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Producción y purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de E. coli

recombinante

Article · January 2002

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Jorge Gomez Luis G Bermúdez-Humarán

University of Missouri French National Institute for Agriculture, Food, and Environment (INRAE)
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Juan Manuel Adame-Rodriguez

Autonomous University of Nuevo León
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Ciencia UANL
Universidad Autónoma de Nuevo León
[email protected]
ISSN (Versión impresa): 1405-9177
MÉXICO

2002
Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez / Luis G. Bermúdez Humarán / Reyes Tamez
Guerra / Juan Manuel Adame Rodríguez / Roberto Montes de Oca Luna
PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E.
COLI RECOMBINANTE
Ciencia UANL, julio-septiembre, año/vol. V, número 003
Universidad Autónoma de Nuevo León
Monterrey, México
pp. 316-321
Producción y purificación
de la Taq DNA polimerasa
a partir de E. coli recombinante
Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez*, Luis G. Bermúdez Humarán*, Reyes Tamez Guerra*, Juan Manuel
Adame Rodríguez**, Roberto Montes de Oca Luna*

L
a DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq
DNA polimerasa) es la enzima usada en el
procedimiento del PCR (reacción en cadena
de la polimerasa). Este es un método extraor-
dinario para la síntesis de ácido desoxirribonucleico
(DNA) in vitro. El PCR puede amplificar un gen o un
fragmento específico de DNA en varios millones de
veces en menos de dos horas. Sus vastas aplicacio-
nes dieron lugar a un avance vertical en el área de
las ciencias biológicas. Dentro de algunas de las
aplicaciones del PCR se encuentran el diagnóstico
molecular de enfermedades genéticas humanas, de
infecciones virales y bacterianas, en estudios de evo-
lución molecular, clonación y expresión de genes,
identificación de individuos, etc.
El PCR es una reacción de varios ciclos en cade-
na, donde cada ciclo se compone de tres etapas
que son: (a) desnaturalización del DNA, (b) hibrida-
ción de oligonucleótidos y (c) síntesis de DNA. En el
Representación tridimensional de la Taq DNA polimerasa.
primer paso se separan las cadenas de DNA a tem-
peraturas de aproximadamente 94oC, esto permite
que en el segundo paso se hibriden los oligonucleó- enzima termoestable que no perdía su actividad a
tidos a la región de DNA que se desea amplificar y, dichas temperaturas. Esta enzima es la Taq DNA
finalmente, en el tercer paso la enzima Taq DNA polimerasa producida por la bacteria termófila
polimerasa lleva a cabo la síntesis de DNA a una Thermus aquaticus.2 La Taq DNA polimerasa sim-
temperatura de 72 oC. Estos tres pasos se repiten en plificó en gran medida la reacción de PCR al pres-
un promedio de 30 veces. Es decir, que durante cada cindir de adicionar enzima en cada uno de los 30
ciclo los componentes de la reacción pasan por tem- ciclos que se repite la reacción.
peraturas muy elevadas a las cuales se inactivan la La importancia que cobró esta enzima determi-
mayoría de las enzimas. Originalmente el procedi- nó que se establecieran procedimientos para facili-
miento del PCR se estableció usando la DNA poli- tar su purificación, a partir de la bacteria producto-
merasa I de Escherichia coli. 1 Esta enzima no es ra de esta enzima, Thermus aquaticus. Posteriormen-
resistente a las temperaturas usadas en la te, con el uso de la tecnología del DNA recombi-
desnaturalización del DNA y por ende se adiciona-
ba nueva enzima después del primer paso en cada *Laboratorio de Inmunología y Virología.
ciclo de reacción. Este problema se resolvió al susti- **Laboratorio de Micología Médica, Facultad de Ciencias Biológi-
tuir la DNA polimerasa I de Escherichia coli por una cas, UANL, [email protected]

316 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.

nante el gen de la Taq DNA polimerasa se clonó a nientes de cada medio, LB y TB.
partir de T. aquaticus y se expresó en Escherichia
coli.3 La expresión de este gen en E. coli facilitó su Inducción de la expresión del gen Taq
producción y purificación.4 Para determinar el tiempo óptimo de producción de
En el presente trabajo se describe la adaptación Taq DNA polimerasa, básicamente se hizo lo mis-
de un procedimiento para la producción y purifica- mo que en el procedimiento anteriormente descrito,
ción de esta enzima Taq DNA polimerasa, a partir con la diferencia que solamente se crecieron las bac-
de una cepa recombinante de E. coli. terias en el medio LB, ya que como se verá más
adelante (resultados) en éste se obtuvo mayor acti-
Metodología vidad enzimática que en el medio TB. Se tomaron
muestras de 1ml del cultivo celular cada dos horas
Cepa recombinante de E.coli durante 18h, a partir de la inducción con IPTG. Se
y plásmido pTRC-Taq prepararon extractos celulares, mediante sonicación,
Se introdujo por electroporación en una cepa DH5α y se les determinó la actividad de Taq DNA polime-
de E.coli (Stratagene) el plásmido pTRC-Taq (figu- rasa, de acuerdo a lo descrito en el punto anterior.
ra1), el cual porta el gen de la Taq DNA polimerasa
bajo la regulación del promotor lac. Para demos- Purificación de Taq DNA polimerasa
trar la presencia del gen de la Taq DNA polimerasa Una vez que se demostró que el medio LB propor-
se aisló el DNA plasmídico, según la técnica descri- cionaba mayor actividad enzimática y que a las diez
ta por Birnboim and Doly (1979),5 se digirió con la horas de incubación se obtenía la mayor produc-
enzima de restricción XhoI por 2h a 37ºC y se ana- ción de Taq (ver resultados). Se inoculó 1 litro de
lizó en un gel de agarosa al 0.8%, teñido con bro- LB/Amp (40mg/ml) y se indujo la expresión de la
muro de etidio. Taq con IPTG, como se describió anteriormente. Se
cosecharon las bacterias por centrifugación y se la-
Producción de la Taq en medio LB versus TB varon con Buffer A, posteriormente las bacterias se
El medio TB es un medio más enriquecido y se alcan- resuspendieron nuevamente en Buffer A, contenien-
zan densidades celulares de bacterias mayores que do lisozima a 4 mg/ml, se incubó a temperatura
las que se obtienen con LB. Por tal motivo decidimos ambiente por 15 minutos (min) y se le adicionó un
probar si en el medio TB se obtenía un mayor produc- volumen de Buffer B (10mM Tris pH 7.9, 1mM EDTA,
ción de Taq DNA polimerasa que en el medio LB. 1mM PMSF, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPAL). El lisado
Para este propósito se preparó un preinóculo de celular se centrifugó a 25,000 rpm por 45 min en
5 ml de la bacteria recombinante y se usaron 2.5 un rotor SW 28. Al sobrenadante obtenido se le ajus-
ml, para inocular 25 ml de ambos tipos de medio: tó la concentración de KCl a 200 mM, se pasó por
LB (peptona de caseína 1%, NaCl 1%, y extracto de una columna de DE52 (BIO-RAD), previamente pre-
levadura 0.5%) y TB (peptona de caseína 1.2%, ex- parada y equilibrada con buffer B. Se colectaron
tracto de levadura 2.4% y glicerol 0.1ml). Se incu- fracciones de 5 ml y se combinaron aquéllas que en
baron las bacterias hasta una densidad óptica, DO550 ensayos de PCR presentaron actividad de Taq. Las
= 0.250 y se añadieron 20mg/ml de IPTG (Isopropyl fracciones se dializaron toda la noche contra tres
B D thiogalactopyranosido), para inducir la expre- volúmenes de Buffer C (HEPES 20mM, pH 7.9, EDTA
sión del gen Taq DNA polimerasa y se incubó toda 1mM, PMSF 0.5mM, Twen20 0.5% e IGEPAL 0.5%).
la noche a 37°C con agitación. Posteriormente, los El dializado se pasó por una columna de resina Bio
cultivos se centrifugaron y la pastilla se resuspendió Rex 70 (BIO-RAD), equilibrada con Buffer C, y la
en Buffer A (Tris 50mM pH 7.9, glucosa 50mM y Taq DNA polimerasa se eluyó con el mismo buffer,
EDTA 1mM ) y se lisaron las células por sonicación. conteniendo KCl a 200 mM. Se colectaron fraccio-
Nuevamente se centrifugaron las células y se recu- nes de 1ml y se les determinó la actividad de la en-
peró el sobrenadante del cual se prepararon dilu- zima mediante un ensayo de PCR.
ciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). La actividad de Taq
DNA polimerasa se determinó por PCR, amplifican- Medición de la actividad de Taq purificada
do el transgen p53 humano, a partir de genoma La actividad de la Taq purificada se determinó me-
murino. Lo anterior se hizo para las células prove- diante la amplificación del transgen humano p53 a

CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002 317

 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE

partir de un genoma murino. Las reacciones de PCR

se realizaron en volúmenes de 25 µl, conteniendo
100 ng de cada oligonucleótido, desoxiribonucleó-
tidos de trifosfato a una concentración final de 250
mM, 100 ng de DNA genómico y 1 µl, ya sea de
extractos celulares o fracciones de las columnas. Las
condiciones del PCR fueron (°C/min): un ciclo ini-
cial de 94/4, 30 ciclos de 94/1, 56/1, 72/3 y un
ciclo final a 72/7. Para medir la actividad de la en-
zima purificada, así como su calidad, se realizaron
diferentes tipos de amplificaciones (sencillas y múlti-
ples) y se usaron diferentes tipos de templados de
diferentes especies. Generalmente se usaron 100
ng de DNA genómico. Fig.1. Mapa del plásmido pTRC-Taq.

M 1 2
Almacenamiento de la Taq DNA polimerasa
Puesto que se obtuvo una enzima Taq DNA polime-
rasa con actividad biológica, es recomendable
almacenarla y mantenerla estable por un periodo
largo. Por lo tanto, decidimos probar dos diferentes
1 KK 1079 pb
Buffers de almacenamiento y monitorear a través
1 Kb 947 pb
del tiempo su actividad biológica. La enzima purifi-
cada se almacenó en dos diferentes tipos de buffer.
Esto se llevó a cabo con la diálisis de la enzima pu- Fig. 2. Caracterización del plásmido que porta el gen de la
rificada contra 100 volúmenes de Buffer I (HEPES Taq DNA polimerasa. El plásmido se aisló de la bacteria
20mM, KCl 100mM, EDTA 0.1mM, PMSF 0.5mM, recombinante y se digirió con la enzima XhoI. Carril 1
DTT 1 mM y Glicerol al 50%) o Buffer II (Tris 1M pH plásmido sin digerir; carril 2 plásmido digerido, y M es el
marcador de peso molecular 1 Kb.
8, DTT 1mM, EDTA 0.1mM, KCl 100mM, Tween
20 al 0.5%, IGEPAL al 0.5% y Glicerol 50%). La
enzima dializada se almacenó a -20ºC y se le de- dios de cultivo, LB y TB (metodología), se indujo la
terminó su actividad de Taq DNA polimerasa, a tra- expresión del gen con IPTG y se comparó la activi-
vés del tiempo, a intervalos de tres meses. dad de la enzima producida en extractos celulares
preparados por sonicación. Se probaron diluciones
Resultados de los extractos celulares (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Los
resultados se muestran en la figura 3, donde se ob-
Aislamiento y caracterización serva que los productos del ensayo de PCR son más
del gen de la Taq DNA polimerasa intensos en los extractos celulares de las bacterias
Para corroborar que nuestra cepa recombinante de crecidas en LB (carriles 1 al 4), en comparación con
E.coli porta el plásmido pTRC-Taq se realizó un ais- los extractos obtenidos del crecimiento en TB (carri-
lamiento de DNA plasmídico por la técnica de mini- les 5 al 8). Este resultado nos indica que existe una
prep (ver metodología) y se digirió con la enzima de mayor cantidad de actividad enzimática de Taq DNA
restricción XhoI. Ya que el gen Taq posee tres sitios polimerasa en las bacterias crecidas en LB.
XhoI en las posiciones 461 ,1540 y 2487 pb, la
digestión del plásmido con esta enzima debe de Cinética del tiempo óptimo de producción de
generar la liberación de dos fragmentos de 1079 y Taq
947pb (figuras 1 y 2 ). Debido a que en la bacteria recombinante el gen
de la Taq DNA polimerasa está bajo la regulación
Producción de Taq DNA polimerasa en dos di- del promotor lac, el cual es inducible con IPTG, era
ferentes medios de cultivo necesario definir el tiempo óptimo para cosechar
La bacteria recombinante se creció en los dos me- las bacterias, después de la inducción con dicho in-

318 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.

LB TB do heterocigoto y usando tres diluciones diferentes

M 1 2 3 4 5 6 7 8 (1:2, 1:4 y 1:8) de ambas enzimas. Los productos
1.6 kb de PCR, del alelo silvestre y del alelo mutado, indi-
1 kb can que la Taq DNA polimerasa purificada (carriles
1, 4 y 7) presentó mayor actividad que la enzima
0.5 kb comercial (carriles 2, 5 y 8). Además, el almacena-
Tg p53
miento de la enzima en un buffer diferente al I (Bu-
ffer II, metodología) no mejoró la estabilidad de la
Fig. 3. Determinación de la productividad de Taq DNA poli- Taq DNA polimerasa purificada (carriles 3, 6 y 9);
merasa en dos medios de cultivo: LB y TB. Se amplificó el esto, debido a que nuestra enzima purificada mos-
transgen p53 humano (Tgp53). Los carriles del 1 al 4 corres- tró tener igual o mayor actividad que la comercial
ponden a diluciones (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular (5 U/µl).
obtenido del medio LB, los carriles del 5 al 8 son las dilucio-
nes (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular obtenido del me-
dio TB.
P C BII P C BII P C BII
ductor. Después de determinar la actividad de Taq M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
obtenida de muestras de cultivo tomadas cada 2 h, 1 Kb
a partir de la inducción hasta un máximo de 18 h,
encontramos que la actividad de Taq comienza a AM
detectarse a las 4 h, incrementándose progresiva- 0.5 Kb AS
mente hasta las 10 h de crecimiento y disminuyen-
Fig. 5. Comparación de la actividad de la Taq purificada (P)
do a partir de las 12 h (figura 4). Estos resultados
y de una enzima comercial (C). Se amplificó por PCR el gen
indican que a las 10 h se observa mayor actividad p53 murino, en estado heterocigoto: AM, alelo mutante; AS,
de Taq DNA polimerasa. alelo silvestre. Carriles 1, 4 y 7 enzima purificada; carriles 2,
5 y 8 enzima comercial, y carriles 3, 6 y 9 corresponden a la
enzima purificada almacenada en Buffer II (BII). M es el mar-
Hrs de crecimiento cador de peso molecular 1Kb.
Post-inducción
M 2 4 6 8 10 12 14 16 18
1.6 kb Funcionalidad de la Taq DNA polimerasa
A la enzima purificada se le probó su habilidad de
1 kb
amplificar DNA, a partir de genomas de diferentes
organismos y condiciones de reacción. Primero se
0.5 kb
Tg p53 determinó la funcionalidad de nuestra enzima para
la amplificación simultánea de varias regiones del
Fig. 4. Determinación del tiempo óptimo de inducción de genoma humano (PCR múltiple, figura 6).
Taq DNA polimerasa. Actividad de la enzima en extractos
celulares obtenidos a los tiempos indicados (2 a 18 hrs) pos- M 1 2 3 4
terior a la inducción con IPTG. La actividad se determinó
mediante la amplificación del transgen Tg p53. M es el mar-
cador de peso molecular 1 kb. 400 pb

100 pb
Comparación de la Taq DNA polimerasa purifi-
cada y una Taq comercial 50 pb
La figura 5 se muestra la comparación de la activi-
dad enzimática de la Taq DNA polimerasa purifica-
Fig. 6. PCR múltiple del brazo largo del cromosoma Y usan-
da en comparación con una enzima comercial do la Taq DNA polimerasa purificada. M marcador de peso
(BioSelec). Para este propósito se realizó un ensayo molecular 50 pb; carriles 1 al 4 productos de PCR espera-
de PCR para amplificar un gen p53 murino en esta- dos de acuerdo al estuche comercial.

CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002 319

 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE

En este experimento se usaron todos los reacti- M BII BI M BII BI M BII BI

vos de un estuche de amplificación de diferentes
regiones del brazo largo del cromosoma Y, sustitu-
yendo la Taq del estuche por nuestra enzima. El
resultado obtenido fue el mismo patrón de bandas
esperadas, de acuerdo con el estuche comercial. Tg p53
Por otro lado, se probó la habilidad de la enzi-
ma purificada para amplificar DNA de aves. En la (A) (B) (C)
figura 7 se muestra el resultado que corresponde a Fig. 8. Monitoreo de la Taq DNA polimerasa con respecto a
un procedimiento de sexado molecular de aves su actividad a través del tiempo en dos tipos de Buffers de
monomórficas, en donde se amplificaron regiones almacenamiento (BII y BI). Panel A, B y C, enzima con 3, 6 y 9
meses de almacenamiento. M es el marcador de peso mole-
específicas de los cromosomas sexuales Z y W. Los
cular 1Kb.
machos poseen dos cromosomas Z y amplifican una
sola banda (carriles 1, 2, 4, 5, 7 y 9) y las hembras polimerasa, a partir de una bacteria recombinante
poseen un cromosoma Z y un W, y amplifican dos de E.coli. En general la actividad de la enzima puri-
bandas (carriles 3, 6 y 8). ficada fue similar a la de una Taq DNA polimerasa
comercial bajo condiciones estándar de nuestro la-
boratorio. La cantidad producida a partir de 1Lt de
M1 2 3 4 5 6 7 8 9
cultivo fue ~ 100,000 U. Dos puntos importantes
400 pb de resaltar de la enzima purificada son: (1) su repro-
W ducibilidad para amplificar los alelos del gen
endógeno p53 murino (figura 5), con los cuales nor-
100 pb Z malmente se presentaban problemas en nuestro la-
boratorio con la enzima comercial y (2) la enzima
purificada amplificó secuencias de DNA bacteriano,
Fig. 7. Amplificación de los genes CHD-W de la hembra y a partir de DNA aislado de tejido bovino embebido
CHD-Z del macho. Carriles del 1 al 5, Amazona en parafina, nuevamente con mayor reproducibili-
leucocephalla y carriles del 6 al 9 pertenecen a Lory sp.
dad que la enzima comercial usada en este trabajo
(datos no mostrados). Asimismo, la enzima purifica-
da se ha probado en dos estuches comerciales, uno
Estabilidad de la enzima purificada de PCR múltiple para la detección de microdelecio-
La enzima purificada se almacenó a –200C en dos nes del cromosoma. Y, y otro para reacciones de
diferentes buffers y se monitoreó su actividad a tra- RT-PCR en la amplificación de DNAs complementa-
vés del tiempo, mediante la amplificación por PCR rios humanos y virales (datos no mostrados). En am-
del Tg p53 humano a partir de genoma murino. En bos casos el uso de la Taq DNA polimerasa purifica-
la figura 8 se muestra el resultado de la actividad da funcionó en igual medida que la enzima Taq DNA
de Taq DNA polimerasa a los tres, seis y nueve me- polimerasa presente en el estuche. Las comparacio-
ses de almacenamiento (panel A, B y C, respectiva- nes fueron hechas de manera cualitativa y no cuan-
mente). En los dos primeros paneles se aprecia que titativa. Finalmente, la vida media de la Taq bajo
la intensidad de las bandas es comparable en am- condiciones de almacenamiento en nuestro labora-
bos buffers, es decir que la actividad permanece torio ha sido superior a un año. En conclusión se
similar hasta los seis meses. Por el contrario a los implementó un procedimiento para la producción y
nueve meses de almacenamiento (panel C) existe purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de
una actividad ligeramente mayor en la enzima al- una cepa recombinante de Escherichia coli.
macenada en el Buffer I.
Agradecimientos
Conclusión y discusión
Este proyecto CN 314-00 fue apoyado por el pro-
En este trabajo se logró implementar un procedi- grama PAICYT de la Universidad Autónoma de Nuevo
miento para la purificación de la enzima Taq DNA León.

320 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O.

Resumen Referencias

En el presente trabajo se implementó un método para 1. Mullis Kary, Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn
la producción y purificación de la enzima Taq DNA G., and Erlich H. Especific Enzymatic
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producción en cultivo, se probaron dos diferentes 51: 263-273, Cold Spring Harbor Lab.
medios para el crecimiento de dicha bacteria y dos 2. Saiki R.K., Gelfand H., Stoffel S., Scharf R.,
diferentes buffers de almacenamiento para la enzi- Higuchi R., Horn T. y Mullis K. Primer-Directed
ma purificada. A partir de un litro de cultivo se logró Enzymatic Amplification of DNA with a
obtener enzima Taq DNA polimerasa equivalente a Thermostable DNA Polymerase. Science 1988;
100,000 unidades. Esta enzima purificada se ha 239: 487-491.
utilizado en protocolos estándar de laboratorio para 3. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki K., Myambo K.,
la amplificación de secuencias genómicas de bac- Drummond R. y Gelfand H. Isolation,
terias, virus, aves, ratones, bovinos y humanos, mos- Characterization, and Expression in Escherichia
trando ser igual o más eficiente que una prepara- coli of the DNA polymerase gene from Thermus
ción comercial. La actividad de la enzima purificada aquaticus. Journal of Biological Chemistry 1989;
ha permanecido estable durante al menos nueve 264: 6427-6437.
meses de almacenamiento a –200C. 4. Engelk D.R., Krikos A., Bruck E. y Ginsburg D.
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Palabras clave: Taq DNA polimerasa, PCR, PCR polymerase Expressed in Escherichia coli.
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In the present work we developed a protocol to pro- 1513-23.
duce and isolate Taq DNA polymerase of 6. Qureshi, S.J., Ross A.R. Ma K. et al (1996)
recombinant Escherichia coli. We determined the Polymerase chain reaction screening for Y
optimum time of Taq DNA polymerase production. chromosome microdeletions. A first step towards
We tested two different culture media for the growth the diagnosis of the genetically-determined
of the recombinant bacterium and two different spermatogenic failure in men. Mol Hum. Reprod.,
storage buffers for enzyme stability. From one liter 2, 775-779.
media culture we obtained 100,000 units of said 7. Ogawa, A., Murata, K. & Mizuno, S. (1998).
enzyme. This enzyme was used for gene amplification The location of Z- and W-linked marker genes
from different organisms such as birds, mice, human and sequence on the homomorphic sex
and bacteria. The enzyme activity has been stable chromosome of the ostrich and the emu. Proc.
for at least nine months at –20ºC storage. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4415-18.
8. Nakamura, T., Pichel, JG., Williams-Simons, L.,
Keywords: Taq DNA polymerase, PCR, PCR Westphal, H. (1995). An apoptotic defect in lens
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by a mutant allele. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
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CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002 321

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