ENSAYO ENZIMÁTICO DISCONTINUO CON ß-GALACTOSIDASA
Fundamento teórico y objetivos
El objetivo de esta práctica es ilustrar experimentalmente algunas de las
propiedades que presentan las enzimas. Así, (i) pondremos de manifiesto la relativa
especificidad de sustrato que pueden presentar las enzimas, (ii) el elevado poder
catalítico que muestran estos biocatalizadores, (iii) el efecto de la concentración de
enzima sobre la velocidad, (iv) el efecto de la concentración de sustrato sobre la
velocidad, (v) el efecto de efectores sobre la velocidad, (vi) el efecto de la temperatura
sobre la velocidad, (vii) el efecto del pH sobre la velocidad. Finalmente, también
ilustraremos una frecuente estrategia de regulación de la actividad enzimática:
inducción de la expresión genética para modificar los niveles de enzima.
El ensayo enzimático
La ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la descomposición de
ß-D-galactósidos, como la lactosa, en los azúcares que los componen por hidrólisis del
residuo de ß-D-galactosa no reductor. En el caso de la lactosa, los productos de la
reacción son glucosa y galactosa.
Esta actividad enzimática se puede determinar usando el sustrato cromogénico
o-nitrofenol-ß-D-galactósido (ONPG) que se hidroliza en o-nitrofenol y galactosa. El
o-nitrofenol es un producto coloreado que, a pH alcalino, presenta un máximo de
absorción a 410 nm, lo que permite el seguimiento de la reacción.
En determinadas ocasiones, como en el caso que nos ocupa, podemos desarrollar
ensayos discontinuos. En este tipo de ensayo, la reacción se desarrolla durante un
tiempo que no exceda de aquél en el que la cinética es lineal. Esto significa, que la
concentración de producto aumenta de forma constante (no hay variaciones de la
velocidad de reacción) en el intervalo de tiempo fijado. De este modo, podemos poner
en marcha la reacción, pararla exactamente transcurrido dicho tiempo y medir la
cantidad de producto formado. Dividiendo dicha cantidad por el tiempo de incubación
tendremos la velocidad inicial. Puesto que no medimos el producto continuamente (no
tenemos curva de progresión) el ensayo se denomina discontinuo.
Material y reactivos
● Espectrofotómetro.
● Extracto enzimático: 40 mg cultivo Aspergillus oryzae / 100 ml de agua
(preparación reciente, conservar a 4 ºC).
● Tampones fosfato-citrato 50 mM a pH 3, 4.5, 6 y 7.5.
● Tampón borato 200 mM pH 9.8
● o-Nitrofenol--ß-D-galactósido (ONPG) 40 mM en agua.
● o-Nitrofenol (ONP) 2 mM en fosfato-citrato 20 mM, pH 4.5
Día 1
a) Recta patrón
Preparar los siguientes tubos por duplicado a partir de la solución patrón de
o-nitrofenol (ONP) 2 mM según las indicaciones de la tabla:
Añadir agua hasta completar 1 ml de volumen final.
Añadir 3 ml de tampón borato 200 mM pH 9.8 a cada tubo.
Medir la absorbacia a 410 nm frente al ‘Blanco’.
Calcular el coeficiente de extinción molar del compuesto coloreado representado
‘Absorbancia a 410 nm’ frente a [ONP]. Representar los valores en papel
milimetrado y ajustar la recta por mínimos cuadrados. El coeficiente de extinción
molar que determinemos nos servirá para el cálculo posterior de actividades
enzimáticas.
b) Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción
Preparar una serie de tubos por duplicado de acuerdo con la siguiente tabla:
Notar cómo en cada tubo se pipetea un volumen distinto de enzima y en
consecuencia se obtiene una concentración de enzima diferente.
La reacción se dispara añadiendo la enzima. Poner en marcha la reacción en cada
tubo a intervalos de 30 segundos. Agitar inmediatamente e incubar a temperatura
ambiente durante 10 minutos. Parar la reacción añadiendo 3 ml de tampón borato a
cada tubo, también a intervalos de 30 segundos. Medir la absorbancia a 410 nm
frente al blanco (tubo sin enzima).
Calcula la actividad expresada en katales y en unidades internacionales (UI).
Discute la relación existente entre la velocidad máxima y la cantidad de enzima.
Día 2
a) Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción
Preparar una serie de tubos por duplicado siguiendo las indicaciones de la tabla:
Obsérvese cómo en cada tubo la concentración final de ONPG es
diferente, pues se pipetean diferentes volúmenes de diferentes stocks de ONPG.
La reacción se dispara, igual que en el caso anterior, añadiendo la enzima
con desfases de 30 segundos de tubo a tubo. Agitar inmediatamente e incubar a
temperatura ambiente 10 min. Parar la reacción añadiendo 3 ml de tampón
borato a cada tubo, también a intervalos de 30 segundos. Medir la absorbancia a
410 nm frente al blanco.
Calcular las velocidades iniciales expresadas en μmoles de ONP por
minuto y en moles de ONP por segundo.
Hacer (en papel milimetrado) una representación gráfica de directos y de
dobles inversos. Obtener los parámetros cinéticos mediante el ajuste
minimocuadrático de directos y de dobles inversos.
b) Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción
Se ensayarán en 4 tubos los pH 3.0, 4.5, 6.0 y 7.5
Blancos 1a 4 Tubos 1 a 4
Agua: 550 μl 525 μl
Tampón: 200 μl 200 μl
ONPG 40 mM: 250 μl 250 μl
Enzima: - 25 μl
Disparar la reacción mediante la adición del extracto enzimático a
intervalos de 30 segundos. Incubar la reacción durante 10 min a temperatura
ambiente y parar la reacción añadiendo 3 ml de tampón borato a cada tubo
(teniendo en cuenta el desfase de 30 segundos). Medir la absorbancia a 410 nm
en cada tubo frente a su correspondiente blanco.
Representar (en papel milimetrado) la actividad enzimática frente al pH.
c) Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción
Preparar 4 tubos eppendorfs con 100 μl de extracto enzimático y repartiéndolos
en baños a 40, 50 y 60 ºC. El cuarto tubo se deja a temperatura ambiente. Tras
incubar 10, 20 y 30 minutos a cada temperatura, extraer 25 μl para disparar la
reacción, para lo cual habremos preparado previamente tubos según las
siguientes indicaciones:
Tubo H2O (ul) Tampón ONPG Extract. Enz.
pH 4.5 (ul) 40 mM (ul) (ul)
B 550 200 250 -
M 525 200 250 25
Ten presente que tendrás que preparar tantos tubos ‘M’ como ensayos
vayas a realizar (12 tubos en total más sus correspondientes blancos). Una vez
disparada la reacción se incuba a temperatura ambiente durante 10 min y se
detiene la reacción con 3 ml de tampón borato. Mediar las absorbancias a 410
nm para calcular las actividades como viene siendo habitual. Representar los
datos (en papel milimetrado) seleccionando según tu criterio las variables
relevantes.
Día 3
a) Efecto de la galactosa sobre la actividad enzimática
Las sustancias que disminuyen la velocidad de reacción se denominan inhibidores. Aquí
vamos a determinar los parámetros cinéticos de la β-galactosidasa en presencia de dos
concentraciones diferentes de galactosa.
Preparar la siguiente batería de tubos:
Poner en marcha la reacción por adición de la enzima a intervalos de 30
segundos. Incubar 10 min a temperatura ambiente y parar la reacción añadiendo 3 ml de
tampón borato. Medir absorbancia a 410 nm y determinar las velocidades iniciales.
Realizar la representación de la velocidad en función de la concentración de
sustrato para ambas concentraciones de inhibidor junto con la representación obtenida el
día 2, donde se obtuvo la velocidad en función de la concentración de sustrato en
ausencia de inhibidor. Hacer la representación de dobles inversos para los tres conjuntos
de datos y determinar qué tipo de inhibidor es la galactosa. Determinar Km aparente en
presencia de inhibidor.
b) Inducción del gen de la β-galactosidasa de Escherichia coli
E. coli puede sintetizar la enzima β-galactosidasa. Sin embargo, el gen que codifica
para esta enzima se encuentra normalmente reprimido excepto en presencia de lactosa.
En esta práctica vamos a observar como las bacterias crecidas en presencia de lactosa,
como fuente de carbono, inducen la producción de la enzima para utilizar la lactosa que
se les ha suministrado como nutriente, a diferencia de un cultivo de la misma cepa
bacteriana crecido en presencia de glucosa como fuente de carbono.
Crecer dos cultivos de E. coli en medio LB con glucosa y con lactosa como fuente
de carbono a 37 ºC toda la noche (agitación moderada).
Tampón Z:
Na2HPO4.7H2O 16.1 g (0.06M)
NaH2PO4.H2O 5.5 g (0.04M)
KCl 0.75 g (0.01M)
MgSO4. 7H2O 0.246 g (0.01M)
ß-mercaptoetanol 2.7 mL (0.05M)
H2O hasta 1 litro. Ajustar a pH 7.0
Preparar los siguientes tubos (añadir todo excepto el ONPG):
E. coli E. coli LB-lactosa sin Galactosidasa Tolueno Tampón Z Fosfato-citrato ONPG 40
LB-lactosa LB-glucosa bacterias pH 4.5 mM
100 - - - 1gota 700 - 200
500 - - - 1gota 300 - 200
- 100 - - 1gota 700 - 200
- 500 - - 1gota 300 - 200
- - 100 - 1gota 700 - 200
- - 500 - 1gota 300 - 200
- - - 25 1gota - 775 200
Cuando hayamos puesto todo excepto el ONPG agitamos bien y dejamos los tubos
abiertos a temperatura ambiente para que se evapore el tolueno. Después de esto,
disparamos la reacción añadiendo los 200 μl del sustrato (ONPG 40 μM). Agitamos e
incubamos durante 10 min a temperatura ambiente. Parar la reacción añadiendo 3 ml de
tampón borato y medir la absorbancia a 410 nm y a 550 nm en cada tubo.
La lectura que obtengamos a 410 nm será la resultante de la absorción del ONP
y de la dispersión ocasionada por los restos celulares. Restar a la lectura de absorbancia
a 410 nm la obtenida a 550 nm multiplicada por 1.75 (la absorbancia obtenida a 550 nm
solo es debida a la dispersión por partículas y no al color amarillo). Calcular las
actividades enzimáticas y discutir los resultados.
Día 4
Hay que acudir con todos los datos recabados en los tres días precedentes y habiendo
leído los siguientes documentos que se encuentran disponibles en campus virtual:
1. Enzyme kinetic parameters estimation: A tricky task?
(Biochem Mol Biol Educ. 2021 Jul;49(4):633-638. doi: 10.1002/bmb.21522).
2. renz: An R package for the analysis of enzyme kinetic data. (BMC
Bioinformatics. 2022 May 16;23(1):182. doi: 10.1186/s12859-022-04729-4).
el documento “Ajuste MM” que encontrareis en Campus Virtual. En esta práctica
llevaremos a cabo el ajuste mínimo-cuadrático no lineal de nuestros datos a la ecuación
de Michaelis-Menten.
