ 3’
6. Es semidiscontinua: Hebra continua/Hebra retrasada
7. Usa un ARN primer
Procesamiento y unión de los fragmentos de Okazaki

• Un sistema de reparaciónde DNA borra el primer de RNA y lo

reemplaza por DNA que luego se une al otro fragmento
mediante una DNA ligasa
Proteínas y complejos de replicación
(Replisoma)
Enzimas del Replisoma
 Helicasas: Desaparean enlaces de hidrógeno y
desenrollan el DNA
La doble hélice frente a la horquilla de
replicación para exponer los
nucleótidos de la hebra templado

DNA helicasas abren la hélice a

expensas de hidrólisis de ATP a una
velocidad de 1000 pares de
nucléotidos/seg en ambos sentidos

Bidireccional
 Estabilización de las hebras simples de
DNA
Proteínas de unión a DNA hebra simple:
- Procariontes (Single-strand DNA-
binding (SSB) proteins)
- Eucariontes: Replication protein A
(RPA)

Ayudan la acción de la helicasa

estabilizando la hebra simple y evitando
la formación de asas
 Topoisomerasas disminuyen el enrollamiento del DNA
frente a la horquilla de replicación
Superenrollamiento en los extremos de la
horquilla al romperse los puentes de H y
separarse las cadenas complementarias

Topoisomerasas I y II
• Disminuyen la tensión torsional Corta una hebra Corta las dos hebras
del enrollamiento

• Utilizan energía del ATP

• Tienen actividad nucleasas

(cortando las cadenas de DNA) y
como ligasas ( reestablecen los
enlaces)
Primasa: Enzimas que generan cadenas cortas de unos 10 nucleótidos de ARN sobre la
cadena molde. Este segmento de ARN sintetizado se denomina Cebador o Primer o
Iniciador.

DNA primasa
(Cebadora)

Sintetiza fragmentos
cortos de RNA sobre la
hebra templado
rezagada
 ADN polimerasas en eucariontes

PCNA: Ayuda a mantener la DNA polimerasa en el DNA

 Etapas de la replicación
• Inicio
• Reconocimiento de orígenes de replicación.
• Secuencia ARS: Segmento rico en A y T más fácil de separar o fundir (melt)
• Sitio de unión del complejo ORC (Origin Replication Complex)
• Sitio de unión de proteínas que ajustan la estructura del DNA para facilita la
unión de ORC
• Separación de hebras y formación de la horquilla de replicación
• Posicionamiento de maquinaria enzimática

• Elongación
• Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación
• Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada

• Terminación
• Desensamblaje de los complejos de replicación al encontrarse con otra
horquilla de replicación en sentido opuesto o al final del cromosoma
 Iniciación: Formación del complejo
pre-replicación (Pre-RC)

• ORC se une la secuencia ARS del ADN y

recluta a Cdt1 y Cdc6
• Las Helicasas (MCM) se unen al ADN en
fase G1 próximo al ORC creando un
complejo Pre-Replicativo

• ORC: Complejo de reconocimiento de

origen (ORC1-6)
• MCM: ADN helicasa replicativa (MCM2-7)
• CDT1/CDC6: cargadores del MCM
 Activación de la Replicación

• En la fase S se fosforila Cdc6 por las

quinasas específicas de esta etapa del
ciclo (CDK) degradandolo y
desensamblando Cdt1.

• Además se fosforila el ORC. No se puede

formar un nuevo complejo pre-replicativo
hasta que se desfosforila ORC

• Las helicasas también se fosforilan

mediada por quinasas específicas de esta
etapa del ciclo.

• Se abre el DNA y se unen las proteínas

necesarias para el inicio de la replicación:
Replisoma

El mecanismo asegura que cada origen de

replicación es activado solo una vez por ciclo
Activación de la helicasa cargada lleva al
ensamblaje del replisoma con polimerasas
 Terminación de la replicación

• A diferencia de los replicones circulares procariotas los replicones eucariotas no tienen

secuencias de terminación, la ADN polimerasa simplemente extiende la cadena hasta
toparse con una ADN polimerasa en la direccione opuesta, tras lo cual se desprende.

• O se cae del cromosoma una ves ha alcanzado su extremo terminal (telomeros).

 Telomeros

 Los cromosomas eucariotas lineales tienen telómeros en ambos extremos.

 El término telómero se refiere al complejo de secuencias de ADN telomérico y proteínas unidas.
 Regiones de ADN no codificante, altamente repetitivas, cuya función principal es la estabilidad estructural de
los cromosomas en las células eucariotas (LOS TELÓMEROS PREVIENEN LA FUSIÓN DE
CROMOSOMAS)

 Las secuencias teloméricas consisten en

 Matrices en tándem moderadamente repetitivas
 Saliente de 3 'de 12 a 16 nucleótidos de largo
 Poseen un sistema especial de replicación con su
Polimerasa propia (TELOMERASA)
Vaiserman and Krasnienkov January 2021 | Volume 11 | Article 630186
Vaiserman and Krasnienkov January 2021 | Volume 11 | Article 630186
 Bibliografía de esta clase para revisar

• Alberts, B., Wilson, J. y Hunt, T. (2010). Biología Molecular de la célula.

Ediciones Omega S.A. (Capítulo 5: Replicación, reparación y
recombinación del ADN)

• Lodish, H. F., Berk, A. y Darnell, J. E. (2016). Biología celular y

molecular. Médica Panamericana. (Capítulo 4: Mecanismos genéticos
moleculares /Capítulo 19: El ciclo celular de las células eucariontes)