TEMA 2-BACTERIOLOGÍA: TÉCNICAS DE

TINCIÓN Y OBSERVACIÓN BACTERIANA

MORFOLOGÍA DE LAS BACTERIAS. Los micoplasmas son las bacterias
más pequeñas que existen y miden
La morfología puede ser microscópica o macroscópica (cuando las bacterias
menos de 0,5 µm son una
forman colonias).
excepción. Algunos bacilos pueden
[Link]ÍA MICROSCÓPICA: Es necesario observar las bacterias al llegar a medir decenas de micras.
microscopio por su pequeño tamaño (oscila entre 0,5 y 5 µm de longitud),
por lo que es imposible verlas a simple vista.

Al observar al microscopio, podemos observar dos tipos de morfología dentro de la microscópica:

-Morfología individual: forma que tienen sus individuos.

• Cocos: bacterias esféricas o prácticamente esféricas.

• Bacilos: bacterias alargadas, con forma de bastón de bordes fusiformes con extremos afilados.

• Cocobacilos: bacterias con formas ovaladas cortas (el tamaño de los ejes mayor y menor es muy parecido).

• Vibrios: bacterias alargadas ligeramente curvadas en forma de coma.

• Espirilos: bacterias alargadas en forma de espiral con una o más vueltas de hélice.

Para poder observar esta morfología tenemos que usar tinciones, ya que las bacterias son transparentes. El empleo
de tinciones especiales permite observar, además de la forma, otras características morfológicas estructurales
externas (flagelos. fimbiras, cápsulas…).

Las bacterias no siempre se encuentran solitarias, hay veces, que forman agrupaciones (a partir de un individuo y, en
condiciones de cultivo adecuadas, se obtienen millones de bacterias en poco tiempo, que quedan juntas sin
separación entre ellas). Es mucho más común que se agrupen a que queden individualizadas.

La división de una célula implica la duplicación del cromosoma bacteriano, la migración de cada cromosoma a un
polo opuesto y la partición de la célula madre en dos células hijas mediante estrangulamiento de la pared en el
ecuador de la célula madre (fisión binaria).

Tipos de agrupamientos:

AGRUPAMIENTO DE COCOS:

-Diplococos: dos cocos unidos (si yo veo diplococos sueltos, aunque haya mucho agrupamiento se denomina aun así
diplococo). Ejemplo: Neisseria.

-Tétradas: cuatro cocos unidos formando un cuadrado. Se originan por la presencia de dos planos de división
perpendiculares. Ejemplo: Mycrococus.

-Cadenas: múltiples cocos unidos formando una cadena. En este caso, solo existe un plano de división. Se le conoce
coloquialmente como collar de perlas. Ejemplo: Streptococcus.
-Sarcinas: cocos agrupados formando paquetes cúbicos tridimensionales. Se originan por la presencia de tres planos
de división. Ejemplo: Sarcina.

-Racimos: cocos agrupados en masas de forma irregular. Se originan por la presencia de múltiples planos de división.
Ejemplo: Staphylococcus.

AGRUPACIONES DE BACILOS

-Cadenas en “caña de bambú”: múltiples bacilos unidos por los extremos (cadenas muy largas de bacilos). Ejemplo:
Bacillus.

-Empalizadas: múltiples bacilos colocados lateralmente. Tras la división se produce un giro de 180º , quedando los
bacilos unidos en forma paralela por el eje mayor (se quedan verticales y pegados entre ellos). Ejemplo:
Corynebacterium

-Letras chinas: igual a las empalizadas, pero los giros son inferiores a 180º, por lo que cada uno al girar en ángulos
diferentes quedan unidos de maneras diferentes. Ejemplo:Corynebacterium.

-Ramificados: múltiples bacilos formando cadenas ramificadas. Ejemplo: Nocardia.

La diferencia entre la de cadena de bambú

y ramificadas, es que en las ramificadas al
ser tan largas y entrecruzadas las cadenas
queda como una mancha. Sin embargo,
las cadenas de bambú se pueden ver

[Link]ÍA MACROSCÓPICA, se produce en una placa de Petri.

Cuando una bacteria se cultiva y se incuba en condiciones adecuadas, se

multiplica de forma exponencial, de manera que al cabo de varias horas
genera una colonia visible a simple vista.

Para unas condiciones de cultivo determinadas, la morfología de la colonia

es característica de cada especie. En general el análisis del morfotipo de
colonias se realiza tras 24 horas de incubación (bacterias que infectan al ser
humano) en un medio adecuado. La morfología de las colonias (va a ser
propia para cada especie) varía en función del medio y de las condiciones
de cultivo y evoluciona con el tiempo, por lo que siempre hay que
analizarlas en las mismas condiciones.

PARAMETROS PARA IDENTIFICAR COLONIAS MACROSCÓPICAS

 1. Tamaño
2. La forma en el plano trasversal (corta el cuerpo por la mitad)
3. La forma en plano sagital (me da la información de la altura de la colonia, es un corte vertical)
4. El borde (hay colonias con borde liso y otras con borde irregular)
5. La superficie (lisa, estriada, brillante…)
6. El color (amarillo, blanco, rosa..)
7. La consistencia (dura, cremosa, mucosa..)

ESTRUCTURA BACTERIANA

Las bacterias son organismos unicelulares procariotas.

• Componentes comunes: presentes en todas las bacterias (pared

celular (excepto en los micplasmas), membrana citoplasmática,
material genético y ribosomas).

• Componentes específicos: presentes solamente en algunos

tipos de bacterias (cápsula, flagelos, fimbrias, pili (tubo que
permite el intercambio genético entre bacterias), endosporas…)

COMPONENTES COMUNES

1. Pared bacteriana:

• La pared bacteriana es una estructura rígida presente en todas las bacterias, rodea la membrana plasmática y da
forma y tamaño a la bacteria (1ª función). Constituye el 20% del peso de la bacteria, debido a esa rigidez que
presenta.

• La pared(2ª función) protege a la bacteria de fenómenos osmóticos (equilibrio entre la concentración de los dos
medios interno y externo separados por una pared) y (3ª función) funciona como una barrera contra sustancias
tóxicas químicas y biológicas. A pesar de su rigidez, posee poros que facilitan el intercambio de moléculas.

• El componente principal de la pared bacteriana es el peptidoglucano. Es un copolímero formado por largas

cadenas polisacáridas ( muchos azúcares).

Los glúcidos que tiene el peptidoglicano en su composición son: N-Acetil murámico, N-Acetil glucosamina. El N-Acetil
murámico tiene unida una cadena de péptidos, aminoácidos.

Según la pared bacteriana, hay tres tipos de bacterias:

• Grampositivas, se caracterizan por tener muchas capas de peptidoglicano (hasta 40 capas), cada NAM con su
tetrapéptido.
Pared gruesa, compacta y de aspecto homogéneo.
Contiene ácidos teicoicos la membrana plasmática y las capas de peptidoglicanos, que son polialcoholes con
una doble función:
- Dotar de carga negativa a la pared bacteriana. Todas las paredes bacterianas tienen carga negativa.
- Anclar la pared a la membrana plasmática mediante enlaces covalentes con lípidos de la membrana para
formar ácidos lipoteicoicos.
Espacio periplásmico: espacio que queda entre la pared y la membrana.
Van a generar toxinas.

• Gramnegativas, pared mas fina, de aspecto rugoso.

La capa de peptidoglicano esta recubierta por una membrana externa adicional de naturaleza fosfolipídica. La
cara interna de esta membrana contiene lipoproteínas que se unen a la capa de peptidoglicano.
 En la cara exterior de la membrana externa se sitúan numerosos lipopolisacáridos, su función es dar carga
negativa a la pared.
La parte más externa del lipopolisacárido, denominada antígeno O, es altamente antigénica y permite
diferenciar cepas de una misma especie (presente en todas pero diferente en cada cepa), clasificándolas en
serogrupos. Por lo tanto, van a activar al sistema inmune.

• Ácido-alcohol resistentes, pared muy resistente a la decoloración.

Pared de composición diferente a las bacterias grampositivas o negativas (pared muy grasa, corresponde al
60-70% de la pared de la bacteria). En este caso, el peptidoglucano se une a lípidos (ácidos micólicos),
glucolípidos y ceras (ácidos grasos). Esta composición le confiere a la pared un aspecto céreo y un carácter
hidrófobo (repelen el agua), así como una elevada resistencia a la desecación y a agentes químicos
antibacterianos.
Presenta más de una capa de peptidoglicanos, pero no tantas como las Gram+.
En el dibujo el PIM es el tetrapéptido.
Mycobaterium tuberculosis es un ejemplo de este tipo de bacteria.

2. La membrana citoplasmática:

La membrana citoplasmática de las bacterias se estructura según el modelo de mosaico fluido, como una bicapa
fosfolipídica en la que se integran proteínas.

Las procariotas presentan muchas más membranas en su membrana que las eucariotas.
Según su localización; las proteínas que solo sobresalen
por un lado de la membrana son proteínas periféricas, y
aquellas que atraviesan la membrana son integrales.
Sabemos que hay proteínas que ayudan al transporte de
sustancias del interior al exterior y viceversa. Este
transporte dependiendo de la proteína, puede ser:

- Proteínas de transporte activo, presentan bombas

de flujo, permiten el paso de sustancias del
interior al exterior y viceversa con gasto de
energía.
- Proteínas de difusión pasiva o proteínas canal,
entran o salen sustancias sin gasto de energía.

En la membrana podemos encontrar también colesterol que le da más fluidez o más rigidez a la membrana según su
presencia.

Glicolípidos, son azúcares unidos a los fosfolípidos de la membrana. Al tener forma de Y esperan la llegada de una
señal (receptores de señales).

FUNCIONES DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA

La diferencia principal con la membrana plasmática de células eucariotas es que la bacteriana tiene una porción
mayor de proteínas y elementos relacionados con su multifuncionalidad:

• Barrera osmótica (evita que haya gran diferencia de concentraciones entre el interior y el exterior) y selectiva: es
impermeable a moléculas cargadas y a iones, y permeable a compuestos orgánicos y moléculas neutras.

• Biosíntesis de componentes. La membrana está implicada también en la modificación y secreción de proteínas y

moléculas que forman parte del resto de la bacteria.

• Metabolismo energético: en la membrana se acopla la cadena respiratoria, que implica la síntesis de ATP.

• Recepción de señales del exterior gracias a los glicolípidos.

• Sistemas de transporte.

• Anclaje del cromosoma bacteriano MESOSOMAS (dibujo estructura bacteriana): durante la división celular.

• Anclaje de los flagelos/fimbrias.

3. Genoma bacteriano (su cromosoma + conjunto de plásmidos que puedan aparecer),

El material genético de las bacterias está contenido en un único cromosoma bacteriano. Pueden presentar también
pequeñas moléculas circulares de ADN,
denominadas plásmidos.

• Cromosoma bacteriano: es una gran

molécula circular de ADN bacteriano. No existe
núcleo propiamente dicho (ya que son células
procariotas), por lo que se encuentra en el
seno del citoplasma, asociado a proteínas y
superenrollado, formando una estructura de
aspecto fibrilar, denominado nucleoide.
Contiene toda la información genética
necesaria para el ciclo vital de la bacteria.
En el ADN hay unas proteínas llamadas histonas, que ayuda a la compactación de ese ADN y pueda caber en la
bacteria. El ADN de las E. coli, su ADN compactado mide 1 micrómetro y extendido 1 milímetro.

Cromosomas + histonas = nucleoide

Todas las bacterias presentan ADN no presenta ARN, el único ARN que presentan las bacterias está en los ribosomas.

• Plásmidos: moléculas circulares de ADN bicatenario

extracromosómico.

No están asociados a proteínas y su replicación es independiente

de la del cromosoma bacteriano.

No tienen porque ir a la par que el cromosoma bacteriano, y se

pueden dividir sin que haya división del cromosoma.

Están presentes en muchas especies bacterianas y su número

puede variar. No son esenciales para el ciclo de vida de la
bacteria pero aportan ventajas adaptativas muy importantes para
ellas.

Su descubrimiento supuso un avance para la ingeniería genética

por su potencialidad como vectores de clonación. (los plásmidos son Los plásmidos nos van a perjudicar
capaces de integrar un gen nuevo en su estructura y clonarlo, se les llama
a los seres humanos pero son
vectores de clonación).
beneficiosos para las bacterias.
TIPOS DE PLÁSMIDOS:
En las bacterias pueden no tener
- Plásmidos de resistencia a antibióticos: contienen genes que codifican ningún plásmido o de 1 plásmido
enzimas que degradan o modifican determinados antibióticos, hasta 100.
inactivándolos. Un mismo plásmido puede contener varios genes de
resistencia a diferentes antibióticos. (que las bacterias no se lisen ante la
presencia de un antibiótico).

- Plásmidos de virulencia: contienen genes que potencian la patogenicidad

de la bacteria, bien por facilitar su adhesión a superficies, la digestión de
componentes tisulares, la producción de toxinas…

- Plásmidos degradativos: contienen genes que codifican enzimas capaces

de degradar o expulsar sustancias tóxicas para la bacteria.

Algunos plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra de la misma

especie mediante conjugación. También existen plásmidos capaces de
integrarse en el genoma bacteriano o incluso en genomas de células
eucariotas infectadas.

CONJUGACIÓN PLÁSMIDOS (mediante un pili)

En las bacterias, los plásmidos se transmiten por conjugación mediante los

pili (prolongación celular que une a las bacterias).

En el dibujo tenemos una bacteria portadora de un plásmido F+ o macho y

una bacteria sin plásmido F- o hembra. El plásmido para poder ser
transmitido a otra bacteria tiene que duplicarse (del dibujo 1 al 2). La
bacteria F+ produce una prolongación celular formada por su pared,
membrana y citoplasma que llega hasta la bacteria F- de tal manera que
permanezcan unidas por esa prolongación (dibujo 2) denominada pili. (dibujo 3) Se transfiere el plásmido y hay un
plásmido bicatenario.(dibujo 4) Se elimina el pili y se separan y el resultado final son dos bacterias individuales que
portan el mismo plásmido.

La peligrosidad de esto, es que ese plásmido tenga un gen de resistencia, que puede ser transferida a cualquier F-. Si
esto sucede rápidamente, se genera bacterias resistentes.

4. Ribosomas,

Es el único orgánulo presente en procariotas

Los ribosomas son las estructuras donde se sintetizan las proteínas. En las bacterias se encuentran libres en el
citoplasma en un número que oscila entre 5.000 y 50.000, pudiendo llegar a representar la cuarta parte del volumen
celular.

El componente principal de los ribosomas es el ARN ribosómico, asociado a más de 50 proteínas

(ribonucleoproteínas). Constan de dos subunidades, una embebida dentro de la otra:

• Subunidad grande: con un peso de 50S y dos tipos de ARN ( ARNr + ribonucleoproteínas

Un ARNm que viene de la replicación y transcripción de un ADN se introduce en un ribosoma y se transforma en

proteína.

• Subunidad pequeña: con un peso de 30S y un tipo de ARN (ARN 16S, usado para simplificar APUNTES TAXONOMÍA
MOLECULAR).

El tamaño total de todo el ribosoma, no es la suma de sus subunidades, ya que una al estar embebida en otra, se le
otorga 70S

La unidad de medida de los ribosomas es, Sverdberg (S)

DIAPO 21

5. Otros componentes estructurales

Solo están presentes en algunas especies bacterianas y, por lo tanto, tienen cierta utilidad en la identificación de las
mismas.

El tener unas estructuras que algunas bacterias no tienen, les van a conferir ventajas frente a las bacterias que no
presentan ese componente.

• Cápsula: algunas especies bacterianas se caracterizan por tener una capa externa que recubre a la pared, esta capa
les sirve de protección (función) frente a la desecación (por su componente mucoso) y a la fagocitosis (es un
inconveniente para nosotros), y les facilita la colonización de tejidos, ya que les permite adherirse a las superficies.

Cuando una bacteria coloniza un tejido, se

adhieren a él formando un biofilm (es una
capa mucosa debida a la cápsula que se
adhiere a un tejido). Esta capa le confiere
patogenicidad.

Esta estructura superficial se compone de

polipéptidos (grandes proteínas) o
polisacáridos (grandes carbohidratos).

Cuando las bacterias capsuladas forman colonias, estas tienen aspecto mucoso, gelatinoso…
Ejemplo: Streptococcus pneumoniae (cadenas de cocos, va a tener una cápsula común, pero si se tienen que separar
por algún motivo cada una conserva su cápsula)

• Flagelos: son apéndices filamentosos extracelulares (se observan fuera de la célula), largos y helicoidales,
responsables del movimiento en los medios líquidos de la mayor parte de las bacterias móviles (permitir el
movimiento bacteriano en medios líquidos), para poder relacionarse con el medio, con otras bacterias.

- Monotricos: flagelo único en disposición polar.

Producen desplazamiento lento en línea recta hacia el
lado contrario al que está el flagelo.

- Lofotricos: dos o más flagelos en disposición polar.

Producen desplazamiento lento en línea recta al lado
contrario al que están los flagelos. Dependiendo del
número de flagelos esa rapidez va a depender.

- Anfitricos: varios flagelos en disposición polar en

ambos extremos de la bacteria. Producen movimiento
rápido y errático, es decir, un movimiento que no está
definido son bacterias que van vibrando.

- Peritricos: múltiples flagelos distribuidos por toda la superficie bacteriana. Producen movimiento rápido y errático.

El tipo de flagelo me va a ayudar a diferenciar y determinar el tipo de bacteria que estamos observando.

En su composición participan alrededor de 50 proteínas. El movimiento flagelar necesita de energía, por lo tanto, hay
un gasto energético cuando la bacteria se mueve por el flagelo. Estructuralmente constan de 3 partes:

➢ Filamento: parte visible por microscopía óptica.

Consiste en un tubo hueco helicoidal constituido por
subunidades de flagelina (proteína que recubre el
flagelo, pero el centro es hueco). Tiene propiedades
antigénicas (activa al sistema inmune) (antígeno H)
específicas de cada especie.

➢ Cuerpo o corpúsculo basal (iniciador del

movimiento de la bacteria): estructura de anclaje del
flagelo al cuerpo celular, desempeña la actividad
motora, son los que proporcionan el movimiento con
gasto de energía. El movimiento de un anillo de ese
corpúsculo basal, es circular. Está formado por una
serie de anillos a nivel de la pared bacteriana y la
membrana plasmática.

➢ Codo: estructura proteica curvada que conecta el eje central del cuerpo basal con el filamento externo,
posibilitando la transformación del movimiento giratorio del eje en helicoidal.

Fimbrias y pili: estructuras filamentosas proteicas más cortas y finas que los
flagelos, se insertan a nivel de la membrana plasmática. Presentan aspecto
similar pero su función es completamente distinta.

• Las fimbrias se distribuyen por toda la superficie de la bacteria y tienen

funciones de adhesión a superficies vivas e inertes.
• Los pili o pelos sexuales son un poco más gruesos pero mucho menos numerosos; toman parte en el intercambio
genético (plásmido) entre bacterias mediante la conjugación bacteriana. Normalmente hay un pili por bacteria.

DIAPO 25

• Endosporas: son formas de resistencia bacteriana que se producen en el interior de algunas bacterias Gram
positivas en condiciones medioambientales desfavorables (desecación, temperaturas excesivamente elevadas,
cambios de presión, pH…) esos cambios estresan a la bacteria, matándola. El cuerpo celular se destruye pero la
endospora resiste a pesar de las condiciones.

Son células vivas (porque en su interior hay material genético) en reposo con su metabolismo reducido al mínimo, y
muy resistentes.
Están formadas por varias cubiertas concéntricas impermeables que encierran un protoplasto central.

Los mesosomas bacterianos, son unas estructuras fundamentales en la formación de la endospora. El material
genético se duplica, y lis mesosomas se van a encargar de cerrar el cromosoma que va a pertenecer a la endospora.

Estos mesosomas van a ir formando una primera capa que va a ir rodeando al cromosoma y a los ribosomas. Deben
de haber múltiples capas de protección. La estructura de dentro se denomina protoplasto.

Un ejemplo de bacteria formadora de colonia es Bacillus.

Al final del proceso de formación, la célula madre se lisa y la espora se libera al medio. Cuando las condiciones
ambientales son favorables (cuando la tenemos en nuestro organismo), la espora germina y se transforma de nuevo
en una célula vegetativa viable.

Las endosporas son capaces de aguantar hasta 120º.

En resumen, si tu matas a la bacteria, si la endospora resiste, se

vuelve a generar la bacteria.

Según su posición en la bacteria: endosporas, centrales,

subterminales y terminales.

TERMINAL SUBTERMINAL CENTRALES

Según su forma: pueden ser ovales y esféricas.

Según su deformidad: deformante o no
deformante.

Esta clasificación me sirve únicamente para

identificar a la bacteria.

Ejemplo: Las deformantes son típicas de

Clostridium
TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA BACTERIANA

La gran limitación a la hora de visualizar las bacterias es su pequeño tamaño, por lo que se requieren instrumentos
ópticos de amplificación para ello. Se necesita microscopio

Otra limitación importante reside en que la mayoría de las bacterias son incoloras, por lo que no presentan gran
contraste con el medio que las rodea. Se necesitan tinciones.

OBSERVACIÓN EN FRESCO (técnica rápida y limitada)

Es una técnica muy rápida que permite visualizar organismos vivos sin el uso de colorantes. En la práctica está
restringida al uso de cultivos en medio líquido para observar si existe movimiento de las bacterias.

La limitación que tengo es que al ser en fresco no hay colorantes, por lo que será más difícil observar a las bacterias,
porque son incoloras.

La observación en fresco se debe hacer a partir de un cultivo en líquido. Para cultivos líquidos es una técnica
destinada a la observación de parásitos, como por ejemplo en una muestra de heces líquidas o en sospecha de
parasitismo en exudado vaginal.

Para dar un diagnóstico preciso tendré que realizar más técnicas.

La forma más sencilla consiste en colocar una gota de medio de cultivo (con asa de siembra o pipeta Pasteur
esterilizada) crecido entre porta y cubre y visualizarlo al microscopio óptico. La visualización debe hacerse de forma
rápida, porque la evaporación del medio puede alterar el movimiento de las bacterias.

El resultado esperado, es el movimiento de bacterias incoloras.

Variante de la observación en fresco:

❑ Método de la gota pendiente :

Se coloca una gota de medio de cultivo líquido crecido sobre el centro de un cubreobjetos y sendas gotas de aceite
de inmersión o vaselina en los bordes o en las esquinas.

El cubreobjetos se coloca invertido (con la gota en posición inferior) sobre un portaobjetos especial que tiene una
excavación central ; la gota tiene que quedar justamente en la excavación del porta y la vaselina ayuda a que el cubre
se pegue y no se mueva. Llegado a este punto hay que ir rápidamente al microscopio ya que la muestra se puede
evaporar rápidamente.

La visualización se realiza con un microscopio óptico de luz transmitida. Permite observar el desplazamiento de las
bacterias, lineal o browniano, consistente en una especie de vibración.

PREPARACIONES FIJADAS (son las que más se utilizan en microbiología clínica)

El estudio morfológico de las bacterias se realiza sobre extensiones de bacterias fijadas y teñidas (la principal ventaja
es que aportan color, por lo que las bacterias se pueden observar mejor). Estas extensiones se pueden obtener a
partir de cultivos crecidos en medio líquido, de colonias sobre medio de cultivo sólido o de la propia muestra
biológica (orina, esputo, exudado, heces…). Otro beneficio de estas muestras es el uso del objetivo de inmersión, por
lo que se pueden observar las muestras bacterianas más cerca.

PASOS PARA LA PREPARACIÓN FIJADA

1. Extensión de la muestra: sobre un portaobjetos. Esta extensión o frotis debe ocupar la región central del
portaobjetos (sin llegar a los extremos ya que se podría perder muestra) y tener forma ovalada. Dependiendo del
material de partida:

- Medio de cultivo líquido crecido: se carga un asa de siembra estéril, introduciéndola en el medio de cultivo y se
descarga sobre el portaobjetos, extendiendo el material en su superficie.

- Colonia sobre medio de cultivo sólido: se carga un asa de siembra estéril con el material de la colonia y se coloca
sobre una gota de agua destilada previamente colocada en el centro del portaobjetos y se extiende.

- Muestra biológica (no haría falta un asa de siembra): si la muestra es un fluido biológico, se procesa de la misma
manera que un cultivo líquido. Si la muestra se remite al laboratorio con una torunda (exudados) la extensión se
realiza directamente en la torunda sobre la zona central del portaobjetos.

2. Fijación de la muestra: tiene una doble función, preservar la morfología y las estructuras de las células y conseguir
una buena adherencia de la muestra al portaobjetos. Se consigue mediante desnaturalización y precipitación de las
proteínas por calor o colorantes químicos:

- Calor: es el método más utilizado. Mechero de Bunsen. El procedimiento es:

Pasar con la mano sin guante, ya que es mucho mas peligroso fijar con guante que tocar la bacteria sin guantes. Paso
unas cuantas veces por el mechero, me alejo un poco, dejo que se enfríe y vuelvo a pasarlo por la llama hasta ver
que no quedan restos líquidos, que está seca la muestra en el porta.

- Fijadores químicos: los más utilizados son alcoholes y acetonas. La extensión se deja secar a temperatura ambiente
y, seguidamente se sumerge en el fijador. Terminada la fijación, la extensión se deja secar nuevamente a temperatura
ambiente.

• Tinción: se realiza con los colorantes adecuados y siguiendo el protocolo específico en cada caso.

• Lavado y secado: los procedimientos de tinción suelen terminar con un lavado para la eliminación de los restos del
último colorante usado. Puede realizarse con agua destilada o con agua corriente ya que la muestra ya está fijada y
muerta. A continuación se deja secar la extensión a temperatura ambiente, en posición vertical con un ángulo de
45º.

• Observación microscópica: se realiza con un microscopio óptico, empezando con un objetivo de bajo aumento (10x)
y terminando con un objetivo 100x. Se puede llegar hasta el objetivo de inmersión, sin cubreobjetos.
COLORANTES

Dependiendo de la carga del ion que porta el color, los colorantes pueden ser de tres tipos:

• Ácidos o aniónicos: tienen carga negativa, por lo que se unen a componentes y estructuras con carga positiva. La
superficie bacteriana, cargada negativamente, repele este tipo de colorantes, por lo que no tiñen bien la pared.
Ejemplos: eosina o rosa de bengala.

NOTA: Recordemos que en TODAS las bacterias la pared presenta carga negativa. Por lo que los colorantes ácidos no
podrán teñir estas paredes, pero van a teñir el interior

• Básicos o catiónicos: tienen carga positiva por lo que se utilizan para teñir componentes y estructuras generalmente
ácidas o con carga negativa. Si tiñen la pared de las bacterias. Ejemplo: azul de metileno.

• Neutros o anfóteros: son sales de colorantes ácidos y básicos, por lo que tiñen todo tipo de estructuras,
predominando uno u otro dependiendo del pH al que se realice la tinción. Ejemplo: eosinato de azul de metileno.

En algunas tinciones se utilizan también un tipo de sustancias denominadas mordientes. No son colorantes
propiamente dichos, pero favorecen la unión del colorante a una estructura concreta. Fijan o aumentan la afinidad.
Ejemplo: Lugol utilizado en la tinción de gramm

TINCIONES SIMPLES

Se utiliza un único colorante disuelto en solución

acuosa o alcohólica, de modo que todas las bacterias
presentes en la extensión se tiñen por igual.

• Son tinciones inespecíficas (todas las bacterias se

tiñen igual), ya que no permiten diferenciar bacterias
con distintas propiedades tintoriales. (desventaja)

• Sirven para estudiar la morfología individual, el

tamaño y los agrupamientos (ventaja).

• También ponen de manifiesto la densidad

bacteriana de una muestra y su homogeneidad, es
decir la presencia de un único morfotipo o de varios.

TIPOS DE TINCIONES SIMPLES

• Tinción con azul de metileno: se emplea un tinte denominado cloruro de metiltionina. Es una tinción simple
positiva, rápida y sencilla.

Se realiza sobre extensiones bacterianas fijadas por calor en tres pasos:

1. Cubrir la extensión fijada con una solución al 1% de azul de metileno

e incubar 2 minutos a temperatura ambiente.

2. Lavar con agua destilada.

3. Secar a temperatura ambiente. Con esta tinción todas las bacterias

se colorean de azul más o menos oscuro.
• Tinción con nigrosina: es un colorante aniónico negro incapaz de penetrar en las bacterias, porque es repelido por
la pared bacteriana. En consecuencia, la tinción con nigrosina es una tinción simple negativa (tiñen el fondo y no a la
bacteria).

La utilidad de está tinción se limita a la

observación de bacterias con cáp sula,
esporas, bacterias flageladas y levaduras y
bacterias difíciles de teñir por otros métodos.
El procedimiento consta de los siguientes
pasos:

1. Colocar una gota de nigrosina en un

extremo de un portaobjetos, la muestra no se fija.

2. Cargar un asa de siembra con la muestra que se va a teñir (cultivo líquido crecido o parte de una colonia).

3. Emulsionar la muestra con la nigrosina utilizando el asa de siembra.

4. Realizar una extensión o frotis, clocando un segundo portaobjetos limpio sobre la gota de nigrosina con la muestra
y deslizándolo a lo largo del primero.

5. Dejar secar a temperatura ambiente.

TINCIONES DIFERENCIALES

Las tinciones diferenciales o compuestas utilizan dos colorantes que contrastan en intensidad o color, en
combinación con un tratamiento que provoca una respuesta diferente a la tinción entre distintos microorganismos.
De esta manera, permiten distinguir entre bacterias de igual morfología por sus diferentes propiedades tintoriales.
Van a dar información extra ya que contrastan entre ellas.

• Tinción de Gram: es la más utilizada en los laboratorios de microbiología. Es un procedimiento rápido que
proporciona la misma información que una tinción simple en cuanto a morfología y tamaño de las bacterias pero
que, además, las divide en dos grandes grupos, según el color del que se tiñen.

Es lo primero que se hace tras la recepción de una muestra biológica, porque es fácil, rápida y aporta mucha
información.

- Bacterias Grampositivas: se tiñen de color azul o violáceo oscuro.

- Bacterias Gramnegativas: se tiñen de color rosáceo intenso o rojizo.

• Esta prueba es de gran importancia, ya que las principales claves dicotómicas de identificación bacteriana se inician
con el resultado obtenido con ella (bacilos y cocos grampositivos o negativos).
También resulta de gran utilidad realizar esta tinción sobre extensiones obtenidas directamente de la propia muestra
biológica remitida al laboratorio, puesto que la identificación de determinados morfotipos bacterianos hace
sospechar del agente etiológico causante de una enfermedad y, así, iniciar un tratamiento a la espera de resultados
definitivos y orientar al laboratorio en la ruta de identificación. Ejemplos:

• Muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) (es estéril, por lo que

en condiciones normales no presenta ningún microorganismo, si
presentase, es indicio de infección) procedente de un paciente
con sospecha de meningitis bacteriana: la visualización en una
preparación del LCR teñida con la tinción de Gram de diplococos
gramnegativos intracelulares apunta a una meningitis
meningocócica (Neisseria meningitidis), mientras que la
visualización de diplococos grampositivos extracelulares apunta a
una meningitis neumocócica (Streptococcus pneumoniae).

• Exudado uretral procedente de un paciente con secreción

purulenta: la observación microscópica de diplococos
gramnegativos con forma de grano de café en el interior de las
células inflamatorias hace sospechar de una gonococia (Neisseria gonorrhoeae).

Antes de teñir, hay que extender la muestra de una Placa de Petri; cojo una colonia bien aislada y hacemos una
extensión de la muestra sobre una gota de agua. Posteriormente fijamos y pasamos a la tinción.

La tinción de Gram se desarrolla en tres fases:

1. Tinción con un colorante catiónico (cristal violeta) capaz de unirse a la pared bacteriana, y estabilización del mismo
con un mordiente (no son colorantes, ayudan a que el colorante se pueda fijar) con yodo (lugol), que forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. Cualquier bacteria en este primer paso se tiñen de morado, bien
sean Gram+ o Gram-.

Para poder distinguir si es Gram+ o Gram-:

2. Decoloración con una mezcla de alcohol/acetona en proporción 1:1, en la que el complejo cristal violeta/lugol sí es
soluble. La mezcla alcohol/acetona es un solvente lipídico, capaz de disolver la membrana externa de las bacterias
gramnegativas y extraer rápidamente el colorante de la delgada capa de peptidoglicano. La pared de las bacterias
grampositivas, mucho más gruesa, con un número elevado de capas de peptidoglicano y menor contenido lipídico es
resistente durante más tiempo a esta decoloración y retiene el cristal violeta. El tiempo de decoloración es el factor
limitante de la técnica, puesto que si se prolonga excesivamente, las bacterias grampositivas también se decoloran.
Las Gram+ resisten y las Gram- se les quita el colorante.

3. Coloración de contraste con un colorante rojo, como la safranina, que tiñe la pared de las bacterias gramnegativas,
previamente decoloradas. Las bacterias grampositivas, teñidas con el cristal violeta, no se tiñen con este segundo
colorante y permanecen azules o violáceas.

* Esta tinción hay que realizarla sobre cultivos jóvenes, puesto que en los envejecidos se puede perder la positividad.
Procedimiento: se parte de una extensión fijada por calor y se siguen estos pasos.

1. Cubrir la extensión con solución de cristal violeta e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

2. Lavar brevemente con agua destilada y escurrir el portaobjetos. Es importante que el lavado sea breve, porque el
cristal violeta sin mordiente es soluble en agua y un lavado excesivo puede decolorar las bacterias. En algunos
protocolos este paso se suprime, directamente se es escurre el exceso de cristal violeta. No lavar entre cristal violeta
y Lugol, echar Lugol encima del cristal violeta.

3. Cubrir el portaobjetos con lugol (mordiente) e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

4. Lavar con agua destilada y escurrir el

portaobjetos.

5. Cubrir el portaobjetos con la mezcla de

alcohol/acetona durante 30 segundos y escurrir.
En algunos protocolos, el portaobjetos se sujeta
verticalmente con unas pinzas en un ángulo de
45º y la mezcla de alcohol/acetona se deja caer
gota a gota sobre el portaobjetos, decolorando la
extensión.

6. Lavar con agua destilada y escurrir el

portaobjetos.

7. Cubrir el portaobjetos con solución de safranina

e incubar durante 2 minutos a temperatura
ambiente.

8. Lavar abundantemente con agua destilada y

dejar secar a temperatura ambiente.

9. Visualizar al microscopio óptico.

OTRO TIPO DE TINCIÓN DIFERENCIAL

• Tinción de Ziehl-Neelsen: permite distinguir un grupo especial de bacterias cuya pared presenta resistencia a la
decoloración por una mezcla de ácido clorhídrico+alcohol (bacterias ácido-alcohol resistentes o BAAR).

Tienen gran importancia porque entre las BAAR se encuentran las micobacterias que son bacilos (no confundir con
los micoplasmas!), agentes etiológicos de enfermedades como la tuberculosis o la lepra. Estas bacterias son:
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae. Son las pocas bacterias que presentan ácido alcohol resistencia.
Si me llega muestra de esputo voy a sospechar de tuberculosis, pero si me llega una muestra de tejido se sospecha
de lepra.

Todo lo que se ve de
rojo o rosa son las
bacterias (en la
primera tuberculosis
en la segunda lepra)
y lo que se observa
en azul son las
células humanas
que se han teñido
con colorante de
contraste.
• Es una tinción con especificidad, ya que, aparte de las micobacterias, el número de microorganismos ácido-alcohol
resistentes es muy reducido.

Pasos a seguir en la tinción,

La tinción de Ziehl-Neelsen se desarrolla en 3 fases:

1. Tinción en caliente con un colorante básico, como la fucsina fenicada o carbón fucsina. Las BAAR presentan en su
pared ácidos micólicos (ácidos grasos ramificados de 50-90 átomos de carbono) y ceras que le confieren un carácter
hidrofóbico e impiden el paso de colorantes. El calentamiento fluidifica esta pared cérea, permitiendo el paso de
colorantes catiónicos. En las demás bacterias, los colorantes básicos penetran la pared bacteriana sin ningún
problema. En consecuencia, en esta fase todas las bacterias se tiñen de rojo. (Tengo que estar aplicando calor para
que la grasa de la membrana de las bacterias se derrita y el colorante acuoso pueda penetrar).

El calor se aplica con una pequeña antorcha de algodón metido previamente en alcohol. Se le dan bases por debajo
de la muestra, con cuidado para no quemar a las muestras, tienen que salir vapores pero que nunca entre en
ebullición.

En este primer paso todas las bacterias van a estar rosa, tanto las que son BAAR como las que no son BAAR.

2. Decoloración, para poder distinguir a las BAAR de las no BAAR, en frío con una mezcla ácido-alcohol (es un
decolorante muy potente que solo aguantan las BAAR, ya que si se usa alcohol acetona, las Gram+ van a seguir
siendo rosa, y no podríamos distinguir). Hay que esperar a que se enfríe la muestra, para que ellos ácidos grasos
vuelvan a su forma, retengan el colorante, y echar el decolorante sin miedo a perder el colorante. Con el frío, los
ácidos micólicos y las ceras de la pared de las BAAR vuelven a solidificar, atrapando el colorante e impidiendo su
arrastre por la mezcla de ácido-alcohol. En las demás bacterias, la mezcla arrastra el colorante inicial y las decolora. Al
final de esta fase, las BAAR permanecen teñidas de rojo y el resto de las bacterias, incoloras.

3. Coloración de contraste para observar a las no BAAR; a parte, puede teñir también a las células humanas. En las
BAAR, la coloración de contraste (azul de metileno) no puede penetrar, mientras que en las demás bacterias, el
colorante sí puede atravesar la pared y las tiñe de azul. Al final de esta fase, las BAAR aparecen teñidas de rojo y las
demás bacterias de azul.

Procedimiento: se parte de una extensión fijada por calor y se siguen estos pasos.

1. Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada y calentar el portaobjetos por debajo, lenta y progresivamente con un
mechero hasta que el colorante emita vapores, pero
sin que llegue a hervir.

2. Dejar que se enfríe y repetir el calentamiento 2 o

3 veces durante 10-15 min, evitando que el
colorante hierva o se seque. 3. Lavar con agua
destilada y escurrir el portaobjetos.

4. Decolorar con alcohol-clorídrico al 3-5% durante 2

minutos a temperatura ambiente. En algunos
protocolos, el portaobjetos se sujeta verticalmente
con unas pinzas en un ángulo de 45º y la mezcla de
alcohol/clorhídrico se deja caer gota a gota sobre el
portaobjetos, decolorando la extensión.

5. Lavar con agua destilada abundante y escurrir el

portaobjetos.

6. Cubrir el portaobjetos con una solución de azul de

metileno e incubar durante 1-3 minutos a
temperatura ambiente.
7. Lavar con agua destilada, escurrir el portaobjetos y dejar secar a temperatura ambiente.

8. Visualizar al microscopio óptico.

TINCIONES ESTRUCTURALES

• Las tinciones estructurales están diseñadas para teñir estructuras concretas, que están presentes solo en algunas
especies bacterianas y que, por tanto, sirven como criterio de identificación. Las principales son cápsulas, flagelos y
esporas.

• No tiene utilidad clínica, es decir, no me dice que tipo de bacteria es. Pero si que tiene gran importancia en la
clasificación taxonómica.

En la imagen: [Link]; [Link]; [Link] (lo verde que hay en la mitad de la bacteria)

• Tinción de cápsula: la cápsula, debido a su composición química, es difícil de teñir, por lo que se suelen utilizar
tinciones negativas para ponerla de manifiesto. Las más utilizadas son la tinción con nigrosina, la tinción con tinta
china y la tinción de Hiss.

1. Tinción con tinta china o nigrosina: se realiza mezclando una suspensión bacteriana con tinta china y
visualizando la mezcla entre porta y cubre.

Imagen 1 y 2: bacterias encapsuladas y la 3 levadura

 2. Tinción de Hiss: se realiza sobre extensiones secadas a temperatura ambiente.

• Teñir la extensión con una solución acuosa de cristal violeta al 1%.

• Tratar la extensión con una solución acuosa de sulfato de cobre al 2%. El sulfato de cobre decolora la cápsula,
pero no así el cuerpo celular bacteriano. Al microscopio se observan las bacterias de color violáceo y las cápsulas azul
muy pálido.

• Tinción de flagelos: los flagelos son estructuras filamentosas tan finas que no son visibles de forma natural al
microscopio óptico. Para su visualización se requiere de
compuestos químicos que se depositen sobre ellos,
recubriéndolos y aumentando su grosor. Las dos técnicas más
utilizadas son:

1. Tinción de Leifson. Utiliza ácido tánico para recubrir el flagelo y

rosanilina para teñir el conjunto. Los flagelos se observan en
tono rosáceos o azulones.

2. Tinción de Rhodes. Utiliza nitrato de plata amoniacal

(engrosador), un colorante y el mordiente para ayudar a unirse al
engrosador. Los flagelos se ven negros.

• Tinción de esporas (están en el citoplasma, por lo que es una endospora): teñir las endosporas bacterianas es
complejo por su situación, en el interior del cuerpo celular, y por
su estructura, con varias cubiertas impermeables. Por ello, se
requieren tinciones con calor para favorecer la penetración de los
colorantes. Hace falta aplicar color para que se tiña el interior de la
endospora.

La técnica más empleada es la tinción de Wirtz-Conklin, que se

practica sobre extensiones fijadas por calor y que consta de los
siguientes pasos:

1. Cubrir la extensión con una solución de verde malaquita al 5%. Calentar el portaobjetos por debajo con un
mechero durante 5 minutos. Se debe evitar que el colorante entre en ebullición y que se seque.

2. Lavar con agua abundante el exceso de colorante.

3. Cubrir la extensión con una solución de safranina al 0,5%. Este es el colorante

de contraste para teñir las formas vegetativas.

4. Lavar con agua abundante el exceso de colorante y dejar secar la preparación.

5. Visualiza la preparación al microscopio. Las esporas adquieren un color verde,

mientras que las formas vegetativas se ven de color rojo.
TINCIONES FLUORESCENTES

• Son una alternativa a las tinciones cromogénicas, para conseguir (ventajas) mayor sensibilidad (me da mayor
positividad de las muestras que son positivas, se evitan los falsos negativos), sobre todo en la detección de ciertas
especies bacterianas en extensiones directas de muestras biológicas muy contaminadas, como el esputo, ya que sale
por la boca y ahí tenemos mucha microbiota o las heces. Requiere un microscopio de fluorescencia para visualizar el
resultado.

• Pueden ser de dos tipos:

- Directas (microbiología): se basan en el uso de colorantes fluorescentes, es decir, compuestos químicos que se
unen a determinados componentes de las bacterias y tienen capacidad de emitir luz visible a una determinada
longitud de onda cuando se excitan con luz ultravioleta. Portaobjetos especial con pocillos y se suele hacer por
duplicado o triplicado.

- Indirectas (inmunodiagnóstico): Deposito mi muestra en el portaobjetos especial de fluorescencia, se basan en el

uso de anticuerpos marcados con fluorocromos o fluoróforos y permiten detectar antígenos concretos en las
bacterias. El anticuerpo va contra un epítopo (antígeno) concreto de la superficie del organismo. Es más específica
que la directa, por el uso de anticuerpos específicos.

Deposito mi muestra en el portaobjetos especial de fluorescencia,

El colorante fluorescente se deposita sobre algunos antígenos de la superficie bacteriana

LEVADURAS EN GEMACIÓN CADENAS DE BACILOS CON DOS FLUOROCROMOS

TINCIONES FLUORESCENTES DIRECTAS.

1. Tinción de naranja de acridina: El naranja de acridina (tié de verde el ADN y de rojo el ARN) es un colorante
fluorescente derivado de la tetrametilacridina que se une inespecíficamente a todos los ácidos nucleicos (ADN y ARN)
de bacterias y células. Cuando se une a ADN de doble cadena emite fluorescencia verde, mientras que cuando se une
a ADN de cadena sencilla o a ARN, emite fluorescencia roja.

Esta tinción es inespecífica (se une tanto a ADN como a ARN), pero aporta mayor
sensibilidad, en algunos casos, que las tinciones cromogénicas. Se utiliza para
detectar micoplasmas en muestras biológicas con baja carga bacteriana
(micoplasmas) o con bacterias que se tiñe mal con tinciones convencionales, como
exudados uretrales, hemocultivos, LCR…, porque son líquidos muy estrériles. Tanto
las células humanas como en las bacterias van a tener fluorescencia roja, porque
presentan ADN de doble cadena. Se realiza sobre extensiones fijadas por calor:

• Cubrir la extensión con una solución de naranja de acridina e incubar 2 minutos a

temperatura ambiente (sin que se seque), se unirá al ADN o ARN de las bacterias y
de las células humanas.
• Lavar con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente.

Visualizar con microscopio de fluorescencia. Las bacterias y los núcleos celulares fluorescen en amarillo brillante
sobre fondo oscuro.

2. Tinción de auramina-rodamina: tiene un fundamento similar a la de Ziehl-

Neelsen, ya que el colorante utilizado (auramina-rodamina) se une a los ácidos
micólicos de la pared de las micobacterias y resiste la decoloración con una
mezcla de ácido-alcohol. Se trata de una tinción fluorescente diferencial, que
permite distinguir las BAAR de las demás bacterias que no retienen el
colorante.

La diferencia principal ente ambos protocolos es que no es necesario calentar

la preparación para que la auramina-rodamina penetre en la pared bacteriana.

Se realiza sobre preparaciones fijadas por calor:

• Inundar la preparación con una solución de auramina-rodamina e incubar 12-15 minutos a temperatura ambiente.

• Lavar con agua destilada.

• Decolorar con alcohol-ácido durante 3 minutos. Este tratamiento elimina el colorante de las bacterias no BAAR.

• Lavar con agua destilada.

• Cubrir con solución de contraste e incubar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. La solución de contraste
más utilizada es permanganato potásico al 0,5% en agua destilada (tiñe el fondo de un color oscuro para que los
colorantes brillen más y se vean mejor), que elimina la fluorescencia de fondo que haya podido quedar tras la
decoloración y suministra un fondo oscuro sobre el que contrastan muy bien las bacterias fluorescentes.

• Lavar con agua destilada.

• Dejar secar al aire.

Bajo el microscopio de fluorescencia, las BAAR fluorescen en amarillo-anaranjado intenso sobre fondo oscuro.

Otro ejemplo de fluorescencia: Cuando hay sospecha de sifilis, y llega una muestra de sudado vaginal o uretral, se va
a sospechar de Treponema pallidum. Es una bacteria que se tiñe muy mal con tinciones convencionales. Además,
presenta alta sensibilidad, porque su morfología es un espirilo.

Se puede hacer fluorescencia para muestras infectadas por virus.

TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN CON MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

No utiliza un haz de luz como otros microscopios si no que utiliza un haz de electrones (ese haz de electrones es lo
que incide sobre la muestra, baña la muestra). Son técnicas largas y laboriosas, que básicamente aportan
información morfológica y estructural. Los procedimientos más utilizados son:

1. Tinción negativa: para estudiar la morfología externa de las bacterias y es

especialmente útil para visualizar estructuras como flagelos, fimbrias y pili. El
procedimiento implica colocar una microgota de una suspensión bacteriana sobre una
rejilla de microscopio electrónico recubierta de una película, y tratar las bacterias que
se depositen sobre la película con una sustancia electrodensa (cuyo objetivo es
engordarlas para hacerlas más visibles) que se deposita sobre su superficie y contorno,
como el ácido fosfotúngstico. La visualización ofrece una imagen en negativo de las
bacterias. Es más útil en virus.
2. Tinción con tetróxido de osmio y acetato de uranilo: es la tinción
histológica básica de microscopía electrónica. Requiere que el material que
se va a estudiar, ya sea una colonia bacteriana o una biopsia de un tejido
infectado, sea deshidratado e incluido en una resina. Seguidamente se
realizan cortes ultrafinos del material, a los cuales se aplica la tinción.

El osmio y el uranilo de los colorantes son electrodensos y se depositan

sobre las membranas, facilitando el contraste para la visualización de la
preparación con un microscopio electrónico de transmisión. Permite
visualizar las estructuras internas de las bacterias, puesto que se tiñen
cortes histológicos (pared, membrana, ribosomas…).

3. Microscopía de barrido: se pueden observar tridimensionalmente

bacterias enteras, lo que es útil para estudiar su morfología externa y,
también, las relaciones entre bacterias.

La tinción se realiza colocando el material con las bacterias sobre un soporte

adecuado y recubriendo toda la muestra con átomos electrodensos
(generalmente átomos de carbono.