LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES

INFECCIOSAS
Las pruebas serológicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo constituyen una valiosa
herramienta en el diagnóstico, manejo y seguimiento de las enfermedades infecciosas.
Las pruebas serológicas sirven para detectar un antígeno o un anticuerpo en las muestras del
paciente.
CLASES DE PRUEBAS SEROLÓGICAS

Según lo que se investiga

➢ PRUEBAS DIRECTAS:
Son aquellas que basadas en el principio de la reacción Antígeno - Anticuerpo investigan la
presencia del antígeno.
➢ PRUEBAS INDIRECTAS:
Son aquellas que basadas en la reacción Antígeno - Anticuerpo, investigan no el agente en sí,
sino la huella que dejó éste al pasar por su huésped (Anticuerpos).

De acuerdo con el procedimiento que utilicen para evidenciar la reacción antígeno

anticuerpo se dividen también en dos grandes grupos: primarias y secundarias.

▪ PRUEBAS PRIMARIAS
La reacción Antígeno - Anticuerpo no da lugar a ninguna manifestación visible, requiriéndose,
para evidenciar que la reacción ha ocurrido, procedimientos técnicos complejos y en ocasiones
equipos sofisticados y costosos.
Dentro de esta categoría tenemos:
1) Fijación de complemento
2) Inmunofluorescencia
3) Radioinmunoensayo
4) Pruebas Inmunoenzimáticas
5) Inmunoelectrotransferencia
6) Inmunocromatografía

▪ PRUEBAS SECUNDARIAS
La reacción Antígeno-Anticuerpo da lugar a una manifestación visible lo cual permite una
lectura visual macroscópica. Su realización usualmente es simple.
Este tipo de pruebas incluyen la precipitación y la aglutinación.

REACCIÓN DE PRECIPITACIÓN
Un complejo visible de antígeno-anticuerpo se llama precipitina, y los ensayos in vitro que
producen precipitina se denominan reacciones de precipitina.
Un antígeno soluble al ser puesto en contacto con su anticuerpo específico, forma complejos Ag-
Ac que al encontrarse en condiciones óptimas se insolubilizan dando una reacción de
precipitación (retículo insoluble).

La mayoría de las pruebas de precipitina utilizan un antisuero policlonal porque los anticuerpos
policlonales pueden unirse a múltiples epítopos, lo que hace más probable la formación de
redes. Aunque los mAb pueden unirse a algunos antígenos, la unión ocurrirá con menos
frecuencia, por lo que es mucho menos probable que se forme una precipitina visible.
Para que la formación de precipitina sea visible, debe haber una proporción óptima de anticuerpo
a antígeno.

La Figura 2 ilustra cómo la proporción de antígeno y anticuerpo afecta la cantidad de precipitación:

A medida que el antígeno se agrega lentamente a una solución que contiene una cantidad constante
de anticuerpo, la cantidad de precipitina aumenta a medida que la proporción de anticuerpo a
antígeno se acerca a la zona de equivalencia y disminuye una vez que la proporción de antígeno
excede la proporción óptima.

cEsta prueba se realiza en gel de agar (agarosa) o en solución.

Al contactarse Ag y Ac específicos se forma

una banda de precipitación en el punto en
que ambos alcanzan equivalencia.

Clases:
Varias técnicas nos permiten utilizar la formación de precipitina para cuantificar la
concentración de antígeno o la cantidad de anticuerpo presente en un antisuero:
1) Prueba del anillo de precipitina
Se utiliza para determinar la cantidad relativa de anticuerpo específico del
antígeno en una muestra de suero.
 Para realizar esta prueba, se prepara un juego de tubos de ensayo agregando una
solución de antígeno al fondo de cada tubo. Cada tubo recibe el mismo volumen
de solución y la concentración de antígenos es constante (p. Ej., 1 mg / ml).
A continuación, se agrega glicerol a la solución de antígeno en cada tubo de
ensayo, seguido de una dilución en serie del antisuero (suero con Ac). El glicerol
evita la mezcla del antisuero con la solución de antígeno, permitiendo que la unión
antígeno-anticuerpo tenga lugar solo en la interfaz de las dos soluciones.
El resultado es un anillo visible de precipitina en los tubos que tiene una relación
antígeno-anticuerpo dentro de la zona de equivalencia. Esta dilución más alta con
un anillo visible se usa para determinar el título de los anticuerpos. El título es el
recíproco de la dilución más alta que muestra un resultado positivo, expresado
como un número entero. En la Figura 3, el título es 16.

Inconveniente: Requiere el uso de grandes cantidades de suero y se debe tener

mucho cuidado para evitar mezclar las soluciones y romper el anillo. Realizar
una prueba similar en una matriz de gel de agar puede minimizar estos problemas.

2) Inmunodifusión doble o ensayo de Ouchterlony:

Para el diagnóstico de micosis sistémica: de histoplasmosis, paracoccidioidomicosis,
coccidioidomicosis y aspergilosis. Causados
respectivamente por (Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides spp. y
aspergillus spp.)
Esta técnica se realiza en placas de agar en
donde se practican pocillos. En uno de estos
pozos se coloca el suero o muestras a investigar
(centro) y en el resto se coloca el antígeno
preparado frente a la sustancia que se quiere
identificar. Cuando difunden, ambos sistemas
se encontrarán y se formará en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspon-
diente que se hace visible en forma de una línea o banda de precipitación.
 INMUNOELECTROFORESIS
Es una combinación de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusión.
Se coloca el antígeno en un pocillo y se separa por electroforesis. Después se coloca anticuerpo
en un surco y se forman líneas de precipitación a medida que el antígeno y el anticuerpo difunden
el uno hacia el otro.
Consiste en realizar un fraccionamiento electroforético de suero humano en una capa de agarosa
colocada en un portaobjeto microscópico.
En un pequeño orificio hecho en la capa de agarosa se coloca entre 5-10 microlitros de suero
humano, la placa se coloca en cámara electroforética de manera que un extremo esté en contacto
con el ánodo y el otro extremo con el cátodo y se aplica una corriente continua de 150 voltios por
20 minutos, las proteínas plasmáticas se separan electroforéticamente según su carga eléctrica
relativa de modo que aquella proteína electronegativa marcha al ánodo y aquellas menos
electronegativas marchan al cátodo; terminando el tiempo de separación electroforética se hace
una pequeña zanja frente al orificio donde se colocó la muestra en forma tal que la zanja tenga la
longitud casi del porta objeto, esta zanja se llena con un antisuero antihumano, obtenido
usualmente en cabra o en conejo y se deja incubar por 18 horas para que ocurra la doble difusión,
por cada proteína presente en el suero se producirá un arco de precipitación muy definido,
permitiendo un análisis de la mezcla antigénica.
Usos:
La aplicación al diagnóstico clínico de esta técnica es muy limitada reduciéndose al estudio del
mieloma múltiple, y a unas pocas situaciones neurológicas en que el estudio
inmunoelectroforético del LCR puede arrojar alguna luz.
Contrainmunoelectroforesis
Esta técnica es similar al método de Ouchterlony, pero el movimiento del antígeno es facilitado por
electroforesis. El antígeno y el anticuerpo se pueden colocar en pocillos separados y permitir que se desplacen
electroforéticamente el uno hacia el otro.

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN
- Método rápido y sencillo para identificar virus, bacterias y grupos sanguíneos. La
reacción se produce entre partículas en solución.
- Cuando el antígeno es particulado, la reacción de un anticuerpo con el antígeno puede
detectarse por aglutinación (agrupamiento) del antígeno. El término general aglutinina
se usa para describir anticuerpos que aglutinan antígenos particulados. Cuando el
antígeno es un eritrocito, se utiliza el término hemaglutinación.
- Para hacer visible la unión antígeno-anticuerpo se utiliza partículas inertes como
partículas de látex, carbón vegetal, bentonita (arcilla), gelatina unida al antígeno o al
anticuerpo en esta reacción el antígeno siempre está en suspensión, pues se trata de
partículas.
- Cuando existe un exceso de anticuerpos respecto de la concentración de antígenos se
suele producir el fenómeno de Prozona en el que no hay una aglutinación visible para
evitar este error se recomienda diluir el suero hasta alcanzar una concentración
equilibrada de aglutinógeno (antígeno) y aglutininas y apreciar una reacción positiva
correcta.
Las reacciones de aglutinación pueden realizarse en portaobjetos de cristal, en tarjetas plásticas,
en microplacas de plástico de microtitulación y en tubos de ensayo.

Ejemplo de técnicas directas de aglutinación (las propias células con sus antígenos se
aglutinan)
- Grupo sanguíneo (GR con antígenos en su superficie en la sangre y anticuerpos contra
esos antígenos en el reactivo).
Ejemplo de técnicas indirectas de aglutinación: (Se utiliza antígeno unido a partículas de látex)
- Prueba de los "Antígenos Febriles" (anticuerpos en el suero y antígenos recubiertos en el
reactivo).
- Prueba de la hepatitis B (HBsAg) (Antígeno en el suero y anticuerpos recubiertos con
partículas de látex en el reactivo).
 Aglutinación directa Aglutinación indirecta

Pruebas de aglutinación indirecta

- Prueba de aglutinación cualitativa

Las pruebas de aglutinación se pueden utilizar de manera cualitativa para analizar la
presencia de un antígeno o un anticuerpo. El anticuerpo se mezcla con el antígeno en
partículas y la aglutinación del antígeno en partículas indica una prueba
positiva. (Figura 1).

Por ejemplo, los glóbulos rojos de un paciente se pueden mezclar con un anticuerpo contra
un antígeno de grupo sanguíneo para determinar el tipo de sangre de una persona. En un
segundo ejemplo, el suero de un paciente se mezcla con glóbulos rojos de un tipo de
 sangre conocido para analizar la presencia de anticuerpos contra ese tipo de sangre en el
suero del paciente.

- Prueba de aglutinación cuantitativa

Las pruebas de aglutinación también se pueden utilizar para medir el nivel de anticuerpos
frente a antígenos particulados. En esta prueba, se hacen diluciones en serie de una
muestra para analizar en busca de anticuerpos y luego se agrega un número fijo de
glóbulos rojos o bacterias u otro antígeno en partículas. Luego se determina la dilución
máxima que da aglutinación. La dilución máxima que produce una aglutinación visible
se llama título . Los resultados se informan como el recíproco de la dilución máxima que
da una aglutinación visible. La Figura 2 ilustra una prueba de hemaglutinación
cuantitativa.

Efecto prozona - Ocasionalmente, se observa que cuando la concentración de anticuerpo

es alta (es decir, diluciones más bajas), no hay aglutinación y luego, a medida que la
muestra se diluye, se produce la aglutinación (Ver Paciente 6 en la Figura 2). La falta de
aglutinación a altas concentraciones de anticuerpos se denomina efecto prozona . La falta
de aglutinación en la prozona se debe al exceso de anticuerpos que resulta en complejos
muy pequeños que no se agrupan para formar una aglutinación visible.

Desventajas
Ventajas
- Sólo son pruebas cualitativas: presencia o ausencia, pero no la
- Alto grado de
concentración. Se puede semicuantificar (Concentración aprox. De la
sensibilidad.
sustancia en la muestra problema) mediante diluciones seriadas para
- Se pueden detectar
muchos Ag y Ac obtener el título que viene a ser la inversa de la última dilución que dio
positivo.

Ensayos de floculación
La floculación es uno de los mecanismo que sirve para evidenciar la reacción antígeno-
anticuerpo in vitro y es considerada como una interacción secundaria porque no necesita
ningún reactivo o sustancia biológica adicional para hacer visible la reacción.

Un ensayo de floculación es similar a una reacción de precipitina, excepto que involucra

antígenos insolubles como lípidos. Un floculante es similar a una precipitina en que hay
una red visible de antígeno y anticuerpo, pero debido a que los lípidos son insolubles en
solución acuosa, no pueden precipitar. En lugar de precipitación, se observa floculación.
Ejm. RPR.

ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO

Mecanismo: El anticuerpo se une al antígeno, induciendo la activación del complemento y sin
dejar complemento para lisar los glóbulos rojos. Ejemplo: Prueba de fijación del complemento
para anticuerpos del paciente contra bacterias difíciles de cultivar como la clamidia
 1)El suero del paciente A contiene Ac. Para el
antígeno sospechoso. Suero del paciente B no
contine Ac. Ambos pacientes tienen
complemento (C’), pero diferentes cantidades.

2) Calentando el suero se destruye todo el C’ del

suero de los pacientes.
AC permanecen en el suero del paciente A

3) - Luego agregar igual cantidad de (C’) al suero de ambos pacientes.

- Se agrega los antígenos
En el suero del paciente A, los Ac se unen al antígeno y ocurre la fijación
del C´.
El suero del paciente B carece de Ac., por lo que no ocurre la fijación
del C’.

Se agregan a ambas muestras:

Glóbulos rojos de ovinos y Ac contra los
GR de ovinos

5) En el paciente A, el C’ ya está fijado y no puede lisar

los GR del ovino. Los anticuerpos se unen a los glóbulos
rojos del ovino y se depositan en el fondo.
En el paciente B, los Ac. Se unen a los GR del ovino y el
C’ los lisa. El suero se torna rosado.

Figura 10. Haga clic para ver una imagen más grande. La prueba de fijación del complemento se utiliza
para determinar si el suero de un paciente contiene anticuerpos contra un antígeno específico. Si lo hace,
se producirá la fijación del complemento y no habrá ningún complemento disponible para lisar los glóbulos
rojos de oveja unidos a anticuerpos que se agregan a la solución en el siguiente paso. Si la muestra no
contiene anticuerpos contra el antígeno, se observará hemólisis de los glóbulos de oveja.
 Inmunoblots e inmunoensayos enzimáticos
Ensayos inmunocromatográficos (flujo lateral)
Ensayo inmunoabsorbentes ligado a enzimas (ELISA)
Inmunotransferencias
Inmunotransferencias

1) INMUNOCROMATOGRAFIA
- Los ensayos inmunocromatográficos, o pruebas de flujo lateral, permiten analizar el
antígeno o anticuerpo en una solución diluida. A medida que el líquido fluye a través de
la tira reactiva, rehidrata los reactivos.
- La prueba ha sido ensamblada en una placa plástica del tamaño de un portaobjeto, en su
interior la placa tiene hacia un extremo una pequeña almohadilla y hacia el otro extremo
una pequeña tira de papel de celulosa que hace contacto directo con la almohadilla.
- Al mirar la placa por su cara superior se observa tres ventanas; la primera se abre
directamente sobre la almohadilla absorbente y es el sitio en donde se coloca la muestra
clínica, la segunda se abre sobre una zona de la membrana cromatográfica y es el sitio
donde se lee el resultado positivo o negativo de la prueba y la tercera se abre sobre una
zona de la membrana cromatográfica en donde se lee el control de la reacción.
- La zona de lectura de la prueba y en la zona de lectura del control interno han sido
colocados en forma linear, la reacción se evidencia con una banda intensamente rosada.
- Los anticuerpos conjugados con partículas pequeñas de oro coloidal se unen al antígeno
en la primera franja y luego fluyen hacia la segunda franja donde están unidos por un
segundo anticuerpo fijo. Esto produce una línea de color.
- La franja de control, indica que la prueba está funcionando correctamente.

Utilidad clínica:
Estas técnicas se han estandarizado para investigación de:
- La hormona gonadotropina coriónica humana como prueba de embarazo con una sensibilidad
de 20 mUI/ml,
- Para investigación de antígeno prostático específico con una sensibilidad de 4 ng/ml, para la
investigación de AgsHB (Antígeno de superficie del Virus de Hepatitis B),
 - Para la investigación de la hormona Luteinizante LH como prueba de ovulación.
- Como prueba para identificación de Streptococcus pyogenes en muestras clínicas o en cultivos
y como pruebas para drogas de abuso como cocaína, morfina, heroína, marihuana y
anfetamina.
Hay varios tipos de pruebas inmunocromatográficas entre las cuales tenemos:
1- Prueba directa o de Captura
2- Prueba de Bloqueo
3- Prueba indirecta
Prueba Directa o de Captura: se investiga el antígeno en la muestra del paciente. Se detecta
mediante un anticuerpo monoclonal que viene absorbido en la almohadilla dirigido contra el
antígeno que se desea investigar este anticuerpo además viene marcando con oro coloidal.
Ejemplo investigar en un paciente el AgsHB.
Prueba de Bloqueo: Es la más utilizada para la investigación de drogas de abuso.
En esta prueba, en la almohadilla se encuentra un anticuerpo monoclonal dirigido contra la droga
que se investiga.
Prueba indirecta: Se investiga anticuerpos específicos contra determinados antígenos
microbianos y así poder establecer un diagnóstico indirecto, pruebas para VIH, Trypanosoma
cruzi, Dengue y Brucella, han sido ya estandarizadas y comercializadas.
Ejemplos:
Prueba rápida de la hormona gonadotropina coriónica humana (test del embarazo)

Prueba rápida de diagnóstico de covid-19

Principio de la prueba
El casete de prueba rápida para COVID-19 IgG/IgM (sangre total/suero/plasma) es un ensayo
inmunocromatográfico cualitativo basado en membrana para la detección de anticuerpos IgG e
IgM contra SARS-CoV-2 en muestras de sangre, suero o plasma.
Esta prueba consta de dos componentes, un componente IgG y un componente IgM.
En el componente IgG, la IgG antihumana está recubierta en la región de la línea de prueba de
IgG. Durante la prueba, la muestra reacciona con partículas recubiertas de antígeno 2019-nCoV
en el casete de prueba.
2) TÉCNICA ELISA (Ensayo inmunoabsorbentes ligado a enzimas)
- El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) es una técnica muy usada en
inmunología para medir anticuerpos, antígenos, proteínas y glicoproteínas en
muestras biológicas.
- La técnica de ELISA utiliza anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la
peroxidasa) (anticuerpo conjugado) para visualizar la reacción Ag-Ac, la cual es utilizada
tanto para la determinación de antígenos como de anticuerpos.
- Se cuantifica por espectrofotometría, en función de la intensidad del color producido
como respuesta a la conversión de un sustrato por su enzima.
- APLICACIONES DE ELISA:
• Diagnóstico de infección por virus (hepatitis, VIH, etc.), bacterias, hongos, y
medición de citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o suero.
• Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC,
etc. Proteínas de drogas,
• Control de calidad de vacunas, Screening de recién nacido,
• Investigación clínica
• Anticuerpos: Acs antinucleares, Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag
prostático, etc. Autoanticuerpos.
Generalmente se llevan a cabo en placas de 96 pocillos, lo que permite medir múltiples
muestras en un único experimento.
- Ventaja: Es una prueba de alta sensibilidad y especificidad. Es cuantitativa. Es
relativamente económica. Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa. Reactivos de
gran estabilidad.
- Desventaja: Dificultad de detección de Acs en pacientes con alguna inmunodeficiencia,
en período de ventana o infectados por cepas desconocidas. Puede dar falsos positivos
por reacción cruzada por infección con otros virus.
 Tipo de ELISA:

ELISA directo:
- Es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos.
- Detecta antígenos en la muestra.
- Fundamento: un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al
antígeno de interés de la muestra, permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.

ELISA indirecto
- Investigan anticuerpos IgG, IgM o Ig A en la muestra para un determinado antígeno sea
este un virus, parásito, bacteria u hongo.
- Fundamento: Los sistemas traen las placas de poliestireno sensibilizadas con los
antígenos respectivos. Por ejemplo, si deseamos investigar anticuerpos contra el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH), el sistema comercial trae la placa de poliestireno en
cada uno de los pozos tiene adheridos los componentes antigénicos del VIH. Al agregar
la muestra los anticuerpos se unen a los antígenos de la cubeta lo cual se hace visible con
el anticuerpo secundario, éste último irá conjugado a una enzima, que al añadir un sustrato
cromógeno producirá un color el cual se mide en el lector de Elisa (espectrofotómetro).
- Principalmente usado para detectar anticuerpos en procesos infecciosos
- Ejemplos: Diagnóstico de infección por VIH-1, Diagnóstico serológico de H. pylori,
hongos

ELISA tipo sándwich:

- Detecta antígenos de la muestra.
- Fundamento: El antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura que
viene adherido en la cubeta y otro de detección el cual es conjugado con una enzima que
al añadir un sustrato cromógeno producirá un color el cual se mide en el lector de Elisa
(espectrofotometro). Es decir el antígeno de la muestra es detectado por 2 anticuerpos por
lo tanto es más específica. Ejemplos: Determinación de antígenos de superficie del Virus
de Hepatitis B, Diagnóstico de antígenos de H. pylori en heces.

ELISA competitivo o ELISA de inhibición

- Detecta antígeno de la muestra.
- Fundamento: Un antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por
unirse al anticuerpo primario. En este procedimiento, un antígeno de la referencia se
inmoviliza en la superficie de la placa y la muestra biológica preincubada con una
determinada cantidad de anticuerpo específica se agrega a la placa. La cantidad de
antígeno presente en la muestra determinará la cantidad de anticuerpos desatados o libres
disponibles para unirse al antígeno de la referencia en la placa.
Ejemplos: Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG).
 11. Solución stop

12. Lectura en lector de ELISA

TAREA
1. Resumen del tema.
2. Luego de visualizar los videos tutoriales, mencione los materiales y equipos usados en la
prueba de ELISA y esquematice la prueba de ELISA según el inserto de winer
proporcionado.
3. Recursos adicionales
- Video tutorial prueba rápida anticuerpos covid-19
[Link]
- Video tutorial prueba rápida de antígenos covid-19
[Link]
de-contagios/
- Video ELISA INDIRECTA
[Link]
- Video ELISA DIRECTA
[Link]
- Video ELISA Sandwich
[Link]
- Cómo realizar un ELISA cualitativo
[Link]
- Cómo realizar un ELISA cuantitativo
[Link]
- Inmunodifusión Radial (IDR). Fundamentos de la técnica
[Link]
- Double immunodiffusion (Ouchterlony Double Diffusion) (FL-Immuno/58)
[Link]

Foro: Utilidad de la prueba de ELISA